laporan elektroforesis

Praktikum Halal, 27 Juni 2014

BAB I

LANDASAN TEORI

Ringkasnya metode elektroforesis ini mulai berkembang akhir abad ke 19 setelah

ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel

atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam ha1 ini termasuk juga protein

(PORNET, QUINCKE, HARDY. Dalm RICHARDSON dkk, 1986). Menurut PASSTEUR

dkk. (1988) elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau

perpindahan melalui partikel-partikel listrik.

1. 1. Struktur dan fungsi protein.

Sebelum melakukan metode elektroforesis guna mengetahui suatu populasi

ataupun sistematik dari suatu jenis hewan ataupun tumbuhan, sebaiknya didasari

terlebih dahulu dengan pengetahuan mengenai biokimia protein serta pengetahuan

tentang metode elektroforesis.

Bila dilihat dari struktur protein, hampir sebagian besar sel terbentuk dari

protein, karena di dalam sel bahan ini mencapai lebih dari separuh berat kering sel.

Protein akan menentukan bentuk dan struktur sebuah sel serta bertindak sebagai alat

utama pengenalan antar molekul dan proses katalis. Walaupun DNA menyimpan

informasi yang dibutuhkan untuk sebuah sel, peran langsungnya sangat kecil dalam

proses-proses di dalam sel (BRUCE dkk 1994).

Konformasi tiga demensi sebuah molekul protein ditentukan oleh urutan asam

aminonya. Dalam hal ini struktur pelipatannya dimantapkan oleh interaksi-interaksi

non kovalen antara bagian-bagian yang berbeda dalam rantai polipeptida. Asam-asam

amino dengan rantai-rantai samping yang hidrofobik cenderung menggerombol di

bagian sebelah dalam molekul, dan interaksi-interaksi ikatan hidrogen lokal antara

ikatan-ikatan peptids yang berdekatan menyebabkan terbentuknya alpha helix dan beta

sheet.

BRUCE dkk. (1994) mengatakan bahwa di dalam istilah komputer, DNA dan

mRNA dapat disamakan sebagai "perangkat lunak atau software" yaitu rangkaian


perintah yang diterima oleh sebuah sel dari induknya. Sedangkan protein dan molekul-

molekul RNA yang katalitik dapat dianggap sebagai "perangkat keras atau hardware",

yakni mesin pengeksekusi program-program yang tersimpan dalam memori.

DNA dan RNA adalah rantai-rantai nukleotida yang secara kimia hampir tidak

saling berbeda, sedangkan sebaliknya protein terbuat dari campuran 20 macam asam

amino yang sangat berlainan, masing-masing dengan sifat kimianya yang khas.

Keragaman inilah yang memungkinkan sifat kimia yang serba canggih dimiliki oleh

setiap protein, dan ini diduga dapat menjelaskan mengapa evolusi telah memilih

protein dari pada molekul RNA sebagai katalisator yang terbesar reaksinya di dalam

sel (BRUCE dkk 1994 dan RICARDSON dkk. 1986).

Menurut SCHULZ & SCHIRMER(1979) ada 16 asam amino yang berbeda

yang digunakan oleh hewan, dan masing-masing asam amino tersebut mempunyai

rantai samping yang berbeda pula. Rantai-rantai tersebut sangat berbeda dalam ukuran,

bentuk, dan perintah. Perintah tersebut dapat positif, negatif atau netral, bervariasi

untuk asam amino yang berbeda dan juga akan bervariasi dengan pH untuk setiap asam

amino.

Sedangkan fungsi biologi sebuah protein menurut BRUCE dkk. (1994) dan

RICHARDSON dkk. (1986) bergantung pada sifat-sifat kimia rinci di permukaannya.

Tempat-tempat pengikatan yang berupa rongga-rongga di permukaan protein dibentuk

oleh penempatan rantai-rantai samping asam amino secara tepat melalui pelipatan

protein. Dengan mengikat sangat kencang molekul-molekul antara pada reaksi-reaksi

yang tidak mantap, enzim-enzim mengkatalis perubahan-perubahan kimia pada

molekul-molekul substrat yang terikat, sering kali dengan bantuan molekul-molekul

ko-enzim yang kecil dan terikat kencang untuk menambah kecanggihan kimiawinya.

Laju-laju rekasi enzim sering dibatasi oleh difusi namun dapat ditingkatkan bila enzim

dan substratnya dikurung dalam kompartement kecil yang sama.


Protein alosterik dapat berubah-ubah bentuk bila ada ligan (sebuah molekul

protein mengikat sebuah molekul lain, maka molekul kedua disebut dengan ligan)

yang terikat pada permukaannya. Perubahan yang ditimbulkan oleh sebuah ligan sering

berpengaruh terhadap pengikatan ligan yang lain, karena itu membentuk suatu

mekanisme untuk pengaturan berbagai proses dalam sel. Perubahan-perubahan protein

seperti itu dapat dibuat terarah apabila diberi energi kimia tambahan. sebagai contoh,

apabila ATP, protein-protein dapat melakukan kerja yang bermanfaat misalnya

membangkitkan gaya mekanik atau memompa ion-ion agar dapat memintas sebuah

membran. "Mesin-mesin protein" yang sangat efisien dapat dibentuk dengan cara

menyertakan protein-protein yang selalu bergerak ke dalam kompleks-kompleks

multienzim; kompleks protein semacam ini tampaknya berfungsi menyelenggarakan

berbagai reaksi biologi yang utama BRUCE dkk. (1994) dan RICARDSON dkk.

