laporan bioteknologi kultur organ fakultas pertanian universitas brawijaya malang 2012

35
LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI “KULTUR ORGAN” Disusun Oleh: Nama : ZAIM DZOEL HAZMY NIM : 115040201111085 Kelompok : SELASA JAM 11.00 WIB Asisten : HUSNUL KHOTIMAH L.B. PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN

Upload: de-casual

Post on 05-Aug-2015

718 views

Category:

Documents


11 download

DESCRIPTION

HASIL PENGAMATAN KULTUR ORGAN KELOMPOK PRAKTIKUM HARI SELASA JAM 11 WIB (ZAIM DZOEL HAZMY)

TRANSCRIPT

Page 1: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

“KULTUR ORGAN”

Disusun Oleh:

Nama : ZAIM DZOEL HAZMY

NIM : 115040201111085

Kelompok : SELASA JAM 11.00 WIB

Asisten : HUSNUL KHOTIMAH L.B.

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

MALANG

2012

Page 2: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

BAB IPENDAHULUAN

1.1 PendahuluanTeknologi kultur jaringan dimulai dengan spekulasi

ilmuwan dari German bernama Haberlandt pada awal abad ke 20 tentang teori totipotensi. Haberlandt menyatakan bahwa setiap sel mampu tumbuh dan berkembang menjadi tanaman normal jika dikulturkan pada nutrisi dan lingkungan yang tepat.

Kultur Jaringan, khususnya kultur organ merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri & bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utamanya adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman, menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril.

Teknik kultur jaringan pada saat ini telah berkembang menjadi teknik perkembangbiakan tanaman yang sangat penting pada berbagai spesies tanaman.

1.2 Tujuan Mengetahui bagaimana cara untuk menanam eksplan

didalam botol kultur Mengerti dan memahami tentang definisi inokulasi eksplan Mengerti dan memahami tentag definisi inkubasi eksplan Mengerti dan memahami tentang tahap kutur jaringan Mengertidan memahami tentang factor penentu keberhasilan

kultur organ Mengeri dan memahami tentang macam-macam kultur organ

Page 3: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

2.1 Definisi Isolasi EksplanIsolasi eksplan adalah isolasi jaringan/organ yang digunakan

dalam kultur jaringan. Isolasi eksplan yang digunakan ini adalah ujung pucuk-pucuk apikal (panjang ± 20 mm) saja, teknik ini disebut sebagai shoot-tip culture, namun bila eksplan yang digunakan adalah ujung pucuk apikal beserta bagian tunas lain dibawahnya disebut sebagai shoot culture.

(Smith, 2000)isolasi eksplan adalah proses pengambilan suatu bagian

tanaman dari tempat asalnya untuk diteliti lebih lanjut dalam kultur jaringan.

(Gunawan, 1987)

2.2 Definisi Inkubasi EksplanInkubasi eksplan adalah tahapan dimana menumbuhkan

eksplan setelah tanaman ditanam pada media kultur dan kondisi pada proses tersebut diatur sedemikian rupa, faktor tersebut antara lain suhu, panjang hari atau lama penyinaran, dan intensitas cahaya.

(Smith, 2000)Inkubasi eksplan adalah proses menumbuhkan eksplan

setelah ditanam dengan mengatur faktor-faktor eksternal bagi pertumbuhan.

(Suryowinoto, 1996)2.3 Tahap Kultur Jaringan

a. Pembuatan MediaMerupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur

jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan juga

Page 4: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf pada suhu 121º C selama 45 menit.

