1.1Latar Belakang

Bioteknologi adalah cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan makhluk hidup (bakteri,

jamur, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup (enzim, alkohol) dalam proses

produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. Dewasa ini, perkembangan bioteknologi tidak

hanya didasari pada biologi semata, tetapi juga pada ilmu-ilmu terapan dan murni lain, seperti

biokimia, komputer, biologi molekular, mikrobiologi, genetika, kimia, matematika, dan lain

sebagainya (www.id.wikipedia.org).

Dengan kata lain, bioteknologi adalah ilmu terapan yang menggabungkan berbagai cabang

ilmu dalam proses produksi barang dan jasa. Bioteknologi secara sederhana sudah dikenal oleh

manusia sejak ribuan tahun yang lalu. Sebagai contoh, di bidang teknologi pangan adalah

pembuatan bir, roti, maupun keju yang sudah dikenal sejak abad ke-19, pemuliaan tanaman

untuk menghasilkan varietas-varietas baru di bidang pertanian, serta pemuliaan dan reproduksi

hewan (www.id.wikipedia.org).

Di bidang medis, penerapan bioteknologi di masa lalu dibuktikan antara lain dengan

penemuan vaksin, antibiotik, dan insulin walaupun masih dalam jumlah yang terbatas akibat

proses fermentasi yang tidak sempurna. Perubahan signifikan terjadi setelah penemuan

bioreaktor oleh Louis Pasteur. Dengan alat ini, produksi antibiotik maupun vaksin dapat

dilakukan secara massal (www.id.wikipedia.org).

Pada masa ini, bioteknologi berkembang sangat pesat, terutama di negara negara maju.

Kemajuan ini ditandai dengan ditemukannya berbagai macam teknologi semisal rekayasa

genetika, kultur jaringan, DNA rekombinan, pengembangbiakan sel induk, kloning, dan lain-

lain. Teknologi ini memungkinkan kita untuk memperoleh penyembuhan penyakit-penyakit

genetik maupun kronis yang belum dapat disembuhkan, seperti kanker ataupun AIDS.

Penelitian di bidang pengembangan sel induk juga memungkinkan para penderita stroke

ataupun penyakit lain yang mengakibatkan kehilangan atau kerusakan pada jaringan tubuh

dapat sembuh seperti sediakala. Di bidang pangan, dengan menggunakan teknologi rekayasa

genetika, kultur jaringan dan DNA rekombinan, dapat dihasilkan tanaman dengan sifat dan

produk unggul karena mengandung zat gizi yang lebih jika dibandingkan tanaman biasa, serta

juga lebih tahan terhadap hama maupun tekanan lingkungan. Penerapan bioteknologi di masa

ini juga dapat dijumpai pada pelestarian lingkungan hidup dari polusi.Sebagai contoh, pada

penguraian minyak bumi yang tertumpah ke laut oleh bakteri, dan penguraian zat-zat yang

bersifat toksik (racun) di sungai atau laut dengan menggunakan bakteri jenis baru.Kemajuan di

bidang bioteknologi tak lepas dari berbagai kontroversi yang melingkupi perkembangan

teknologinya.Sebagai contoh, teknologi kloning dan rekayasa genetika terhadap tanaman

pangan mendapat kecaman dari bermacam-macam golongan.Bioteknologi secara umum berarti

meningkatkan kualitas suatu organisme melalui aplikasi teknologi. Aplikasi teknologi tersebut

dapat memodifikasi fungsi biologis suatu organisme dengan menambahkan gen dari organisme

lain atau merekayasa gen pada organisme tersebut(www.id.wikipedia.org).

1.2Tujuan

Setiap acara praktikum memiliki tujuan dan output masing-masing sebagai berikut:

1.2.1. Visualisasi Ekstraksi DNA

1. Mengetahui cara mengekstraksi DNA secara sederhana

2. Melihat presipitasi DNA

1.2.2. Elektroforesis

Mengetahui cara kerja serta manfaat dari elektroforesis

1.2.3. Analisis sequen DNA dengan Blast

Mengindentifikasi kekerabatan terdekatsequen DNA isolate

1.2.4. Pengolahan Data Hasil Identifikasi Sequen Menggunakan Program

BioInformatika

Mengetahui cara membuat pohon filogenik yang menunjukan tingkat kekerabatan

terdekat dengan mikroorganisme yang lain.

1.3. Manfaat Praktikum

Adapun manfaat dari praktikum ini adalah :

1. Praktikan dapat mengetahui cara mengekstraksi DNA secara sederhana dan melihat

presipitasi DNA.

2. Praktikan dapat mengidentifikasi kekerabatan terdekat pada DNA sequen isolate.

3. Praktikan dapat membuat pohon filogenik dimana pohon filogenik tersebut dapat

menunjukan kekerabatan terdekat dengan mikroorganisme lainnya.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1.Deoxyribose Nucleic Acid (DNA)

DNA, Deoxyribose Nucleic Acid adalah asam nukleotida, biasanya dalam bentuk heliks

ganda yang mengandung instruksi genetik yang menentukan perkembangan biologis dari

seluruh bentuk kehidupan sel. DNA berbentuk polimer panjang nukleotida, mengkode barisan

residu asam amino dalam protein dengan menggunakan kode genetik, sebuah kode nukleotida

triplet. DNA seringkali dirujuk sebagai molekul hereditas karena ia bertanggung jawab untuk

penurunan sifat genetika dari kebanyakan ciri yang diwariskan. Pada manusia, ciri-ciri ini

misalnya dari warna rambut hingga kerentanan terhadap penyakit. Selama pembelahan sel,

DNA direplikasi dan dapat diteruskan ke keturunan selama reproduksi

(www.id.wikipedia.org).

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur

perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus,

mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk

linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan

kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA

mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal

dari garis ibu (Semagn, K., Bjornstad, A., Ndjiondjop, M.N, 2006).

DNA bukanlah suatu molekul tunggal, nampaknya ia adalah sepasang molekul yang

digandeng oleh ikatan hidrogen: DNA tersusun sebagai untai komplementer dengan ikatan

hidrogen di antara mereka. Masing-masing untai DNA adalah rantai kimia batu bata penyusun,

yakni nukleotida, yang terdiri dari empat tipe: Adenine (A), Cytosine (C), Guanine (G) dan

Thymine (T). DNA mengandung informasi genetika yang diwariskan oleh keturunan dari suatu

organisme; informasi ini ditentukan oleh barisan pasangan basa. Sebuah untai DNA

mengandung gen, sebagai cetak biru organisme. DNA membuat genom organisme (Semagn,

K., Bjornstad, A., Ndjiondjop, M.N, 2006).

2.1.1 Struktur DNA

DNA adalah polimer, lebih tepatnya, suatu himpunan dua polimer yang terbelit. Tiap-tiap

monomer yang menyusun polimer ini adalah nukleotida yang terdiri dari tiga elemen: fosfat,

gula dan basa [2]. Gula dan fosfat dari seluruh nukleotida seluruhnya sama, tetapi nukleotida

dapat dibedakan dengan meninjau komponen basanya menjadi empat tipe, termasuk dua

kategori, purin: Adenine (A) dan Guanine (G) yang memiliki dua siklus organik dan pirimidin:

Cytosine (C) dan Thymine (T), yang memiliki satu siklus organik(www.id.wikipedia.org).

Satu pengamatan penting yang menuntun Watson dan Crick ke penemuan terkenal dari

struktur heliks ganda DNA adalah, basa cenderung berpasangan melalui ikatan hidrogen, dan

pasangan yang terbentuk oleh purin dan pirimidin memiliki ukuran yang hampir sama,

sehingga pasangan-pasangan demikian membentuk struktur dua rantai nukleotida berikatan

hidrogen yang sangat teratur. Untuk memahami mengapa dua rantai nukleotida terkait

membentuk heliks ganda, maka harus ditinjau interaksi antara grup penyusun nukleotida

(www.id.wikipedia.org).

Terdapat dua kelas interaksi dasar yang menstabilkan struktur heliks ganda:

ikatan hidrogen antara basa-basa komplementer;

interaksi tumpukan (stacking interaction) dari plateu pasangan basa.

Barisan pasangan basa dalam DNA mengkode informasi untuk mensintesa protein, adalah

polimer yang terdiri dari 20 asam amino berbeda. Dalam kaitan dengan gen, DNA

mengandung daerah tak terkode yang peranannya belum sepenuhnya dipahami. Selama

replikasi DNA, yang terjadi selama pembelahan sel, misalnya, molekul dikopi dengan cara

membukanya seperti ritsleting. Transkripsi DNA adalah pembacaan gen tunggal untuk

mensintesa protein (www.id.wikipedia.org).

2.1.2 Model DNA

DNA adalah entitas yang sangat dinamis dan srtukturnya tidak beku. Pernapasan

(breathing) DNA terkandung dalam pembukaan temporer pasangan-pasangan basa. Dalam

pemodelan gerak fungsional DNA, dianalogikan dengan gerak mekanis. Terdapat banyak

variasi model yang mendeskripsikan gerak DNA: kontinyu dan diskrit, spiral dan tak spiral,

gerak tiruan dari setiap atau hampir setiap atom, model homogen dan model-model yang

memasukkan keberadaan barisan basa (Miftachul Hadi and Hans J. Wospakrik, 2004).

Model batang elastis dicirikan oleh tiga tipe gerak internal: gerak longitudinal, gerak rotasi

atau berpilin, dan gerak transversal. Model DNA tingkat kedua memasukkan perhitungan

bahwa molekul DNA terdiri dari dua rantai polinukleotida, dapat dimodelkan dengan dua

batang elastis yang berinteraksi lemah di antara mereka serta tergulung ke dalam spiral ganda.

Analogi diskrit dari model demikian mewakili dua rantai dari cakram yang terkait oleh pegas

longitudinal dan transversal serta kekakuan pegas longitudinal yang jauh lebih kuat ketimbang

pegas transversal(Miftachul Hadi and Hans J. Wospakrik, 2004).