(1986).

DNA dapat diisolasi dari setiap bagian mahkluk hidup yang mengandung

nukleus/ inti sel, dengan langkah-langkah berikut :

o Pengumpulan/panen sel-sel (cell harvest)

o Pemecahan sel-sel (cell lysis)

o Pencernaan protein agar asam nukleat dilepaskan (protein digestion)

o Pengendapanan DNA (DNA precipation

1. 2. Prinsip

Ada tiga prinsip utama dalam isolasi DNA yakni penghancuran (lisis), ektraksi

atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian

DNA. Prinsip elektroforesis agarose adalah teknik pemisahan asam nukleat/ protein

berdasarkan perbedaan medan listrik, molekul dan partikel bermuatan akan bergerak

ke arah elektrode yang memiliki muatan berlawanan di bawah pengaruh medan listrik.

Prinsip elektroforesis SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrilamide Gel


Reaction) teknik pemisahan protein darah dengan migrasi komponen acrilamida

berdasarkan perbedaan berat molekul.

1. 3. Difinisi Elektroforesis.

Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada

pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik

isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran,

besar muatan dan sifat kimia dari molekul (TITRAWANI 1996). Pemisahan dilakukan

berdasarkan perbedaan ukuran berat molekul dan muatan listrik yang dikandung oleh

makro-molekul tersebut. Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium penyangga yang

telah berisi protein plasma maka komponen-komponen protein tersebut akan mulai

bermigrasi (RICARDSON dkk. 1986).

Menurut STENESH dalam TITRAWANI (1996) teknik elektroforesis dapat

dibedakan menjadi dua cara, yaitu : elektroforesis larutan (moving boundary

electrophoresis) dan elektroforesis daerah (zone electrophoresis). Pada teknik

elektroforesis larutan, larutan penyangga yang mengandung makro-molekul

ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari

makromolekul diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat

seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis daerah adalah

menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media penunjang yang berisi

(diberi) larutan penyangga.

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA

berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa

digunakan antara lain agarosa. Dengan gel agarosa dapat dilakukan pemisahan sampel

DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan

bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran

molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat

diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-

fragmen molekul DNA strandar (marker) yang telah diketahui ukurannya. Visualisasi


DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dulu gel

direndam di dalam larutan etidium bromid.

Mobilitas fragmen DNA pada gel elektroforesis sangat dipengaruhi oleh

komposisi dan kelarutan ion buffer elektroforesis. Jika konsentrasi ion-ion sangat

sedikit maka konduktifitas listrik sangat kecil dan migrasi DNA menjadi lambat.

Konsentrasi ion yang berlebih akan mengakibatkan gel mencair dan DNA

terdenaturasi. Selain buffer elektroforesis, teknik elektroforesis DNA juga memerlukan

loading buffer. Buffer ini berfungsi meningkatkan densitas sampel sehingga fragmen

tersebut berada di dasar well dan tidak menyebar. Fungsi lainnya adalah memberi

warna pada fragmen DNA sehingga mempermudah pengamatan proses elektroforesis.

Buffer ini dapat juga membantu pergerakan sampel ke anoda. Ukuran fragmen DNA

hasil pemotongan dengan endonuklease restriksi dapat ditentukan dengan memakai

penanda DNA (marker). Penanda DNA adalah fragmen DNA yang telah diketahui

ukurannya (Sambrook et al.1989).

Media penunjang yang biasa dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel

poliakrilamida dan kertas sellulose poliasetat. Adapaun menurut SARGENT &

GEORGE (1975) elektroforesis daerah disebut sebagai elektroforesis gel dengan dua

buah model yaitu horizontal dan vertikal. Metode yang biasa digunakan adalah model

horizontal, karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan

sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat

menghasilkan pemisahan yang lebih baik.

a) Elektroforesis Gel (Gel Electrophoresis)

Elektroforesis Gel : teknik pemisahan dari DNA, RNA, dan protein

menggunakan dan protein menggunakan arus listrik pada matrik gel.

Metode elektroforesis gel

Elektroforesis gel agarosa (Agarose Gel Electrophoresis): digunakan untuk

separasi DNA dan RNA (200-50,000 pg ) asangan basa)


Elektroforesis gel poliakrilamid (Poliacrylamide gel electrophoresis): digunakan

untuk separasi protein, dan DNA/RNA molekul “kecil”

Elektroforesis kapiler (Capillary electrophoresis)

1. 4. Kegunaan Metode Elektroforesis.