b. Sterilisasi Eksplant Inisiasi Kultur (Culture Estabilishment)Sterilisasi eksplan merupakan bagian yang paling sulit dalam

proses produksi bibit melalui kultur jaringan. Sterilisasi biasanya dilakukan dalam beberapa tahap. Pertamatama eksplan dicuci dengan deterjen atau bahan pencuci lain, selanjutnya direndam dalam bahan-bahan sterilan baik yang bersifat sistemik atau desinfektan. Bahan-bahan yang biasa digunakan untuk sterilisasi antara lain clorox, kaporit atau sublimat. Sebagai contoh, sterilisasi eksplan tanaman dapat dilakukan sebagai berikut: tunas yang akan digunakan sebagai eksplan dicuci dengan deterjen sampai betul-betul bersih. Setelah itu, tunas diambil dan direndam berturut-turut dalam benlate (0,5%) selama 5 menit, alkohol (70%) selama 5 menit, clorox (20%) selama 20 menit, dan HgCl2 (0,2%) selama 5 menit. Akhirnya eksplan dibilas dengan aquades steril (3-5 kali) sampai larutan bahan kimia hilang. Apabila kontaminan tetap ada maka konsentrasi dan lamanya perendaman sterilan dapat ditingkatkan. Bahan yang digunakan serta metode sterilisasi biasanya berbeda untuk setiap bahan tanaman, sehingga bahan dan cara tersebut belum tentu berhasil apabila diaplikasikan pada bahan yang berbeda serta waktu yang berlainan. Dengan demikian, setiap pekerjaan kultur jaringan, cara sterilisasi eksplan harus dicoba beberapa kali.

c. Penumbuhan Eksplant Dalam Media Cocok.Setelah disterilkan eksplan ditumbuhkan dalam media kultur.

Media yang banyak digunakan sampai saat ini adalah media MS. Untuk mengarahkan biakan pada organogenesis yang diinginkan, ke dalam media ditambahkan zat pengatur tumbuh.

d. Multipliksi Atau Perbanyakan PlanletProses penggandaan tanaman dimana tanaman dipotong-

potong pada bagian tertentu menjadi ukuran yang lebih kecil kemudian ditanam kembali kemedia agar yang telah disiapkan. Proses ini dilakukan secar berulang setiap tanggal waktu tertentu. Pada setiap siklusnya tanaman dipotong dan menghasilkan perbanyakan dengan tingkat RM (Rate Of Multiplication) tertentu yang berbeda-beda untuk setiap tanaman.

Kemampuan multiplikasi akan meningkat apabila biakan disubkultur berulang kali. Namun perlu diperhatikan, walaupun

Page 5: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

subkultur dapat meningkatkan factor multiplikasi dapat juga meningkatkan terjadinya mutasi. Untuk itu, biakan perlu diistirahatkan pada media MS0, yaitu tanpa zat pengatur tumbuh. Banyaknya bibit yang dihasilkan oleh suatu laboratorium tergantung kemampuan multiplikasi tunas pada setiap periode tertentu. Semakin tinggi kemampuan kelipatan tunasnya maka semakin banyak dan semakin cepat bibit dapat dihasilkan.

e. Pemanjangan Tunas, Induksi dan Perkembangan Akar.Merupakan proses induksi (perangsangan) bagi sistem

perakaran tanaman. Hasil dari proses ini adalah tanaman dari kondisi sempurnah. Tahapan ini tidak berlaku untuk semua jenis tanaman. Pengakaran adalah fase dimana planlet akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang mana biasanya hanya berupa penambahan zat pemacu pertumbuhan dari golongan auxin. Dalam fase ini biasanya tunas ditanam dalam media yangmengandung zat pengatur tumbuh (IAA, IBA atau NAA).Perakaran umumnya dilakukan pada tahap akhir dalam suatu periode perbanyakan kultur jaringan, yaitu apabila jumlah tunas in vitro sudah tersedia sesuai dengan jumlah bibit yang akan diproduksi.

f. Aklimatisasi Planlet Kelingkungan LuarAklimatisasi adalah proses penyesuaian planlet dari kondisi

mikro dalam botol (heterotrof) ke kondisi lingkungan luar (autotrof). Planlet yang dipelihara dalam keadaan steril dalam lingkungan (suhu dan kelembaban) optimal, sangat rentan terhadap lingkungan luar (lapang). Planlet yang tumbuh dalam kultur di laboratorium memiliki karakteristik daun yang berbeda dengan planlet yang tumbuh di lapang. Daun dari planlet pada umumnya memiliki stomata yang lebih terbuka, jumlah stomata tiap satuan luas lebih banyak, dan sering tidak memiliki lapisan lilin pada permukaannya. Dengan demikian, planlet sangat rentan terhadap kelembaban rendah. Mengingat sifat-sifat tersebut, sebelum ditanam di lapang, planlet memerlukan aklimatisasi. Aklimatisasi dapat dilakukan di rumah kaca atau pesemaian, baik di rumah kaca atau pesemaian. Dalam aklimatisasi, lingkungan tumbuh (terutama kelembaban) berangsur-angsur disesuaikan dengan kondisi lapang. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat

Page 6: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif.

