Pada praktikum kali ini dilakukan percobaan mengenai kuantitasi mikroba dengan menggunakan

metode hitungan cawan. Praktikum ini bertujuan agar praktikan dapat melakukan pengenceran

serial dan menentukan konsentrasi suspensi bakteri dengan metode hitungan cawan. Dalam

perhitungan bakteri ada beberapa cara yang dapat dilakukan baik secara langsung maupun tidak

langsung. Beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat

preparat dari austu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan

ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk

mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count),

yaitu : perhitungan pada cawan petri (total plate count / TPC), perhitungan melalui pengenceran,

perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau

turbidimetri). Dasar metode hitungan cawan ini sendiri menggunakan anggapan bahwa setiap sel

yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni.

Hal yang pertama dilakukan dalam praktikum ini adalah menyiapkan semua bahan dan alat-alat

yang digunakan. Alat- alat yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah cawan untuk media

pertumbuhan bakteri, tabung reaksi sebagai wadah untuk pengenceran, kapas & kasa sebagai

penutup tabung reaksi & volume pipet agar tetap steril, volume pipet untuk mengambil sejumlah

tertentu sampel, korek untuk menyalakan api, rak tabung untuk menyimpan tabung, Koran untuk

membungkus cawan petri yang telah berisi media dan bakteri dan inkubator sebagai tempat

perkembangan bakteri. Sedangkan bahan-bahan yang digunakan adalah nutrient agar sebagai

media tumbuh bakteri, aquadest steril untuk pengenceran sampel, sampel air sebagai bahan yang

akan diuji. Setelah semuanya siap selanjutnya dilakukan pengenceran sampel (bakteri). Metode

pengenceran yang digunakan yaitu pengenceran tabung. Dimana pengenceran sampel dilakukan

dengan menggunakan tabung.

Dalam praktikum ini, semua pengerjaan harus dilakukan secara aseptis dimana setiap pengerjaan

harus dilakukan didekat api, agar tidak terjadi kontaminasi dari lingkungan luar terhadap sampel

ataupun biakan bakteri yang akan dibuat. Namun juga tidak boleh terlalu panas karena suhu yang

terlalu panas dapat mematikan bakteri sehingga bakteri tidak dapat tumbuh.

Prinsip pengenceran adalah menurunkan jumlah sehingga semakin banyak jumlah pengenceran

yang dilakukan, makin sedikit sedikit jumlah mikroba, dimana suatu saat didapat hanya satu

mikroba pada satu tabung. Larutan yang digunakan untuk pengenceran harus memilki

sifat osmotik yang sama dengan keadaan lingkungan asal mikroba untuk menghindari rusaknya

sel, selain itu juga harus dijaga agar tidak terjadi perbanyakan sel selama pengenceran. Selain

menggunakan larutan garam fisiologi (NaCl) 0,85 %, pengenceran juga dapat dilakukan dengan

menggunakan larutan fosfat buffer, larutan Ringer, atau akuades. Untuk pengenceran

menggunakan akuades sebaiknya pelaksanaan pengencerannya harus cepat. karena dapat

mengakibatkan rusaknya sel akibat perbedaan tekanan osmotic. Pengenceran yang dilakukan

dalam percobaan ini adalah pengenceran decimal yaitu 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 ,10-6 10-7, 10-8,

dan 10-9. Dan yang diplating dan diamati adalah pengenceran 10-7, 10-8 dan10-9.

Pertama-tama yang dilakukan dalam pengenceran sampel yaitu mengambil tiga buah

tabung tertutup kasa yang sebelumnya telah disterilisasi didalam autoklaf dan dikeringkan

didalam autoklaf. Sterilisasi tersebut bertujuan agar sampel tidak terkontaminasi dari kotoran

yang berada pada alat yang digunakan. Kemudian, kedalam masing-masing tabung tersebut

dimasukkan aquadest steril sebanyak 9 mL dengan menggunakan volume pipet 5 mL tertutup

kapas. Volume pipet yang digunakan juga volume pipet yang telah disterilisasi didalam

autoklaf, namun tidak dikeringkan didalam oven karena alat tersebut memiliki skala volumetric

yang jika dipanaskan akan memuai sehingga dapat mempengaruhi keakuratannya. Pengambilan

aquadest steril tersebut dilakukan dengan cara menyedot aquadest tersebut dengan menggunakan

volume pipet, sehingga pada mulut volume pipet harus ditutup kapas agar aquadest tersebut tidak

tertelan ke mulut. Semua langkah tersebut dilakukan secara aseptis didekat api.

Pada tabung pertama kemudian dimasukkan sampel sebanyak 1 mL dengan menggunakan

volume pipet 1 mL tertutup kapas, lalu dikocok agar sampel tercampur merata dengan aquadest,

namun pengocokkan harus dilakukan parlahan, agar tidak mengenai kasa tutup tabung.

Pengambilan sampel ini juga dilakukan dengan menyedot sampel menggunakan volume pipet

tertutup kapas, agar ketika sampel tidak sengaja tersedot hingga ke mulut maka bakteri akan

terjerat dikapas tersebut. Selanjutnya dari tabung pertama diambil 1 mL dengan menggunakan

volume pipet 1ml tertutup kapas lalu dipindahkan ke tabung kedua, lalu dikocok agar homogen.