Telah disebutkan di atas bahwa pola protein tertentu dari satu spesies hewan

berbeda, secara elektroforesis akan memperlihatkan pola protein yang berbeda pula

pada hewan lainnya. Faktor tersebutlah yang menyebabkan pola protein dapat

digunakan untuk membedakan spesies hewan. Perbedaan pola protein inilah yang

seringkali digunakan sebab untuk membedakan populasi secara tepat kadangkala tidak

dapat dilakukan apabila hanya menggunakan pengamatan melalui morfologis saja.

Fenomena ini pula yang menyebabkan metode elektroforesis banyak dilakukan untuk

pengamatan taksonomi, sistematik dan genetik serta untuk mengindentifikasi spesies

hewan maupun tumbuhan (bio-sistematik). Dapat pula digunakan untuk melihat

phylogenetic reconstruction (rekonstruksi secara Filogenetik) dari suatu jenis hewan

atau tumbuhan.


1. 5. Elektroforesis.

Sebelum dilakukan percobaan sebaiknya disiapkan dahulu alat dan bahan kimia

yang akan digunakan. Alat yang biasa digunakan adalah tabung Eppendorf,

mikropipet, tip, mortat, tabung Erlenmeyer, gelas ukur, penangas air (dengan suhu

80°C), magnetic stir rer, magnectic bar, sentrifuga, pinset, timbangan, pompa vacum,

cetakan gel 20 x 16 x 1 cm3, timer, meja pendingin, pembungkus plastik, freezer,

kawat halus untuk memotong gel, inkubator, power supply, pisau, penggaris, spidol,

kantong plastik tebal untuk menyimpan gel setelah pewarnaan, nampan plastik, spons

dan alat-alat tulis.

Sedangkan untuk bahan kimia yang digunakan, tergantung dari hewan atau

tumbuhan enzim apa yang akan diuji. Seperti misalnya larutan pengekstra yang

digunakan untuk jenis udang-udangan berdasarkan DICKSON dkk, (1983) adalah

menggunakan sistem enzim Esterase (EST), dan Malat dehidrogenase (MDH).

WIKNESWARI (1995) menggunakan Malik Enzim (ME), serta CHELIAK & PITEL

(1984) menggunakan Phosphat glukosa isomerase (PGI) dan lain sebagainya. Untuk

menentukan sistem enzim tersebut sebelumnya dilakukan uji optimalisasi terlebih

dahulu terhadap hewan yang akan diujikan.

Cara kerja terdiri dari beberapa tahap yaitu: 1. ekstraksi enzim, 2. pembuatan

gel pati, 3. penempatan sampel, 4. proses elektroforesis, 5. visualisasi sistem enzim, 6.

observasi gel dan 7. Metode analisis.

1. Ekstraksi enzim

Setelah sample dibersihkan ditempatkan di dalam mortar dan diberi larutan

pengekstrak sebanyak + 200 µ (tergantung dari banyak, sedikitnya sampel atau

besar kecilnya sampel). Kemudian sampel digerus hingga halus. Penggerusan

dilakukan pada kondisi dingin (+4°C) dan dilakukan di dalam meja pendingin,

agar suhu tetap konstan. Hasil gerusan tersebut dimasukkan ke dalam tabung


Eppendorf dan kemudian dilakukan sentrifuse dengan kecepatan 2000 rpm selama

20 menit. Supernatan yang didapat dipisahkan dari endapan, yang selanjutnya

dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf dan disimpan dalam lemari pendingin

(Freezer) dengan suhu sekitar -70°C.

2. Pembuatan gel pati.

Pembuatan gel pati biasanya bermacam macam. Ada yang berasal dari pati

kentang, dan lain sebagainya. Setelah ditentukan banyaknya pati, maka diberikan

larutan buffer morfolin sitrat dengan pH 6.1 sebanyak 350 ml di dalam labu

erlenmeyer 1000 ml. Campuran tersebut kemudian dipanaskan dalam penangas air

dengan suhu + 80 °C, selama 25 menit. Panaskan lagi dengan magnetic bar dan

diaduk dengan menggunakan magnetic strirer selama 5 menit hingga mengental

membentuk gel yang bening.

Setelah gel mendidih, dilakukan pengisapan gelembung udara dengan cara diisap

dengan "water jet pump" dan setelah dingin, gel dituangkan ke dalam cetakan gel

yang berukuran 20 x 16 x 1 cm3 hingga rata dan biarkan mengeras pada suhu

kamar lebih kurang 60menit.

3. Penempatan sampel

Gel dilepaskan dari cetakan gel dengan cara mengiris keliling tepi gel dengan

menggunakan pisau. Bagian ujung gel diiris kira 2 cm dari salah satu tepinya yaitu

dari arah kotada yang dipakai sebagai penyimpan ekstra enzim.

Ekstrak enzim yang akan diuji dikeluarkan dari freezer dan biarkan sebentar

hingga mencair. Pengambilan ekstrak enzim dilakukan dengan cara mencelupkan

kertas saring berukuran 6x15 mm ke ekstrak enzim. Potongan kertas saring yang

telah berisi ekstrak enzim diletakkan dengan posisi tegak lurus ke celah irisan gel.

