5. metode mikrobiologi

8/11/2019 5. Metode mikrobiologi

1/34

METODE DALAM

MIKROBIOLOGI


2/34

Preparat basah dan preparatgantung

-dapat memeriksa karakteristik sel

hidup : motilitas, bentuk, susunan

Preparat terfiksasi

Dibuat mll pengeringan dan

pemanasan spesimen. Hapusan

diwarnai menggunakan pewarnaan

untuk mendapatkan visualisasi sel

atau bagian sel.

PREPARASI SPESIMEN


3/34

Fiksasi menempel pada permukaan slide dg:

bahan kimia : metanol, formalin (1 mnt)

panas : dipanaskan melewati slidepada bunsen ( 1 menit)

Tujuan pengeringan dan fiksasi: membunuh

mikroba, melekatkan pada slide, memeliharabentuk dan ukuran sel serta mengawetkan

sel


4/34

Kenapa kita harus mewarnai bakteri ?

Mikroba tidak berwarna susah dilihat dgmikroskop cahaya

Sel mikroba dan struktur

internalnya lebih dpt dilihatdi bwh mikroskop cahaya

Kontras antara struktur spesimen

dan latar belakang

Pewarnaan


5/34

Apakah zat warna itu ???

Pewarna adalah suatu substansi yang melekatpada sel dan memberikan sel menjaadi berwarna

Adanya warna membuat sel menjadi kontras dan

jelas sehingga mudah terlihat

Pewarnaan yang berbeda mempunyai afinitas ygberbeda pada organisme berbeda atau padabagian berbeda pada suatu organisme

Pewarna digunakan untuk diferensiasi tipeorganisme yg berbeda untuk melihat ke khasanbagian organisme


6/34

Prinsip pewarnaan

Pengecatan utk mikroskop cahaya garam

Kation (+)

Anion (-)

Kromofor berikatan dengan bahan kimia melalui :

ikatan hidrogen, ikatan ion, ikatan kovalen.

Pewarnaan :

Pewarnaan positif :Zat warna berikatan dg spesimen

Pewarnaan Negative : Zat warna tidak ber ikatan dg

spesimen tetapi mewarnai sekitar spesimen

ex: pewarnaan kapsul


7/34

ex : metilen biru klorida

kation kromofor : metilen

biru berikt dg molekul sel

bermuatan - DNA,

protein

anion kromofor : klorida

pewarna asam : kromofor anion

- mewarnai struktur bersifat basa, bekerja sangatbaik pada kondisi asam

- digunakan untuk pewarnaan negatif (-)

Contoh: eosin, fuchsin acid

Pengecatan basa : Kromofor kation

- mewarnai struktur bersifat asam, bekerja sangat

baik pada kondisi basa

contoh: malachite green, safranin, kristal violet,dll

- lebih banyak digunakan di bidang mikrobiologi


8/34

1. PEWARNAAN SEDERHANA

Terdiri dari pewarnaan tunggal,

ex : basa tunggal : kristal violet, safranin , metilen blue

asam tunggal : asid Fuchsin, dll.

Digunakan untuk menentukan ukuran, bentuk dan

susunan sel

Sederhanamemberikan zat warna 3060 detikdibilas dengan air

langsung diamati

JENIS JENIS PEWARNAAN :

paling sederhana, zat warna

ditetes setetes demi setetes

pada slide


9/34

2. PEWARNAAN DIFERENSIAL

Sering digunakan dalam mikrobiologi

Menggunakan lebih dari satu zat warna, shg

komposisi kimia sel, struktur sel dpt dibedakan

secara mikroskopis

Pewarnaan diferensial yang umum :

- pewarnaan Gram- tahan asam

- endospora.


10/34

2.1. Pewarnaan Gram

Dikembangkan oleh orang Denmark yi Hans Christian

Gram.

Membedakan 2 kelompok besar bakteri berdasarkan

dinding sel yaitu

Gram positif (+) unguGram negatif (-) pink

Tahap awal dalam teknologi laboratorium medis untuk

mengidentifikasi patogen

Prosedur pewarnaan Gram memberikan hasil yang

terbaik pada sel bakteri yang muda (umur 24 jam). Sel

Gram + yang tua mudah tercuci sehingga memberikan

warna pink seperti sel Gram


11/34

Gm(+) and Gm(-) both take up CV-I equivalently

CV-I is not readily removed from Gm(+) due to the

reduced porosity of the thick cell wall

CV-I is readily removed from Gm(-) thin peptidoglycan

due perhaps to the discontinuities in the outer

membrane structure introduced during the

decolorization step.

