1.) Menurut Rohman (2012), keuntungan metode Kjedahl adalah dapat digunakan untuk semua jenis makanan, relatif sederhana, tidak mahal, akurat, merupakan metode resmiuntuk analisis kandungan protein secara kasar, dan telah dimodifikasi (metode mikro Kjedahl) untuk mengukur kandungan protein dalam skala mikro. Sedangkan, kerugian metode Kjedahl adalah mengukur nitrogen organik secara total sehingga nitrogen apapun yang bukan merupakan nitrogen yang berasal dari protein juga ikut tertetapkan, menggunakan waktu yang lama (minimal 2 jam), presisinya yang lebih rendah dibanding metode Biuret, serta menggunakan reagen korosif seperti asam sulfat.

1.1 Pengertian SpektrofotometriSpektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Peralatan yang digunakan dalam spektrofotometri disebut spektrofotometer. Cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron valensi.Spektrofotometri merupakan suatu metode analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang spesifik dengan mengguankan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detector Fototube. Dalam analisis cara spektrofotometri terdapat tiga daerah panjang gelombang elektromagnetik yang digunakan, yaitu daerah UV (200-380 nm), daerah Visible (380-700 nm), daerah Inframerah (700-3000 nm).1.2 Spektofotmetri UVa. Karakteristik dan FungsiPrinsip kerjanya berdasarkan penyerapan cahaya atau energi radiasi oleh suatu larutan. Jumlah cahaya atau energi radiasi yang diserap memungkinkan pengukuran jumlah zat penyerap dalam larutan secara kuantitatif (Triyati,1985).Spektofotometri UV di = 280nm dapat digunakan untuk analisis triptofan, sementara tirosin dapat ditentukan di 278nm. Fenillalanin menyerap sinar kurang kuat dan pada panjang gelombang yang lebih pendek (Rohman, 2013).

b. MetodeSusunan peralatan Spektrofotometer Ultra-violet meliputi bagian-bagian sebagai berikut: Sumber radiasi/cahaya (A) Sumber cahaya dipergunakan untuk pengukuran absorpsi. Sumber cahaya ini harus memancarkan sinar dengan kekuatan yang cukup untuk penentuan dan pengukuran, juga harus memancarkan cahaya berkesinambungan yang berarti harus mengandung semua panjang gelombang dari daerah yang dipakai. Kekuatan sinar radiasi harus konstan selama waktu yang diperlukan. Sumber radiasi Ultra-violet biasa dipergunakan lampu Hidrogen atau Deuterium yang terdiri dari tabung kaca dengan jendela dari kwartz yang mengandung Hidrogen dengan tekanan tinggi. Oleh karena kaca menyerap radiasi Ultra-violet, maka sistim optik Spektrofotometer Ultra-Violet dan sel harus dibuat dari bahan kwartz. Monokromator (B)Monokromator dipergunakan untuk memisahkan radiasi ke dalam komponen-komponen panjang gelombang dan dapat memisahkan bagian spektrum yang diinginkan dari lainnya. Sel absorpsi (C)Kualitas data absorbans sangat tergantung pada cara pemakaian dan pemeliharaan sel. Sidik jari, lemak atau pengendapan zat pengotor pada dinding sel akan mengurangi transmisi. Jadi sel-sel itu harus bersih sekali sebelum dipakai. Detektor (D)Detektor dipergunakan untuk menghasilkan signal elektrik. Dimana signal elektrik ini sebanding dengan cahaya yang diserap. Signal elektrik ini kemudian dialirkan ke alat pengukur. Pencatat (E)Rekorder dipergunakan untuk mencatat data hasil pengukuran dari detektor, yang dinyatakan dengan angka.

Gambar 1. Bagan susunan alat Spektrofotometer Ultra-violet

Keterangan :

A = sumber cahaya. B = monokromator. C = sel absorpsi (tempat larutan). C1 = contoh. C2 = pelarut. D = detektor. E = meter atau rekorder.

Alat susunan spektrofometer Ultra-violetdipancarkan melalui monokromator (B). Monokromator menguraikan sinar yang masuk dari sumber cahaya tersebut menjadi pita-pita panjang gelombang yang diinginkan untuk pengukuran suatu zat tertentu seperti yang tertera pada tabel 1, yang menunjukkan bahwa setiap gugus kromofor mempunyai panjang gelombang maksimum yang berbeda. Dari monokromator tadi cahaya/energi radiasi diteruskan dan diserap oleh suatu larutan yang akan diperiksa di dalam kuvet. Kemudian jumlah cahaya yang diserap oleh larutan akan menghasilkan signal elektrik pada detektor, yang mana signal elektrik ini sebanding dengan cahaya yang diserap oleh larutan tersebut. Besarnya signal elektrik yang dialirkan ke pencatat dapat dilihat sebagai angka. Metode Spektrofotometri Ultra-violet berdasarkan pada hukum LAMBERT-BEER. Hukum tersebut menyatakan bahwa jumlah radiasi Ultra-violet yang diserap atau ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal larutan.