Jarak antara celah 1-1.5 mm. Sebagai indikator adanya pergerakkan maka pada

celah irisan gel tersebut diberikan sedikit biru brom fenol.

4. Proses elektroforesis

Gel yang telah siap kemudian diletakkan secara horizontal di atas kotak

elektroforesis yang telah berisi larutan penyangga elektroda. Proses ini dilakukan

di dalam lemari pendingin dengan suhu 4 °C.


Kedua sisi gel diberi spons yang telah dibasahi dengan larutan penyangga

elektroda sebagai jembatan antar larutan penyangga elektroda dengan gel. Setelah

itu gel ditutup dengan plastik dan di atas gel tersebut diberi gel yang dingin.

Proses elektroforesis dijalankan dengan memberi daya listrik pada gel. Pemberian

daya listrik disesuaikan dengan sampel yang akan digunakan, misalnya sebesar 50

- 70 µA, 50-60 µA atau 45-55 µA selama kurang lebih 3 jam.

Setelah terlihat bahwa biru brom fenol mencapai titik yang berjarak + 3 cm

dari ujung gel, maka proses elektroforesis dihentikan. Bagian gel yang tidak

terpakai dipotong, sedangkan potongan gel yang menjadi tempat migrasi enzim

diiris tipis secara horizontal dengan menggunakan gergaji yang berkawat tipis.

Gel diiris menjadi beberapa lembar gel yang kemudian setiap lembar diletakkan

dalam wadah plastik, untuk selanjutnya diwarnai sesuai enzim yang akan

dianalisis.

5. Visualisasi sistem enzim

Visualisasi sistem dilakukan dengan pewarna biokimia. Dengan komposisi yang

telah ditentukan sebelumnya.

6. Metode analisis

Dalam hal ini cara menganalisa hasil pita dari elektroforesis tersebut sangat

tergantung dari topik apa yang akan diteliti. Hasil visualisasi enzin berupa bintik

atau noda yang disebut pola pita (bandmorp). Macam pola pita dibedakan atas tipe

pola pita yang terbentuk. Semua tipe pola pita yang berbentuk diinterpretasikan

sebagai lokus isozim dan alel yang kemudian dijadikan dasar dalam pengukuran

parameter-parameter yang ada dalam suatu populasi (NEI 1977; BROWN &

WEIR 1983; ROTHE 1995). Lokus isozim adalah struktur gen yang memiliki

kemampuan menghasilkan enzim pengkatalisis reaksi biokimia tertentu,

sedangkan alel adalah salah satu dari dua atau lebih bentuk gen yang dapat

muncul pada satu lokus (SUZUKI dkk. 1993). Metode analisis dapat dilakukan


dengan beberapa cara misalnya metode analisis ekspresi alel, atau metode analisis

fenetik dan lain sebagainya.

Sedangkan untuk menangani sampel dari mulai pengambilan di lapangan hingga

penyimpangan dapat diterangkan sebagai berikut:

Koleksi Sampel

Agar proses elektroforesis dapat berhasil dengan baik, tidak lepas dari proses

pengambilan sampel di lapangan. Untuk pengambilan sampel sangat

diperlukan pengertian dan pengetahuan yang benar terhadap metode serta

sampling yang digunakan. Disamping juga pengetahuan mengenai dasar bio-

kimia dari protein. Karena proses elektroforesis sangat berpengaruh dengan

jaringan-jaringan dan protein yang terdapat pada hewan koleksi.

Sampel yang akan diambil sedapat mungkin harus segar atau untuk hewan

diusahakan agar tetap hidup dan tidak boleh diawetkan dengan menggunakan

bahan pengawet alkohol ataupun formalin. Atau apabila hewan tersebut mati,

maka sebaiknya disimpan dalam bentuk dingin atau membeku (masukkan

dalam ice box yang diberi dry es atau masukkan ke dalam larutan nitrogen

cair).

Penanganan dan Penyimpanan Sampel

Apabila telah diperoleh sampel yang diinginkan, maka sampel segera dibawa

ke laboratorium untuk disimpan ke dalam freezer dengan suhu -50°C. Sampel-

sampel tersebut dapat disimpan dalam jangka waktu panjang, hingga proses

elektroforesis siap dilakukan. Sebelum dimasukkan ke dalam freezer, sampel

disimpan dalam kotak plastik atau bila dalam bentuk jaringan atau supernatan

dapat dimasuukan ke dalam tabung Eppendorf.

