f{jsalah Seminar Ilmiah Aplikasi Isotop dan Radiasi, 2006

LDso SINAR GAMMA PADA Streptococcus agalactiae UNTUK BAHAN VAKSINIRADIASI MASTITIS PADA SAPI PERAH

T. Handayani, B. J. Tuasikal, I. SugoroPusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi - BATAN

ABSTRAK

~---::>SINAR GAMMA PADA Streptococcus agalactiae UNTUK BAHAN VAKSIN IRADIASIMAS~~PADA SAPI PERAH. Streptococcus agalactiae merupakan salah satu penyebab utama mastitispacta sapi perah yang mengakibatkan turunnya produksi susu. Percobaan ini bertujuan untuk memperolehdosis radiasi sinar gamma yang menyebabkan 50% kematian (LOsolyang selanjutnya dapat digunakan sebagaibahan vaksin mastitis. Tahapan percobaan terdiri dari pembuatan kurva tumbuh, kurva standar, danpenentuan LDso. Pembuatan kurva tumbuh dan kurva standar bakteri menggunakan Brain Heart Infusion(BHIJ broth dan BHI agar sebagai media tumbuh. Pertumbuhan diamati dengan pengukuran absorbansimenggunakan spektrofotometer pada 1..660' Kurva standar diperoleh dengan menghitung jumlah koloni bakteripada BHI agar plate. Penentuan LOsodengan meradiasi bakteri menggunakan sinar gamma pada dosis 0; 25;50; 75; dan 100 Gy. HasH percobaan menunjukkan bahwa kecepatan pembelahan maksimum (11 maks)terjadi pacta jam ke-2,5 dan kurva standar diperoleh persamaan y - 1,492x + 5,8225 (y : log jumlah bakteridan x: absorbansil. LOsoS. agalactiae diperoleh pada dosis radiasi di bawah 25 Gy.

Kata Kunci : Streptococcus agalactiae, kurva standar, dan LOso

ABSTRACT

LD.o GAMMA RAY OF Streptococcus agalactiae AS MASTITIS VACCINE IRRADIATED INDAIRY COW. Streptococcus agalactiae is a major mastitis agent that decreased the milk production. Theexperiment has been carried out to find the gamma radiation doses that caused 50% mortality (LOso)onmastitis vaccine agent. The parameters observed were measurement of growth curve, standard curve andLOso.Growth curve and standard curve used Brain Heart Infusion (BHIJ broth and BHI agar as growth media.The growth of bacteria was measured by spectrophotometre A;;6Q. Standard curve was measured by total platecount in BHI agar. The doses of LOsowere 0; 25; 50; 75 and 100 Gy. The results showed that the rate ofmaximum growth occured in 2,5 h and the formula of standard curve was y - 1,492x + 5,8225 (y : log ofbacteria number and x: absorbance). The dose of LOsowas below of 25 Gy.

Key Words: S. agalactiae, standard curve, and LDso

PENDAHULUAN

Subsektor peternakan telah dan akan terusberperan dalam pemantapan ketahanan pangan.Dengan laju pertambahan penduduk sebesar1,45%, diperkirakan kebutuhan bahan panganasal ternak semakin meningkat sekitar dua kalidari saat ini. Dalam hal ini inovasi teknologiveteriner, kesehatan hewan merupakan satukomponen yang penting. Penyakit pada hewanmemiliki dampak sosial ekonomi yang luas,maka diperlukan teknologi biologi molekuler,teknologi diagnostik yang cepat dan akurat sertatersedianya vaksin yang mudah diaplikasikan (1).

Salah satu penyakit yang menjadipenyebab rendahnya produktivitas sapi perah diIndonesia adalah penyakit mastitis. Mastitisadalah penyakit dengan gejala peradangan padakelenjar air susu (ambing) yang dapatmengakibatkan penurunan produksi air susu.Tingkat keparahan dan intensitas mastitis sangatdipengaruhi oleh organisme penyebabnya.Beberapa organisme penyebab mastitis adalahStreptococcus agalactiae, S. dysgalactiae, S. uberisdan Staphylococcus aureus (2,3).

