elektroforesis gel
TRANSCRIPT
![Page 1: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/1.jpg)
![Page 2: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/2.jpg)
Pengertian• Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau
molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.
![Page 3: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/3.jpg)
Prinsip• Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang
mengandung sampel yang akan dipisahkan.
• Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz
F = gaya Lorentz, q = muatan objek, E = medan listrik
![Page 4: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/4.jpg)
How will you do if :
• You’re holding a small plastic tube with some clear liquid in it
• You’ve been told that the liquid contains DNA strands of several different lengths
• Your job is to figure out what those lengths are
![Page 5: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/5.jpg)
![Page 6: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/6.jpg)
Apa Itu Elektroforesis Gel?
Metode Elektroforesis yang digunakan untuk
memisahkan dan menganalisis fragmen-
fragmen makromolekul (asam nukleat dan
protein)
Menggunakan gel sebagai “saringan”
![Page 7: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/7.jpg)
Kapan Kita MenggunakanElektroforesis Gel?
![Page 8: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/8.jpg)
Jenis-Jenis Elektroforesis Gel
Elektroforesis DNA/RNA :• Elektroforesis gel agarose : horizontal
• Elektroforesis gel poliakrilamida : vertikal
Elektroforesis Protein :• PAGE (PolyAcrilamide Gel Electrophoresis)
Sistem yang digunakan dalam PAGE- Flat Bed- Rod atau Column- Vertical Slab- Capillary
• SDS PAGE
• Blue Native PAGE (BN-PAGE)
• Zymogram PAGE
• Isoelectric Focusing (IEF)
• 2-D Electrophoresis
![Page 9: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/9.jpg)
![Page 10: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/10.jpg)
Komponen
Elektroforesis Gel
![Page 11: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/11.jpg)
Gel
1. Berfungsi sebagai matriks Penyaring molekul
2. Pemilihan gel bergantung pada ukuran
molekul yang akan di elektroforesis
3. Biasanya terdiri dari
• Agarose : digunakan secara horizontal
• Poliakrilamida : digunakan secara vertikal
![Page 12: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/12.jpg)
Agarose ditujukan pada berat molekul lebih dari 100 kb dan untuk
poliakrilamida untuk molekul –molekul 1-300 pasang basa, bahkan
mampu membedakan molekul-molekul dengan selisih panjang 1
nukleotida
![Page 13: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/13.jpg)
Agarose Gel
1. Dimurnikan dari polisakarida alga Rhodophyla.
2. Gelidian dan Glaucaria adalah komponen yang dimodifikasi residu galaktosanya. Didalam hubungan dengan polisakarida, agropefin dibentuk agar.
3. Agarose larut pada buffer (TAE) yang mendidih dan ditunggu untuk dingin, Hasil ini dicetak pada cetakan gel yang ditempatkan pada suhu ruang.
![Page 14: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/14.jpg)
Struktur Agarose Gel
![Page 15: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/15.jpg)
![Page 16: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/16.jpg)
Gambar SEM struktur agarose gel 2%(a) 70 oC (b) 40 oC (c) 30 oC (d) 20 oC
![Page 17: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/17.jpg)
Resolusi Gel Agarose
Resolusi : kemampuan memisahkan molekulsehingga dapat terbaca dengan jelas
![Page 18: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/18.jpg)
![Page 19: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/19.jpg)
![Page 20: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/20.jpg)
Gel Poliakrilamida
Poliakrilamida dibentuk dari akrilamida dan N,N’-methyle-bis-akrilamida yang dihubungkan dengan reaksipolimerisasi dengan penambahan ammonium perisulphate dan N,N,N,N'-tetramethylethylenediamin (TEMED). TEMEDadalah katalis yang dibentuk dari radikal bebas ionperisulfate dan diinisiasi polymerization dari acrilamida.
Poliakrilamida dapat dikondisikan sebagai polimer yang netral, kationik, anionik, atau amfoter dengan sifat fisika dan kimia, panjang dan berat molekul yang bervariasi
![Page 21: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/21.jpg)
Polimerisasi Akrilamida
![Page 22: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/22.jpg)
Hasil SEM polyacrilamide gelFrom :Journal of material chemistry website
![Page 23: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/23.jpg)
• Fungsi : menjaga kesetimbangan pH, memberikan ion untuk konduktivitas,
• Elektroforesis DNA :Buffer TAE (Tris-acetate-EDTA), atauTBE (Tris-borate-EDTA ) Loading buffer
• Elektroforesis Protein :Buffer Tris
Buffer
![Page 24: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/24.jpg)
Bagaimana caranya?
Membuatmatriks gel
Proses
elektroforesis
Visualisasi(staining)
![Page 25: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/25.jpg)
![Page 26: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/26.jpg)
![Page 27: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/27.jpg)
![Page 28: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/28.jpg)
Gel Documentation System
![Page 29: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/29.jpg)
![Page 30: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/30.jpg)
Visualisasi Elektroforesis DNA
• Etidium Bromida disinari lampu UV berpendar
![Page 31: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/31.jpg)
Staining
Dilakukan agar pemisahan elektroforesisdapat teramati.
Staining untuk elektroforesis DNA :
• Etidium bromida (penambahan EtBrmengurangi laju migrasi sebesar 15% )
• SYBR Gold, SYBR Green, Crystal Violet, Methyl Blue
Staining untuk elektroforesis protein:
• Coomasie Blue
• Silver Staining
![Page 32: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/32.jpg)
Elektroforesis Protein
![Page 33: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/33.jpg)
Protein Molecular Weight Markers
![Page 34: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/34.jpg)
Autoradiografi DNA
![Page 35: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/35.jpg)
![Page 36: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/36.jpg)
Seperti apa hasilnya?
• Elektroforesis DNA (EtBr Staining)
![Page 37: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/37.jpg)
• elektroforesis protein
![Page 38: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/38.jpg)
Elektroforesis protein
• Silver staining
![Page 39: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/39.jpg)
Migrasi Molekul DNA Pada Gel• Molekul DNA yang bermuatan negatif
karena adanya gugus fosfat akan bergerak menuju anode (elektrode bermuatan positif) saat dipisahkan dengan elektroforesis
• Fragmen DNA yang memiliki ukuran molekul yang sama akan memiliki elektromobilitas yang sama dan menempuh jarak migrasi yang sama
• Topologi DNA yang dipisahkan menentukan elektromobilitas DNA. DNA yang mengalami supercoil akan bermigrasi lebih cepat karena strukturnya sangat kompak. Topologi molekul DNA
hasil Elektroforesis.
![Page 40: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/40.jpg)
• Konsentrasi gel agarose---->
• Pengaruh Voltase : makintinggi voltase, migrasifragmen yang lebih besarakan lebih cepat
• Buffer Elektroforesis
• Efek Etidium Bromida
Faktor yang mempengaruhi pemisahankomponen pada elektroforesis DNA
![Page 41: Elektroforesis gel](https://reader031.vdokumen.com/reader031/viewer/2022012312/5594f2e21a28abfd3e8b471d/html5/thumbnails/41.jpg)
Faktor yang mempengaruhi pemisahankomponen pada elektroforesis protein
• Densitas molekul : berbeda diantara pH media dan pl molekul
• Pengaruh buffer :
• Bentuk dan ukuran molekul
• Media pendukung: • Restriksi pada mobilitas
• Pengaruh difusi
• Elektroendosmosis
• Mikro-heterogenitas molekuler spesies