LAPORAN PRAKTIKUM

ISOLASI DNA GENOM, PCR, ELEKTROFORESIS

Disusun oleh :

Weda Kusuma

G0007025

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

2007

ISOLASI DNA GENOM, PCR, DAN ELEKTROFORESIS

I. TUJUANA. Isolasi DNA genom

- Mahasiswa memahami dan mampu melakukan isolasi DNA genomB. PCR

- Mahasiswa memahami dan mampu melakukan PCR- Mahasiswa mampu mengamplifikasi intron III dan IV dari hormon pertumbuhan sapi

C. Elektroforesis- Mahasiswa memahami dan mampu melakukan elektroforesis- Mahasiswa menentukan berat molekul sampel DNA

II. DASAR TEORI

III. ALAT DAN BAHANA. Isolasi DNA genom

Alat:1. Mikropipet dan tip2. Sentrifuge3. Almari pendingin4. Vortex

Bahan:1. Darah sapi2. Nuklei lysis solution3. Protein precipitation solution4. DNA rehydration solution5. Cell lysis solution6. Isopropanol7. Etanol 70%

B. PCRAlat:1. Satu set perangkat PCR2. Mikropipet dan tip

Bahan:1. DNA template (hasil isolasi DNA

genom) 1 μl2. Primer 1 0,5 μl3. Primer 2 0,5 μl4. MgCl2 1,5 μl5. Taq Buffer 2,5 μl6. dNTP mix 0,5 μl7. ddH2O 15,3 μl8. Taq Polimerase 0,2 μl

C. ElektroforesisAlat:1. Satu set perangkat elektroforesis2. Mikropipet dan tip3. Lampu UV4. Power supply5. Parafilm

Bahan:1. DNA marker2. DNA sampel3. Ethidium Bromida4. ddH2O5. Gel Agarose6. Loading buffer7. Buffer TAE 10 X 10 mL

- Tris Base 24,2 gr- As. Asetat glacial 5,31 mL- EDTA 0,5 mM 10 mL

IV. CARA KERJAA. Isolasi DNA genom

1. Siapkan 300 μl sampel darah, tambahkan 900 μl cell lysis solution, homogenkan dan inkubasi selama 10 menit pada suhu kamar

2. Sentrifugasi selama 20 detik pada kecepatan maksimum (14.000 rpm)3. Buang supernatan, pelet di vortex4. Tambahkan 300 μl nuclei lysis solution, campurkan dengan membolak-balikkan

tabung5. Tambahkan 100 μl protein precipitation solution , vortex selama 20 detik6. Sentrifugasi selama 3 menit, 14.000 rpm7. Pindahkan supernatan ke dalam tabung yang baru, tambahkan 300 μl isopropanol.

Campurkan dengan membolak-balikkan tabung hingga terbentuk benang-benang putih DNA

8. Sentrifugasi 3 menit9. Buang supernatan, tambahkan etanol 70%10. Sentrifugasi 3 menit11. Buang supernatan, tarik sisa etanol dengan pipet. Kering-udarakan pelet selama 10-

15 menit, sampai pelet berwarna putih12. Tambahkan 100 μl DNA rehydration solution, biarkan semalam pada suhu 4C

hingga DNA mengalami rehidrasi secara sempurna13. Simpan hasil isolasi DNA untuk praktikum selanjutnya

B. PCR 1. Rancang primer sesuai kebutuhan. Tentukan Tm dari masing-masing primer untuk

menentukan suhu annealing2. Rancang siklus yang akan digunakan, program alat sesuai rancangan tersebut.

Rancangan program untuk praktikum ini adalah3. Masukkan campuran PCR dalam tabung PCR4. Letakkan tabung dalam mesin PCR, jalankan mesin. Setelah proses amplifikasi

selesai hasilnya disimpan dalam suhu 4C, diperiksa dengan elektroforesisC. Elektroforesis

1. Prosedur pembuatan gela. 0,5 gr agarose dilarutkan ke dalam TAE 10 X 50 mL yang terdiri dari Tris Base

24,2 gr, asam asetat glacial 5,31 mL, EDTA 0,5 mM 10 mLb. Panaskan sampai mendidih/larut sempurna lalu didiamkan sampai suhunya

turun sekitar 50C. Sementara itu siapkan cetakan gel dan comb-nyac. Larutan agarose ditambah dengan 2 μl ethidum bromidad. Tuangkan ke dalam cetakan lalu dibiarkan pada suhu kamar sampai mengeras.

