MOLEKUL-MOLEKUL3.2. Produksi metanol Ekstrak dari Tongkol Jagung (MEC)

Sampel jagung segar, dibeli di pasar lokal, yang dibersihkan, dicuci, dan biji-bijian yang benar dilucuti untuk menghindari kontaminasi benih. Mereka lanjut berukuran kecil-kecil, kering, dan membumi menjadi tepung. Sebuah metanol (160 ml) ditambahkan ke 10 g bubuk tongkol jagung dan diaduk dalam gelap dan pada 22 ° C selama 24 jam. Setelah itu, pelarut diuapkan dan massa tetap (~1,7 g) terus terlindung dari cahaya dan digunakan untuk analisis lebih lanjut.

3.3. In Vitro Antioksidan Tes3.3.1. Total Kapasitas Antioksidan (TAC)

Metode pengujian didasarkan pada pengurangan molibdenum VI (Mo+6) untuk Mo+5 dengan sampel dan pembentukan selanjutnya dari fosfat hijau / Mo+5 kompleks dalam larutan asam. Sampel yang diinkubasi pada 95 °C selama 90 menit; tabung berisi larutan pereaksi (asam 0,6 M sulfat MEC dan, 28 mM natrium fosfat dan 4 mM ammonium molibdat). Setelah campuran telah mendingin ke kamar suhu, absorbansi setiap solusi diukur pada 695 nm terhadap kosong. Antioksidan kapasitas dinyatakan sebagai mg asam askorbat setara/g sampel.

3.3.2. The Hydroxyl Radical Scavenging ActivityHidroksil aktivitas scavenging radikal MEC diselidiki menggunakan reaksi

Fenton sebagai dasar pengujian. Hasil dinyatakan sebagai tingkat penghambatan. Radikal hidroksil yang dihasilkan menggunakan metode yang dijelaskan sebelumnya dalam 3 mL 150 mM penyangga natrium fosfat (pH 7,4) yang mengandung 10 mM FeSO4 × 7H2O, 10 mM EDTA, 2 mM natrium salisilat, 30% H2O2 dan untuk menilai aktivitas sampel jumlah yang berbeda dari MEC (0; 20; 40; 80; 120; 160; 300 mg / mL) yang digunakan. Dalam kontrol, penyangga natrium fosfat diganti H2O2 tersebut. Solusi diinkubasi pada 37 °C selama 1 jam, dan pemantauan absorbansi pada 510 nm.

3.3.3. The superoksida radikal Scavenging ActivitySuperoksida uji radikal didasarkan pada kapasitas MEC (0; 2,5; 5,0; 10; 20; 40;

50 ug/mL) untuk menghambat pengurangan fotokimia nitroblue tetrazolium (NBT) di riboflavin-NBT cahaya-sistem. Setiap campuran 3 mL reaksi berisi 50 mM bufer fosfat (pH 7,8), 13 metionin mM, 2 mM riboflavin, 100 mM EDTA, 75 mM NBT, dan 1 sampel mL solusi. Setelah 10 menit penerangan dengan sumber cahaya neon, produksi formazan biru dipantau sebagai absorbansi meningkat pada 560 nm. Seluruh perakitan reaksi tertutup dalam sebuah kotak dilapisi dengan aluminium foil. Tabung identik dengan campuran reaksi disimpan dalam gelap dan menjabat sebagai kosong.

3.3.4. Ferri ChelatingIon besi kemampuan sampel chelating diselidiki sesuai yang dijelaskan

sebelumnya. Secara singkat, campuran reaksi yang berisi sampel (0; 20; 40; 80; 120; 160; 300 mg/mL), FeCl2 (0,05 mL, 2 mM) dan ferrozine (0,2 mL, 5 mM) dicampur dengan baik dan diinkubasi selama 10 menit pada ruang temperatur. Absorbansi campuran diukur pada 562 nm terhadap kosong.

3.3.5. Mengurangi DayaSecara singkat, 4 mL campuran reaksi yang mengandung konsentrasi yang

berbeda MEC atau askorbat asam (0; 20; 40; 80; 120; 160; 300 mg / mL) di 0,2 M penyangga fosfat (pH 6,6), diinkubasi dengan kalium ferricyanide (1% b/v) pada 50 ° C selama 20 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan larutan TCA (10% b/v). Solusinya adalah kemudian dicampur dengan air suling dan klorida (0,1% b/v) solusi, dan absorbansi diukur pada 700 nm.

