Penelusuran Aktivitas Antibakteri 15 Jenis Jus Buah-buahan dan Sayur-sayuran Terhadap Isolat Klinis Streptococcus mutans dan Staphylococcus aureusAsep Nurrahman Yulianto, Sri Agung Fitri Kusuma, dan Sulistiyaningih

Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran, Jatinangor Sumedang

ABSTRAKMasalah yang paling sering terjadi dalam bidang kesehatan mulut adalah karies atau plak gigi. Salah satu penyebab utama terbentuknya plak gigi adalah adanya infeksi yang disebabkan oleh bakteri Streptococcus mutans dan Staphylococcus aureus. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri, Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM), dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) dari beberapa buah dan sayuran uji seperti alpukat, anggur, apel, bayam, belimbing wuluh, brokoli, buah naga, jambu biji, jeruk keprok, kubis, mentimun, pepaya, seledri, stroberi, dan wortel terhadap masing-masing dua isolat klinis S.mutans dan S.aureus. Pengujian aktivitas antibakteri, KHTM dan KBM dilakukan dengan menggunakan metode mikrodilusi. Hasil penapisan fitokimia menunjukkan bahwa jus buah dan sayuran uji umumnya mengandung senyawa flavonoid dan polifenol. Hasil pengujian menunjukkan bahwa jus stroberi memiliki aktivitas antibakteri terbesar terhadap seluruh bakteri isolat klinis S.mutans dan S.aureus. Nilai KHTM dan KBM jus stroberi terhadap bakteri isolat klinis S.mutans terletak pada rentang konsentrasi 6,25% v/v 12,5% v/v. Nilai KHTM dan KBM jus stroberi terhadap bakteri S. aureus isolat klinis 1 terletak pada rentang konsentrasi 3,125% v/v 6,25% v/v dan terhadap bakteri S. aureus isolat klinis 2 terletak pada rentang konsentrasi 6,25% v/v 12,5% v/v.Kata kunci: Antibakteri, jus buah dan sayuran, Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus.

ABSTRACT

The most common problem in mouth health matter is caries or dental plaque. The main factor causing dental plaque is the infection that caused by Streptococcus mutans and Staphylococcus aureus. This study was done to determine the antibacterial activity, Minimum Inhibitory Concentration (MIC), and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) from several fruits and vegetables such as avocado, grape, aple, spinach, belimbing wuluh, broccoli, dragon fruit, guava, orange, cabbage, cucumber, papaya, celery, strawberry, and carrot against two clinical isolates each of S.mutans and S.aureus. The antibacteria activity test, MIC, and MBC was conducted by using microdilution method. The result of phytochemistry screening shows that fruits and vegetables juice that was used in the test contains flavonoids and polifenols. The result of the test also showed that strawberry juice had the best antibacteria activity againts all of the clinical isolate of S.mutans and S.aureus. The MIC and MBC value against the clinical isolate of S.mutans is in the range of concentration between 6.25% v/v 12.5% v/v. The MIC and MBC value against the clinical isolate of S.aureus is in the range of concentration between 3.125% v/v 6.25% v/v for the first isolate and for the second isolate is between 6.25% v/v 12.5% v/v.Keywords: Antibacterial, fruits and vegetables juice, Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus.PENDAHULUANKesehatan gigi dan mulut di Indonesia merupakan masalah yang masih perlu mendapat perhatian secara menyeluruh dari semua pihak. Dalam bidang kesehatan mulut, masalah yang sering dihadapi adalah karies atau plak gigi. Hasil survey kesehatan gigi dan mulut di tujuh wilayah pembangunan provinsi Jawa Barat pada tahun 1994 menunjukkan bahwa prevalensi penyakit karies gigi masyarakat provinsi Jawa Barat rata-rata 78,9% dengan angka DMF-T (Decayed Missing,Filled-Teeth) sebesar 5,74 (Dinas Kesehatan Provinsi Jawa Barat, 2004).

