PARAMETER KUANTITATIF

1. Gangguan

Presisi pada beberapa pengukuran sinyal (yang berhubungan dengan

hasil pengujian) dipengaruhi oleh ukuran puncak (sinyal) yang berhubungan

dengan gangguan. Gangguan mengacu pada ketidakpastian dalam nilai

sinyal awal tanpa adanya analit. Terdapat 3 macam gangguan, yaitu pada

jangka pendek, jangka panjang, dan pergeseran awal. (diilustrasikan pada

gambar 14.2)

a. Gangguan jangka pendek (juga disebut sebagai high-frequency

noise) menjadi perhatian utama bagi sebagian pengukuran S/N. Jenis

gangguan ini dapat disebabkan oleh beberapa faktor seperti gangguan

pada detector, dorongan pada sistem pompa, dan gangguan elektronik

dalam sistem integrasi. Komponen gangguan ini (biasanya dengan

periodisitas > 1 Hz) dapat membatasi kemampuan pengukuran sinyal

dalam HPLC.

b. Gangguan jangka panjang (variasi sinyal dengan frekuensi < 0.1 Hz)

merupakan indikasi dari luar atau masalah pada sistem. Penyebab

gangguan ini termasuk:

Pencampuran komponen pelarut yang buruk sehingga

menyebabkan sedikit variasi pada fase gerak selama analisis

berlangsung

Variasi suhu

Kebocoran fase diam dari kolom (terutama selama elusi

gradien)

Senyawa akhir yang terelusi dari injeksi sebelumnya

c. Pergeseran awal (baseline drift), dapat dianggap sebgai tipe khusus

dari gangguan jangka panjang, dapat terjadi meskipun dalam metode

yang sudah dikembangkan dengan baik dan divalidasi. Tipe baseline

drift yang paling banyak terlihat adalah pada saat elusi gradien, di

mana komposisi pelarut berubah selama proses running, oleh karena

itu, respon detector (biasanya UV) dapat berubah sesuai fungsi dari

komposisi pelarut. Pengulangan garis dasar (baseline) dapat dibentuk

dan dapat dilakukan pengukuran panjang puncak dan area puncak

meskipun terbukti adanya pergeseran baseline yang disebabkan elusi

gradien.

Late-eluting peaks (puncak dari injeksi sebelumnya) dapat terlihat

sebagai baseline drift. Puncak-puncak tersebut dielusi sebgai pita yang

luas terkadang tidak dikenali dari baseline drift tipe yang lain. Masalah

baseline ini sering terjadi pada pemisahan isokratik ketika senyawa

akhir yang terelusi tidak dibersihkan dari kolom setelah proses

penginjeksian.

Baseline drift juga disebabkan oleh perubahan dalam detector.

Beberapa indeks refraktif detector yang sensitive terhadap perubahan

suhu; perubahan suhu dari sel detector dapat menyebabkan beberapa

pergeseran (drift) pada sinyal output. Selain itu,baseline drift juga

dapat terjadi pada detector UV yang disebabkan oleh erubahan

intensitas lampu atau diode detector atau phototube.

2. Panjang Puncak (Peak Height)

Cara yang paling mudah untuk menentukan respon detektor adalah

dengan melihat panjang puncak dari suatu sinyal. Panjang puncak

merupakan jarak antara dasar dan juga puncak (bagian teratas) dari suatu

puncak, dimana nilai pada dasar adalah rata-rata dari berbagai data dari awal

puncak hingga akhir. Untuk beberapa puncak yang tidak dapat ditentukan,

panjang puncak dapat ditentukan dengan menggunakan metode skimming

tangen. Metode ini hanya digunakan apabila terdapat puncak yang kecil

pada ujung yang berekor dari puncak sebelumnya. Pengukuran panjang

puncak merupakan prosedur yang mudah dan kebanyakan sistem data

terkini juga menghitung panjang puncak.

3. Luas Daerah puncak (Peak area)

Luas daerah puncak adalah teknik yang umum digunakan dalam

kuantisasi hplc. Luas daerah puncak didefiniskan sebagai integral dari

respons sinyal per waktu dimulai dari awal sampai dengan akhir puncak. Hal

ini relatif sejalan dengan teori. Akurasi dan presisi pengukuran luas daerah

puncak dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu :

penentuan dasar yang tepat, khususnya pada keberadaan panjang atau

pendeknya noise.

Penentuan awal dan akhir puncak. Hal ini sedikit sulit ditentukan

untuk daerah puncak yang tidak simetris.

Jumlah data point yang didapat harus cukup besar untuk membantu

akurasi daerah puncak yang sebenarnya.

Luas daerah puncak umumnya ditentukan menggunakan integrator atau

melalui sistem data komputerisasi. Luas daerah puncak juga dapat

ditentukan secara manual. Melalui sistem data komputer, luas daerah puncak

didapat melalui penjumlahan dari sinyal atau waktu perpotongan terhadap

puncak. Metode integrasi ini bisa memberikan hasil yang presisis jika

dilaksanakan dengan baik (biasanya, presisi lebih baik dari ±0,2% untuk

puncak dengan S / N 'besar.) Deteksi puncak untuk sistem data ini

kebanyakan didasarkan pada nilai ambang puncak untuk menentukan kapan

puncak dimulai dan diakhiri. Penentuan ambang puncak yang tidak tepat

dapat mempengaruhi akurasi dari kuantisasi. Setiap data sistem hanya

memiliki sedikit perbedaan, oleh karena itu sistem ini harus dipastikan

berjalan sebagaimana mestinya sehingga didapatkan hasil yang baik.

4. Kuantisasi Panjang Puncak vs Luas Daerah Puncak

Panjang puncak dan luas puncak dapat digunakan untuk kuantisasi

dalam HPLC, selama kalibrasi yang tepat dilakukan dalam metode yang

sama. Kuantisasi luas puncak banyak digunakan dalam HPLC namun

metode ini bukanlah yang terbaik. Untuk puncak yang hampir simetris,

panjang puncak lebih tepat dan akurat daripada pengukuran dengan luas

puncak. Seperti contoh : perubahan kecil pada laju alir (F) akan

mempengaruhi pengukuran panjang puncak (≤ F -0.2) kurang dari itu, akan

mempengaruhi pengukuran luasa puncak (F-1). Perubahan pada kondisi

kolom yang mempengaruhi jumlah plate (N) mempengaruhi pengukuran

panjang puncak tetapi tidak mempengaruhi pengukuran luas puncak. Pada

akhirnya, pengukuran panjang puncak merupakan metode yang lebih sering

digunakan untuk analisis kuantisasi. Semenjak resolusi yang tidak lengkap

dari analit target sering menjadi kendala, maka kuantisasi panjang puncak

lebih akurat karena sedikitnya gangguan yang ada dalam penentuan ukuran

puncak.