Gel yang telah jadi dapat disimpan dalam buffer TAE sampai digunakan2. Prosedur elektroforesis

a. Siapkan tanki elektroforesis, isi dengan buffer TAE yang telah mengandung EtBr

b. Masukkan gel ke dalam larutan tersebut, tarik comb dari sumur gelc. Sampel DNA yang akan dielektroforesis dicampur dengan loading buffer dan

DNA ladder lalu dimasukkan ke sumur-sumur geld. Tutup tanki dan sambungkan dengan power supply, pastikan arah gel tidak

terbalik. Tentukan arus yang digunakan sekitar 120 Ve. Lakukan proses elektroforesis sampai penanda laju migrasi samapi di bagian

bawah gel.f. Matikan arus listrik, angkat gel lalu letakkan pada wadah plastik

g. Hasil elektroforesis dilihat di bawah paparan sinar UV lalu dibuat dokumentasinya

h. Tentukan ukuran DNA sampel dan jumlahnya

V. HASIL DAN PEMBAHASANPraktikum ini bertujuan untuk mengisolasi DNA genom dari sampel yaitu darah sapi

yang kemudian akan dilipatgandakan secara in vitro menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) sehingga menghasilkan fragmen DNA spesifik sesuai dengan yang kita inginkan dalam jumlah banyak dan waktu singkat meskipun berasal dari DNA yang jumlahnya sedikit sekali. Hasil dari PCR tersebut dapat diperiksa dengan proses elektroforesis dan dilihat di bawah paparan sinar UV untuk mengetahui ukuran dari DNA genom yang berasal dari darah sapi tersebut.

Proses pertama yang dilakukan adalah mengisolasi DNA genom dari suatu sampel yang pada praktikum kali ini diperoleh dari darah sapi yang berwarna merah segar. Prosedur pengerjaan isolasi DNA genom ini berbeda dengan isolasi DNA plasmid yang menggunakan metode lisis dalam keadaan alkali. Pada mamalia, DNAnya berada pada sel darah putih sehingga untuk mengisolasinya dapat dilakukan dengan sentrifugasi berulang. Langkah pertama yang dilakukan ialah mengambil 300 μl sampel darah yang kemudian dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan ditambahkan 900 μl cell lysis solution ke dalamnya. Solution ini berfungsi untuk melisiskan sel darah merah. Kemudian tabung eppendorf dibolak-balikkan hingga tercampur dan diinkubasikan dalam suhu kamar selama 10 menit. Langkah kedua ialah melakukan sentrifugasi pada tabung eppendorf tadi pada kecepatan maksimum 14.000 rpm selama 20 detik. Prosedur sentrifugasi harus dilakukan dalam keadaan seimbang, jarak lubang antara tempat menaruh eppendorf satu dengan lainnya harus sama, sehingga untuk menyeimbangi tabung eppendorf yang berisi darah yaitu dengan menaruh tabung eppendorf berisi aquabidest dengan jarak lubang yang sama. Setelah sentrifugasi maka akan didapatkan pellet sel darah putih. Pellet tersebut kemudian di vortex agar sel darah putih tersebut terlarut kembali setelah sebelumnya supernatan dibuang terlebih dahulu. Langkah selanjutnya ialah menambahkan 300 μl nuclei lysis solution untuk melisis inti sel darah putih dan mencampurnya dengan membolak-balikkan tabung tersebut. Setelah itu ditambahkan 100 μl protein precipitation solution untuk mengendapkan protein serta sisa-sisa sel yang tidak terpakai, yang kemudian di vortex selama 20 detik agar larutan menjadi homogen. Langkah berikutnya dilakukan sentrifugasi kembali selama 3 menit dengan kecepatan 14.000 rpm agar protein dan sisa sel benar-benar mengendap. Kemudian supernatan dipindahkan pada tabung eppendorf baru dan menambahkan 300 μl isopropanol kedalamnya serta membolak-balikkan tabung tersebut hingga tercampur dan terbentuk benang-benang putih DNA. Sentrifugasi kembali dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit. Kemudian supernatan dibuang, ditambahkan etanol 70% kedalamnya, dan disentrifugasi lagi selama 3 menit. Isopropanol dan etanol 70% ini berfungsi untuk menarik molekul air dari DNA sehingga DNA dapat mengendap. Setelah disentrifugasi, supernatan dibuang, tarik sisa etanol dengan pipet, dan kering-udarakan pellet selama 10-15 menit sampai pellet berwarna putih. Setelah itu, tambahkan 100 μl DNA rehydration solution pada tabung untuk proses rehidrasi pada DNA dan inkubasikan semalam pada suhu 4C agar proses tersebut berjalan sempurna.

Setelah proses pengisolasian DNA selesai, dapat dilakukan Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk mengamplifikasi DNA (memperbanyak suatu sekuens atau fragmen spesifik dari total DNA yang ada), sehingga dalam teknik PCR tidak diperlukan sejumlah DNA yang banyak. Pada praktikum ini, yang diamplifikasi ialah intron III dan IV dari

hormon pertumbuhan sapi. Teknik PCR ini melalui tiga tahap yaitu denaturasi, annealing, dan ekstensi.

