OPTIMASI FERMENTASI BATCH

Selama pengembangan proses batch, parameter pertumbuhan utama dapat ditentukan

yang memungkinkan produksi produk mikroba yang diberikan kepada dioptimalkan apakah

biomassa sendiri atau-spesifikasi c metabolit Parameter penting adalah hasil koefisien (Y)

yang ditentukan pada dasar kuantitas gizi rate limiting, biasanya sumber karbohidrat diubah

menjadi produk mikroba. Dalam hal biomassa, itu didefinisikan sebagai:

Pertumbuhan yang berkelanjutan kinetika

Awalnya, fermentasi kontinyu mulai sebagai budaya batch, namun pertumbuhan

eksponensial kemudian dapat diperpanjang inde fi nitely, dalam teori, melalui penambahan

terus menerus dari medium fermentasi segar.Reaktor terus diaduk dan volume konstan

dipertahankan dengan memasukkan over flow weir atau perangkat meratakan lain

(Fig.2.4). Media segar terus ditambahkan dan memindahkan volume yang sama

menghabiskan kaldu fermentasi dan sel-sel pada tingkat yang sama sebagai media segar

diperkenalkan. Kondisi steady state berlaku, di mana laju pertumbuhan sel mikroba sama

dengan tingkat di mana sel-sel yang mengungsi dari kapal.Seperti fermentasi batch, tingkat

yang spesifik di mana mikroorganisme tumbuh dalam budaya terus menerus dikendalikan

oleh ketersediaan hara tingkat-membatasi. Oleh karena itu, laju penambahan media segar

mengontrol tingkat di mana mikroorganisme tumbuh. Namun, tingkat pertumbuhan

sebenarnya tidak hanya tergantung pada fl ow tingkat volumetrik dari media ke dalam

reaktor, tetapi juga pada tingkat pengenceran (D). Ini sama dengan jumlah volume reaktor

melewati reaktor per satuan waktu dan dinyatakan dalam satuan waktu timbal balik, per jam.

Tingkat pertumbuhan dan tingkat hilangnya sel dari fermentor akan ditentukan oleh tingkat

masukan media. Jika tingkat pengenceran meningkat di atas   , Mencuci-out lengkap dari sel

terjadi, karena sel-sel memiliki insufisiensi waktu fi sien untuk 'ganda' sebelum dicuci dari

reaktor melalui atas aliran. Titik di mana ini hanya dihindari disebut sebagai tingkat

pengenceran kritis. Akibatnya, konsentrasi substrat sisa dalam reaktor dikontrol oleh tingkat

pengenceran. Setiap perubahan ini hasil tingkat pengenceran dalam perubahan tingkat

pertumbuhan sel-sel yang akan tergantung pada ketersediaan substrat pada tingkat

pengenceran baru. Dengan demikian, pertumbuhan dikendalikan oleh ketersediaan nutrisi

tingkat-membatasi.

Sistem ini, di mana konsentrasi nutrisi tingkat-membatasi memasuki sistem adalah

yang tetap, sering digambarkan sebagai chemostat, sebagai lawan untuk beroperasi

sebagai turbidostat, di mana nutrisi dalam medium tidak membatasi. Dalam hal ini

kekeruhan atau absorbansi budaya dimonitor dan dijaga pada nilai konstan dengan

mengatur tingkat pengenceran, yaitu konsentrasi sel tetap konstan. Pada tingkat

pengenceran rendah dengan konsentrasi substrat yang tetap, konsentrasi substrat sisa akan

rendah. Namun, seperti D pendekatan Mmax sisa meningkat konsentrasi substrat seiring

dengan laju pertumbuhan mikroorganisme. Selain Dcrit, konsentrasi substrat masukan akan

sama konsentrasi output, karena semua sel telah hilang dari sistem.Dengan demikian,

reaktor kontinu ini dapat digambarkan sebagai chemostat.The tinggi konsentrasi pakan

mengatur diri sendiri terbatas nutrisi, semakin besar konsentrasi biomassa dan konsentrasi

substrat sisa tetap konstan. Namun, semakin tinggi tingkat pengenceran, semakin cepat sel-

sel tumbuh, yang menghasilkan peningkatan simultan dalam konsentrasi substrat sisa dan

pengurangan konsekuen dalam konsentrasi biomassa mapan.