Bahan

1. Sampel: Daging sapi dan daging bagi

2. Kit isolasi (High Pure PCR Template Preparation Kit)

a. Tissue Lysis Buffer

b. Proteinase K


c. Binding Buffer

d. Inhibitor Removal Buffer

e. Wash buffer

f. Elution buffer

g. Collection Tube

h. Filter tube

Alat

1. Microsentrifuge tube Vol. 1,5 ml (steril)

2. Micropipette 20-200 µl


4. Tips kuning (20-200 µl) steril

5. Tips biru (100-1000 µl) steril

6. Tangkai pisau bedah dan pisau bedah (steril)

7. Aluminium Foil

8. Vortex

9. Sentrifugator

Prosedur

1. Daging sapi dan daging babi masing-masing dipotong halus dan ditimbang 100 mg.

kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam Microsentrifuge Tube untuk 1,5 ml

yang telah diberi label

2. Masing-masing tube tersebut ditambahkan 200 µl Tissue Lysis Buffer, kemudian

dihomogenkan dengan cara up and down.

3. Masing-masing ditambahkan 40 µl Proteinase K, dihomogenkan dengan vortex

selama 2 menit.

4. Kedua tube tersebut diinkubasi dalam water bath bersuhu 55-57 C selama 24 jam.

5. Masing-masing tube ditambahkan 200 µl Binding Buffer (berfungsi untuk mengikat

DNA agar terikat dalam filter), divortex 2 menit, dan diinkubasi dalam water bath 70

C selama 10 menit hingga membentuk larutan yang homogeny. ( jika belom

homogeny, waktu inkubasi ditambahkan).


6. Masing-masing ditambahkan 100 µl Isopropanol Absolut untuk presipetasi DNA,

divortex 1 menit

7. Masing-masing campuran dipipet seluruhnya dan dimasukkan ke dalam Filter Tube

yang telah dipasangkan Collection Tube. Divortex 2 menit, kemudian disentrifugasi 1

menit dengan kecepatan 8700 rpm. Cairan yang melewati filter dibuang bersamaan

collection tube. Filter tube dipasangkan dengan collection tube baru.

8. Masing-masing ditambahkan 500 µl Inhibitor Removal Buffer. Divortex 2 menit,

kemudian disentrifugasi 1 menit dengan kecepatan 8700 rpm. Cairan yang melewati

filter dibuang bersamaan collection tube. Filter tube dipasangkan dengan collection

tube baru.

9. Masing-masing ditambahkan 500 µl wash buffer. Divortex 2 menit, kemudian

disentrifugasi 1 menit engan kecepatan 8700 rpm. Cairan yang melewati filter

dibuang bresaaan collection tube. Filter tube dipasangkan dengan collection tube baru.

10. Masing-masing ditambahkan kembali 500 µl wah buffer. Divortex 2 menit, kemudian

disentrifugasi 1 menit dengan kecepatan 8700 rpm.

11. Cairan yang melewati filter dibuang, collection tube dipasangkan kembali.

Disentrifugasi 2 menit dengan kecepatan 8700 rpm untuk menghilangkan sisa Wash

Buffer. Cairan yang melewati filter dibuang bersamaan collection tube. Filter tube

dipasangkan dengan Microsentrifuge Tube steril.

12. Masing-masing ditambahkan 100 µl Elution Buffer (telah dihangatkan pada suhu 70

C minimal 5 menit). Divortex 2 menit, kemudian disentrifugasi 1 menit dengan

kecepatan 8700 rpm. Perlakuan ini dilakukan2 kali.

13. Filter tube dilepaskan dari Microsentrigue tube. Pada microsentrifuge tube telah

mengandung DNA terpurifikasi dan disimpan pda suhu 2 C untuk dianalisa

selanjutnya.


BAB II

METODOLOGI

Judul Praktikum

Analisis DNA Babi dan Sapi dengan metode Elektroforesis

Tempat, Tanggal Praktikum

Laboratorium PNA. Jum’at, 20 juni 2014

Bahan

1. Aquabidest 500 ml

2. Larutan buffer TAE 10 x ( mengandung 24.2 gr Tris Base; 10 ml EDTA 0,5 M pH

8;5.7 ml As. Asetat Glacial; aquabidest Add 500 ml)

3. Agarose

4. Loading Dye

5. Ethidium Bromide 10 mg/ml

Alat


2. Tips putih 1-10 µl

3. Satu set alat elektroforesis

4. Aluminium foil

5. Gel documentation

6. Spatula


7. Gelas ukur

8. Pipet tetis

9. Kaca arloji

10. Erlenmeyer

11. Hot plate

Prosedur Pembuatan

a. Pembuatan buffer elektroforesis TAE 1x, 1 liter

- 50 ml TAE 10 x dimasukkan ke dalam labu ukur 500 ml

- Add aquabidest sampai tanda batas dan dihomogenkan

b. Pembuatan gel agarosa 1%

- 0.5 gr agarosa dilarutkan dengan 50 ml TAE 1x

- Dipanaskan diatas hot plate sampai larutan menjadi bening dan mendidih.

Dihomogenkan.

- Larutan agarosa didiamkan hingga suhu 60 C dan ditambahkan 25 µl etidium

bromide 10 mg/l, diaduk hinga homogeny

- Larutan dituangkan pada gel caster dan comb disisipkan untuk membuat well

(sumur). Larutan agarose dibiarkan hingga mengeras.