Setelah itu dari tabung kedua juga diambil 1 ml menggunakan volume pipet 1 ml tertutup kapas

lalu dipindahkan ketabung ketiga, lalu dikocok agar homogen. Setelah itu dari tabung ketiga

diambil 1 ml menggunakan volume pipet 1 ml tertutup kapas, lalu dibuang agar volumenya sama

dengan tabung pertama dan kedua, sehingga didapat volume di setiap tabung yaitu 9 mL.

Setelah dilakukan pengenceran, yang selanjutnya dilakukan yaitu pembiakkan bakteri.

Pembiakkan bakteri ini menggunakan tiga cawan petri. Pembiakan dilakukan dengan mengambil

1 ml dari masing-masing tabung pengenceran untuk dilakukan penanaman atau plating pada

media NA secara aseptic yaitu selalu dekat dengan api. Plating atau penanaman bakteri adalah

proses pemindahan bakteri dari medium lama ke medium baru (Dwidjoseputro, 1978). Pada

penanaman bakteri dibutuhkan kondisi aseptis atau steril, baik pada alat maupun proses, untuk

menghindari kontaminasi, yaitu masuknya mikrobia yang tidak diinginkan. Media NA digunakan

karena merupakan media yang paling cocok untuk kultur bakteri.             Medium adalah bahan

yang mengandung campuran nutrisi yang bermanfaat untuk menumbuhkan mikroba. Medium

yang digunakan pada praktikum ini adalah Nutrient Agar (NA) termasuk kedalam medium

khusus karena di buat sebagai tempat menumbuhkan mikroba yang sudah diketahui komposisi

pembuatannya. NA di buat dengan komposisi agar – agar yang sudah dipadatkan sehingga NA

juga bisa disebut dengan nutrient padat yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri. Fungsi

agar – agar hanya sebagai pengental namun bukan zat makanan pada bakteri, agar dapat mudah

menjadi padat pada suhu tertentu. Hal ini sesuai dengan pendapat Dwidjoseputro (1994) yang

menyatakan bahwa medium Nutrient Agar adalah salah satu medium padat yang memiliki

komposisi yaitu agar – agar yang telah di panaskan dan mencair dengan suhu 950C. Agar – agar

adalah zat pengental dan bukan sebagai sumber makanan bagi bakteri. Menurut pendapat

Amelia., et all (2005) yang menyatakan bahwa agar – agar digunakan untuk membuat medium

padat, agar larut dan menjadi padat pada suhu 450C. NA lebih bersifat umum sehingga mikroba

banyak tumbuh pada media ini karena stuktur dari nutrient agar itu sesuai dengan tempat

mikroba tumbuh yaitu suhu dan kelembaban nya sehingga mikroba dapat cepat tumbuh pada

kondisi tersebut.

Setelah itu, ke dalam masing-masing cawan petri ditambahkan nutrient agar sebanyak 19 ml.

Lalu cawan digoyangkan di atas meja secara perlahan untuk menghomogenkan suspensi bakteri

serta mencegah tumpahnya agar. Setelah agar mengeras, hentikan pemghomogenan. Selanjutnya

cawan dibalik sehingga bagian tutup berada di bawah. Hal tersebut bertujuan untuk mencegah

jatuhnya air hasil kondensasi saat inkubasi ke dalam media yang dapat mengacaukan perhitungan

bakteri. Kemudian, cawan petri dibungkus menggunakan kertas koran untuk mencegah

masuknya kontaminan. Selanjutnya cawan petri diinkubasi selama kurang lebih 18 jam pada

suhu 37 ºC dalam keadaan terbalik. Inkubasi dilakukan selama kurang lebih 18 jam karena

jumlah mikroba yang dapat dihitung optimal setelah masa tersebut yaitu akhir inkubasi. Selama

masa inkubasi, sel yang masih hidup akan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung oleh

mata. Setelah 18 jam, cawan petri dikeluarkan dari inkubator untuk dihitung koloni bakteri yang

tumbuh dan diletakkan di atas kertas hitam untuk mempermudah melihat bakteri. prinsip metode

hitungan cawan yaitu jika sel jasad renik yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar,

maka sel jasad renik tersebut akan berkembang membentuk koloni dapat dilihat langsung dan

dihitung dengan mata tanpa mikroskop

Setelah dihitung, diperoleh data pada konsentrasi 10-7 terdapat …. Koloni bakteri, pada

konsentrasi 10-8 terdapat … koloni bakteri dan pada konsentrasi 10-9 terdapat …. Koloni bakteri.

Satuan yang  digunakan untuk menyatakan jumlah koloni atau bakteri adalah CFU/mL (CFU

= Colony Forming Units). Untuk menghitung jumlah koloni bakteri dalam 1 mL sampel dapat

dihitung dengan rumus

CFU = ……

Setelah dilakukan perhitungan, didapat bahwa jumlah koloni dalam 1 mL sampel adalah.. dan

rat-ratanya adalah… jumlah koloni bkateri pada konsentrasi …. Lebih banyak dari konsentrasi

… karena adanya pengaruh kontaminan dan pada pengenceran 10-7 dan 10-8 tidak homogen

atau tidak merata sehingga koloni bakteri tidak menyebar dan berkumpul di satu titik.

Dari data tersebut dapat dikatakan bahwa koloni bakteri yang ada dalam sampel masih berada di

batas normal yaitu kurang dari 300 koloni.