Model DNA tingkat ketiga memperhitungkan tiap-tiap rantai terdiri dari tiga subunit: gula,

fosfat dan basa. Model DNA tingkat keempat diwakili oleh model kisi DNA dan

mendeskripsikan gerak atom yang menyusun sel kisi. Solusi tipe model DNA tingkat keempat

ini dapat diselesaikan dengan aproksimasi (harmonik) linier. Model DNA tingkat kelima

mensimulasi struktur dan gerak DNA dengan akurasi maksimum dalam model dinamika

molekuler (Riznichenko Galina, 2006).

Untuk mendeskripsikan gerak internal DNA, digunakan model aproksimasi berbeda.

Model yang paling sederhana dari DNA, katakanlah, model batang elastis dan versi diskritnya.

Untuk mendeskripsikan dinamika internal dari batang elastis, cukup dengan menuliskan tiga

pasang persamaan diferensial: satu persamaan untuk gerak longitudinal, satu persamaan untuk

gerak puntiran (torsional) dan satu persamaan untuk gerak transversal. Untuk mendeskripsikan

versi diskrit diperlukan 3N persamaan (Miftachul Hadi and Hans J. Wospakrik, 2004).

Model yang lebih kompleks, dengan meninjau molekul DNA yang terdiri dari dua rantai

polinukleotida. Model pertama terdiri dari dua batang elastis yang secara lemah berinteraksi

dan melilit satu sama lain untuk menghasilkan heliks ganda. Model kedua adalah versi

diskritnya. Untuk mendeskripsikan model yang terdiri dari dua batang elastis yang berinteraksi

lemah (dengan mengabaikan helisitas struktur DNA), diperlukan enam persamaan diferensial

tergandeng: dua persamaan untuk gerak longitudinal, dua persamaan untuk gerak torsional dan

dua persamaan untuk gerak transversal dalam kedua batang. Deskripsi model untuk versi

diskritnya terdiri dari 6N persamaan tergandeng(Miftachul Hadi and Hans J. Wospakrik,

2004).

Model berikutnya dengan memasukkan dalam perhitungan bahwa masing-masing rantai

polinukleotida terdiri dari tiga tipe grup atom (basa, gula dan fosfat). Dalam model-model

DNA tersebut di atas, grup berbeda ditunjukkan dengan bentuk geometri yang berbeda, dan

untuk penyederhanaan helisitas struktur DNA diabaikan. Daftar model aproksimasi dapat

diteruskan dengan model struktur dan dinamika DNA yang lebih kompleks, hingga model

yang paling akurat dicapai dengan memasukkan dalam perhitungan seluruh atom, gerak dan

interaksi (Miftachul Hadi and Hans J. Wospakrik, 2004).

Englander, Kallenbach, Heeger dan Krumhansl (1980) melakukan penelitian rintisan dalam

pengujian dinamika internal DNA. Metode pertukaran hidrogen-tritium digunakan untuk

menunjukkan kemungkinan utama pembentukan keadaan terbuka (open state) dalam DNA

yang didefinisikan sebagai daerah lokal yang bergerak (dari satu hingga beberapa pasang

basa), dimana ikatan hidrogen dibuka. Pembentukan keadaan terbuka DNA dihubungkan

dengan deviasi sudut basa dari keadaan kesetimbangan. Proses ini dideskripsikan dengan

menggunakan formalisme Hamiltonian (Miftachul Hadi and Hans J. Wospakrik, 2004).

Di dalam pemodelan gerak internal DNA, tidak terbatas pada pemodelan deviasi kecil dari

keadaan kesetimbangan (harmonik atau aproksimasi linier), tetapi juga meninjau gerak internal

dengan amplitudo besar (aproksimasi nonlinier atau nonharmonik). Solusi persamaan nonlinier

dari gerak internal DNA dengan amplitudo besar (persamaan sine-Gordon), merupakan

deskripsi yang menunjukkan keadaan terbuka DNA (Miftachul Hadi and Hans J. Wospakrik,

2004).

Modifikasi model Englander (Yakushevich, 1998) mendeskripsikan gerak rotasi amplitudo

besar dari basa mengelilingi rantai gula-fosfat. Gerak ini memumpun ke putusnya ikatan

hidrogen dan pembentukan keadaan terbuka DNA. Analogi antara molekul DNA dan rantai

bandul digunakan untuk mendeskripsikan sifat-sifat gerak internal DNA. Basa terkait dengan

gula memegang peranan bandul berotasi dalam DNA, rantai gula-fosfat memainkan peranan

rantai horisontal, dan medan gravitasi eksternal diperankan oleh medan yang diinduksi oleh

benang kedua DNA yang secara lemah berinteraksi dengan benang pertama DNA melalui

ikatan hidrogen di antara basa(Miftachul Hadi and Hans J. Wospakrik, 2004).

Dalam skema penguraian DNA, dua rantai gula-fosfat digambarkan oleh dua garis panjang,

sementara basa ditandai dengan banyak garis pendek. Kusutan (kink) berhubungan dengan

daerah lokal dengan pasangan basa yang terbuka. Solusi tipe kink mendeskripsikan deformasi

lokal (pembukaan pasangan-pasangan basa) bergerak sepanjang molekul DNA(Miftachul Hadi

and Hans J. Wospakrik, 2004).

2.1.3 DNA sebagai Sistem Dinamika Nonlinier

Dalam tahun-tahun belakangan, banyak penelitian berkaitan dengan gerak internal

amplitudo besar DNA sampai pada kesimpulan: molekul dapat ditinjau sebagai sistem

dinamika nonlinier dimana muncul gelombang soliton. Apakah gelombang soliton ini sungguh

ada dalam DNA Atau hal ini hanya contoh dari invasi tak benar dari pendekatan fisika ke

dalam biologi (Michel Peyrard, 2004).

Pertanyaan tersebut, pada awalnya, dibahas sekitar tahun 1980-an dalam paper Englander

dkk, yang berjudul Asal Mula Keadaan Terbuka dalam Heliks Ganda Polinukleotida:

Kemungkinan Eksitasi Soliton. Dalam paper tersebut model Hamiltonian nonlinier pertama

DNA ditunjukkan dan hasil ini memberi dorongan yang berdaya guna untuk penelitian

dinamika nonlinier DNA berikutnya (Michel Peyrard, 2004).

Banyak kontribusi yang telah disumbangkan dalam perkembangan studi dinamika

nonlinier DNA dengan menyempurnakan model Hamiltonian, mengajukan model baru,

penyelidikan persamaan diferensial nonlinier terkait dan solusi soliton, tinjauan statistik soliton

DNA(Michel Peyrard, 2004).

Banyak kajian dilakukan dengan menggunakan pendekatan nonlinier untuk menjelaskan

mekanisme dinamis fungsi DNA. Dan mungkin hanya pekerjaan yang dipublikasikan oleh

Selvin dkk (1992), dimana ketegaran puntiran dari gulungan positip dan negatip DNA terukur,

memberi bukti yang nampaknya dapat diandalkan: molekul DNA menunjukkan sifat-sifat

nonlinier (Michel Peyrard, 2004).

2.2 Visualisasi Ekstraksi DNA

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-

komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa

pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin

(A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas

sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan

Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin berikatan dengan

Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen pembangun (building

block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut

nukleotida (Michel Peyrard, 2004).

Metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA dari berbagai jenis tanaman, organ

tanaman, maupun jaringannya dapat dilakukan dengan berbagai cara. Namun pada intinya terdapat

tiga faktor utama yang sangat penting untuk dalam melakukan purifikasi dan ekstraksi DNA

secara maksimal. Pertama adalah cara dalam menghomogenkan jaringan tanaman khususnya

adalah dinding selnya. Kedua adalah komposisi dari larutan buffer yang ditambahkan dalam

penggerusan jaringan tanaman dan yang ketiga adalah penghilangan enzim penghambat-

polisakarida (Michel Peyrard, 2004).

Ekstraksi merupakan suatu proses pemisahan suatu bahan dari campurannya dengan

menggunakan pelarut yang berbeda yang tidak saling campur. Cara yang paling sederhana adalah

dengan ekstraksi bertahap, yaitu cukup dengan hanya menambahkan pelarut pengekstraksi yang

tidak saling campur dengan pelarut semula. Kemudian dikocok sehingga terjadi keseimbangan

konsentrasi zat yang akan diekstraksi dan dicapai suatu lapisan kemudian didiamkan dan

dipisahkan (Michel Peyrard, 2004).

DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun pada tumbuhan DNA manusia dapat

diisolasi melalui darah. Darah manusia terdiri atas plasma darah, globulus lemak, substansi kimia

(karbohidrat, protein dan hormon), dan gas (oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah

terdiri atas eritrosit (sel darah merah), leukosit (sel darah putih) dan trombosit (platelet).

Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih dijadikan pilihan karena

memiliki nukleus, di mana terdapat DNA di dalamnya. DNA pada tumbuhan juga dapat diisolasi,

contohnya pada tumbuhan bawang merah (Allium cepa) dan pada pisang (Michel Peyrard, 2004).

2.3. Elektroforesis

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan

perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan listrik dialirkan pada suatu

medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan

memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan

negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian

dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul

tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif( Westermeier, 2004).

Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta

tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya

Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris

lingkungan:

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.

Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan

fragmen DNA.

2.3.1 Perangkat elektroforesis gel

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam

dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion

kompleks.Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan.

Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas

penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan

adsorpsivitas zat terlarut(Fatchiyah, 2006).

Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk

memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji

(sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein.

Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida

sebagai gel media(Fatchiyah, 2006).

Elektroforesis DNA merupakan teknik analisis digunakan untuk memisahkan DNA

fragmen dengan ukuran. Molekul DNA yang harus dianalisis ditetapkan pada media kental, itu

gel , di mana medan listrik memaksa DNA untuk bermigrasi ke arah potensi positif, anoda ,

karena muatan negatif bersih dari fosfat tulang punggung dari rantai DNA. Pemisahan fragmen

ini dicapai dengan memanfaatkan mobilitas dengan ukuran molekul yang berbeda dapat

melintasi gel.molekul yang lebih lama bermigrasi lebih lambat karena mereka mengalami tarik

lebih dalam gel. Karena ukuran molekul mempengaruhi mobilitasnya, fragmen kecil akhirnya

lebih dekat ke anoda dari yang lama dalam suatu periode tertentu. Setelah beberapa waktu,

tegangan akan dihapus dan gradien fragmentasi dianalisis. Untuk perpisahan yang lebih besar

antara fragmen berukuran sama, baik waktu tegangan atau menjalankan dapat ditingkatkan.