- Gel diletakkan pada chamber electrophorsesis dengan posisi well pada muatan

negative (warna hitam). Kemudian buffer TAE 1x dituang hingga gel terendam

dalam chamber electrophoeresis namun tidak melebihi garis batas max buffer.

c. Loading sample

- Masing-masing sebanyak 5 µl DNA hasil isolasi ditaruh diatas aluminium foil.

Kemudian masing-masingnya ditambahkan 1 µl loading dye dan dihomogenkan

dengan menaik turunkan mikropipet.

- Masing-masing campuran tersebut dipipet dan dimasukkan ke dalam well agar

telah terpasang pada chamber

d. Running sampel

- Chamber ditutu rapat dan kabel chamber dihubungkan dengan power supply


- Running sampel dilakukan selama 45 menit dengan voltase 90 Volt 400 mA.

e. Dokumentasi gel agarose dengan gel Documentation

BAB III

HASIL DAN PEMBAHASAN

HASIL

Terlihat terbentuknya pita saat gel diamati diatas sinar UV.

Pembahasan


Saat praktikum, kami melakukan elektroforesis dengan menggunakan sampel DNA

sapi dan DNA babi. Elektroforesis merupakan suatu teknik pemisahan molekul selular

berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu

medium yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan

memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan

negatif (Yuwono, 2005). Adapun perbedaan dari elektoforesis agarose dan SDS PAGE

adalah pada SDS PAGE yang dianalis adalah proteinnya. Prinsip kerjanya adalah jika

molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel

agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya

(positif), maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif

(Elektroforesis) melalui membran matriks gel agarose tersebut (Yuwono, 2005).

Dalam praktikum ini jenis elektroforesis yang digunakan adalah elektroforesis zona

dan menggunakan teknik elektroforesis horizontal karena menggunakan gel agarose yang

diletakkan pada alat elektroforesis secara horizontal dan teknik ini difungsikan untuk

analisais DNA. Proses isolasi DNA terdiri dari tiga tahapan diantaranya, lisis jaringan dan

membran sel, pemisahan DNA dari protein sel, dan presipitasi DNA.

Siapkan daging sapi dan daging babi lalu dipotong halus agar luas permukaan kontak

dengan reagen kimia lebih luas dan kemudian ditimbang. Kemudian masing masing

dimasukkan ke dalam microsentrifuge tube yang telah diberi label. Selanjutnya ditambahkan

Tissue lysis Buffer yang berfungsi untuk melisiskan sel. Lisis sel berfungsi untuk

mengeluarkan DNA yang terdapat di dalam sel dapat dipisahkan untuk dianalisa. Selanjutnya

ditambahkan proteinase K. penambahan proteinase K digunakan untuk merusak protein yang

menyelubungi di sekeliling DNA. Hal ini dilakukan agar DNA yang didapatkan merupakan

DNA murni yang tidak lagi terikat atau terselubungi oleh protein. Selanjutnya dilakukan

homogenasi dengan vortex selama 2 menit. Selanjutnya dilakukan inkubasi selama 24 jam

pada water bath dengan suhu 55-57oC. Setelah 24 jam, dilakukan penambahan binding buffer

bertujuan untuk mengikat DNA agar dapat terikat pada filter tube. Selanjutnya dilakukan

vortex untuk homogenisasi, dan diinkubasi dalam waterbath 70oC selama 10 menit hingga

membentuk larutan yang homogen.

Selanjutnya ditambahkan isopropanol absolut yang berfungsi untuk mengumpulkan

DNA yang telah terpisah dan berada di lapisan air. Lalu dilakukan vortex selama 1 menit.


Masing masing campuran lalu dipipet seluruhnya dan dimasukkan ke dalam filter tube yang

telah dipasangkan collection tube. Selanjutnya divortex 2 menit dan disentrifugasi 1 menit

dengan kecepatan 8700 rpm untuk memisahkan antara endapan (pellet) dan supernatant.

Cairan yang melewati filter dibuang bersamaan collection tube. Filter tube dipasangkan

dengan collection tube baru. Selanjutnya masing - masing ditambahkan wash buffer yang

berfungsi untuk mencuci DNA yang sudah diikat dari pengotor pengotor enzim enzim/protein

protein. Proses pencucian ini dilakukan sebanyak 2 kali untuk memastikan DNA yang

didapatkan benar benar murni dan bebas dari segala macam pengotor. Setelah itu, dilakukan

vortex 2 menit untuk homogenisasi dan lalu sentrifugasi dengan kecepatan 8700 rpm selama

1 menit.