(Suryowinoto, 1996)

2.4 Faktor Penentu Keberhasilan Kultur Jaringana. Genotipe Tanaman

Salah satu faktor yang sangat mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis eksplan dalam kultur invitro adalah genotip tanaman asal eksplan diisolasi. Hasil-hasil penelitian menunjukkan bahwa respon masing-masing eksplan tanaman sangat bervariasi tergantung dari spesies, bahkan varietas, atau tanaman asal eksplan tersebut. Pengaruh genotip ini umumnya berhubungan erat dengan faktor-faktor lain yang mempengaruhi pertumbuhan eksplan, seperti kebutuhan nutrisi, zat pengatur tumbuh, dan lingkungan kultur. Oleh karena itu, komposisi media, zat pengatur tumbuh dan lingkungan pertumbuhan yang dibutuhkan oleh masing-masing varietas tanaman bervariasi meskipun teknik kultur jaringan yang digunakan sama.

Perbedaan respon genotip tanaman tersebut dapat diamati pada perbedaan eksplan masing-masing varietas untuk tumbuh dan beregenerasi. Masing-masing varietas tanaman berbeda kemampuannya dalam merangsang pertumbuhan tunas aksilar, baik jumlah tunas maupun kecepatan pertumbuhan tunas aksilarnya. Hal serupa juga terjadi pada pembentukan kalus, laju pertumbuhan kalus serta regenerasi kalus menjadi tanaman lengkap baik melalui pembentukan organ-organ adventif maupun embrio somatik. Regenerasi dan perkembangan organ adventif dan embrio somatik juga sangat ditentukan oleh varietas tanaman induk. Perbedaan pengaruh genetik ini disebabkan karena perbedaan kontrol genetik dari masing-masing varietas serta jenis kelamin tanaman induk.

b. Media kulturPerbedaan komposisi media, komposisi zat pengatur tumbuh

dan jenis media yang digunakan akan sangat mempengaruhi pertumbuhan dan regenerasi eksplan yang dikulturkan.

1. Komposisi MediaPerbedaan komposisi media, seperti jenis dan

komposisi garam-garam anorganik, senyawa organik, zat

Page 7: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

pengatur tumbuh sangat mempengaruhi respon eksplan saat dikulturkan. Perbedaan komposisi media biasanya sangat mempengaruhi arah pertumbuhan dan regenerasi eksplan. Meskipun demikian, media yang telah diformulasikan tidak hanya berlaku untuk satu jenis eksplan dan tanaman saja. Beberapa jenis formulasi media bahkan digunakan secara umum untuk berbagai jenis eksplan dan varietas tanaman, seperti media MS. Namun ada juga beberapa jenis media yang diformulasikan untuk tanaman-tanaman tertentu misalnya WPM, VW dll. Media-media tersebut dapat digunakan untuk berbagai tujuan seperti perkecambahan biji, kultur pucuk, kultur kalus, regenerasi kalus melalui organogenesis dan embriogenesis. Media yang dibutuhkan untuk perkecambahan biji, perangsangan tunas-tunas aksilar umumnya lebih sederhana dibandingkan dengan media untuk regenerasi kalus baik melalui organogenesis maupun embryogenesis.2. Komposisi hormon pertumbuhan.