Plak merupakan masalah kesehatan gigi yang dapat menyebabkan bau mulut dan merusak gigi (Lucida, 2006). Plak merupakan lapisan biofilm yang tersusun dari sel-sel mikroorganisme yang berkolonisasi pada permukaan gigi (Madigan, 2006). Mikroorganisme yang terdapat di dalam plak gigi antara lain genus Streptococcus (S. mutans, S. sanguis, S. viridians, S. salivarius), berbagai jenis Actinomyces (A. viscosus, A. naeshundii, A. israelii), dan Staphylococcus aureus (Daniluk, et al., 2006).

Staphylococcus aureus umumnya ditemukan pada permukaan kulit, membran mukosa, air liur, dan permukaan gigi manusia. Apabila Staphylococcus aureus yang terdapat pada plak gigi masuk ke dalam sirkulasi darah, bakteri dapat meluas ke berbagai bagian tubuh dan menyebabkan infeksi berupa endokarditis dan osteomielitis (Ontengco, et al., 2003). Apabila terhirup ke dalam paru-paru, maka dapat menyebabkan infeksi saluran pernafasan seperti pneumonia, bronkhitis, dan penyakit paru obstruksi kronik (Yulianty, 2010).

Bakteri lain yang menyebabkan plak gigi adalah Streptococcus mutans (Jawetz, et al., 1995). Streptococcus mutans biasanya ditemukan pada rongga gigi manusia yang luka dan menjadi bakteri yang paling kondusif menyebabkan karies untuk email gigi (Michalek dan Mc Ghee, 1982).Pengobatan dan pencegahan yang sering dilakukan untuk menghambat pertumbuhan bakteri pada permukaan gigi adalah obat kumur (Amtha, 1997). Obat kumur yang selama ini dianggap aman ternyata ada yang memiliki efek samping khususnya yang mengandung alkohol (Azril, 2009). Dilaporkan bahwa semakin lama obat kumur yang mengandung alkohol tinggi berkontak dengan mukosa mulut, makin besar kemungkinannya untuk menimbulkan lesi atau kanker mulut (Gargari, et al., 1995). Oleh karena itu, penggunaan buah-buahan dan sayur-sayuran dapat dijadikan terobosan menarik untuk pengobatan plak gigi tersebut terutama yang mengandung senyawa antibakteri berupa flavonoid dan polifenol. Beberapa buah dan sayuran yang memiliki kandungan senyawa flavonoid dan polifenol diantaranya adalah alpukat, anggur, apel, bayam, belimbing wuluh, brokoli, buah naga, jambu biji, jeruk keprok, kubis, mentimun, pepaya, seledri, stroberi, dan wortel.Penelusuran obat antiplak gigi terus dilakukan demi penemuan obat yang aman. Telah dibuktikan pada penelitian sebelumnya bahwa jus apel, anggur, dan stroberi memiliki aktivitas antibakteri terhadap Streptococcus mutans karena didalam jus tersebut memiliki kandungan senyawa antibakteri berupa flavonoid dan polifenol (Paramita, 2007; Febrina, 2007; Godfried, 2007). Dengan demikian, pada penelitian ini akan ditelusuri aktivitas antibakteri beberapa buah dan sayuran yang biasa dikonsumsi sehari-hari dan memiliki kandungan senyawa antibakteri terhadap bakteri penyebab karies gigi, diantaranya Streptococcus mutans dan Staphylococcus aureus hasil isolat klinis sehingga aman digunakan dalam pengobatan plak gigi.BAHAN DAN METODEBahanBahan uji: Bahan uji yang digunakan adalah alpukat (Persea americana Mill.), anggur (Vitis vinifera L.), apel (Pyrus malus L.), bayam (Amaranthus tricolor), belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L.), brokoli (Brassica oleracea var. italica), buah naga (Hylocereus undatus (Haw.)Britt.Et R), jambu biji (Psidium guajava L.), jeruk keprok (Citrus nobilis Lour), kubis (Brassica oleracea var. capitata L.), mentimun (Cucumis sativus L.), pepaya (Carica papaya L.), seledri (Apium graveolens var. secalinum), stroberi (Fragaria x ananassa Duch), dan wortel (Daucus carota L.) yang diperoleh dari daerah Jatinangor dan Bandung, Jawa Barat. Bahan kimia: Bahan kimia yang digunakan adalah amil alkohol (Merck), amonia 10% (Merck), asam klorida 2 N (Merck), aquadest, besi (III) klorida, eter (Merck), kloroform (Merck), larutan asam asetat anhidrat dalam H2SO4 pekat (Merck), larutan gelatin 1% (Merck), pereaksi Dragendorff (larutan kalium bismuth iodida), pereaksi Mayer (larutan kalium merkuri iodida), larutan vanilin 10% dalam H2SO4 pekat (Merck), natrium hidroksida 1 N, serbuk kalium permanganat, dan serbuk magnesium. Bakteri uji: Bakteri uji yang digunakan adalah masing-masing dua isolat klinis Streptococcus mutans dan Staphylococcus aureus yang diisolasi dari plak gigi pasien di Unit Pelayanan Terpadu (UPT) Padjadjaran, Jatinangor.