Extended berjalan di gel tegangan rendah menghasilkan resolusi yang paling akurat

(Sambrook, 2003).

DNA dianalisis dengan elektroforesis gel dapat disiapkan dengan beberapa cara sebelum

pemisahan dengan elektroforesis. Dalam kasus molekul DNA besar, DNA seringkali dipotong

menjadi fragmen yang lebih kecil menggunakan endonuklease pembatasan DNA. Dalam kasus

lain, seperti PCR amplifikasi sampel, enzim hadir dalam sampel yang mungkin mempengaruhi

pemisahan molekul dikeluarkan melalui berbagai sarana sebelum analisis. Setelah DNA benar

dipersiapkan, sampel larutan DNA ditempatkan dalam sumur gel dan tegangan diterapkan di

gel untuk jumlah waktu tertentu. Fragmen DNA dengan panjang yang berbeda divisualisasikan

menggunakan pewarna fluorescent spesifik untuk DNA, seperti bromida etidium .gel

menunjukkan band yang berbeda sesuai dengan populasi molekul DNA dengan berat molekul

yang berbeda.Ukuran fragmen biasanya dilaporkan dalam "nukleotida", pasangan basa "" atau

"kb" (untuk ribuan pasangan basa), tergantung pada apakah tunggal atau DNA untai ganda

telah terpisah.Penentuan ukuran fragmen biasanya dilakukan oleh perbandingan untuk

komersial tersedia tangga DNA yang mengandung fragmen DNA linear panjang dikenal

(Sambrook, 2003).

Jenis gel paling sering digunakan untuk elektroforesis DNA agarosa (untuk molekul DNA

panjang relatif) dan poliakrilamida (untuk resolusi tinggi dari molekul DNA pendek, misalnya

dalam DNA sequencing ). Gel telah konvensional dijalankan dalam slab "format" seperti yang

ditunjukkan pada gambar, tapi elektroforesis kapiler telah menjadi penting bagi aplikasi seperti

throughput DNA sequencing-tinggi. Elektroforesis teknik yang digunakan dalam penilaian

kerusakan DNA termasuk elektroforesis gel alkali dan gel elektroforesis lapangan berdenyut .

Pengukuran dan analisis sebagian besar dilakukan dengan khusus perangkat lunak analisis gel.

Hasil elektroforesis kapiler biasanya ditampilkan dalam tampilan jejak disebut

elektroforegram.DNA cetakan digital dari elektroforesis gel agarosa kucing-memasukkan DNA

plasmid (Sambrook, 2003).

Tujuannya adalah untuk melihat DNA, memperbanyak atau mengisolasi DNA “band

tertentu”.Elektroforesis agak serupa dengan chromatography tetapi dengan menggunakan

listrik. Senyawa dengan muatan elektronnya akan berpindah tempat dalam satu bidang elektrik

sebanding dengan laju kerapatan muatan mereka. Elektroforesis secara luas untuk memisahkan

protein dan DNA (Sambrook, 2003).

2.4PCR

Alat pengatur suhu reaksi yang biasanya digunakan pada teknik reaksi berantai

polymerase. Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (kependekan

dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode

perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme (Schmid,

2003).

Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat

sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh

Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat

temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi

molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil (Schmid,

2003).

2.4.1 Prinsip kerja

Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20–30 kali siklus. Setiap

siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus:

1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi,

94–96 °C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal.

Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk

memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan

siap menjadi templat ("patokan") bagi primer. Durasi tahap ini 1–2 menit.

2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang

komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45–60 °C. Penempelan ini

bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau

primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit.

3. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA-

polimerase (P pada gambar) yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya

dilakukan pada suhu 76 °C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit (Schmid, 2003).

Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan renaturasi,

beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat

berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan

berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial (Schmid, 2003).

Gambar 2.4.1 Reaksi PCR

2.5. Bioinformatika

2.5.1 Definisi dan Sejarah Bioinformatika

Bioinformatika (bahasa Inggris: bioinformatics) adalah (ilmu yang mempelajari) penerapan

teknik komputasional untuk mengelola dan menganalisis informasi biologis. Bioinformatika

adalah ilmu yang mempelajari penerapan tekhnik komputasional untuk mengelola dan

menganalisis informasi biologi. Bidang ini mencakup penerapan metode-metode matematika,

statiska, dan informatika untuk memecahkan masalah-masalah biologis, terutama dengan

menggunakan sekuens DNA dan asam amino (www.id.wikipedia.org)

Bidang ini mencakup penerapan metode-metode matematika, statistika, dan informatika

untuk memecahkan masalah-masalah biologis, terutama dengan menggunakan sekuens DNA

dan asam amino serta informasi yang berkaitan dengannya. Contoh topik utama bidang ini

meliputi basis data untuk mengelola informasi biologis, penyejajaran sekuens (sequence

alignment), prediksi struktur untuk meramalkan bentuk struktur protein maupun struktur

sekunder RNA, analisis filogenetik, dan analisis ekspresi gen (Attwood, T.K., dan D.J. Parry-

Smith. 1999. ).

Istilah bioinformatics mulai dikemukakan pada pertengahan era 1980-an untuk mengacu

pada penerapan komputer dalam biologi. Namun demikian, penerapan bidang-bidang dalam

bioinformatika (seperti pembuatan basis data dan pengembangan algoritma untuk analisis

sekuens biologis) sudah dilakukan sejak tahun 1960-an (Attwood, T.K., dan D.J. Parry-Smith.

1999. ).

Kemajuan teknik biologi molekular dalam mengungkap sekuens biologis dari protein

(sejak awal 1950-an) dan asam nukleat (sejak 1960-an) mengawali perkembangan basis data

dan teknik analisis sekuens biologis. Basis data sekuens protein mulai dikembangkan pada

tahun 1960-an di Amerika Serikat, sementara basis data sekuens DNA dikembangkan pada

akhir 1970-an di Amerika Serikat dan Jerman (pada European Molecular Biology Laboratory,

Laboratorium Biologi Molekular Eropa). Penemuan teknik sekuensing DNA yang lebih cepat

pada pertengahan 1970-an menjadi landasan terjadinya ledakan jumlah sekuens DNA yang

berhasil diungkapkan pada 1980-an dan 1990-an, menjadi salah satu pembuka jalan bagi

proyek-proyek pengungkapan genom, meningkatkan kebutuhan akan pengelolaan dan analisis

sekuens, dan pada akhirnya menyebabkan lahirnya bioinformatika (Attwood, T.K., dan D.J.

Parry-Smith. 1999. ).

Perkembangan Internet juga mendukung berkembangnya bioinformatika. Basis data

bioinformatika yang terhubung melalui Internet memudahkan ilmuwan mengumpulkan hasil

sekuensing ke dalam basis data tersebut maupun memperoleh sekuens biologis sebagai bahan

analisis. Selain itu, penyebaran program-program aplikasi bioinformatika melalui Internet

memudahkan ilmuwan mengakses program-program tersebut dan kemudian memudahkan

pengembangannya (Attwood, T.K., dan D.J. Parry-Smith. 1999) 

Gambar. 2.5.1 Skema Bioinformatika

2.5.2 Penerapan Utama Bioinformatika

1. Basis data sekuens biologis

Sesuai dengan jenis informasi biologis yang disimpannya, basis data sekuens biologis

dapat berupa basis data primer untuk menyimpan sekuens primer asam

nukleat maupun protein, basis data sekunder untuk menyimpan motif sekuens protein, dan

basis data struktur untuk menyimpan data struktur protein maupun asam nukleat (Krane, D.E.,

dan M.L. Raymer. 2003)

Basis data utama untuk sekuens asam nukleat saat ini adalah Gen Bank (Amerika Serikat),

EMBL (Eropa) dan DDBJ (DNA Data Bank of Japan, Jepang). Ketiga basis data tersebut

bekerja sama dan bertukar data secara harian untuk menjaga keluasan cakupan masing-masing

basis data. Sumber utama data sekuens asam nukleat adalah submisi langsung dari periset

individual, proyek sekuensing genom, dan pendaftaran paten. Selain berisi sekuens asam

nukleat, entri dalam basis data sekuens asam nukleat umumnya mengandung informasi tentang

jenis asam nukleat (DNA atau RNA), nama organisme sumber asam nukleat tersebut, dan

pustaka yang berkaitan dengan sekuens asam nukleat tersebut(Krane, D.E., dan M.L. Raymer.

2003)

Sementara itu, contoh beberapa basis data penting yang menyimpan sekuens primer protein

adalah PIR (Protein Information Resource, Amerika Serikat), Swiss-Prot (Eropa),

dan TrEMBL(Eropa). Ketiga basis data tersebut telah digabungkan dalam UniProt (yang

didanai terutama oleh Amerika Serikat). Entri dalam UniProt mengandung informasi tentang

sekuens protein, nama organisme sumber protein, pustaka yang berkaitan, dan komentar yang

umumnya berisi penjelasan mengenai fungsi protein tersebut (Krane, D.E., dan M.L. Raymer.