Komposisi dan konsentrasi hormon pertumbuhan yang ditambahkan dalam media sangat mempengaruhi arah pertumbuhan dan regenerasi eksplan yang dikulturkan. Komposisi dan konsentrasi hormon pertumbuhan yang ditambahkan ke dalam media kultur sangat tergantung dari jenis eksplan yang dikulturkan dan tujuan pengkulturannya. Konsentrasi hormon pertumbuhan optimal yang ditambahkan ke dalam media tergantung pula dari eksplan yang dikulturkan serta kandungan hormon pertumbuhan endogen yang terdapat pada eksplan tersebut. Komposisi yang sesuai ini dapat diperkirakan melalui percobaan-percobaan yang telah dilakukan sebelumnya disertai percobaan untuk mengetahui komposisi hormon pertumbuhan yang sesuai dengan kebutuhan dan arah pertumbuhan eksplan yang diinginkan.

Hormon pertumbuhan yang digunakan untuk perbanyakan secara invitro adalah golongan auksin, sitokinin, giberelin, dan growth retardant. Auksin yang umum dipakai adalah IAA (Indole Acetic Acid), IBA (Indole Butyric Acid), NAA (Naphtalena Acetic Acid), dan 2,4-D

Page 8: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

(2,4-dichlorophenoxy Acetic Acid). Selain itu beberapa peneliti pada beberapa tanaman menggunakan juga CPA (Chlorophenoxy Acetic Acid). Sitokinin yang banyak dipakai adalah Kinetin (Furfuryl Amino Purine), BAP/BA (Benzyl Amino Purine/Benzyl Adenine), 2 i-P (2-isopentenyl Adenin). Beberapa sitokinin lainnya yang juga digunakan adalah zeatin, thidiazuron dan PBA (6(benzylamino)-9-(2-tetrahydropyranyl)-9H-purine). Hormon pertumbuhan golongan giberellin yang paling umum digunakan adalah GA3, selain itu ada beberapa peneliti yang menggunakan GA4 dan GA7, sedangkan growth retardant yang sering digunakan adalah Ancymidol, Paraclobutrazol dan TIBA, AbA dan CCC.3. Keadaan fisik media.

Media yang umum digunakan dalam kultur jaringan adalah medium padat, medium semi padat dan medium cair. Keadaan fisik media akan mempengaruhi pertumbuhan kultur, kecepatan pertumbuhan dan diferensiasinya. Keadaan fisik media ini mempengaruhi pertumbuhan antara lain karena efeknya terhadap osmolaritas larutan dalam media serta ketersediaan oksigen bagi pertumbuhan eksplan yang dikulturkan.

Media yang umum digunakan dalam mikropropagasi adalah media semi-solid (semi padat) dengan cara menambahkan agar. Media semi padat ini digunakan karena beberapa alasan antara lain: eksplan yang kecil mudah terlihat dalam media padat, selama kultur eksplan tetap berada pada orientasi yang sama, eksplan berada di atas permukaan media sehingga tidak diperlukan teknik aerasi tambahan pada kultur, orientasi pertumbuhan tunas dan akar tetap, dan kalus tidak pecah seperti jika ditempatkan pada media cair. Namun penambahan agar dalam beberapa kasus dapat menghambat pertumbuhan karena: agar mungkin mengandung senyawa penghambat yang dapat menghambat morfogenesis beberapa kultur atau memperlambat pertumbuhan kultur, eksudasi fenolik dari eksplan terserap oleh media yang menempel dengan eksplan sehingga dapat mempengaruhi pertumbuhan eksplan, agar harus dicuci

Page 9: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

bersih dari akar sebelum diaklimatisasi, dan perlu waktu yang lebih banyak untuk mencuci gelas kultur misalnya botol-botol harus diautoclave untuk melarutkan agar sebelum dicuci.

c. Lingkungan tumbuh1. Suhu.

Tanaman umumnya tumbuh pada lingkungan dengan suhu yang tidak sama setiap saat, misalnya pada siang dan malam hari tanaman mengalami kondisi dengan perbedaan suhu yang cukup besar. Keadaan demikian bisa dilakukan dalam kultur invitro dengan mengatur suhu siang dan malam di ruang kultur, namun laboratorium kultur jaringan selama ini mengatur suhu ruang kultur yang konstant baik pada siang maupun malam hari. Umumnya temperatur yang digunakan dalam kultur in vitro lebih tinggi dari kondisi suhu invivo. Tujuannya adalah untuk mempercepat pertumbuhan dan morfogenesis eksplan.

