METODE ANALISIS VITAMIN

Persyaratan spesimen;

• Puasa plasma atau serum

• Lithium Heparin adalah antikoagulan pilihan untuk vitamin seperti, tiamin, riboflavin, retinol,

tokoferol & cholecalciferol

• EDTA dapat digunakan untuk vitamin B6 dan folat

Metode dan pilihan;

Pemilihan metode tergantung pada vitamin yang sedang dianalisis. Beberapa vitamin

seperti vit-A, K, B12 memiliki fitur khusus yang memungkinkan penggunaan beberapa metode

khusus dengan biaya yang efektif (murah).

Beberapa metode pengukur vitamin secara langsung dan memberikan pengukuran

kuantitatif. Ini direkomendasikan untuk digunakan terutama untuk vitamin yang berguna secara

klinis.

Namun ini mahal dan tidak semua laboratorium dapat memberikan tes tersebut. Metode ini

meliputi:

• HPLC (metode referensi)

• Immunoassays (ELISA, RIA, FIA)

• Colorimetric dan Spektrofotometri tes

• Fluorometric assay & Chemiluminescence assay

• amperometri assay

Karena vitamin berfungsi sebagai ko-faktor dan substrat dalam berbagai reaksi tubuh,

beberapa metode memanfaatkan properti ini dan secara tidak langsung mengukur vitamin dengan

mengukur aktivitas enzim di bawah pengaruh. Metode ini relatif lebih murah dan bisa menjadi

semi-kuantitatif atau kualitatif. Namun beberapa metode ini digunakan saat ini untuk penelitian

saja dan ini termasuk:

• Tes Metabolit pemuatan

• enzim aktivasi eritrosit assay

• Tes kerapuhan Eryhtrocyte

• Waktu Prothrombin

• metode mikrobiologi

• Bioassay (in-vivo & in-vitro)

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Ini adalah metode referensi untuk menganalisis jenis vitamin.

Juga digunakan untuk menentukan bentuk iso vitamin

KEUNTUNGAN

- Langsung

- kuantitatif

- Precise & akurat

- Sensitif dan spesifik

- Otomatis

- Tinggi melalui put

Kerugian :

- Membutuhkan pretreatment sampel seperti ekstraksi & filtrasi

- Membutuhkan perhatian untuk memilih fase gerak & sampel laju pemompaan

- Awalnya membutuhkan optimasi. Dalam rangka untuk mendapatkan resolusi tinggi dasar

rendah dan kembali ketingkat noise yang rendah harus dipertahankan

- Membutuhkan standar internal, kalibrator dan reagen HPLC kelas

- Mahal untuk membeli dan biaya pemeliharaan yang tinggi

Immunoassays

Ada beberapa jenis immunoassays seperti:

- Enzim Linked Sorbant Immuno Assay yang memanfaatkan antibodi terkait dengan enzim.

- Radio-immunoassay bukannya memanfaatkan radio-isotop dan karena pelepasan radioaktif

menyangkut ini sekarang keluar tanggal.

- Immunoassays Fluorescent menggunakan antibodi berlabel dengan fluorophore tetapi tidak

memiliki kepekaan dibandingkan dengan dua sebelumnya.

Vitamin B12 dan Vitamin-D-dapat dianalisis dengan immunoassay. Tes ini tergantung

pada ketersediaan antibodi monoklonal yang menentukan spesifisitas dan sensitivitasnya.

Untuk beberapa sampel immunoassays dianggap mahal tetapi biaya dapat dikurangi jika

sampel yang cukup adalah 'batch' dianalisis pada 96 format yang baik.

Immunoassays adalah metode kedua yang paling dapat diandalkan untuk pengukuran vitamin

setelah HPLC.

Kolorimetri dan Spektrofotometri tes

Reaksi kimia antara chromogen dan vitamin menyebabkan perubahan warna.

Perkembangan warna menunjukkan adanya vitamin .... analisis kualitatif.

Untuk mengukur metode ini, spektrofotometer digunakan untuk mengukur intensitas warna 'end

point', di mana intensitas warna sebanding dengan konsentrasi vitamin.

Terutama digunakan untuk penentuan vit-C (asam askorbat).

KEUNTUNGAN

- Sebuah uji kuantitatif langsung

- Membutuhkan volume sampel kecil

- Otomatis

- Cepat turn-sekitar waktu

- Bisa diterapkan untuk sampel tunggal atau beberapa pada satu waktu

Kerugian

- Sensitivitas dan spesifisitas rendah maka beberapa zat lainnya dapat mengganggu chromogen

atau enzim yang digunakan.