3.3.6. DPPH AssayKemampuan hidrogen menyumbangkan atau pembersih radikal untuk DPPH

stabil radikal dalam metanol sebuah solusi diukur dalam pengujian ini. Solusi metanol DPPH (3 mL, 4×10-6 mol/L) ditambahkan 1 mL dari MEC atau kontrol positif (0; 0,5; 1; 2,5; 5; 10; 15 ug/mL) dilarutkan dalam metanol. Penurunan absorbansi pada 517 nm ditentukan setelah 30 menit dalam kegelapan.

3.4. Dalam Vivo Antioksidan TesTikus Wistar (200-220 g) yang digunakan dalam program studi ini. Setelah periode

aklimatisasi, tikus secara acak dibagi menjadi empat kelompok enam masing-masing. Kelompok pertama (kontrol tidak diobati) menerima garam (0,9%, w/v) setiap hari oleh gavage oral. Tikus kedua menerima CCl4: mineral oil (1: 1, 2 mL/kg bb/hari, sc). Kelompok ketiga menerima dosis oral harian vitamin E (50 mg/kg berat badan). Kelompok keempat adalah diberikan dosis oral harian MEC dalam larutan garam (100 mg/Kg bb). Selain itu, tikus dari ketiga dan kelompok keempat diberikan bersamaan dengan CCl4: mineral oil (1: 1, 2 mL/kg bb/hari, sc) di hari alternatif setelah 30 menit dari MEC atau administrasi vitamin E. 24 jam setelah pemberian CCl4 terakhir, di hari ke 21, hewan-hewan itu eutanasia dengan 20 mg / Kg thiopental (0,5 g Thiopenthax, Cristália, São Paulo, Brazil). Sampel darah mereka dikumpulkan oleh tusukan jantung dalam tabung berisi sitrat dan disentrifugasi (3000 g, 15 menit, 4 ° C) dan plasma itu tetap pada -20 ° C untuk analisis lebih lanjut. Liver tikus dibedah segera kematian mereka, membeku dalam es kering dan disimpan pada -80 ° C sampai digunakan untuk analisis.

3.4.1. Penentuan Jumlah Kapasitas antioksidan Serum dan hati homogenatUntuk determinate kapasitas antioksidan sampel dari tikus kami melakukan Trolox

sebuah setara kapasitas antioksidan (TEAC) assay seperti yang dijelaskan sebelumnya [53]. Secara singkat, 7 mM 2,20-azinobis-(3-etil-benzothiazoline-6-sulfonat) (ABTS, 5 mL) ditambahkan ke 140 mM kalium persulfat (0,088 mL). Setelah 12 jam dalam gelap (25 ° C) larutan ini diencerkan dengan etanol (98%) ke absorbansi dari 0,7 ± 0,05 pada 734 nm. Dua mL larutan ABTS diencerkan ini telah ditambahkan ke sampel (0,02 mL). Absorbansi diukur 6 menit setelah di 734 nm. TEAC dinyatakan sebagai pM Trolox setara per mg protein.

3.4.2. Malonaldehid (MDA) Tingkat Untuk menilai peroksidasi lipid, produksi MDA diukur dengan reaksi asam

thiobarbituric. Hati, sekitar 1 mg, dihomogenisasi dalam es dingin solusi 0,15 M KCl (9 mL) dan disentrifugasi (10.000 g, 20 menit, 4 ° C). Sebuah alikuot dari supernatan yang dihasilkan (0,25 mL) ditambahkan ke thiobarbituric larutan asam (1,5 ml 1% H3PO4 dan 0,5 ml 0,6% asam thiobarbituric). Setelah 45 menit pada 100 ° C di mandi air, n-butanol (2 mL) ditambahkan dan sampel diaduk dan disentrifugasi (10.000 g, 4 ° C, 15 menit). Lapisan butana absorbansi diukur pada 520 nm (L1) dan 533 nm (L2) (Genesys 10s, UV-Vis, Thermo Scientific, Madison, WI, USA). MDA jumlah ditentukan sebagai L2-L1 dan dinyatakan sebagai nmol/g jaringan hati.

3.4.3. Katalase KegiatanAktivitas katalase dari ekstrak hati tikus diukur menurut metode Aebi. Hilangnya

hidrogen peroksida diamati menggunakan spektrofotometer (240 nm, 1 menit, 25 ° C). Aktivitas enzim ditentukan dengan menggunakan koefisien kepunahan 0,043/mM/cm-1. Satu unit kegiatan sesuai dengan mmol H2O2 hancur/min/mg protein.