Metode penghitungan mikroskopis langsung

Jumlah sel dalam suspensi dapat diukur, kecuali untuk organisme filamen,

berdasarkan mikroskopis langsung jumlah, menggunakan Petroff-Hauser atau Neubauer -

jenis hitung ruang. Yang pertama adalah lebih cocok untuk menghitung bakteri.

Counter sel Elektronik

Electronic peralatan penghitungan sel juga cepat, tapi kebanyakan metode yang

lebih cocok untuk yang lebih besar uniseluler mikroba, seperti ragi, protozoa dan beberapa

ganggang, dan kurang berguna untuk memperkirakan bakteri. The Coulter

counter ,misalnya, digunakan untuk menghitung dan partikel ukuran, dan berdasarkan

pengukuran perubahan listrik yang dihasilkan oleh partikel non-konduktif ditangguhkan

dalam elektrolit. Metode ini melibatkan menggambar sebuah suspensi dari sel melalui

aperture kecil di mana arus listrik dipertahankan. Sebagai sel melewati melalui aperture

yang dipindahkan Volume sendiri pemilu trolyte dan perubahan hambatan listrik. Maskapai

perubahan terdeteksi dan dikonversi ke pulsa dihitung. Namun, pada dasarnya menghitung

partikel, dan quences berkala rentan terhadap kesalahan karena sel-sel menggumpal dan

adanya puing-puing partikulat.

Teknik Penghitungan Plat

Metode plate counting mendeteksi sel yang dapat bertahan hidup yang ditandai dengan

terbentuknya koloni pada medium padat. Dua metode yang sering digunakan adalah metode

tebar dan metode tuang.

Pada metode tebar, 0,1 mL sampel ditebar pada permukaan medium agar menggunakan

alat penyebar yang steril. Kemudian cawan disimpan pada suhu pertumbuhan optimal.

Semua koloni harus terpisah dengan baik dan mudah dihitung. Karena mikroorganisme

dengan toleransi rendah terhadap oksigen tidak dapat tumbuh, maka metode tuang lebih

sering digunakan. Biasanya 1 mL sampel diletakkan pada cawan petri yang sudah dicampur

dengan medium agar pada suhu 48-50°C dan memadat ketika diinkubasi. Hasil dari metode

tuang, perkembangan koloni mikroba seluruhnya terjadi di agar. Organism dengan toleransi

oksigen rendah dapat tumbuh. Koloni dari organism aerobic sering mempunyai ukuran yang

berubah-ubah dan tumbuh di dekat permukaan untuk mendapatkan asupan oksigen. Oleh

karena itu, sering kesulitan ketika ingin melihat persamaan morfologi antara koloni yang ada

di permukaan dengan yang ada di agar dan juga pehitungannya lebih sulit daripada metode

tebar. Perawatan media menentukan agar medium tidak terlalu panas, jika tidak beberapa

sel mikroba bisa terluka dan lambat dalam membentuk koloni atau bahkan mati.

Hasil yang tercatat, cawan hanya mengandung 30-300 koloni. Perhitungan konsentrasi sel

di sampel awal di masukkan ke dalam data pelarutan volume cawan. Kedua metode

tersebut diukur dalam satuan colony-forming unit (CFU). Hal ini bisa jadi tidak sama

dengan jumlah sel tergantung pada luasnya sekumpulan koloni dan morfologi selular

mikroorganisme. Teknik ini akurat tetapi membutuhkan minimal 1-2 hari inkubasi sebelum

koloni dapat dihitung.

Teknik turbidimetri dan spektofotometri

Metode ini sederhana, cepat dan cocok untuk memperkirakan total biomass. Metode ini

biasanya dilakukan pada panjang gelombang spesifik untuk setiap mikroorganisme. Metode

turbidimetri mengukur cahaya yang dihamburkan oleh suspensi sel, yang sebanding dengan

konsentrasi sel, sedangkan spektrofotometri menggunakan absorbansi dari suspensi sel.