- Tidak bisa digunakan untuk semua jenis vitamin

- Kontrol yang tepat dan kalibrator harus digunakan

Fluorometric assay & Chemiluminescence assay

Vitamin tertentu memiliki kemampuan untuk menghasilkan fluoresensi ketika

direaksikan dengan fluorophore a. Fluoresensi ini berbanding lurus dengan konsentrasi vitamin.

Dalam tes Chemiluminescence, luminol digunakan untuk bereaksi dengan vitamin bunga.

Campuran disuntikkan pada tingkat dikontrol melalui kapiler di mana 'reaksi kinetik' diukur dan

diberikan pengukuran kuantitatif. Keuntungan dan kerugian yang mirip dengan tes kolorimetri

dan Spektrofotometri.

Tes amperometri

Beberapa vitamin dapat mengalami oksidasi elektro-kimia.

Reaksi ini pada penyebab elektroda perubahan potensial listrik yang berbanding lurus dengan

konsentrasi vitamin dalam sampel.

Kerugian utama dari metode ini adalah kurangnya spesifisitas dan jarang digunakan, kadang-

kadang secara paralel dengan HPLC untuk konfirmasi hasil tertentu.

Metode tidak langsung untuk penentuan vitamin

Metabolit pemuatan uji

Tes ini telah sangat populer di masa lalu.

Ini adalah sebuah assay tidak langsung yang menentukan aktivitas vitamin digunakan sebagai

kofaktor untuk metabolit tertentu.

Langkah-langkah yang terlibat:

- Pasien diberikan secara oral besar, diukur dosis metabolit tertentu yang digunakan oleh vitamin

menarik untuk konversi.

- Darah atau urin sampel diperoleh dari pasien setelah ~ 6 jam menelan.

- Metabolit yang sama diukur dalam sampel ini:

Peningkatan metabolit di atas kisaran normal menunjukkan kekurangan vitamin

Secara signifikan mengurangi metabolit menunjukkan aktivitas vitamin yang normal

- Misal : Tryptophan adalah metabolit pemuatan untuk vit B6-dan Histidin adalah untuk folat

KEUNTUNGAN

- Metode Murah

- Efek samping Minimum

Kerugian

- Metode tidak langsung

- In-vivo karena itu tidak dapat diandalkan karena gangguan oleh faktor-faktor lain

- Tidak berlaku untuk semua vitamin

- Invasif

Uji aktivasi enzim eritrosit

- Hemolysates seluruh darah atau RBC disiapkan

- Aktivitas enzim di bawah pengaruh langsung dari vitamin bunga diukur. Aktivitas enzim ini

dikenal sebagai Activity Koefisien (AC).

- Sejumlah vitamin jenuh tertentu ditambahkan.

- Aktivitas enzim ini diukur kembali dan dibandingkan dengan aktivitas enzim sebelum

penambahan.

- Peningkatan AC menunjukkan kekurangan vitamin. Dalam kasus vitamin normal atau bahkan

vitamin jenuh, AC tidak akan berubah.

- Misal : Kegiatan transketolase diukur untuk mengevaluasi tingkat tiamin, Glutathione reduktase

diukur untuk mengevaluasi riboflavin status dan aspartat transaminase (AST) aktivitas diukur

untuk analisis vit B6-.

Uji fragilitas eritrosit

Digunakan khusus untuk penilaian tingkat vitamin-E. Vitamin ini bertanggung jawab untuk

stabilitas membran RBC.

Langkah-langkah yang terlibat:

- Sampel Pasien dibagi menjadi dua aliquot.

- Sel darah merah dalam satu aliquot dicuci dengan 2% H2O2 (membran racun radikal bebas),

sedangkan sel darah merah dari 2 aliquot dicuci dengan dist. H2O.

- Setelah 3 jam inkubasi, hemoglobin diukur di kedua aliquot.

- Jika hemolisis sel darah merah dalam aliquot 1 (dicuci dengan H2O2) adalah 20% lebih dari

hemolisis dalam 2 aliquot (sel darah merah dicuci dengan dist.H2O), ini akan menunjukkan

kekurangan vitamin-E.

prothrombin Waktu

Ini adalah spesifik, namun tidak langsung assay untuk penilaian kegiatan vit-K.

Sejak vit-K bertanggung jawab untuk aktivasi faktor pembekuan (II, VII, IX, X, protein C, S &

Z) meningkat PT> 2 min menunjukkan defisiensi vit-K.

Hal ini dianggap sebagai tes skrining, namun untuk mengkonfirmasi HPLC atau analisis

spektrofotometri dianjurkan.