Kemudian, tanpa penambahan reagen dilakukan sentrifugasi kembali dengan

kekuatan rpm yang sama selama 2 menit untuk menghilangkan sisa wash buffer yang

mungkin masih terdapat pada sampel. Cairan sisa wash buffer dibuang bersama dengan

collection tubenya. Lalu dipasangkan microsentrifuge steril pada filter tube. Selanjutnya

masing masing ditambahkan elusion buffer untuk mengelusi DNA yang telah murni. Elusion

buffer dapat berupa Tris HCl atau Tris EDTA ldengan pH 8-8,5. Selanjutnya dilakukan

vortex selam 2 menit untuk homogenisasi lalu disentrifuge 1 menit. Perlakuan ini dilakukan

sebanyak 2 kali. Selanjutnya, filter tube dilepaskan. Microsentrifuge steril selanjutnya akan

menampung DNA murni yang telah dilarutkan homogeny dalam buffer elusi yang telah siap

untuk dianalisa. Apabila sampel tidak diguakan langsung, sampel disimpan pada suhu 2oC

untuk menjaga stabilitas.

Dalam proses pengerjaan isolasi DNA harus steril, hati – hati, dan sediaan atau bahan

sesudah digunakan harus ditutup kembali agar tidak terkontaminasi dari mikroba. Dengan

dilakukan proses tersebut maka analisa yang didapat akan baik dan bagus.

Selanjutnya proses pembuatan gel agarose, secara umum proses pembuatan gel

agarose dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk agarosa dengan larutan dengan 50 ml

TAE, dipanaskan diatas Hot plate sampai mendidih. Larutan TAE merupakan suatu buffer

yang mengandung Tris base, EDTA 0.5M dengan pH 8, asam asetat glacial, dan aquabides.

Kemudian didiamkan pada suhu 60˚C ditambah etidium bromida diaduk sampai homogen.

Bubuk agarosa yang digunakan sebanyak 0,5 gr dan larutan buffer 500 mL yang berperan

untuk memudahkan migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik.


Penambahan etidium bromida dilakukan dengan tujuan mewarnai asam nukleat. Etidium

bromida adalah mutagen dan harus ditangani dengan hati-hati. Penanganannya harus

dilakukan dengan sarung tangan karet (Bowen 2000: 4). Cairan etidium bromida

ditambahkan dengan tujuan sebagai pewarna fluoresen untuk mendeteksi asam nukleat,

sehingga hasil elektroforesis nanti dapat diamati dibawah sinar UV. Etidium bromide akan

mengikat pasangan basa DNA dan dapat mengurangi mobilitas DNA. Larutannya ditiangkan

pada coaster dan Comb sampai agarosa tersebut mengeras. Penambahan buffer dilakukan

dengan tujuan mempermudah pengerasan gel saat dilakukan pemanasan. Tahap selanjutnya

adalah gel dimasukan dalam chamber yang bermuatan negatif, kemudian buffer dituang

sampai gel terendam tapi tidak melebihi garis batas maksimum buffer. Teknik elektroforesis

pada dasarnya berdasarkan pada fakta bahwa DNA cenderung bermuatan negatif pada pH

netral dengan buffer sebagai penyangga pH agar saat dilakukan elektroforesis dengan

memberikan daya listrik di kedua kutub maka DNA akan bergerak kekutub positif, inilah

prinsip kerja elektroforesis gel agarosa.

Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA hasil isolasi dengan loading dye yang

memiliki fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor berapa

lama proses elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol biru

(Bowen 2000: 3). Pemindahan sampel DNA dilakukan oleh dua orang praktikan secara

bergantian. Proses pemindahan dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan

secara hati-hati agar campuran DNA dengan loading buffer tidak “meluber” ke bagian well

yang lain. DNA memiliki muatan negatif (DNA mengandung gugus PO4) sehingga

diharapkan akan bergerak menuju kutub positif (Martin 1996: 9).

Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan

arus listrik. Gel dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah mengalami perubahan warna

dan dilihat dengan sinar UV. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung

sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik

yang adapada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul

yangbermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari

suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari

kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah

muatan terhadap massanya serta tergantung pulapada bentuk molekulnya. Secara umum,


elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen

DNA. Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada permukaan partikel,

tanda dan besarnya muatan pembawa oleh variasi group ionogenik. Tergantung kepada

kekuatan molekul listrik dan pH dari medium, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi

karena efek seleksi dan medium yang sesuai.

Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang

terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutup negatif, apabila dialiri arus listrik dengan

menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutup positif. Laju

migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA

terutama ditentukan oleh ukuran panjang danbentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran

kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis

mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya.

Dengan adanya Etilen Bromida yang berfungsi untuk visualisasi pada sinar UV

dimana urutan etidium bromida yang akan masuk diantara ikatan hidrogen pada DNA,

sehingga pita fragmen DNA akan kelihatan dibawah lampu UV 254 nm. Hal ini sesuai

dengan praktikum yang kami lakukan dimana terlihat pita-pita berwarna ketika dilihat pada

sinar UV 254 nm sehingga dapat kami simpulkan bahwa preparasi sampel yang kami lakukan

berhasil. Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya dengan pita DNA

standar.

Pada penggunaan agar-agar untuk eletroforesis agarose, agar-agar yang digunakan

tidak boleh terlalu panas saat dituang ke dalam cetakan karena jika terlalu panas cetakan akan

retak retak dan agar-agar juga tidak boleh terlalu dingin karena agar-agar akan mengental dan

tidak dapat menjadi sumur. Saat menuang agar-agar ke dalam cetakan yang harus

diperhatikan adalah gelembung udara karena tidak boleh ada gelembung udara pada saat

mencetak agar-agar.