Alat

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah juicer (philips), microtitter plates 96 well (Kartel), otoklaf (Hirayama), oven (Memmert 200 dan Memmert 400-800), inkubator (Sakura IF-4), mikropipet volume 20-200 L dan 100-1000 L (Eppendorf), tip mikropipet, ose, sentrifugator, dan sungkub anaerob.

Metode

Pengumpulan dan Determinasi Bahan: Bahan uji yang digunakan diperoleh dari daerah Jatinangor dan Bandung, Jawa Barat. Determinasi tumbuhan dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran, Jatinangor.Pengolahan Bahan: Sebanyak 100 g buah dan sayuran uji segar dipotong-potong dan direndam dengan menggunakan kalium permanganat selama 15 menit. Setelah itu buah dan sayuran uji dimasukan ke dalam juicer. Jus yang dihasilkan kemudian disentrifugasi selama 30 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Supernatan yang didapat kemudian diambil dan disterilkan dengan cara pasteurisasi pada suhu 65 C selama 30 menit.

Penapisan Fitokimia: Penapisan fitokimia dilakukan dengan metode Phytochemical Screening of Plants untuk mengetahui golongan metabolit sekunder yang terdapat pada bahan uji.Pengujian Aktivitas Antibakteri, Penentuan KHTM dan KBM Jus: Pengujian aktivitas antibakteri, penentuan KHTM dan KBM dilakukan dengan menggunakan metode mikrodilusi. Jus buah dan sayuran dibuat dalam 9 konsentrasi yang berbeda menggunakan media MHB yang sudah ditambahkan suspensi bakteri, lalu diinkubasi selama 18-24 jam. Penentuan letak KHTM dilakukan dengan pengamatan kekeruhan media uji dengan pembanding kontrol positif dan negatif yang digunakan. Nilai KHTM terletak pada konsentrasi uji terkecil dimana terdapat penurunan jumlah koloni bakteri yang tinggi pada media uji. Setelah itu, dilakukan teknik dropping untuk melihat pertumbuhan koloni bakteri ke dalam media lempeng agar darah untuk bakteri S.mutans dan media MHA untuk bakteri S.aureus. Nilai KBM berada pada konsentrasi uji terkecil dimana tidak terdapat pertumbuhan koloni bakteri.HASIL DAN PEMBAHASANHasil Pengumpulan dan Determinasi BahanBahan uji yang digunakan adalah alpukat , anggur, apel, bayam, belimbing wuluh, brokoli, buah naga, jambu biji, jeruk keprok, kubis, mentimun, pepaya, seledri, stroberi, dan wortel yang diperoleh dari daerah Jatinangor dan Bandung, Jawa Barat.