-removal of the cell wall (with lysozyme) from a

Gm(+) bacterium results in a Gm(-) stain profile

Gram stain distinguishes Gram+ from Gr


12/34

Teknik Pewarnaan Gram


13/34

Color ofGram + cells

Color ofGram cells

Pewarna utama:

Crystal violet

Purple Purple

Mordant:

Iodine

Purple Purple

Decolorizing agent:

Alcohol-acetone

Purple Colorless

pewarna penutup:

Safranin

Purple Red


14/34

4 Result: Gram-positive cells remainpurple, Gram-negative cells are pink.

Organisme Gram (-) terlihat

berwarna pink karena ditutupi

dg safranin.

Akibat kehadiran lipid yg tinggi

, setelah pencucian dg alkohol,

porositas dinding selbertambah, kompleks CVI

(Crystal violet -Iodine) dapat

lewat. Sehingga pewarna

utama tidak menempel


15/34


16/34

Pewarnaan untuk mewarnai sel Mycobacterium dan

Nocardia penyakit tbc, lepra, infeksi kulit danparu-paru, dll.

Dinding sel lipid yang banyak sehingga tidak

bisa diwarnai dengan pewarnaan sederhana biasa

maupun dengan pewarnaan Gram

Lab mikrobiol. memvariasi prosedur pewarnaan tahan

asam yang dikembangkan oleh Franz Ziehl dan Friedrich

Neelsen th 1883

2.2. Pewarnaan Tahan Asam


17/34

Sel yang tidak tahan asam akan kehilangan zat warna

bila dicuci dengan alkohol asam dan biasanya diberi zat

warna penutup (dengan warna berbeda) untuk

melihatnya.

Kehadiran batang tahan

asam atau acid-fast rods(AFRs)

pada sputum infeksi

mikobakteria

Metilen blue mewarnai sel tercuci (sel tidak tahan

asam (biru) termasuk jaringan dan

sel manusiaSel tahan asam mengandung lipid dan lilin yang tebal

pada dinding selnya yi asam mikolat


18/34

2.3. Pewarnaan Endospora

Beberapa sp Bacillusdan Clostridium menghasilkan

endospora penyebab antraks, gangrenedan tetanus.

Endospora tidak dapat diwarnai dengan prosedur

pewarnaan normal

dinding sel impermiabel thd hampir semua bhn kimia

Pewarnaan endospora SchaefferFulton butuh panas u

membantu pewarnaan primer malachite green masuk

ke endospora.

Setelah dingin, slide didekolorisasi dengan air dan

diberi warna penutup safranin.

Sel endospora hijau , sel vegetatif merah


19/34

Sel endospora hijau

sel vegetatif merahRAO.pptx

3. PEWARNAAN KHUSUS- Pewarnaan khusus merupakan pewarnaan sederhana

yang didesain untuk struktur mikroba tertentu.

Pewarnaan negatif

- 3 tipe pewarnaan khusus pewarnaan flagelapewarnaan fluoresensi

3.1.

Pewarnaan Negatif

Pewarnaan asam tidak terikat dgn muatan-pd perm. sel

tidak mewarnai sel
http://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_1/RAO.pptxhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_1/RAO.pptx


20/34

Pewarnaan negatif latar belakang dan sel tidak

terwarnai.

Contoh: eosin dan nigrosin.

Mewarnai sel diperlukan zatwarna penutup.

Pewarnaan Negatif Kapsul Bermuatan (-)

Pewarnaan Kapsul Daerah Halogen

3.2. Pewarnaan Flagela

Tidak dapat dilihat secara normal dg

mikroskop cahayaFlagela

Identifikasi sp. Bakteri


21/34

Pewarnaan Pararosanaline dan karbol fuchsinMordant. ex: asam tanat dan

potasium alum

- berikt dg flagel

- menambah diameter

- merubah warna


22/34


23/34

Teknik Laboratorium untuk Klasifikasi dan

Identifikasi Mikroba

a. Karakteristik Fisik

-Karakteristik fisika makroskopis & mikroskopis

a. Makroskopis: koloni,ukuran ,warna,dll

b. Mikroskopis : sel, ukuran, bentuk hifa, endospora,

flagela dll

- Karakteristik pewarnaan diferensial

b. Karakteristik Pewarnaan Diferensial

Ex: Gram + atau Gram, Kapsul, endospora, dan lain-lain

c. Karakteristik pertumbuhan

Uji biokimia

Berdasarkan kemampuan menggunakan/ prod.