Menurut Searcy et. al., mastitis subklinismerupakan problema di peternakan sapi perahkarena menyebabkan terjadi kerugian ekonomiyang cukup besar seperti adanya penurunanproduksi susu, memerlukan biaya pengobatanbagi sapi sakit, dan sapi yang berulang terkenamastitis harus dikeluarkan dari peternakan lebihdini (culling). Selama ini pengobatan hanyadilakukan pada sapi yang secara klinismenunjukkan gejala sakit dengan pemberianantibiotik dalam jangka waktu lama. Pengobatandengan antibiotik tersebut diketahui banyakmenimbulkan efek samping, diantaranyaakumulasi residu antibiotik dalam produk hewanyang dapat mergikan masyarakat konsumen (4,5).Kandungan residu obat yang melebihi batasmaksimum menyebabkan daging dan susu tidakaman dikonsumsi karena timbul reaksi alergi,keracunan, resistensi mikroba tertentu ataumengakibatkan gangguan fisiologis pada manusia(6,7).

Dengan demikian perlu dilakukanpenelitian mengenai upaya pencegahan mastitistanpa penggunaan antibiotika. Misalnyapemanfaatan S. agalactiae sebagai kandidat

189

Risalah Seminar 11miah Aplikasi Isotop dan Radiasi, 2006

vaksin dengan teknik radiasi yang dapatmenurunkan infektivitas, virulensi danpatogenitas agen penyakit tetapi diharapkanmampu merangsang timbulnya kekebalan padatubuh terhadap infeksi penyakit (81. Selanjutnya,penggunaan obat-obatan seperti antibiotika yangdiketahui mempunyai berbagai macam efeksamping pada ternak maupun pada masyarakatkonsumen dapat dikurangi atau bahkanditiadakan.

Terkait dengan hal tersebut di atas dansebagai tindak lanjut dari percobaan sebelumnya,maka percobaan ini dilakukan untukmemperoleh dosis radiasi yang menyebabkankematian 50% (LD5ol. Selanjutnya bakteri S.agalactiae terse but dapat digunakan sebagaibahan vaksin mastitis pada sapi dengan teknikradiasi.

BAHAN DAN METODE

Bahan dan peralatanIsolat bakteri Streptococcus agalactiae yang

digunakan dalam percobaan ini berasal darikasus mastitis di Kecamatan Cilawu, KabupatenGarut. Medium untuk pertumbuhan S. agalactiaeyaitu Brain Heart Infusion {BHI} agar, dan BHIbroth (Oxoid TMI. Iradiasi kultur bakterimenggunakan irradiator gamma chamber diPATIR - BATAN. ~

Pembuatan Kurva TumbuhKultur bakteri dipermuda dengan cara

mengambil satu ase isolat S. agalactiae ke dalammedium BHI agar miring, selanjutnya disimpandi inkubator pada suhu 37°C selama semalam.Kultur yang tumbuh diambil lima ase untukdiinokulasikan ke dalam medium BHI broth 50

ml dan diinkubasi pada inkubator shaker dengansuhu 39°C pada agitasi 120 rpm. Selanjutnyadiukur absorbansinya pad a 0; 0,5; 1; ; 4jam menggunakan spektrofotometer UV-VisHitachi model 100 - 50 pada panjang gelombang660 nm

Kurva Standar

Inokulum pada BHI agar miring yang telahdipermuda diinokulasikan sebanyak lima asekedalam Erlenmeyer yang berisi BHI broth 50 ml,kemudian diinkubasi ke dalam inkubator shaker

pada suhu 39°C dan agitasi 120 rpm. Sebanyakenam tabung reaksi diisi masing-masing denganinokulan dan BHI broth steril denganperbandingan antara Inokulan : BHI broth adalah0:3; 0,5:2,5; 1:2; 1,5:1,5; 2:1; dan 2,5:0,5.Kemudian masing-masing diukur absorbansinyadan dari masing-masing tabung reaksi diambilsebanyak 0,1 ml kemudian dimasukkan ke dalamtabung eppendorf yang telah diisi dengan 0,9 ml

190

NaCI 0,85% dan dilakukan pengenceran berseridari 10.1 sampai 10.12• Selanjutnya padapengenceran 10.5 sampai dengan 10.12 diambilsebanyak 0,1 ml untuk ditanam pada media BHIagar plate. Seluruh plate disimpan dalaminkubator selama satu malam pada suhu 37°C.Koloni yang tumbuh dihitung dan dibuat kurvastandar dengan y = log jumlah sel/ml dan x =absorbansi (9).

Penentuan Lethal Dose (LD)5oSinar GammaIsolat bakteri S. agalactiae yang berumur

satu hari diambil sebanyak lima ase dandimasukkan kedalam erlenmeyer yang berisi BHIbroth 50 ml, kemudian inokulum di agitasi 120rpm, pada suhu 39°C. Inokulum diukurabsorbansinya dengan spektrofotometer dan hasilpengukuran absorbansi terse but kemudiandimasukkan ke persamaan garis kurva standaruntuk mengetahui jumlah volume yangditambahkan dalam 50 ml inokulum agardiperoleh jumlah sel 108 sel/ml.