Metode Mikrobiologi (digunakan penelitian saja)

Beberapa mikro-organisme misalnya Lactobacillus Casel dan Lactobacillus Plantoides

tergantung pada vitamin tertentu untuk pertumbuhannya.

Mikroorganisme ini tumbuh dalam kaldu atau kultur agar yang mengandung sampel dengan

konsentrasi yang tidak diketahui dari vitamin.

Sebuah kontrol negatif yang tidak memiliki vitamin sama sekali juga digunakan.

Inkubasi selama beberapa hari

Kepadatan pertumbuhan diukur dengan turbidimetri

Pembentukan asam laktat juga dapat dikuantifikasi yang berbanding lurus dengan konsentrasi

vitamin dalam sampel

Bioassay untuk vitamin

adalah alat penelitian saja dan jarang digunakan secara klinis untuk analisis vitamin. Untuk

mengukur enzim dibawah pengaruh vitamin dan efek kekurangan fenotipik. Ada dua jenis bio-

tes:

In-vivo Bioassays

• Membutuhkan hewan hidup lebih kecil dalam ukuran seperti tikus atau ayam

• sifat fisik hewan seperti berat, perilaku, laju respirasi, denyut nadi, anggota tubuh dan gerakan

mata dan pengamatan fisik lainnya dicatat.

• Aktivitas enzim di bawah pengaruh langsung dari vitamin yang akan dianalisis ditentukan

dalam sampel darah spektrofotometri (nilai puncak).

• hewan tersebut kemudian kekurangan diet yang mengandung vitamin tertentu untuk jangka

waktu tertentu.

• Saat hewan ini mulai mengembangkan penyakit yang terkait dengan kekurangan vitamin,

sampel darah yang lain diambil dan aktivitas enzim diukur ulang. Ini adalah nilai dasar. Gejala

fisik lainnya yang direkam selama keadaan penyakit.

• Kemudian dosis dihitung dan secara bertahap meningkatkan vitamin diumpankan ke hewan

pada titik waktu tertentu.

• Aktivitas enzim yang kembali dan gejala fisik mulai membaik.

• Sampel darah diambil pada interval waktu tertentu dan aktivitas enzim diukur sampai puncak

(optimal) aktivitas kembali dan gejala penting hewan ini telah sepenuhnya pulih.

• Uji ini memungkinkan konsentrasi vitamin vs aktivitas enzim kurva standar.

• Kurva standar yang sama sekarang dapat digunakan untuk menganalisis vitamin yang sama

dalam berbagai model binatang karena aktivitas enzim dapat diukur dan menggunakan kurva,

konsentrasi vitamin yang diharapkan dapat diperoleh.

misalnya tikus ketika kekurangan vit-D untuk beberapa waktu, akan mengembangkan rakhitis.

Vit-D aktivitas enzim 25-hidroksilase dipengaruhi, yang memanfaatkan vit-D sebagai substrat.

Hal ini memicu kaskade kejadian yang menyebabkan cacat tulang pada tikus ini. Namun ketika

dosis dihitung tertentu vit-D diumpankan gejala sembuh. Aktivitas enzim diukur pada setiap titik

waktu dosis dan kurva standar dirumuskan.

KEUNTUNGAN

- Dekat dengan realitas

- Bisa menyebabkan menerobos dalam penelitian

Kerugian

- Metode tidak langsung

- Membutuhkan pemantauan yang cermat

- Sulit untuk mempertahankan data yang konsisten karena gangguan oleh faktor-faktor lain

- Tidak berlaku untuk semua vitamin

- Mahal karena manajemen hewan

- Memakan Waktu

- Tidak memiliki aplikasi klinis

In-vitro Bioassays

• Tes ini melibatkan menargetkan jalur sel tertentu atau jaringan dalam media kultur.

• Mempengaruhi vitamin dipelajari pada pertumbuhan, proliferasi dan diferensiasi sel.

• Faktor-faktor lain atau bahan kimia seperti: protein, imunoglobulin, kalsium, fosfor yang

diproduksi oleh sel-sel & jaringan setelah terpapar vitamin juga diukur.

Misalnya efek anti-oksidatif vit-C dan E yang didirikan oleh tes ini

KEUNTUNGAN

- Lebih mudah dari in-vivo

- Lebih baik monitoring & control kondisi

- Kurang memakan waktu & murah

- Dapat digunakan untuk menganalisis efek dari beberapa vitamin

Kerugian

- Tidak Langsung

- Tidak dekat dengan realitas

- Jaringan dan sel kultur beresiko kontaminasi