Validasi Metode Mikrobiologi

A. Akurasi (Kecermatan)

1. Definisi:a. Akurasi adalah kemampuan metode untuk mengukur dan mendeteksi nilai aktual atau nilai sebenarnya dari mikroorganisme target dalam sampel.b. Akurasi merupakan ukuran ketepatan atau kedekatan hasil pengujian dengan hasil yang sebenarnya.

2. Perhitungana. Recovery (Persen perolehan kembali)

b. Galat Reatif

c. Recovery Relatif

Keterangan:H= Hasil metode ujiA= Hasil teoritisB= Hasil metode baku

3. Cara Pengujiana. Spiked-Placebo Recovery Methodb. Standard Addition MethodMenggunakan 9 kali pengukuran (3 level konsentrasi dengan 3 replikasi)

Tabel 1. Contoh Perhitungan Akurasi dan Recovery MetodeGalur BakuJumlah Angka Lempeng Total

TeoritisMetode UjiMetode Baku

I125126127

II12512011

III125120118

IV125120128

V125132131

Rata-rata125125125

B. Presisi (Keseksamaan)

1. Definisi:a. Presisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil pengujian individual dengan hasil rata-rata pengujian berulang pada sampel yang homogeny dengan kondisi pengujian yang sama.b. Presisi: keterulangan (repeatability), ketertiruan (reproducibility), kesekasamaan antara (intermediate precision)

2. Cara PerhitunganSimpangan baku relative (Relative Standard Deviation=RSD) untuk intermediate precision

Keterangan:ai dan bi= hasil pengujian I (1,2,3,,n)xi= rata-rata = 1/n (log ai+log bi)P= jumlah sampel yang diuji

NoALT (cfu/mL)logaritmaRata-rata (I)Selisih (II)(II/I)2

abaB

193861,96851,93451,95150,03400,000303

234301,53151,47711,50430,05440,001306

398731,99121,86331,92730,12790,004404

489831,94941,91911,93420,03030,000246

51161042,06452,01702,04070,04750,000540

61681562,22532,19312,20920,03220,000212

762561,79241,74821,77030,04420,000623

838281,57981,44721,51350,13260,007679

93303002,51852,47712,49780,04140,000275

10230020403,36173,30963,33570,005210,000244

0,015832

RSD= = 0,0281KV= 100 x RSD = 2,81 %

C. Sensitifitas dan Spesifisitas

1. Definisia. Sensitifitas (Kepekaan): Kemampuan metode untuk mendeteksi/mengukur mikroorganisme target dalam jumlah sekecil mungkin.b. Spesifisitas (Kemenjenisan): Kemampuan metode untuk mendeteksi/mengukur mikroorganisme tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya mikroorganisme asing atau bahan/matriks lain.

2. Cara Perhitungana. Sensitifitas: Fraksi koloni/kultur yang positif pada uji konfirmasi terhadap pengujian presumtif.b. Spesifisitas: Fraksi koloni/kultur yang negatif pada uji konfirmasi terhadap pengujian presumtif.c. Selektifitas: Logaritma fraksi koloni/kultur yang positif pada uji konfirmasi terhadap jumlah pengujian

Uji KonfirmatifUji PresumtifJumlah

Positif (+)Negatif (-)

Positif (+)aba+b

Negatif (-)cdc+d

Jumlah ujia+cb+da+b+c+d=n

Sensitifitas= a/(a+b)Spesifisitas= d/(c+d)Rasio positif palsu= c/(a+c)Rasio negative palsu= b/(b+d)Efisiensi= (a+d)/nSelektifitas absolut= RS= log (a/n)Selektifitas apparent= F= log [(a+c)/n)]

Uji KonfirmatifUji PresumtifJumlah

Positif (+)Negatif (-)

Positif (+)2508258

Negatif (-)20120140

Jumlah uji270128398

Sensitifitas= 250/258= 0,97Spesifisitas= 120/140= 0,86Rasio positif palsu= 20/270= 0,07Rasio negative palsu= 8/128= 0,06Efisiensi= 370/398= 0,93Selektifitas absolut= RS= log (250/398)=Selektifitas apparent= F= log [270/398]= 0,1685

D. Rentang Hasil Pengujian

1. Rentang menunjukkan nilai terendah dan tertinggi hasil pengujian yang dapat ditentukan dengan cermat dan seksama.2. Batas Terendah (Lower Limit) adalah hasil analisis/pengujian terendah yang ditandai dengan galat analisis 20,0% dari rata-rata (pengukuran minimal 3 kali)

ALT (cfu/lempeng)Galat BakuGalat relative (%)

103,1631,6

153,8725,8

204,4722,8

255,0020,0

275,2019,2

295,3918,6

305,4818,3

3. Batas Tertinggi (Upper Limit) adalah hasil analisis/pengujian koloni tertinggi yang masih dapat dihitung dengan cermat dan seksama ditandai dengan galat analisis 15,0% dari rata-rata (pengukuran minimal 3 kali)

4. Rentang Hasil Pengujian (Lempeng Agar)a. Sampel makanan dan obat-obatan: 25-250 cfu/lempengb. Sampel air: 30-300 cfu/lempengc. Kapang: 8-80 koloni/lempeng

E. Robustness (Ketangguhan)1. Pengujian ketangguhan sebenarnya harus dilakukan pada saat fase pengembangan metode dan tergantung pada factor-faktor yang berpengaruh pada pengujian.2. Jika pengujian sangat peka terhadap perubahan dalam kondisi analisis, maka kondisi pengujian hendaknya dikendalikan atau dilakukan dengan penuh kehati-hatian.3. Jenis keragaman kondisi pengujian yang harus diperhatikan:a. Stabilitas sampelb. Pengaruh suhu inkubasic. Pengaruh waktu inkubasid. Kondisi aerobic atau anaerobic (untuk pengujianmkroba tertentu)e. Pengaruh jenis media (nutrisi), dll4. Hasil pngujian dievaluasi secara statistika menggunakan ANOVA atau Algoritma dari Yate

F. Syarat Sampel untuk Uji Validasi1. Untuk metode analisis kualitatif, sampel yang digunakan terdiri dari 3 macam sampel: sampel yang tidak dikontaminasi, sampel yang sengaja dikontaminasi pada jumlah yang mendekati batas limit deteksi (low contamination level), sampel yang sengaja dikontaminasi pada jumlah yang tinggi (high contamination level). Low contamination level berkisar 1-5 cfu/25g sampel sedangkan high contamination level 10-50 cfu/25 g sampel.2. Untuk metode analisis kuantitatif, maka sampek dibagi 4, yaitu 1 sampel tanpa inokulasi, dan 3 sampel masing-masing dengan low, medium, dan hig contamination level. Low contamination level berada pada batas limit deteksi, medium contamination level kira-kira dengan jumlah 1 log lebih tinggi, dan high contamination level kira-kira dengan jumlah log lebih tinggi.