3.4.4. Superoxide Dismutase (SOD) KegiatanAktivitas SOD dari ekstrak hati tikus diuji spektrofotometri seperti yang

dijelaskan. Satu Unit SOD mewakili jumlah enzim yang dibutuhkan untuk menghambat laju NBT oksidasi oleh 50%. Kegiatan tersebut dinyatakan sebagai satuan/mg protein.

3.5. MTT AssaySel HeLa ditumbuhkan dalam termos budaya di media DMEM dengan 10% janin

bovine serum. Sel berlapis ke piring 96-baik dengan kepadatan 5 × 103 sel / baik dan diizinkan untuk melampirkan untuk semalam pada 37 ° C dan 5% CO2. Dalam uji antiproliferatif, MEC ditambahkan (0; 2,5; 5,0; 10; 20; 40; 50 ug / mL). Setelah 72 jam inkubasi, jejak ekstrak dihilangkan dengan mencuci sel-sel dengan PBS dan media segar dan 10 uL 12 mM 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) dilarutkan dalam PBS ditambahkan untuk menentukan dampak dari sampel pada proliferasi sel. Sel-sel kemudian diinkubasi selama 4 jam pada suhu 37 ° C dan 5% CO2. Untuk melarutkan produk MTT berkurang, isopropanol (100 uL) yang mengandung 0,04 N HCl ditambahkan ke setiap baik dan dicampur menggunakan sebuah pipettor multichannel. Dalam 1 jam Selain HCl-isopropanol, absorbansi pada 570 nm dibacakan menggunakan Multiskan Pendakian Microplate Reader (Thermo Labsystems, Franklin, MA, USA). Persen proliferasi sel dihitung sebagai berikut:

Proliferasi sel(%)=|.|570 nmdari sampel|.570|nmdari kontrol

× 100

3.6. Western Blot (imunoblot)Teknik barat blot dipekerjakan untuk mengevaluasi pengaruh ekstrak dalam jumlah

protein yang berhubungan dengan sistem antioksidan enzimatik dan kematian sel apoptosis. Secara singkat, 2×105 sel / baik dikultur di piring enam dengan baik. MEC telah ditambahkan ke budaya menurut uji diperlukan. Setelah pengobatan, sel dikumpulkan dan kemudian segaris dengan penyangga lisis (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO3, 10 mMNaF, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 25 ug / mL aprotinin, dan 25 mg / mL leupeptin) dan terus es. Lisat kemudian disentrifugasi pada 12.000×g pada 4 ° C selama 20 menit; supernatan disimpan pada -70 °C sampai digunakan. Konsentrasi protein ditentukan dengan metode Bradford. Aliquot dari lisat yang dipisahkan oleh 12% SDS-PAGE dan ditransfer ke membran nitroselulosa menggunakan Transfer penyangga (192 mM glisin, 25 mM Tris-HCl, pH 8,8, dan 20% metanol (v / v)). Setelah memblokir dengan 5% tanpa lemak kering susu, membran diinkubasi selama 2 jam dengan antibodi primer, dan kemudian dengan 30 menit dengan antibodi sekunder dalam susu yang mengandung tris-buffered saline (TBS) dan 0,5% Tween. Anti-manusia Procaspase-3, Bcl-2, Bax, PKC, katalase, MT, SODMn dan antibodi β-aktin (Sel Signaling Technology, Inc, Danvers, MA, USA) digunakan pada pengenceran 1: 1000 sebagai antibodi primer, sementarahorseradish peroksidase-conjugated kuda anti-kelinci IgG (Sigma Kimia, St Louis, MO, USA) adalah digunakan pada 1: 5.000 pengenceran sebagai antibodi sekunder. Membran kemudian terkena, dan protein band yang terdeteksi menggunakan ditingkatkan chemiluminescence. Semua bahan kimia yang digunakan adalah penelitian kelas.

3.7. Analisis statistikSemua data yang dinyatakan sebagai berarti standar ± dari quadruplicates

pengukuran. Setiap percobaan adalah dilakukan minimal tiga kali. Analisis statistik dilakukan oleh satu arah ANOVA menggunakan SPSS Versi statistik 17,0-2.008 software. Mahasiswa-Newmans-Keuls post-tes dilakukan untuk beberapa perbandingan kelompok. Dalam semua kasus, signifikansi statistik yang ditetapkan sebesar p <0,05.