Tabel 1. Pita absorpsi elektronik untuk gugus kromofor tunggal (SKOOG & WEST, 1971)

Hal-hal yang harus diperhatikan dalaultrav analisis spektrofotometri ultraviolet : Pemilihan panjang gelombang maksimumPanjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang dimana terjadi serapan maksimum. Untuk memperoleh panjang gelombang maksimum, dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku pada konsentrasi tertentu. Pembatan kurva kalibrasiDibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai konsentrasi. Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi. Bila hokum Lambert-Beer terpenuhi maka kurva kalibrasi berupa garis lurus. Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikanAbsorbansi yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara 0,2 sampai 0,6. Anjuran ini berdasarkan anggapan bahwa pada kisaran nilai abssorbansi tersebut kesalahan fotometrik yang terjadi adalah paling minimal (Gandjar dan Rohman, 2007).

Berikut merupakan salah satu analisa asam amino :Asam amino disiapkan dalam Guanidin 6M + HCl 0,2M dan konsentrasinya diatur 0,05mg/ml untuk tirosin dan triptofan serta 0,2mg/ml untuk fenilalanin. Koreksi baseline selalu digunakan, dengan lebar celah 2nm. Spektra dibaca pada panjang gelombang antara 260-300nm, terhadap blanko guanidine 6M + HCl 0,2M. Spektra order nol (norma) ditransformasi ke turunan kedua dengan penghalusan titik ( smoothing) sesuai prosedur Savitzky-Golay. Ekstra daging disiapkan dengan homogenisasi 0,1g daging dalam 10ml Guanidin 6M dengan politron selama 30 detik. Lipid dan kolagen yang tidak larut dihilangkan dengan penyaringan pada kertas saring, lalu ekstrak daging ditambah dengan HCl 0,2M untuk membuat kondisi yang sama, dengan standar asam amino, lalu dibaca dengan spektrofotometer UV.

Gambar 2. Spektra derivaft kedua 3 AA aromatis dalam Guanidin-HCl. Puncak yang digunakan untuk analisis ditandai dengan puncak tebal. Konsentrasi adalah 0,05mg/ml untuk Trp dan Tyr, serta 0,2 mg/ml untuk Phe.Gambar ini menunjukkan spectrum turunan kedua tiap AA aromatis. Trp menunjukkan 2 puncak, yang mayor ada di 288,5nm , sementara yang minor ada di 281nm. Tyr menunjukkan puncak mayor di 282,5 nm dan puncak minor di 275 nm, sementara itu Phe menunjukkan puncak mayor dan minor masing-masing 263,5 nm dan 268 nm. Panjang gelombang ini dapat dimanfaatkan untuk pengukuran kedua AA aromatis pada sampel daging.

c. Kelebihan dan Kekurangan Menurut Afriyana (2009), pemakaian Spektrofotometer Ultra-violet dalam analisis kuantitatif mempunyai beberapa keuntungan: Dapat dipergunakan untuk banyak zat organik dan anorganik. Adakalanya bebe rapa zat harus diubah dulu menjadi senyawa berwarna sebelum dianalisa. Selektif. Pada pemilihan kondisi yang tepat dapat dicari panjang gelombang untuk zat yang dicari. Mempunyai ketelitian yang tinggi, dengan kesalahan relatif sebesar 1% 3%, tetapi kesalahan ini dapat diperkecil lagi. Dapat dilakukan dengan cepat dan tepat.Kelemahan Spektrofotometer Ultra-violet dan Sinar Tampak dalam analisis kualitatif adalah kurang teliti. Hal tersebut disebabkan karena pita-pita absorpsi yang diperoleh melebar, dengan demikian kurang khusus atau terbatas pemakaiannya. Walaupun demikian, berdasarkan spektrum serapan Ultra-violet dan Sinar Tampak, dapat dipakai untuk mengetahui ada atau tidak adanya gugus fungsional tertentu dalam senyawa organik. Alat ini dapat juga dipergunakan untuk menentukan jumlah kecil senyawa berkadar rendah yang dapat mengabsorpsi dalam media non absorben.

Daftar Pustaka

Afriyana, Rina. 2009. Penerapan Metode Spektrofotometer Ultraviolet pada Penetapan Kadar NIfedipin dalam Sediaan Tablet. Skripsi. Universitas Sumatra Utara.Gandjar, I.G. dan Rohman, A.2007. Kimia Farmasi Analisis. Cetakan II. Yogyakarta : Perpustakaan Pelajar. Halaman 246.Rohman, Abdul. 2013. Analisis Komponen Makanan. Graha Ilmu:Yogyakarta.Skoog, D.A. dan D.M. West. 1971. Principles Of Instrumental Analysis. Holt, Rinehart and Winston, Inc., New York.Triyati, Etty. 1985. Spektrofotometer Ultra-Violet Dan Sinar Tampak Serta Aplikasinya Dalam Oseanologi. Oseana, Volume X, Nomor 1 : 39 - 47, 1985. ISSN 0216-1877.