2003)

2.5.3 Penyejajaran sekuens

Penyejajaran sekuens (sequence alignment) adalah proses penyusunan/pengaturan dua atau

lebih sekuens sehingga persamaan sekuens-sekuens tersebut tampak nyata. Hasil dari proses

tersebut juga disebut sebagai sequence alignment atau alignment saja. Baris sekuens dalam

suatu alignment diberi sisipan (umumnya dengan tanda "–") sedemikian rupa sehingga kolom-

kolomnya memuat karakter yang identik atau sama di antara sekuens-sekuens tersebut. Berikut

adalah contoh alignment DNA dari dua sekuens pendek DNA yang berbeda, "ccatcaac" dan

"caatgggcaac" (tanda "|" menunjukkan kecocokan atau match di antara kedua sekuens) (Krane,

D.E., dan M.L. Raymer. 2003)

Sequence alignment merupakan metode dasar dalam analisis sekuens. Metode ini

digunakan untuk mempelajari evolusi sekuens-sekuens dari leluhur yang sama (common

ancestor). Ketidakcocokan (mismatch) dalam alignment diasosiasikan dengan proses mutasi,

sedangkan kesenjangan (gap, tanda "–") diasosiasikan dengan proses insersi atau

delesi. Sequence alignment memberikanhipotesis atas proses evolusi yang terjadi dalam

sekuens-sekuens tersebut. Misalnya, kedua sekuens dalam contoh alignment di atas bisa jadi

berevolusi dari sekuens yang sama "ccatgggcaac". Dalam kaitannya dengan hal

ini, alignment juga dapat menunjukkan posisi-posisi yang dipertahankan (conserved) selama

evolusi dalam sekuens-sekuens protein, yang menunjukkan bahwa posisi-posisi tersebut bisa

jadi penting bagi struktur atau fungsi protein tersebut (Krane, D.E., dan M.L. Raymer. 2003)

Selain itu, sequence alignment juga digunakan untuk mencari sekuens yang mirip atau

sama dalam basis data sekuens. BLAST adalah salah satu metode alignment yang sering

digunakan dalam penelusuran basis data sekuens. BLAST menggunakan algoritma heuristik

dalam penyusunan alignme (Mount, D.W. 2001)

Beberapa metode alignment lain yang merupakan pendahulu BLAST adalah metode

"Needleman-Wunsch" dan "Smith-Waterman". Metode Needleman-Wunsch digunakan untuk

menyusun alignmentglobal di antara dua atau lebih sekuens, yaitu alignment atas keseluruhan

panjang sekuens tersebut. Metode Smith-Waterman menghasilkan alignment lokal, yaitu

alignment atas bagian-bagian dalam sekuens. Kedua metode tersebut

menerapkan pemrograman dinamik (dynamic programming) dan hanya efektif

untuk alignment dua sekuens (pairwise alignment) (Mount, D.W. 2001)

Clustal adalah program bioinformatika untuk alignment multipel (multiple alignment),

yaitu alignment beberapa sekuens sekaligus. Dua varian utama Clustal

adalah ClustalW dan ClustalX. (Mount, D.W. 2001)

Metode lain yang dapat diterapkan untuk alignment sekuens adalah metode yang

berhubungan dengan Hidden Markov Model ("Model Markov Tersembunyi", HMM). HMM

merupakan model statistika yang mulanya digunakan dalam ilmu komputer untuk mengenali

pembicaraan manusia (speech recognition). Selain digunakan untuk alignment, HMM juga

digunakan dalam metode-metode analisis sekuens lainnya, seperti prediksi daerah pengkode

protein dalam genom dan prediksi struktur sekunder protein (Mount, D.W. 2001)

2.5.4. Prediksi struktur protein

1. Model protein hemaglutinin dari virus influensa

Secara kimia/fisika bentuk struktur protein diungkap dengan kristalografi sinar-

X ataupun spektroskopi NMR, namun kedua metode tersebut sangat memakan waktu dan

relatif mahal. Sementara itu, metode sekuensing protein relatif lebih mudah

mengungkapkan sekuens asam amino protein. Prediksi struktur protein berusaha meramalkan

struktur tiga dimensi protein berdasarkan sekuens asam aminonya (dengan kata lain,

meramalkan struktur tersier dan struktur sekunder berdasarkan struktur primer protein). Secara

umum, metode prediksi struktur protein yang ada saat ini dapat dikategorikan ke dalam dua

kelompok, yaitu metode pemodelan protein komparatif dan metode pemodelan de novo

(Mount, D.W. 2001)

2. Pemodelan protein komparatif (comparative protein modelling)

Permodelan ini meramalkan struktur suatu protein berdasarkan struktur protein lain yang

sudah diketahui. Salah satu penerapan metode ini adalah pemodelan homologi (homology

modelling), yaitu prediksi struktur tersier protein berdasarkan kesamaan struktur primer

protein. Pemodelan homologi didasarkan pada teori bahwa dua protein

yang homolog memiliki struktur yang sangat mirip satu sama lain. Pada metode ini, struktur

suatu protein (disebut protein target) ditentukan berdasarkan struktur protein lain (protein

templat) yang sudah diketahui dan memiliki kemiripan sekuens dengan protein target tersebut.

Selain itu, penerapan lain pemodelan komparatif adalah protein threading yang didasarkan

pada kemiripan struktur tanpa kemiripan sekuens primer. Latar belakang protein

threading adalah bahwa struktur protein lebih dikonservasi daripada sekuens protein selama

evolusi; daerah-daerah yang penting bagi fungsi protein dipertahankan strukturnya. Pada

pendekatan ini, struktur yang paling kompatibel untuk suatu sekuens asam amino dipilih dari

semua jenis struktur tiga dimensi protein yang ada. Metode-metode yang tergolong

dalam protein threading berusaha menentukan tingkat kompatibilitas tersebut (Mount, D.W.

2001)

Dalam pendekatan  de novo atau ab initio, struktur protein ditentukan dari sekuens

primernya tanpa membandingkan dengan struktur protein lain. Terdapat banyak kemungkinan

dalam pendekatan ini, misalnya dengan menirukan proses pelipatan (folding) protein dari

sekuens primernya menjadi struktur tersiernya (misalnya dengan simulasi dinamika

molekular), atau dengan optimisasi global fungsi energi protein. Prosedur-prosedur ini

cenderung membutuhkan proses komputasi yang intens, sehingga saat ini hanya digunakan

dalam menentukan struktur protein-protein kecil. Beberapa usaha telah dilakukan untuk

mengatasi kekurangan sumber daya komputasi tersebut, misalnya

dengan superkomputer (misalnya superkomputer Blue Gene dari IBM) ataukomputasi

terdistribusi (distributed computing, misalnya proyek Folding@home) maupun komputasi grid

(Mount, D.W. 2001)

2.5.5Analisis ekspresi gen

Ekspresi gen dapat ditentukan dengan mengukur kadar mRNA dengan berbagai macam

teknik (misalnya dengan microarray ataupun Serial Analysis of Gene Expression ["Analisis

Serial Ekspresi Gen", SAGE]). Teknik-teknik tersebut umumnya diterapkan pada analisis

ekspresi gen skala besar yang mengukur ekspresi banyak gen (bahkan genom) dan

menghasilkan data skala besar. Metode-metode penggalian data (data mining) diterapkan pada

data tersebut untuk memperoleh pola-pola informatif. Sebagai contoh, metode-metode

komparasi digunakan untuk membandingkan ekspresi di antara gen-gen, sementara metode-

metode klastering (clustering) digunakan untuk mempartisi data tersebut berdasarkan

kesamaan ekspresi gen (Mount, D.W. 2001)

2.5.6 Cabang-cabang Bioninformatika

Dari pengertian Bioinformatika yang telah dijelaskan, kita dapat menemukan banyak

terdapat banyak cabang-cabang disiplin ilmu yang terkait dengan Bioinformatika, terutama

karena bioinformatika itu sendiri merupakan suatu bidang interdisipliner. Hal tersebut

menimbulkan banyak pilihan bagi orang yang ingin mendalami Bioinformatika.

1. Biophysics

Adalah sebuah bidang interdisipliner yang mengalikasikan teknik-teknik dari ilmu Fisika

untuk memahami struktur dan fungsi biologi (British Biophysical Society). Disiplin ilmu ini

terkait dengan Bioinformatika karena penggunaan teknik-teknik dari ilmu Fisika untuk

memahami struktur membutuhkan penggunaan TI.

2. Computational Biology

Computational biology merupakan bagian dari Bioinformatika (dalam arti yang paling

luas) yang paling dekat dengan bidang Biologi umum klasik. Fokus dari computational

biology adalah gerak evolusi, populasi, dan biologi teoritis daripada biomedis dalam molekul

dan sel(Attwood, T.K., dan D.J. Parry-Smith. 1999)

3. Medical Informatics

Menurut Aamir Zakaria [ZAKARIA2004] Pengertian dari medical informatics adalah

“sebuah disiplin ilmu yang baru yang didefinisikan sebagai pembelajaran, penemuan, dan

implementasi dari struktur dan algoritma untuk meningkatkan komunikasi, pengertian dan

manajemen informasi medis.” Medical informatics lebih memperhatikan struktur dan

algoritma untuk pengolahan data medis, dibandingkan dengan data itu sendiri. Disiplin ilmu

ini, untuk alasan praktis, kemungkinan besar berkaitan dengan data-data yang didapatkan pada

level biologi yang lebih “rumit” (Attwood, T.K., dan D.J. Parry-Smith. 1999)

4. Cheminformatics

Cheminformatics adalah kombinasi dari sintesis kimia, penyaringan biologis, dan

pendekatan data-mining yang digunakan untuk penemuan dan pengembangan obat (Cambridge

Healthech Institute’s Sixth Annual Cheminformatics conference). Kemungkinan penggunaan

TI untuk merencanakan secara cerdas dan dengan mengotomatiskan proses-proses yang terkait

dengan sintesis kimiawi dari komponenkomponen pengobatan merupakan suatu prospek yang

sangat menarik bagi ahli kimia dan ahli biokimia(Attwood, T.K., dan D.J. Parry-Smith. 1999)

5. Genomics

Genomics adalah bidang ilmu yang ada sebelum selesainya sekuen genom, kecuali dalam

bentuk yang paling kasar. Genomics adalah setiap usaha untukmenganalisa atau

membandingkan seluruh komplemen genetik dari satu spesies atau lebih. Secara logis tentu

saja mungkin untuk membandingkan genom-genom dengan membandingkan kurang lebih

suatu himpunan bagian dari gen di dalam genom yang representatif (Attwood, T.K., dan D.J.

Parry-Smith. 1999)

6. Mathematical Biology

Mathematical biology juga menangani masalah-masalah biologi, namun metode yang

digunakan untuk menangani masalah tersebut tidak perlu secara numerik dan tidak perlu

diimplementasikan dalam software maupun hardware (Attwood, T.K., dan D.J. Parry-Smith.