BAB IV

PENUTUP

Kesimpulan

1. Dari hasil elektroforesis yang diperoleh bahwa telah terbentuk pita yang

mengidentifikasi DNA sapi dan DNA babi.

2. Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya dengan pita DNA

standar.

Saran

1. Peralatan yang digunakan untuk praktikum sebaiknya ditambah sehingga memudahkan untuk pengerjaan praktikum dan praktikan juga lebih memahami proses praktikum.

2. Dalam proses pengerjaan isolasi DNA harus steril, hati – hati, dan sediaan atau bahan

sesudah digunakan harus ditutup kembali agar tidak terkontaminasi dari mikroba.

Dengan dilakukan proses tersebut maka analisa yang didapat akan baik dan bagus.


DAFTAR PUSTAKA

BROWN, A.H.D dan B.S. WEIR 1983. Measuring Variability in Plant Population. In : S.D.

TANKSLEY and T. J. ORTON (eds.), Isozymes in plant Genetics and Breed ing. Part

A. Elsevier Science Publisers, Amsterdam: 219 pp.

BRUCE, A., D. BRAY., J. LEWIS, M. RAFF., ROBERTS dan J.D. WATSON 1994. Biologi

Molekuler Sel Mengenai Sel. Edisi kedua PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta: 346

hal.

CHELIAK, W. M dan J. A. PITEL 1984. Techniques for Starch Gel Electrophoresis of

Enzymes from Forest Tree Species. Information Report PI - X - Y2. Petawawa

National Forestry Institute. Canadian Forestry Service Agriculture Canada : 127 pp.

DICKSON, R, SIEGMUND., S. SCHNEIDER, H. J. LINZEN, B. GIELENS, C. PREAUX.,

G. LONTIE., R. KELLER MANN dan J. F. LOTTSPEICH 1983. Complete Amino

Acid sequence of a Functional Unit from a Molluscan Hemocyanin (Helix pomatia).

Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368 : 617 pp.


NEI, M. 1977. F-Statistic and Analysis of Gen Diversity in Subdivided Populations. Ann.

Hum. Genet, 41:255.

PASTEUR, N, G. PASTEUR., F. BONHOMME., J. CATALAN., J. BRITTON. dan

DAVIDIAN., 1988. Practical Isozyme Genetics. Laboratory of Ecological Genetics,

University of Montpellier 2. France: 54 pp.

RICHARDSON, B. J, P. R. BAVERSTOCK and M. ADAMS 1986. Allozyme

Electrophoresis. A Handbook for Animal Systematics and Population Studies.

Academic Press, Inc. San Diego : 410 pp.

ROTHE, G. M. 1995. Electrophoresis of Enzymes. Springer - Verlag. Berlin Heidelberg: 278

pp.

SARGENT, J. R. dan S. G. GEORGE 1975. Methods in Zone Electrophoresis BDH

Chemical LTD. Poole England: 219 pp.

DOKUMENTASI

A. PREPARASI SAMPEL

Siapkan daging sapi dan daging sapi segar Bersihkan masing-masing daging secara terpisah

Ambil bagian daging yang tidak berlemak (lakukan secara terpisah)

Potong halus (lakukan secara terpisah)


Timbang 100mg masing-masing Masukan ke tube terpisah

Tambahkan 200µl tissue lysis buffer, homogenkan

Tambahkan 40µl protein K, homogenkan

Vortex 2 menit Hasil yang telah divortex, diInkubasi di waterbath selama 24jam suhu 60-70


PENGENCERAN LARUTAN TAE

TAE KONSENTRASI 10x DIENCERKAN 50 ml dalam 500ml

B. ALAT BAHAN

KIT PCR REAGEN YANG DIGUNAKAN


C. ISOLASI PROTEIN


\


D. PENYAIAPAN GEL AGAROSE

Bahan yang digunakan Pelarutan agarose menggunakan TAE

Pemanasan

Penambahan etidium bromida

Penuangan pada pencetak gel Penyisipan comb


Letakan gel pada chamber elektroforesis

Penuangan buffer TAE Isolat DNA disimpan diatas aluminum foil

Tambahkan loading dye Pemasukan sampel kedalam sumur

Running sampel


ISOLASI DNA DAGING SAPI DAN DAGING BABI DENGAN

MENGGUNAKAN KIT ISOLASI

HIGH PURE PCR TEMPLATE PREPARATION KIT

DISUSUN OLEH :

Rahmi Sertiana 1111102000085

Ageng Hasna F 1111102000088

Nindya nurfitriani azhar 1111102000095

Galih Nurhadi 1111102000103

M.A.W. Khairrurrijal 1111102000102


Beryl Zahyin A 1111102000106

Ana Yuliana 1111102000109

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

2014

laporan elektroforesis

Documents