Teknik PCR ini diawali dengan memasukkan DNA template yang berasal dari isolasi DNA genom darah sapi sebelumnya sebanyak 1 μl ke dalam tabung. Kemudian ditambahkan sepasang primer yang masing-masing sebanyak 0,5 μl. Sepasang primer ini merupakan suatu oligonukleotida pendek yang dirancang khusus untuk memperbanyak sekuens target (dalam praktikum ini adalah intron III dan IV dari gen hormon pertumbuhan sapi) dalam reaksi polimerase berulang ini. Kedua primer tersebut ialah GH5 sebagai primer forward dan GH6 sebagai primer reverse. GH5 : 5’ – AGAATCAGGCCCAGCAGAAATC – 3’GH6 : 5’ – GTCGTCACTGCGCATGTTTG – 3’Langkah selanjutnya adalah menambahkan dNTP mix 0,5 μl yang terdiri dari dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP. Kemudian ditambahkan Taq Polymerase 0,2 μl, ddH2O 15,3 μl, dan Taq buffer 2,5 μl untuk arus listrik. Untuk meningkatkan spesifikasi DNA ditambahkan MgCl2.

Tabung yang berisi berbagai larutan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR. Untuk denaturasi awal dilakukan hot start pada suhu 94C selama 5 menit agar DNA terdenaturasi sempurna. Kemudian diikuti dengan 30 siklus dengan tiap siklus melalui tahapan denaturasi pada suhu 94C selama 45 detik, annealing pada suhu 60C selama 45 detik, dan ekstensi pada suhu 72C selama 1 menit. Suhu 72C pada proses ekstensi merupakan suhu optimum bagi taq polymerase untuk bekerja karena taq polymerase tersebut berasal dari bakteri Thermus aquaticus yang merupakan bakteri thermofilik yang aktif pada suhu tinggi. Pada akhir proses ini ditambahkan proses ekstensi selama 5 menit untuk memastikan seluruh proses ekstensi telah selesai. Mesin PCR kemudian secara otomatis menurunkan suhu menjadi 4C.

Tahapan-tahapan dalam proses PCR dapat dilihat pada bagan berikut:.........

Hasil pelipatgandaan DNA dari proses PCR kemudian dapat dilihat dengan proses elektroforesis. Elektroforesis merupakan teknik pemisahan senyawa yang bermuatan dengan meletakkan pada suatu medan listrik sehingga terjadi separasi material yang dibedakan berdasarkan muatan dan ukuran molekul. Dengan elektroforesis, DNA hasil PCR dapat diketahui ukurannya. Pada praktikum kali ini, jenis elektroforesis yang digunakan ialah elektroforesis zona yaitu menggunakan media penunjang yaitu agrose, suatu polisakarida yang dapat melewatkan molekul-molekul besar. Elektroforesis yang dilakukan ialah sistem horizontal. DNA yang bermuatan negatif akan bergerak ke arah kutub positif melalui molekul-molekul agarose.

Proses elektroforesis diawali dengan pembuatan gel sebagai medianya yaitu 0,5 gr agarose dilarutkan ke dalam TAE 10 X 50 mL yang telah dibuat sebelumnya yang terdiri dari Tris Base 24,2 gr, asam asetat glacial 5,31 mL, EDTA 0,5 mM 10 mL. EDTA merupakan salah satu komposisi pembentukan gel dan buffer yang berfungsi sebagai salah satu alat bantu untuk mengalirkan DNA sampel pada buffer. Kemudian tambahkan 2 μl ethidium bromida (EtBr) yaitu pewarna yang dapat menyisip atau interkalasi diantara basa DNA pada dua utas DNA yang berlainan sehingga pada saat dibawah paparan sinar UV dapat berpendar. Setelah itu, tuangkan ke dalam cetakan lalu dibiarkan pada suhu kamar sampai mengeras. Gel yang telah jadi dapat disimpan dalam buffer TAE.

Langkah berikutnya ialah menyiapkan tanki elektroforesis yang telah diisi buffer TAE. Kemudian masukkan gel kedalamnya dan tarik comb dari sumur gel. Sampel DNA yang akan dielektroforesis dicampur dengan loading buffer, yang terdiri dari sukrosa sebagai pemberat agar sampel dapat tenggelam ke dasar gel dan tidak melayang ke luar dan pewarna yang menandai kemajuan proses elektroforesis dan menentukan kapan

saatnya harus menghentikan proses yaitu Bromophenol blue (4 kbp), Xylene cyanol (100 bp), dan Orange G (50 bp), dan kemudian diletakkan pada parafilm sebelum ditaruh di sumur-sumur gel. Setelah itu, masukkan juga DNA ladder sebagai marker DNA. Kemudian tutup tanki, sambungkan dengan sumber listrik (120 V), dan tunggu hingga penanda laju migrasi sampai di bagain bawah gel. Matikan arus listrik, angkat gel lalu letakkan pada wadah plastik. Hasil elektroforesis yang dilihat di bawah paparan sinar UV menunjukkan bahwa terbentuk band pada keempat sumuran. Namun masing-masing fragmen mempunyai ukuran sama dan berbeda. Pada sumuran 1, 2, dan 4 ukuran fragmen yang ditunjukkan adalah sama yaitu 223 bp. Sedangkan pada sumuran ke-3 ukuran fragmen berbeda dengan lainnya yaitu 171 bp.

VI.

DAFTAR PUSTAKA