Metode turbidimetri dan spektrofotometri membutuhkan kurva kalibrasi, yang disiapkan

menggunakan suspensi sel standard yang mengandung konsentrasi sel dan harus hati-hati

ketika menafsirkan hasil jika fermentasi mengandung partikulat.

Perkiraan berat kering

Metode ini menentukan berat dari total sel baik yang hidup maupun yang mati dalam sampel

kultur cair. Metode ini meliputi pemisahan biomass dari volume suspensi sel homogeny yang

sudah diketahui. Biasanya, hasil bisa didapatkan dengan penyaringan di bawah keadaan

vakum melalui penyaring membran dengan ukuran pori sebesar 0,2 µm atau µm. Penyaring

yang berisi kumpulan sel ‘dicuci’ dengan air untuk menghilangkan sisa medium

pertumbuhan dan dikeringkan sampai beratnya konstan di dalam oven dengan suhu 105°C.

Biasanya, hasilnya dinyatakan dalam mg sel/mL kultur. Tidak bisa dipungkiri kalau ada

bahan non suspensi yang ikut tersaring dan menyebabkan error. Batasan selanjutnya

adalah waktu yang dibutuhkan untuk mendapatkan hasil akhir dan volume sampel yang

relative tinggi dibutuhkan untuk mendapatkan biomass supaya berat yang didapatkan lebih

akurat.

ATP bioluminometri

ATP lepas dari sel yang telah mati dan sangat bermanfaat dalam penentuan konsentrasi

mikroorganisme yang bertahan hidup. Jumlah ATP dalam sampel dapat diukur

menggunakan ATP bioluminometer. Teknik ini memanfaatkan enzim-substrat kompleks,

seperti luciferase-luciferin yang didapatkan dari kunang-kunang, Photinus pyralis, yang

dapat menghasilkan cahaya foton pada setiap molekul ATPnya. Ketika cairan luciferase-

luciferin ditambahkan pada ekstrak ATP dari sampel suspensi sel, cahaya yang dikeluarkan

dapat dideteksi oleh bioluminometer. Hasilnya berupa sinyal yang dapat dibaca dan

dinyatakan sebagai keluaran data digital.

ATP + O2 + luciferin oxyluciferin + AMP + CO2 + PPi + cahaya foton (562

nm)

Prosedur ini sangat cepat dan sensitif. Alat ini dapat mendeteksi sampai 10 femtomol

ATP (1 femtomol = 10-15mol). ATP bioluminometer adalah alat yang paling cocok untuk

mengukur sampel yang tidak berwarna secara langsung. Karena metode ini sangat sensitif,

sampel sangat membutuhkan pelarutan.

Perkiraan secara on-line

Pengawasan fermentor secara on-line memberikan perkiraan biomass pada waktu yang

sebenarnya dan meminimalisir analisis ulang. Sistem pengawasan meliputi densitas optic

atau kapasitas pemeriksaan dan juga pada kebanyakan proses fermentasi, mikroorganisme

membutuhkan oksigen dan menghasilkan karbondioksida. Dalam kasus tersebut, secara

teori dapat menentukan hubungan antara faktor dan konsentrasi biomass dalam reactor.

Oleh karena itu, perkiraan konsentrasi biomass dan produk pembentukan dapat dibuat

lucifera

dengan mengukur parameter-parameter tersebut menggunakan detektor karbondioksida

atau oksigen dan biosensor yang ditangkap oleh komputer. Metode ini memberikan

perkiraan akurat dari konsentrasi biomass.

Pemantauan pertumbuhan mikroba dalam kultur

Selama fermentasi sebuah, metode yang diperlukan untuk penentuan rutin populasi

mikroba, jumlah sel dan / atau biomassa, dalam rangka untuk memonitor

kemajuannya. Banyak metode langsung dan tidak langsung yang tersedia untuk tujuan

ini. Prosedur langsung melibatkan penentuan berat kering, menghitung sel dengan

mikroskop dan menghitung piring metode. Metode tidak langsung meliputi turbidimetri,

spektrofotometri, estimasi komponen sel (protein, DNA, RNA atau ATP), dan pemantauan

online produksi karbon dioksida atau pemanfaatan oksigen.