Pada sebagian besar laboratorium, suhu yang digunakan adalah konstan, yaitu 25°C (kisaran suhu 17-32°C). Tanaman tropis umumnya dikulturkan pada suhu yang sedikit lebih tinggi dari tanaman empat musim, yaitu 27°C (kisaran suhu 24-32°C). Bila suhu siang dan malam diatur berbeda, maka perbedaan umumnya adalah 4-8°C, variasi yang biasa dilakukan adalah 25°C siang dan 20°C malam, atau 28°C siang dan 24°C malam. Meskipun hampir semua tanaman dapat tumbuh pada kisaran suhu tersebut, namun kebutuhan suhu untuk masing-masing jenis tanaman umumnya berbeda-beda. Tanaman dapat tumbuh dengan baik pada suhu optimumnya. Pada suhu ruang kultur dibawah optimum, pertumbuhan eksplan lebih lambat, namun pada suhu diatas optimum pertumbuhan tanaman juga terhambat akibat tingginya laju respirasi eksplan.2. Kelembaban relatif.

Kelembaban relatif dalam botol kultur dengan mulut botol yang ditutup umumnya cukup tinggi, yaitu berkisar antara 80-99%. Jika mulut botol ditutup agak longgar maka kelembaban relatif dalam botol kultur dapat lebih rendah dari 80%. Sedangkan kelembaban relatif di ruang kultur

Page 10: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

umumnya adalah sekitar 70%. Jika kelembaban relatif ruang kultur berada dibawah 70% maka akan mengakibatkan media dalam botol kultur (yang tidak tertutup rapat) akan cepat menguap dan kering sehingga eksplan dan plantlet yang dikulturkan akan cepat kehabisan media. Namun kelembaban udara dalam botol kultur yang terlalu tinggi menyebabkan tanaman tumbuh abnormal yaitu daun lemah, mudah patah, tanaman kecil-kecil namun terlampau sukulen. Kondisi tanaman demikian disebut vitrifikasi atau hiperhidrocity. Sub-kultur ke media lain atau menempatkan planlet kecil ini dalam botol dengan tutup yang agak longgar, tutup dengan filter, atau menempatkan silica gel dalam botol kultur dapat membantu mengatasi masalah ini.3. Cahaya.

Seperti halnya pertumbuhan tanaman dalam kondisi invivo, kuantitas dan kualitas cahaya, yaitu intensitas, lama penyinaran dan panjang gelombang cahaya mempengaruhi pertumbuhan eksplan dalam kultur invitro. Pertumbuhan organ atau jaringan tanaman dalam kultur invitro umumnya tidak dihambat oleh cahaya, namun pertumbuhan kalus umumnya dihambat oleh cahaya.

Pada perbanyakan tanaman secara invitro, kultur umumnya diinkubasikan pada ruang penyimpanan dengan penyinaran. Tunas-tunas umumnya dirangsang pertumbuhannya dengan penyinaran, kecuali pada teknik perbanyakan yang diawali dengan pertumbuhan kalus. Sumber cahaya pada ruang kultur ini umumnya adalah lampu flourescent (TL). Hal ini disebabkan karena lampu TL menghasilkan cahaya warna putih, selain itu sinar lampu TL tidak meningkatkan suhu ruang kultur secara drastis (hanya meningkat sedikit). Intensitas cahaya yang digunakan pada ruang kultur umumnya jauh lebih rendah (1/10) dari intensitas cahaya yang dibutuhkan tanaman dalam keadaan normal. Intensitas cahaya dalam ruang kultur untuk pertumbuhan tunas umumnya berkisar antara 600-1000 lux. Perkecambahan dan inisiasi akar umumnya dilakukan pada intensitas cahaya lebih rendah.