Determinasi tumbuhan telah dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam yang hasilnya menunjukkan bahwa ke-15 bahan uji berasal dari divisi Magnoliophyta. Hasil determinasi ke-15 bahan uji tersebut dapat dilihat pada Gambar 1, Lampiran A.Hasil Pengolahan Bahan

Proses pengolahan bahan uji dengan juicer dipilih karena menghasikan jus buah dan sayur yang lebih murni dan lebih banyak dibandingkan dengan menggunakan blender. Kalium permanganat digunakan untuk menghilangkan kontaminasi dari mikroorganisme yang ada pada permukaan buah dan sayur. Gambar jus buah dan sayuran uji dapat dilihat pada Gambar 2, Lampiran B.Hasil Penapisan Fitokimia

Secara umum, senyawa metabolit sekunder yang terkandung di dalam bahan uji adalah senyawa flavonoid dan polifenol. Hal ini mengindikasikan bahwa seluruh bahan uji mengandung zat antibakteri. Hasil penapisan fitokimia tersebut dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1 Hasil Penapisan Fitokimia Jus Buah dan Sayuran Uji

SampelAlkFlaPolTanM&SS&TKuiSap

Alpukat++++++++

Anggur++++----

Apel++++--+-

Bayam-++++--+

Belimbing wuluh++--++++

Brokoli++---+-+

Buah naga-++---++

Jambu biji-+++---+

Jeruk+-+-----

Kubis-+++--++

Pepaya+++----+

Seledri-++-+-++

Stroberi-+++----

Timun+-+--+-+

Wortel-++-+---

Keterangan : (+): terdeteksi

(-): tidak terdeteksi

Alk: Alkaloid

Fla: Flavonoid

Tan: Tanin

Pol: Polifenol

M&S: Monoterpenoid dan seskuiterpenoid

S&T: Steroid dan triterpenoid

Kui: Kuinon

Sap: Saponin

Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri, Penentuan KHTM dan KBM JusMetode yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri, penentuan konsentrasi hambat tumbuh minimum (KHTM) dan konsentrasi bunuh minimum (KBM) dari 15 jus buah dan sayuran uji adalah metode pengenceran mikro. Metode ini dipilih karena metode yang terstandar secara internasional, dapat menentukan aktivitas antibakteri, konsentrasi hambat tumbuh minimum (KHTM) dan konsentrasi bunuh minimum (KBM) secara sekaligus, pengerjaan yang mudah, waktu pengerjaan yang cepat dan hanya memerlukan jumlah zat uji yang kecil.Hasil pengujian aktivitas antibakteri dan penentuan KHTM dan KBM dari bahan uji terhadap bakteri uji dapat dilihat pada Tabel 2 5.

Tabel 2Hasil Uji Aktivitas Antibakteri, Penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM) dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) Jus Terhadap Streptococcus mutans Isolat Klinis 1Bahan UjiKonsentrasi (v/v)Kontrol

100%75%50%25%12,5%6,25%3,125%1,5625%0,78125%(+)(-)Jus

Alpukat++++++++++--

Anggur-+++++++++--

Apel---+++++++--

Bayam++++++++++--

Belimbing wuluh----++++++--

Buah naga++++++++++--

Jambu biji---+++++++--

Jeruk++++++++++--

Kubis--++++++++--

Pepaya++++++++++--

Seledri++++++++++--

Stroberi-----+++++--

Timun++++++++++--

Wortel++++++++++--

Keterangan: + : keruh

- : beningBerdasarkan Tabel 2, diperoleh 6 jenis jus buah dan sayuran yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap Streptococcus mutans isolat klinis 1, yaitu jus anggur, apel, belimbing wuluh, jambu biji, kubis, dan stroberi. Aktivitas antibakteri terbesar dihasilkan oleh jus stroberi. Rentang konsentrasi hambat tumbuh minimum (KHTM) konsentrasi bunuh minimum (KBM) jus stroberi terhadap Streptococcus mutans isolat klinis 1 terletak pada rentang konsentrasi jus 6,25 12,5 % (v/v). Hasil dropping dari 15 jus buah dan sayuran uji tersebut dapat dilihat pada Gambar 3 6, Lampiran C.Tabel 3Hasil Uji Aktivitas Antibakteri, Penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM) dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) Jus Terhadap Streptococcus mutans Isolat Klinis 2