1999)

Menurut Alex Kasman [KASMAN2004] Secara umum mathematical biology melingkupi

semua ketertarikan teoritis yang tidak perlu merupakan sesuatu yang beralgoritma, dan tidak

perlu dalam bentuk molekul, dan tidak perlu berguna dalam menganalisis data yang terkumpul

(Attwood, T.K., dan D.J. Parry-Smith. 1999)

7. Proteomics

Istilah proteomics pertama kali digunakan untuk menggambarkan himpunan dari protein-

protein yang tersusun (encoded) oleh genom. Michael J. Dunn [DUNN2004], mendefiniskan

kata “proteome” sebagai: “The PROTEin complement of the genOME“. Dan

mendefinisikan proteomics berkaitan dengan: “studi kuantitatif dan kualitatif dari ekspresi gen

di level dari protein-protein fungsional itu sendiri”. Yaitu: “sebuah antarmuka antara biokimia

protein dengan biologi molekul” (Attwood, T.K., dan D.J. Parry-Smith. 1999.).

8. Pharmacogenomics

Pharmacogenomics adalah aplikasi dari pendekatan genomik dan teknologi pada

identifikasi dari target-target obat. Contohnya meliputi menjaring semua genom untuk

penerima yang potensial dengan menggunakan cara Bioinformatika, atau dengan menyelidiki

bentuk pola dari ekspresi gen di dalam baik patogen maupun induk selama terjadinya infeksi,

atau maupun dengan memeriksa karakteristik pola-pola ekspresi yang ditemukan dalam tumor

atau contoh dari pasien untuk kepentingan diagnosa (kemungkinan untuk mengejar target

potensial terapi kanker) (Attwood, T.K., dan D.J. Parry-Smith. 1999.)

Istilah pharmacogenomics digunakan lebih untuk urusan yang lebih “trivial” — tetapi

dapat diargumentasikan lebih berguna– dari aplikasi pendekatan Bioinformatika pada

pengkatalogan dan pemrosesan informasi yang berkaitan dengan ilmu Farmasi dan Genetika,

untuk contohnya adalah pengumpulan informasi pasien dalam database (Attwood, T.K., dan

D.J. Parry-Smith. 1999.)

9. Pharmacogenetics

Pharmacogenetics adalah bagian dari pharmacogenomics yang menggunakan metode

genomik/Bioinformatika untuk mengidentifikasi hubungan-hubungan genomik, contohnya

SNP (Single Nucleotide Polymorphisms), karakteristik dari profil respons pasien tertentu dan

menggunakan informasi-informasi tersebut untuk memberitahu administrasi dan

pengembangan terapi pengobatan (Attwood, T.K., dan D.J. Parry-Smith. 1999.)

Gambaran dari sebagian bidang-bidang yang terkait dengan Bioinformatika di atas

memperlihatkan bahwa Bioinformatika mempunyai ruang lingkup yang sangat luas dan

mempunyai peran yang sangat besar dalam bidangnya. Bahkan pada bidang pelayanan

kesehatan Bioinformatika menimbulkan disiplin ilmu baru yang menyebabkan peningkatan

pelayanan kesehatan (Attwood, T.K., dan D.J. Parry-Smith. 1999.)

2.5.7 Bioinformatika Di Indonesia

Saat ini mata ajaran bioinformatika maupun mata ajaran dengan muatan bioinformatika

sudah diajarkan dibeberapa perguruan tinggi di Indonesia. Sekolah Ilmu dan Teknologi

Hayati ITB menawarkan mata kuliah "Pengantar Bioinformatika" untuk program Sarjana dan

mata kuliah Bioinformatikan untuk program Pascasarjana (www.id.wikipedia.org)

Fakultas Teknobiologi Universitas Atma Jaya, Jakarta menawarkan mata kuliah

"Pengantar Bioinformatika". Mata kuliah "Bioinformatika" diajarkan pada Program

Pascasarjana Kimia Fakultas MIPA Universitas Indonesia (UI), Jakarta. Mata kuliah

"Proteomik dan Bioinformatika" termasuk dalam kurikulum program S3

bioteknologi Universitas Gadjah Mada (UGM),  Yogyakarta. Materi bioinformatika termasuk

di dalam silabus beberapa mata kuliah untuk program sarjana maupun pascasarjana biokimia,

biologi, dan bioteknologi pada Institut Pertanian Bogor (IPB). Selain itu, riset-riset yang

mengarah pada bioinformatika juga telah dilaksanakan oleh mahasiswa program S1 Ilmu

Komputer maupun program pascasarjana biologi serta bioteknologi IPB

(www.id.wikipedia.org)

Riset bioinformatika protein dilaksanakan sebagai bagian dari aktivitas riset rekayasa

protein pada Laboratorium Rekayasa Protein, Pusat Penelitian

Bioteknologi LembagaIlmuPengetahuanIndonesia (LIPI), Cibinong, Bogor. Lembaga

Biologi Molekul Eijkman, Jakarta, juga secara khusus memiliki laboratorium bioinformatika

sebagai fasilitas penunjang kegiatan risetnya. Selain itu, basis data sekuens

DNA mikroorganisme asli Indonesia sedang dikembangkan di UI (www.id.wikipedia.org)

2.6 BLAST

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) merupakan perkakas bioinformatika yang

berkaitan erat dengan penggunaan basis data sekuens biologis. Penelusuran BLAST (BLAST

search) pada basis data sekuens memungkinkan ilmuwan untuk mencari sekuens asam nukleat

maupun protein yang mirip dengan sekuens tertentu yang dimilikinya. Hal ini berguna

misalnya untuk menemukangen sejenis pada beberapa organisme atau untuk memeriksa

keabsahan hasil sekuensing maupun untuk memeriksa fungsi gen hasil

sekuensing. Algoritma yang mendasari kerja BLAST adalah penyejajaran sekuens(Krane,

D.E., dan M.L. Raymer. 2003)

PDB (Protein Data Bank, Bank Data Protein) adalah basis data tunggal yang menyimpan

model struktural tiga dimensi protein dan asam nukleat hasil penentuan eksperimental

(dengan kristalografi sinar-X, spektroskopi NMR dan mikroskopi elektron). PDB menyimpan

data struktur sebagai koordinat tiga dimensi yang menggambarkan posisi atom-atom dalam

protein ataupun asam nukleat (Krane, D.E., dan M.L. Raymer. 2003)

2.7 Pohon Filogenik

Filogenetik Istilah asal Yunani dari istilah phyle / phylon yang berarti "suku, ras," dan

genetikos yang berarti "relatif terhadap kelahiran" dari genesis ("kelahiran"). Taksonomi ,

klasifikasi, identifikasi, dan penamaan organisme, telah diberitahu oleh filogenetik kaya tetapi

tetap metodologis dan logis yang berbeda. Bidang Namun tumpang tindih dalam ilmu

sistematika filogenetik - sering disebut "cladism" atau "cladistics" -, dimana hanya pohon

filogenetik digunakan untuk membatasi taksa , yang mewakili kelompok-terhubung individu

keturunan. Dalam sistematika biologis secara keseluruhan, analisis filogenetik telah menjadi

penting dalam meneliti evolusi pohon kehidupan (Artama, 1991).

2.7.1 Konstruksi pohon filogenetik

Evolusi dianggap sebagai proses percabangan, dimana populasi berubah dari waktu ke

waktu dan dapat speciate menjadi cabang-cabang terpisah, silang bersama-sama, atau

mengakhiri oleh kepunahan. Hal ini mungkin divisualisasikan dalam pohon filogenetik,

Masalah yang ditimbulkan oleh filogenetik adalah bahwa genetik data hanya tersedia untuk

saat ini, dan fosil catatan ( osteometric data) adalah sporadis dan kurang dapat diandalkan .

Pengetahuan kami tentang bagaimana evolusi beroperasi digunakan untuk merekonstruksi

pohon penuh. Dengan demikian, pohon filogenetik didasarkan pada hipotesis dari urutan

peristiwa evolusi diasumsikan telah terjadi (Artama, 1991).

Cladistics adalah metode saat ini pilihan untuk menyimpulkan pohon filogenetik. Yang

sering digunakan metode yang paling untuk menyimpulkan filogeni termasuk penghematan ,

kemungkinan maksimum , dan MCMC berbasis inferensi Bayesian . Phenetics , yang populer

pada pertengahan abad ke-20 tetapi sekarang sebagian besar usang, menggunakan matriks

jarak jauh berbasis metode-untuk membangun pohon berdasarkan kesamaan secara

keseluruhan, yang sering diasumsikan untuk mendekati hubungan filogenetik. Semua

tergantung pada metode implisit maupun eksplisit suatu model matematis yang

menggambarkan evolusi karakter yang diamati pada spesies yang termasuk, dan biasanya

digunakan untuk filogeni molekul , dimana karakter selaras nukleotida atau asam amino

sekuens (Artama, 1991).

Kelompok filogenetik, atau taksa , dapat monofiletik , paraphyletic , atau polifiletik . Ada

beberapa istilah yang menggambarkan sifat pengelompokan di atas pohon tersebut. Misalnya,

semua burung dan reptil yang diyakini memiliki keturunan dari nenek moyang yang sama, jadi

ini pengelompokan taksonomi (kuning dalam diagram di bawah) disebut monofiletik. "Modern

reptil" (Cyan dalam diagram) adalah pengelompokan yang berisi satu nenek moyang, tetapi

tidak mengandung semua keturunan bahwa leluhur (burung tidak termasuk). Ini adalah contoh

dari paraphyletic kelompok. Sebuah pengelompokan seperti berdarah panas hewan mamalia

hanya akan meliputi dan burung (merah / oranye dalam diagram) dan disebut polifiletik karena

anggota kelompok ini tidak termasuk nenek moyang terakhir yang paling umum (Artama,

1991).

2.7.2 Filogenetik molekuler

Hubungan evolusi di antara organisme yang diwakili grafis melalui pohon filogenetik.

Karena kenyataan bahwa evolusi terjadi selama jangka waktu yang lama yang tidak dapat

diamati secara langsung, ahli biologi harus merekonstruksi filogeni oleh menyimpulkan

hubungan evolusioner antara organisme saat ini (Mubarika, 1990).