Dari kultur 50 ml dengan jumlah selbakteri 108 sel/ml, diambil 30 ml sebagaiinokulum dan dimasukkan ke tabung sentrifuge.Tabung disentrifuge dengan kecepatan 10.000rpm, pada 4°C selama 10 menit. Setelah itusupernatan dibuang dan pelet yang tertinggaldicuci dengan NaCl, sentrifuge diulang sebanyak3 kali. Pelet dilarutkan dengan NaCI sebanyak 30ml Uumlah sel bakteri 108 sel/ml), kemudiandimasukkan ke dalam 5 tabung masing-masingsebanyak 5 ml. Bakteri diradiasi denganmenggunakan sinar gamma masing-masing padadosis yaitu 0 Gy; 25 Gy; 50 Gy; 75 Gy; dan 100Gy. Setelah itu bakteri ditanam pada BHI agarplate dari pengenceran 10.5 sampai 10.12 dandiinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam.Koloni bakteri yang tumbuh dihitung untukpenentuan LD5o,

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pertumbuhan S. agalactiae mengalami 3fase yaitu fase adaptasi (lag), fase eksponensial(log), dan fase stasioner [Gambar 1). Faseadaptasi merupakan masa penyesuaian bagibakteri dan tidak terjadi pertambahan jumlah seldan terjadi hingga jam ke-1,5. Fase eksponensialterjadi hingga jam ke-3,5. Fase ini merupakanfase pertumbuhan yang memiliki lajupertumbuhan spesifik, yaitu laju pembelahan selyang tetap (10). Selanjutnya fase stasioner yaitusaat jumlah sel mencapai maksimal, lajupembiakan berkurang dan beberapa sel matiyang ditunjukkan oleh menyusutnya nutriendalam media. Fase stasioner terjadi pada jam ke3,5 - 4 jam.

Risal3h Sel ..inar II/T1iah Aplikasi Isotop dan Radiasi, 2f)(J(j

Waktu ijam)

Gambar 1. Kurva pertumbuhan bakteri S. agalactiae padaBRI broth dengan suhu inkubasi 39°C danagitasi120rpm

~=---------1.~. n__.._ n--------~--1- F "-"-'--" .'co -- ----- .... Fl·:O .. ". -- . :C .8' -.-.- .... '

I .e ' ,o 0.6co

~ 0.40.2

oo 0.5

penghematan media dan waktunya relatif singkat(9). Sebagai contoh apabila kultur S. agalactiaeyang berumur 2,5 jam memiliki nilai absorbansi1, maka jumlah sel berdasarkan persamaan kurvastandar di at as adalah 107.31S4.

1.50.5

i-=- 8 ,-_-_- _n_. -l, I 'I = I

. ~7.~-~ ... n •• _ -- I'i .. I.t 6.5 y -1.09b· 58255

J 6 R' -0:9854 iI

o I

43.532.521.5

Kecepatan pembelahan sel bakteri S.agalactiae clapat diperoleh dengan mengukurabsorbansi sel tiap jam sehingga akan diperolehpembelahan sel bakteri tiap jam. Penghitungankecepatan pembelahan sel menggunakan rumus~ - (lnxt-lnxto)/(t-to)' Kecepatan pembelahanmaksimum (p maks) terjadi pada jam ke-2,5.Waktu 2,5 jam tersebut digunakan sebagai umurkultur yang akan diiradiasi. p maks adalah waktudi mana sel melakukan aktivitas metabolisme

yang tinggi clan memiliki membran sel yang tipis.Efek iradiasi lebih optimal bila umur kultur yangdiiradiasi tepat pada saat p maks (Ill.

Gambar2. Kurvastandar pertumbuhanS. agalactiaedalammediumBRI broth

Hasil iradiasi kultur bakteri menunjukkanbahwa dosis radiasi yang digunakan belummendapatkan nilai dosis untuk LDso (Tabel 2 danGambar 3). Dosis LDso masih di bawah 25 Gysehingga diperlukan percobaan lebih lanjut. LDsoadalah dosis iradiasi yang mampu menyebabkankematian sel hingga 50 % dari total populasi.Dengan kata lain, bakteri yang akan digunakansebagai bahan vaksin adalah bakteri yang 50%bertahan hidup setelah perlakuan pada dosisradiasi tertentu.