Bahan UjiKonsentrasi (v/v)Kontrol

100%75%50%25%12,5%6,25%3,125%1,5625%0,78125%(+)(-)Jus

Alpukat++++++++++--

Anggur-+++++++++--

Apel---+++++++--

Bayam++++++++++--

Belimbing wuluh----++++++--

Brokoli++++++++++--

Buah naga++++++++++--

Jambu biji---+++++++--

Jeruk++++++++++--

Kubis--++++++++--

Pepaya++++++++++--

Seledri++++++++++--

Stroberi-----+++++--

Timun++++++++++--

Wortel++++++++++--

Keterangan: + : keruh

- : bening

Berdasarkan Tabel 3, diperoleh 6 jenis jus buah dan sayuran yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap Streptococcus mutans isolat klinis 2, yaitu jus anggur, apel, belimbing wuluh, jambu biji, kubis, dan stroberi. Aktivitas antibakteri terbesar dihasilkan oleh jus stroberi. Rentang konsentrasi hambat tumbuh minimum (KHTM) konsentrasi bunuh minimum (KBM) jus stroberi terhadap Streptococcus mutans isolat klinis 2 terletak pada rentang konsentrasi jus 6,25 12,5 % (v/v). Hasil dropping dari 15 jus buah dan sayuran uji tersebut dapat dilihat pada Gambar 7 10, Lampiran C.Tabel 4Hasil Uji Aktivitas Antibakteri, Penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM) dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) Jus Terhadap Staphylococcus aureus Isolat Klinis 1

Bahan UjiKonsentrasi (v/v)Kontrol

100%75%50%25%12,5%6,25%3,125%1,5625%0,78125%(+)(-)Jus

Alpukat++++++++++--

Anggur----++++++--

Apel---+++++++--

Bayam++++++++++--

Belimbing wuluh-+++++++++--

Brokoli++++++++++--

Buah naga++++++++++--

Jambu biji++++++++++--

Jeruk---+++++++--

Kubis--++++++++--

Pepaya++++++++++--

Seledri++++++++++--

Stroberi------++++--

Timun++++++++++--

Wortel++++++++++--

Keterangan: + : keruh

- : bening

Berdasarkan Tabel 4, diperoleh 6 jenis jus buah dan sayuran yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus isolat klinis 1, yaitu jus anggur, apel, belimbing wuluh, jeruk, kubis, dan stroberi. Aktivitas antibakteri terbesar dihasilkan oleh jus stroberi. Rentang konsentrasi hambat tumbuh minimum (KHTM) konsentrasi bunuh minimum (KBM) jus stroberi terhadap Staphylococcus aureus isolat klinis 1 terletak pada rentang konsentrasi jus 3,125 6,25 % (v/v). Hasil dropping dari 15 jus buah dan sayuran uji tersebut dapat dilihat pada Gambar 12 15, Lampiran C.Tabel 5Hasil Uji Aktivitas Antibakteri, Penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM) dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) Jus Terhadap Staphylococcus aureus Isolat Klinis 2

Bahan UjiKonsentrasiKontrol

100%75%50%25%12,5%6,25%3,125%1,5625%0,78125%(+)(-)Jus

Alpukat++++++++++--

Anggur--++++++++--

Apel---+++++++--

Bayam++++++++++--

Belimbing wuluh-+++++++++--

Brokoli++++++++++--

Buah naga++++++++++--

Jambu biji++++++++++--

Jeruk++++++++++--

Kubis--++++++++--

Pepaya++++++++++--

Seledri++++++++++--

Stroberi-----+++++--

Timun++++++++++--

Wortel-+++++++++--

Keterangan:+ :keruh

- :bening

Berdasarkan Tabel 5, diperoleh 6 jenis jus buah dan sayuran yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus isolat klinis 2, yaitu jus anggur, apel, belimbing wuluh, kubis, stroberi, dan wortel. Aktivitas antibakteri terbesar dihasilkan oleh jus stroberi. Rentang konsentrasi hambat tumbuh minimum (KHTM) konsentrasi bunuh minimum (KBM) jus stroberi terhadap Staphylococcus aureus isolat klinis 2 terletak pada rentang konsentrasi jus 6,25 12,5 % (v/v). Hasil dropping dari 15 jus buah dan sayuran uji tersebut dapat dilihat pada Gambar 16 19, Lampiran C.SIMPULAN DAN SARAN