Fosil dapat membantu dengan rekonstruksi filogeni, namun, catatan fosil sering terlalu

miskin untuk bisa membantu yang baik. Oleh karena itu, ahli biologi cenderung dibatasi

dengan menganalisa organisme saat ini untuk mengidentifikasi hubungan evolusioner mereka.

Hubungan filogenetik di masa lalu itu direkonstruksi dengan melihat fenotipe , sering

karakteristik anatomi. Saat ini, data molekul, yang meliputi protein dan urutan DNA,

digunakan untuk membangun pohon filogenetik (Mubarika, 1990).

2.7.3 Teori rekapitulasi Haeckel Ernst

Selama abad 19, Ernst Haeckel teori rekapitulasi atau hukum biogenetic diterima secara

luas. Teori ini sering dinyatakan sebagai " ontogeni mengulangi filogeni ", yaitu

perkembangan organisme tepat mencerminkan perkembangan evolusi dari spesies. Versi awal

sejak itu ditolak, dan hipotesis diubah sebagai mirroring pengembangan embrio embrio dari

leluhur evolusionernya. Dia dituduh oleh lima profesor memalsukan gambar yang embrio.

Kebanyakan ahli biologi modern mengakui berbagai hubungan antara ontogeni dan filogeni,

menjelaskan mereka menggunakan teori evolusi atau melihat mereka sebagai bukti untuk

mendukung teori itu. Donald I. Williamson menyarankan agar larva dan embrio diwakili orang

dewasa di taksa lainnya yang telah ditransfer oleh hibridisasi (larva tersebut transfer teori).

Namun, yang dilihat Williamson tidak merepresentasikan pemikiran arus utama dalam biologi

molekular , dan ada tubuh signifikan bukti melawan teori transfer larva (Mubarika, 1990).

2.7.4 Sampling sinyal takson dan filogenetik

Karena perkembangan teknik sekuensing maju dalam biologi molekular , telah menjadi

layak untuk mengumpulkan sejumlah besar data (DNA atau sekuens asam amino) untuk

menyimpulkan hipotesis filogenetik. Sebagai contoh, tidak jarang ditemukan studi dengan

matriks karakter berdasarkan seluruh mitokondria genom (~ 16.000 nukleotida, di banyak

hewan). Namun, telah diusulkan bahwa lebih penting untuk meningkatkan jumlah taksa dalam

matriks daripada meningkatkan jumlah karakter, karena lebih banyak taksa yang lebih kuat

adalah pohon filogenetik yang dihasilkan. Ini mungkin sebagian disebabkan oleh terpecahnya

cabang lama . Telah dikemukakan bahwa ini adalah alasan penting untuk memasukkan data

dari fosil ke filogeni di mana mungkin. Tentu saja, data filogenetik yang mencakup taksa fosil

umumnya didasarkan pada morfologi, bukan data DNA. Menggunakan simulasi, Derrick

Zwickl dan David Hillis [10] menemukan bahwa peningkatan takson sampling dalam inferensi

filogenetik memiliki efek positif pada keakuratan analisis filogenetik (Mubarika, 1990).

Faktor lain yang penting yang mempengaruhi keakuratan rekonstruksi pohon adalah

apakah data dianalisis benar-benar berisi sinyal filogenetik yang berguna, sebuah istilah yang

digunakan secara umum untuk menunjukkan apakah organisme yang terkait cenderung mirip

satu sama lain dengan hormat bahan genetik atau sifat-sifat fenotipik. Pada akhirnya,

bagaimanapun, tidak ada cara untuk mengukur apakah suatu hipotesis tertentu filogenetik

akurat atau tidak, kecuali jika "benar" hubungan antara taksa yang diuji sudah dikenal. Hasil

terbaik sebuah systematist empiris bisa berharap untuk mencapai adalah pohon dengan cabang-

cabang serta didukung oleh bukti yang tersedia (Mubarika, 1990).

2.7.5 Keterbatasan

Meskipun pohon filogenetik diproduksi berdasarkan sekuensing gen atau genomik data

dalam spesies yang berbeda dapat memberikan informasi tentang evolusi, mereka memiliki

keterbatasan penting. Mereka tidak harus secara akurat menggambarkan sejarah evolusi

spesies. Data yang mereka berbasis analisis yang dapat dikacaukan oleh transfer gen

horizontal, hibridisasi antara spesies yang tidak tetangga terdekat di pohon sebelum hibridisasi

terjadi, evolusi konvergen, dan dilestarikan urutan. Juga, ada masalah dalam analisis

mendasarkan pada satu jenis karakter, seperti tunggal gen atau protein atau hanya pada analisis

morfologi, karena pohon tersebut dibangun dari sumber data lain yang tidak terkait sering

berbeda dari yang pertama, dan oleh karena itu hati-hati diperlukan dalam menyimpulkan

hubungan kekerabatan diantara spesies. Hal ini paling benar dari bahan genetik yang memiliki

transfer gen lateral dan rekombinasi , di mana yang berbeda haplotype blok dapat memiliki

sejarah yang berbeda. Secara umum, pohon output dari analisis filogenetik adalah perkiraan

karakter 's filogeni (yaitu pohon gen) dan bukan filogeni dari taksa (yaitu jenis pohon) dari

yang karakter ini adalah sampel, meskipun idealnya, keduanya harus sangat dekat. Untuk

alasan ini, studi filogenetik serius umumnya menggunakan kombinasi gen yang berasal dari

sumber genom yang berbeda (misalnya, dari genom mitokondria atau Plastida vs nuklir), atau

gen yang akan diharapkan untuk berkembang di bawah rejim selektif yang berbeda, sehingga

homoplasy (palsu homologi ) tidak mungkin untuk hasil dari seleksi alam (Mubarika, 1990).

Karena tidak mungkin bahwa mereka adalah nenek moyang langsung dari setiap spesies

yang tersisa. Scepticism harus berlaku bila spesies punah termasuk dalam pohon yang

seluruhnya atau sebagian didasarkan pada data sekuens DNA, karena fakta bahwa sedikit

berguna " DNA kuno "dipertahankan selama lebih dari 100.000 tahun, dan kecuali dalam

keadaan yang tidak biasa paling tidak urutan DNA cukup lama untuk digunakan dalam analisis

filogenetik yang belum pulih dari bahan lebih dari 1 juta tahun. Dalam beberapa organisme,

endosymbionts memiliki sejarah genetik independen dari tuan rumah, jaringan filogenetik

digunakan ketika pohon-pohon memisahkan tidak cocok, karena komplikasi ini yang

menyarankan lebih retikular sejarah evolusi organisme sampel (Mubarika, 1990).

2.8 Lamun

Padang lamun adalah ekosistem pesisir yang ditumbuhi oleh lamun sebagai vegetasi yang

dominan. Lamun (seagrass) adalah kelompok tumbuhan berbiji tertutup (Angiospermae) dan

berkeping tunggal (Monokotil) yang mampu hidup secara permanen di bawah permukaan air

laut (Sheppard et al., 1996). Komunitas lamun berada di antara batas terendah daerah

pasangsurut sampai kedalaman tertentu dimana cahaya matahari masih dapat mencapai dasar

laut (LIPI, 2008).

Tanaman lamun memiliki bunga, berpolinasi, menghasilkan buah dan menyebarkan bibit

seperti banyak tumbuhan darat. Klasifikasi lamun adalah berdasarkan karakter tumbuh-

tumbuhan. Selain itu, genera di daerah tropis memiliki morfologi yang berbeda sehingga

pembedaan spesies dapat dilakukan dengan dasar gambaran morfologi dan anatomi. (LIPI,

2008).

Lamun merupakan tumbuhan laut monokotil yang secara utuh memiliki perkembangan

sistem perakaran dan rhizoma yang baik. Pada sistem klasifikasi, lamun berada pada Sub kelas

Monocotyledoneae, kelas Angiospermae. (LIPI, 2008).

Di seluruh dunia diperkirakan terdapat sebanyak 52 jenis lamun, di mana di Indonesia

ditemukan sekitar 15 jenis yang termasuk ke dalam 2 famili: (1) Hydrocharitaceae, dan (2)

Potamogetonaceae. Jenis yang membentuk komunitas padang lamun tunggal, antara lain:

Thalassia hemprichii, Enhalus acoroides, Halophila ovalis, Cymodocea serrulata, dan

Thallassodendron ciliatum (LIPI, 2008).

Eksistensi lamun di laut merupakan hasil dari beberapa adaptasi yang dilakukan termasuk

toleransi terhadap salinitas yang tinggi, kemampuan untuk menancapkan akar di substrat

sebagai jangkar, dan juga kemampuan untuktumbuh dan melakukan reproduksi pada saat

terbenam. Salah satu hal yang paling penting dalam adaptasi reproduksi lamun

adalahhidrophilus yaitu kemampuannya untuk melakukan polinasi di bawah air. (LIPI, 2008)

Secara rinci klasifikasi lamun menurut Den Hartog (1970) dan Menez, Phillips dan

Calumpong (1983) adalah sebagai berikut :

Divisi : Anthophyta

Kelas : Angiospermae

Famili : Potamogetonacea

Subfamili : Zosteroideae

Genus : Zostera, Phyllospadix, Heterozostera.

(LIPI, 2008)

Lamun merupakan tumbuhan yang tingkat tinggi karena telah bisa dibedakan akar, batang

dan daunnya.