senyawa kimia tertentu.

ex : fermentasi karbohidrat


24/34

- Perbedaan komposisi asam lemak pada mikroba METODE NESTE

- API 20E, menggunakan plat plastik memp. cupule

mengandung medium

API 20E
http://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_1/METODE%20NESTER.pdfhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_1/METODE%20NESTER.pdfhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_1/METODE%20NESTER.pdfhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_1/METODE%20NESTER.pdf


25/34

Medium didesain utk mendeteksi enzim

urease yang mendegradasi urea

menghasilkan karbondioksida dan amonia,

pH indicator that turns bright pink in alkalineconditions.

Triple Sugar Iron (TSI) Test

Antimicrobial Sensitivity Test

Pada beberapa kasus, uji biokimia dapat dilakukan tanpa

mengkultur organisme contoh :-Breath test mrp uji kehadiran urease

digunakan untuk mendeteksi Helicobacterpylori


26/34

Interaksi mikroba dengan antibodi tes serologi)

Fungsi : membedakan antar spesies dan dlm 1 sp,

kadang-kadang strain. ex : E. coliO157 : H7

- System otomatis (microscan). Berdsrkan hasil uji

biokimia pada plat plastik dengan melihat perubahan

warna


27/34

antibodi merupakan protein sistim imun yang beriktan

sgt spesifik dengan antigen target.

Mikroba umumnya antigenic (merangsangrespon imun untuk menghasilkan antibodi)

Antibodi diisolasi dari serum host,

konsentrat antibodi dlm bentuk larutan antiserum

Antiserum berikatan dgn antigen produksi.

Tes aglutinasi

Anti serum + sampel sel target

sel antigen ada

aglutinasi (+)

Sel antigen tidak ada

aglutinasi (-)


28/34

Analisis Asam lemak

Tipe dan jumlah asam lemak penyusun membran pada

tiap jenis bakteri berbeda

Sel bakteri ditumbuhkan dan diberi Sodium

hidroksida dan metanol utk melepas asam lemak dan

merubahnya menjadi bentuk metil ester volatil (FAME

stands for fatty acid methyl ester).

FAME dianalisa dengan gas kromatografi

Kromatogram dibandingkan utk mengetahui spesies

isolat


29/34

Karakteristik genotip

Karakteristik genotipik digunakan untuk identifikasi

mikroorganisme yang sulit dikultur

Probes asam nukleat

digunakan utk mendeteksi urutan as. Nukleat spesifik

yang mencirikan spesies

Polymerase chain reaction PCR)

Digunakan untuk memperbanyak urutan nukleotida

spesifik mikroba dari sampel ex: cairan tubuh, tanah,

makanan dan air

Sampel harus diberi preparasi untuk mengeluarkan

dan mendenaturasi DNA

Membutuhkan primer spesifik yg telah diketahui


30/34

Cara memperoleh kultur murni

Kultur murni: suatu populasi organisme (koloni)

berasal dari suatu progenitor (induk) tunggal.

Progenitor berasal dari kultur murni derivat dari sel

tunggal atau sel yg sama.

progenitor = Colony forming unit (Cfu)

Media, instrumen hrs steril, bebas dr kontaminasi

Dasar-dasar untuk mendapatkan kultur murni:

- Penggunaan teknik aseptis- Kultivasi bakteri pada agar padat (agar base)

- Metode untuk memisahkan sel secara individu


31/34

Teknik isolasi

1. Streak plate: cara goresan pd perm. medium padatdi petridish menggunakan jarum ose

Kelebihan:

- Menyebarkan jutaan sel di permukaan

- Sel individu dpt dipisahkan dari yg lain

- Membelah membentuk koloni berbeda

- Koloni yg berbeda tidak bersentuhsn dg koloni lain

- Klon bakteri tunggal koloni


32/34


33/34

2. Pour plate: CFU dipisahkan satu sama lainmelalui pengenceran berseri

Koloni terbtk diatas dan dibawah permmedium

2. Spread plate: sampel disebar pada


34/34

sSpread plate

2. Spread plate: sampel disebar padamedium dg batang kaca.

5. metode mikrobiologi

Documents