Berdasarkan hasil penelitian, dapat disimpulkan bahwa jus stroberi memiliki aktivitas antibakteri terbesar terhadap masing-masing isolat klinis Streptococcus mutans dan Staphylococcus aureus. Hasil penapisan fitokimia menunjukan bahwa secara umum senyawa metabolit sekunder yang terkandung di dalam bahan uji adalah senyawa flavonoid dan polifenol. Nilai KHTM dan KBM jus stroberi terhadap bakteri isolat klinis S.mutans terletak pada rentang konsentrasi 6,25% v/v 12,5% v/v. Nilai KHTM dan KBM jus stroberi terhadap bakteri S. aureus isolat klinis 1 terletak pada rentang konsentrasi 3,125% v/v 6,25% v/v dan terhadap bakteri S. aureus isolat klinis 2 terletak pada rentang konsentrasi 6,25% v/v 12,5% v/v.

Dari hasil penelitian ini disarankan untuk melakukan penelusuran senyawa aktif antibakteri dari jus buah dan sayuran, khususnya yg memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri isolat klinis Streptococcus mutans dan Staphylococcus aureus sehingga dapat dijadikan sebagai dasar pengembangan formulasi sediaan obat herbal terstandar yang berguna bagi bidang kesehatan gigi dan mulut.DAFTAR PUSTAKA

Daniluk, Tokajuk G., Cylwik-Rokicka D., Rozkiewicz D., Zaremba M. L., Stokowska W. 2006. Aerobic and anaerobic bacteria in subgingival and supragingival plaques of adult patients with periodontal disease. Advances in Medical Science. 81-85.Dinas Kesehatan Provinsi Jawa Barat. 2004. Karies, Dominasi Masalah Kesehatan Gigi. Tersedia di : http://www.pdpersi.co.id. [Diakses tanggal 9 April 2011].

Febrina W.N. 2007. Perbandingan Efek Antibakteri Jus Anggur Merah (Vitis Vinifera) Pada Berbagai Konsentrasi Terhadap Streptococcus mutans. [Skripsi]. Semarang: Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro.Gagari, Kabani S. 1995. Adverse effect of mouthwash use Oral srg Oral Med Oral pathol. 80: 432-9.

Godfried E.Y. 2007. Perbandingan Efek Antibakteri Jus Stroberi (Fragariavesca L.) pada Berbagai Konsentrasi Terhadap Streptococcus mutans. [Skripsi]. Semarang: Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro.Jawetz, E., Melnick, L. Josept, Adelberg, A. Edward. 1995. Medical Microbiology. 20th Edition. Connecticut: Appleton and Lange.

Lucida, H. 2006. Determination of the ionization constant and the stablility of catechin from gambir ( Uncaria gambir (Hunter) Roxb). ASOPMS 12 International Conference, Padang.Madigan MT, Martinko JM, Brock TD. 2006. Brock Biology of Microorganisms. 11th Ed. New Jersey: Pearson Prentice Hall. 617-619.Michalek, S and J. Mcghee. 1982. Oral Streptococci with Emphasis on Streptococcus mutans. Philadelphia: Harper and Row Publisher

Ontengco, D. C., L. A. Baltazar, R. S. Santiago, R. R. Matias, and C. A. Isaac. 2003. Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Isolates from Filipino Patients (1999-2003). Phil J. Microbiol Infect Dis. 17(1) : 4-8.

Paramita K. 2007. Perbandingan Efek Antibakteri Jus Apel (Pyrus malus) Jenis Granny Smith Pada Berbagai Konsentrasi Terhadap Streptococcus mutans. [Skripsi]. Semarang: Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro.

Yulianty. 2010. Hubungan Antara Penyakit Periodontal dengan Penyakit Saluran Pernafasan. [Skripsi]. Medan: Universitas Sumatera Utara.

9