Akar

Terdapat perbedaan morfologi dan anatomi akar yang jelas antara jenis lamun yang dapat

digunakan untuk taksonomi. Akar pada beberapa spesies seperti Halophiladan

Halodulememiliki karakteristik tipis (fragile), seperti rambut, diameter kecil, sedangkan

spesiesThalass odendr on memiliki akar yang kuat dan berkayu dengan sel epidermal. Jika

dibandingkan dengan tumbuhan darat, akar dan akar rambut lamun tidak berkembang dengan

baik. Namun, beberapa penelitian memperlihatkan bahwa akar dan rhizoma lamun memiliki

fungsi yang sama dengan tumbuhan darat. Akar-akar halus yang tumbuh di bawah permukaan

rhizoma, dan memiliki adaptasi khusus (contoh : aerenchyma, sel epidermal) terhadap

lingkungan perairan. Semua akar memiliki pusat stele yang dikelilingi oleh endodermis. Stele

mengandung phloem (jaringan transport nutrien) dan xylem (jaringan yang menyalurkan air)

yang sangat tipis. Karena akar lamun tidak berkembang baik untuk menyalurkan air maka

dapat dikatakan bahwa lamun tidak berperan penting dalam penyaluran air. (Azkab,

M.H.1988)

Patriquin (1972) menjelaskan bahwa lamun mampu untuk menyerap nutrien dari dalam

substrat (interstitial) melalui sistem akar-rhizoma. Selanjutnya, fiksasi nitrogen yang

dilakukan oleh bakteri heterotropik di dalam rhizosper Halophila ovalis, Enhalus acoroides,

Syringodium isoetifolium dan Thalassia hemprichii cukup tinggi lebih dari 40 mg N.m-2.day-

1. Koloni bakteri yang ditemukan di lamun memiliki peran yang penting dalam penyerapan

nitrogen dan penyaluran nutrien oleh akar. Fiksasi nitrogen merupakan proses yang penting

karena nitrogen merupakan unsur dasar yang penting dalam metabolisme untuk menyusun

struktur komponen sel. (Azkab, M.H.1988)

Diantara banyak fungsi, akar lamun merupakan tempat menyimpan oksigen untuk proses

fotosintesis yang dialirkan dari lapisan epidermal daun melalui difusi sepanjang sistem

lakunal (udara) yang berliku-liku. Sebagian besar oksigen yang disimpan di akar dan rhizoma

digunakan untuk metabolisme dasar sel kortikal dan epidermis seperti yang dilakukan oleh

mikroflora di rhizospher. Beberapa lamun diketahui mengeluarkan oksigen melalui akarnya

(Halophila ovalis) sedangkan spesies lain (Thallassia testudinum) terlihat menjadi lebih baik

pada kondisi anoksik. (Azkab, M.H.1988)

Larkum et al (1989) menekankan bahwa transport oksigen ke akar mengalami penurunan

tergantung kebutuhan metabolisme sel epidermal akar dan mikroflora yang berasosiasi.

Melalui sistem akar dan rhizoma, lamun dapat memodifikasi sedimen di sekitarnya melalui

transpor oksigen dan kandungan kimia lain. Kondisi ini juga dapat menjelaskan jika lamun

dapat memodifikasi sistem lakunal berdasarkan tingkat anoksia di sedimen. Dengan demikian

pengeluaran oksigen ke sedimen merupakan fungsi dari detoksifikasi yang sama dengan yang

dilakukan oleh tumbuhan darat. Kemampuan ini merupakan adaptasi untuk kondisi anoksik

yang sering ditemukan pada substrat yang memiliki sedimen liat atau lumpur. Karena akar

lamun merupakan tempat untuk melakukan metabolisme aktif (respirasi) maka konnsentrasi

CO2 di jaringan akar relatif tinggi. (Azkab, M.H.1988)

Rhizoma dan Batang

Semua lamun memiliki lebih atau kurang rhizoma yang utamanya adalah herbaceous,

walaupun pada Thallasodendron ciliatum (percabangan simpodial) yang memiliki rhizoma

berkayu yang memungkinkan spesies ini hidup pada habitat karang yang bervariasi dimana

spesies lain tidak bisa hidup. Kemampuannya untuk tumbuh pada substrat yang keras

menjadikan T. Ciliatum memiliki energi yang kuat dan dapat hidup berkoloni disepanjang

hamparan terumbu karang. (Azkab, M.H.1988)

Struktur rhizoma dan batang lamun memiliki variasi yang sangat tinggi tergantung dari

susunan saluran di dalam stele. Rhizoma, bersama sama dengan akar, menancapkan

tumbuhan ke dalam substrat. Rhizoma seringkali terbenam di dalam substrat yang dapat

meluas secara ekstensif dan memiliki peran yang utama pada reproduksi secara vegetatif dan

reproduksi yang dilakukan secara vegetatif merupakan hal yang lebih penting daripada

reproduksi dengan pembibitan karena lebih menguntungkan untuk penyebaran lamun.

Rhizoma merupakan 60 – 80% biomas lamun. (Azkab, M.H.1988)

Daun

Seperti semua tumbuhan monokotil, daun lamun diproduksi dari meristem basal yang

terletak pada potongan rhizoma dan percabangannya. Meskipun memiliki bentuk umum yang

hampir sama, spesies lamun memiliki morfologi khusus dan bentuk anatomi yang memiliki

nilai taksonomi yang sangat tinggi. Beberapa bentuk morfologi sangat mudah terlihat yaitu

bentuk daun, bentuk puncak daun, keberadaan atau ketiadaan ligula. Contohnya adalah

puncak daunCymodocea serrulata berbentuk lingkaran dan berserat, sedangkan C. Rotundata

datar dan halus. Daun lamun terdiri dari dua bagian yang berbeda yaitu pelepah dan daun.

Pelepah daun menutupi rhizoma yang baru tumbuh dan melindungi daun muda. Tetapi genus

Halophila yang memiliki bentuk daun petiolate tidak memiliki pelepah. (Azkab, M.H.1988)

Anatomi yang khas dari daun lamun adalah ketiadaan stomata dan keberadaan kutikel yang

tipis. Kutikel daun yang tipis tidak dapat menahan pergerakan ion dan difusi karbon sehingga

daun dapat menyerap nutrien langsung dari air laut. Air laut merupakan sumber bikarbonat

bagi tumbuh-tumbuhan untuk penggunaan karbon inorganik dalam proses fotosintesis.

(Azkab, M.H.1988)

BAB III

MATERI DAN METODE

3.1. Waktu dan Tempat

Hari dan Tangggal : Jumat 13 April 2012

Waktu : 10.00- selesai

Tempat : Laboratorium Mikrobioligi Jurusan Ilmu Kelautan

Universitas Diponegoro, Tembalang Semarang

3.2. Alat dan Bahan

Adapun alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum dasar – dasar bioteknologi dari

acara 1 sampai dengan acara 3 yaitu diantaranya:

3.2.1Alat

3.2.2. Bahan

No Bahan Kegunaan Gambar

1 95 % alcohol Untuk memisahkan DNA pada

strawberry, yang berupa

benang2 putih

2 Strawberry Bahan uji ekstraksi DNA

N

o

Alat Kegunaan Gambar

1 Tabung

sentrifuge

Sebagai tempat dari sampel

2 Beaker glas Sebagai tempat dari sampel

yang akan dicampur

3 Plastik Zip-

lock

Sebagai tempat untuk

stroberry yang sudah

diremas- remas

4 Saringan Alat untuk menyaring

sampel larutan

5 Komputer Sebagai media untuk

menghubungkan keinternet

dan untuk mengolah data

yang diperoleh.

6 LCD Untuk menampilkan

gambar yang ada pada

komputer

7 Software

bioinformatik

a

Sebagai progam untuk

mengolah dari data DNA

yang diperoleh

8 Internet Sebagai sarana untuk

menghubungkan kesitus

NCBI

3 Pisang Bahan Uji Ekstrasi DNA

3 Air destilasi Untuk melarutkan garam dan

shampo

4 Enzim Sebagai sampel

5. Shampo Sebagai pengganti deterjen

6 Garam iodium Sebagai campuran untuk

menghomogenkan larutan-

larutan

3.3. Cara Kerja

3.3.1. Visualisasi Ekstraksi DNA

1. Buat 100 ml buffer lisis dengan cara mengambil 90 ml air steril + 10 ml shampoo + ¼

sendok garam, kemudian di aduk hingga garam larut / homogeny.

2. Ambil 1 buah strawberry dan 1 buah pisang, kemudian dibelah / dibagi menjadi 2 bagian.

3. Letakkan masing-masing sebagian strawberry dan ke dalam plastic ziplock dan remas-

remas dengan jari tangan hingga menjadi cairan juice.

4. Tambahkan 10 ml buffer lisis kedalam plastic dan tutup kembali.

5. Lanjutkan meremas plastic kurang lebih 2-3 menit hingga bercampur/ homogeny dengan

larutan juice.

6. Kemudian larutan disaring/filter dan biarkan selama 10 menit

7. Buang saringan dan ekstrak yang ada

8. Teteskan sebanyak 2-4 tetes enzim ke dalam tabung yang telah berisi strawberi dan larutan.

9. Tuangkan sebanyak 30 ml 95 % alcohol dingin ke dalam tabung sentrifuge 50 ml.

10. Lalu tuangkan larutan yang telah disaring kedalam tabung, tutup tabungnya dan amati

sampai terlihat DNA mulai presipitasi sampai beberapa menit.

3.3.2. Elektroforesis

1. Buat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE 50x ke dalam

245 ml akuades.

2. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan ke dalam

bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna.

3. Siapkan baki gel agarosa, lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa

selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-masing ujung baki)

4. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir

menyentuh dasar baki

5. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan, jika

suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 0C, tambahkan 1 µl etidium bromid

(PERINGATAN KERAS!!, gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik).

6. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar, kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel

agarosa, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat.

7. ambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki.

8. masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi

dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE).

9. siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis.

10. masukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa

dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada

kertas parafilm menggunakan mikropipet.

11. buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan.

12. hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang

tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran; jika tidak demikian, ubahlah posisi

baki/gel ke arah sebaliknya).

13. nyalakan sumber arus, aturlah volatase dan waktu running hingga diperoleh angka 70 V

dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus.

14. jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber

arus.

15. elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai oleh

adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis.

16. keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas

UV transluminator).

17. Nyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1.Hasil

4.1.1 Visualisasi Ekstraksi DNA

Elektroforesis

Skema Elektroforesis

4.1.2 Analisis sequen DNA dengan Blast

5. Proses Elektroforesis Kertas

1. Hasil Elektroforesis Kertas

2. Indikator

3. Tinta

4. Zat Warna

4.1.3 Pengolahan Data Hasil Identifikasi Sequen Menggunakan Program BioInformatika

4.2 Pembahasan

4.2.1. Visualisasi Ekstraksi DNA

Praktikum kali ini menggunakan ekstraksi DNA dengan menggunakan buah strawberry

dan pisang. Hal ini dilakukan karena sel tumbuhan dari pisang dan strawberry memiliki

membrane plasma yang terlindungi oleh dinding sel yang kaku dan untuk mengekstraksi DNA

dilakukan dengan memecah dinding sel tersebut, dengan cara meremas buah pisang dan

starwberry menjadi halus seperti di juice.