Tabel1. Kecepatan Pembelahan S. agalactiae, berdasarkanabsorbansi diukur dengan spektrofotometer padapanjanggelombang660nm

Tabel2. HasH penghitungan jumlah koloni S. agalactiae

setelah diradiasi dengan berbagai dosis radiasigamma

Gambar3. Viabilitassel bakteri S. agalactiae setelahdiradiasidenganberbagaidosisradiasigamma

Dosis(Gy) Jumlahsellml% Viabilitas0

1,69x109 10025

6,10x10836,150

2,40x10814,275

1,05x1086,21100

WaktuUam)Absorbansi\I (selljaml

0

0.04 0

0:50.01-2.77259

1.0

0.01 0

1.5

0.021.386294

2.0

0.051.832581

2.5

0.182.561868

3.0

0.522.121744

3.5

1.021.347458

4.0

1.030.019512

Keterangan:\1= kecepatanpembelahanselljam

Berdasarkan penghitungan jumlah koloniyang tumbuh pada agar plate diperoleh kurvastandar bakteri S. agalactiae mengikutipersamaan y - 1,492x + 5,8225 (Gambar 21.Persamaan terse but akan digunakan untukmenghitung secara tidak langsung dari kulturbakteri yang akan diiradiasi. Keuntungan daripembuatan kurva standar adalah untukmendapatkan kemudahan penelitian,

1009080

:(I 70= 60

:g 50> 40~ 30

2010o

o 25

y = 95,414E!-O,0371x

R2 = 0.9979

50 75

Dosis (Gy)

100

191

MastitisMakalah

ProgramPertanian

RisaJah Seminar Ilmiah Aplikasi Isot"P dan Joadiasi, 2006

Sel bakteri yang terkena sinar gamma akanmenyebabkan terjadinya kematian sel, sel tetaphidup normal, sel tetap hidup tetapi mengalamimutasi, atau sel akan mati setelah beberapagenerasi (apoptosis) (11). Dalam percobaan inidiharapkan sel bakteri S. agalactiae akan dapatdilemahkan dengan sinar gamma yang ditandaidengan menurunnya infektivitas, virulensi danpatogenitas tetapi diharapkan mampume rang sang timbulnya kekebalan pada tubuhterhadap infeksi penyakit.

KESIMPULAN

LDso sinar gamma pada bakteriStreptococcus agalactiae berada pada dosisdibawah 25 Gy, sehingga perlu dilakukanpenelitian lanjutan untuk memperoleh dosis yangtepat.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penulis mengucapkan terima kasih padaBpk Dinardi dan Ibu Yusneti atas kerjasamanyayang telah membantu penelitian ini.

DAFTAR PUSTAKA

1. ANONIMUS. Seminar Nasional: TeknologiPeternakan dan Veteriner 2006. BadanPenelitian dan PengembanganPertanian. Departemen Pertanian.2006. Hal. viii-ix.

2. DUVAL, J. Treating mastitis withoutantibiotics. Ecological AgricultureProjects. http;/l:w:ww.eap.mcgill.ca/Publicatious/EAP69.htm. 1997. [15­12-2000].

3. SUBRONTO. Ilmu Penyakit Ternak 1. GadjahMada University Press. 1989. Hal.328-329.

192

4. SEARCY, R., O. REYES, G. GUAJARDO.Control of Subclinical bovine mastitis.

British Homeopathic Journal. April1995.Vol. 84 : 67-70.

5. PARYATI, S.P.Y., PatogenesisSubklinis Pada Sapi Perah.Pengantar Falsafah SainsPasca Sarjana. InstitutBogor. 2002

6. RESURRECCION, A.V.A. and F.C.F. GALVES.Will Consumers Buy Irradiated beef?Food Techno. 1999.53:52-55

7. KHODIJAH, S., TUASIKAL, B.J., SUGORO, 1.,dan YUSNET1. Pertumbuhan

Streptococcus agalactiae Sebagai bakteripenyebab Mastitis Subklinis Pada SapiPerah. Seminar Nasional TeknologiPeternakan dan Veteriner 2006. Badan

Penelitian dan PengembanganPertanian. Departemen Pertanian.(Belum diterbitkan)

8. SUGORO, 1. Per an an Teknik Nuklir di BidangPeternakan. 22 Mei 2004. Kompas No.20 (41

9. YUSNETI, dan DINARDI, Kurva StandarIsolat Bakteri Streptococcus agalactiae.BATAN.2005. Makalah unpublish

1O.MANGUNWIDJAJA, D., dan SURY ANI, A.,Teknologi Bioproses. PenebarSwadaya. 1994. Hal. 15-17.

11. SUGORO, 1., Modul Kuliah : RadiobiologiDasar. UIN Syarif HidayatullahJakarta. (2005)