Tekhnik ekstraksi DNA memerlukan lisis buffer yang dalam praktikum ini menggunakan

bahan shampoo dengan fungsi sebagai katalisator yan mempercepat proses ekstraksi.

Kemudiam dilanjutkan dengan ekstraksi protein dengan menggunakan larutan alkohol 95%.

Lalu ditambahkan enzim untuk bisa mengikat protein-protein yang terdapat dalam DNA kedua

buah tersebut. Kemurnian DNA dapat diketahui dengan menggunakan elektroforesis untuk

mengetahui keutuhan relative DNA tersebut.

Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi sel, pelisisan dinding dan

membran sel, pengekstraksian dalam larutan, Pada isolasi DNA kedua buah tersebutdidapatkan

hasil, DNA naik keatas setelah diberi alcohol dengan warna dari DNA itu sendiri berwarna

bening dan berupa benang-benang putih.

Alcanivorax_venustensis_strain

Uncultured_gamma_proteobacteri

Alcanivorax_balearicus_strain

Uncultured_bacterium_clone_OTU

Alcanivorax_dieselolei_strain_

Alcanivorax_sp._TE-9_gene_for_

DiasNatasasmita0.05

4.2.2. Elektroforesis

Prinsip dasar elektroforesis adalah proses pemisahan partikel berdasarkan laju mobilisasi

partikel pada suatu medan listrik. Dalam percobaan ini menggunakan kertas elektroforesis

kertas sebagai teknik yang menunjukan bahwa beberapa indikator dan beberapa pigmen dalam

tinta adalah molekul yangterionisasi.Awalnya percobaan dilakukan dengan mempersiapkan

percobaan dengan penyiapan bahan.Bahan uji yang dipakai adalah tinta warna hitam, biru dan

merah. Indikator yang digunakan adalah congo red, fenol red, dan brom fenol blue. Zat warna

yang digunakan adalah fluorecein dan tetrazine, campurannya.Spot dari sampel dibuat tipis,

dan satu titik kecil untuk menghindari penyebaran pada kertas elektroforesis yaitu kertas

selulosa asetat.Elektroforesis membuat kertas yang ditetes bahan berwarna. Tinta hitam

menghasilkan warna biru,coklat, dan agak kuning. Tinta merah mengasilkanwarna merah,

orange dan agak kuning. Tinta campuran menghasilkan warna biru,coklat, dan agak kuning.

Fenol red menghasilkan warna kuning dan orange. Bromfenol blue menghasilkan warna biru.

Indikator yang dicampurkan menghasilkan warna kuning dan orange.Flourocein menghasilkan

warna kuning. Tartrazine juga menghasilkan warna kuning.Zat warna campuran menghasilkan

warna merah dan orange.Kegunaan dari hasil elektroforesis adalah menilai kemurnian contoh

untuk identifikasi komponen, menentukan besar molekul, dan lain-lain.Faktor yang

mempengaruhi mobilitas sampel adalah voltase yang digunakan, konsentrasi buffer, pH buffer,

pengaruh elektroosmotik, dan pengaruh difusi.Dari hasil pengamatan, ditunjukan muatan tinta,

indikator, dan zat warnamenhasilkan positif.

Namun, pada saat percobaan ada yang menghasilkan negatif,ini diperngaruhi oleh pada

saat pembuatan titik hasil penotolan yang terlalu lebar,dan juga ada faktor kerusakan alat.

Disebabkan oleh hal tersebut, proses pemisahan menjadi kurang baik.Pada saat alat

elektroforesis running, hasil yang didapatkan terlalu cepat, sehingga menyebabkan alat tersebut

harus segeradimatikan, jangan sampai mengenai larutan buffer yang menyebabkan hasil

elektroforesis gagal.

4.2.3. Analisis sequen DNA dengan Blast

Analisa DNA sequencing merupakan salah satu alat yang digunakan untuk mengetahiu

genetik dari makhluk hidup dan mempelajari hubungan kekerabatan suatu sekuens baru

dengan beberapa sekuens lainnya yang telah terlebih dahulu diketahui. DNA sequencing

menggunakan elektrophoresis kapiler yang merupakan teknologi kunci pada laboratorium-

laboratorium life science.

Analisis sequen DNA adalah dengan menggunakan BLAST. Dengan melakukan analisis

sekuensing dari DNA, maka dapat diketahui dari jenis – jenis bakteri dan sumber atau asal dari

suatu bakteri tersebut. Untuk pemilihan bakteri pada analisis sekuensing DNA ini, pemilihanya

dilakukan secara random atau acak tidak berdasarkan ketentuan secara urut. Sedangkan untuk

penetuan dari sequencing DNA ini diproses dengan progam bioinformatika, dengan progam

tersebut maka akan diketahui dari pohon filogenik dari suatu bakteri yang dimasukan kedalam

pemrosesan data tersebut. Data dari suatu DNA ini didapat dari GenBank.

Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang

umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain terminationmethod) yang sudah

dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR

dengan pereaksi yang agak berbeda, yaituhanya menggunakan satu primer (PCR biasa

menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent

4.2.4. Pengolahan Data Hasil Identifikasi Sequen Menggunakan Program BioInformatika

Untuk mengidentifikasi DNA dapat dilakukan dengan menggunakan software

bioinformatika yang bertujuan untuk mengetahui tingkat hubungan dari kekerabatan dari suatu

mikroorganisme. Dengan pengolahan data dari hasil sekuensing DNA tersebut maka dapat

dihasilkan berupa pohon filogenetik.

Bioinformatika menyimpan basis data sekuens biologis berupa basis data primer asam

nukleat maupun protein, basis data sekunder untuk menyimpan motif sekuens protein, dan basis

data struktur untuk menyimpan data struktur protein maupun asam nukleat. Basis data utama

untuk sekuens asam nukleat saat ini adalah GenBank.

Dari hasil identifikasi didapatkan pohon filogenik yang menujukan bahwa :

Alcanivorax dieselolei memiliki tingkat kekerabatan yang sangat tinggi / dekat dengan

Alcanivorax sp. TE-9, Alcanivorax_balearicus Uncultured bacterium clone.

Alcanivorax venustensis memilki kekerabatan yang sangat tinggi / dekat dengan

Uncultured bacterium gamma.

BAB V

PENUTUP

5.1. Kesimpulan

Dari praktikum dasar – dasar bioteknologi kali ini dapat diambil beberapa kesimpulan

yang diantaranya yaitu:

1.DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur

perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.

2.Bioinformatika adalah ilmu yang mempelajari penerapan tekhnik komputasional untuk

mengelola dan menganalisis informasi biologi. Bidang ini mencakup penerapan metode-

metode matematika, statiska, dan informatika untuk memecahkan masalah-masalah biologis,

terutama dengan menggunakan sekuens DNA dan asam amino.

3.Analisa DNA sequencing sangat penting untuk mengetahui genetik kehidupan.

4.BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) merupakan perkakas bioinformatika yang

berkaitan erat dengan penggunaan basis data sekuens biologis.

5.Pohon filogenik dapat dibuat dengan menggunakan software ClustalX dan NJ plot dengan

terlebih dahulu mengetahui sequence dari DNA.

5.2. Saran

1. Semoga bahan dan alat sewaktu praktiku m lebih lengkap dan berfungsi dengan baik

sehingga praktikan lebih mengerti tidak hanya secara teori tetapi praktek juga.

2. Penjelasan mengenai materi mungkin bisa lebih diperjelas dengan di buat dalam bentuk

tutorial.

DAFTAR PUSTAKA

Anggadiredja, T.J. 2006. Teknologi produk perikanan dalam industri farmasi, potensi dan

pemanfaatan makro algae laut. Makalah Stadium Generate Teknologi Alternatif Produk

Perikanan dalam Industri Farmasi. Bogor.

Artama, W.T. 1991. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi.

UGM.Yogyakarta.

Attwood, T.K., dan D.J. Parry-Smith. 1999. Introduction to Bioinformatics. Harlow: Pearson

Education. ISBN 0-582-32788-1

Azkab,M.H.1999. Pedoman Invetarisasi Lamun. P3O-LIPI, Teluk Jakarta: Jakarta

Fatchiyah. 2006. Gel Elektroforesis. Malang: Brawijaya Press

Krane, D.E., dan M.L. Raymer. 2003. Fundamental Concepts of Bioinformatics. San Francisco:

Benjamin Cummings. ISBN 0-8053-4633-3

Michel Peyrard .2004 .Nonlinear Dynamics and Statistical Physics of DNA.

Miftachul Hadi and Hans J. Wospakrik .2004. SU(2) Skyrme Model for Hadron, Published in

Physics Journal IPS Proceeding Supplement C8 0514, http://pj.hfi.fisika.net(di akses pada

tanggal 21Juni 2011 jam 09.00).

Mount, D.W. 2001. Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis. Cold Spring Harbor: Cold

Spring Harbor Laboratory Press

Mubarika, Sofia. 1990. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi UGM.

Yogyakarta.

Mubarika, Sofia. 1990. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi UGM.

Yogyakarta.

Riznichenko Galina Yurevna .2006.Mathematical Models in Biophysics,

http://www.biophysics.org/education/galina.pdf, May 22, (di akses pada tanggal 21Juni 2011

jam 09.00).

Sambrook, L., et al. 2003. Molecular Clonning : A laboratory Manual, second edition. Cold

Spring Harbor Laboratory Press. New York.

Schmid, R.D. 2003. Pocket Guide to Biotechnology and Genetic Engineering. Wiley- VCH.

Germany.

Semagn, K., Bjørnstad, A., Ndjiondjop, M.N. 2006. An overview of molecular marker methods for

plants. African Journal of Biotechnology 5: 2540-2568Cold Spring Harbor Laboratory Press.

New York.

Westermeier. 2004. Electrophoresis in Practice: A Guide to Theory and Practice. New Jersey:

John Wiley & Sons inc.

www.lipi.go.id (Diakses pada tangga 23 April 2012 pukul 17.00)