Page 11: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

Selain intensitas cahaya, lama penyinaran atau photoperiodisitas juga mempengaruhi pertumbuhan eksplan yang dikulturkan. Lama penyinaran umumnya diatur sesuai dengan kebutuhan tanaman sesuai dengan kondisi alamiahnya. Periode terang dan gelap umumnya diatur pada kisaran 8-16 jam terang dan 16-8 jam gelap tergantung varietas tanaman dan eksplan yang dikulturkan. Periode siang/malam (terang/gelap) ini diatur secara otomatis menggunakan timer yang ditempatkan pada saklar lampu pada ruang kultur. Dengan teknik ini penyinaran dapat diatur konstan sesuai kebutuhan tanaman.

d. Kondisi EksplanPertumbuhan dan morfogenesis dalam mikropropagasi

sangat dipengaruhi oleh keadaan jaringan tanaman yang digunakan sebagai eksplan. Selain faktor genetis eksplan yang telah disebutkan di atas, kondisi eksplan yang mempengaruhi keberhasilan teknik mikropropagasi adalah jenis eksplan, ukuran, umur dan fase fisiologis jaringan yang digunakan sebagai eksplan.

Meskipun masing-masing sel tanaman memiliki kemampuan totipotensi, namun masing-masing jaringan memiliki kemampuan yang berbeda-beda untuk tumbuh dan beregenerasi dalam kultur jaringan. Oleh karena itu, jenis eksplan yang digunakan untuk masing-masing kultur berbeda-beda tergantung tujuan pengkulturannya.

Umur eksplan sangat berpengaruh terhadap kemampuan eksplan tersebut untuk tumbuh dan beregenerasi. Umumnya eksplan yang berasal dari jaringan tanaman yang masih muda (juvenil) lebih mudah tumbuh dan beregenerasi dibandingkan dengan jaringan yang telah terdiferensiasi lanjut. Jaringan muda umumnya memiliki sel-sel yang aktif membelah dengan dinding sel yang belum kompleks sehingga lebih mudah dimodifikasi dalam kultur dibandingkan jaringan tua. Oleh karena itu, inisiasi kultur biasanya dilakukan dengan menggunakan pucuk-pucuk muda, kuncup-kuncup muda, hipokotil, inflorescence yang belum dewasa, dll. Jika eksplan diambil dari tanaman dewasa, rejuvenilisasi tanaman induk melalui pemangkasan atau pemupukan dapat membantu untuk memperoleh eksplan muda agar kultur lebih berhasil.

Page 12: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

Ukuran eksplan juga mempengaruhi keberhasilan kultur. Eksplan dengan ukuran kecil lebih mudah disterilisasi dan tidak membutuhkan ruang serta media yang banyak, namun kemampuannya untuk beregenerasi juga lebih kecil sehingga dibutuhkan media yang lebih kompleks untuk pertumbuhan dan regenerasinya. Sebaliknya semakin besar eksplan, maka semakin besar kemungkinannya untuk membawa penyakit dan makin sulit untuk disterilkan, membutuhkan ruang dan media kultur yang lebih banyak. Ukuran eskplan yang sesuai sangat tergantung dari jenis tanaman yang dikulturkan, teknik dan tujuan pengkulturannya.

(Wattimena, 1992)

2.5 Macam-macam Kultur OrganKultur organ terdiri atas dua macam teknik kultur, yaitu

kultur organ dewasa dan kultur bakal organ. Kultur organ dewasa pada umumnya dipakai untuk mempertahankan kehidupan organ yang diambil dari tubuh baik yang masih sehat maupun kehidupan organ yang tidak mungkin dapat bertahan hidup. Kultur bakal organ memelihara jaringan-jaringan bakal organ untuk dikembangkan di dalam kondisi in-vitro.

(Smith, 2000)

Page 13: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

BAB IIIMETODOLOGI

3.1 Alat, Bahan dan Fungsia. Alat Pinset : alat untuk mengambil eksplan secara steril Skapel : berfungsi sebagai pisau pembedah / pemotong Petridish : cawan petri / tempat menaruh eksplan sementara LAFC : ruangan penanaman Sprayers : menyemprotkan cairan Mata Pisau : memotong bahan eksplan Cutter atau gunting : memotong eksplan sebelum di sterilkan Gelas ukur 400ml : tempat cairan yang di butuhkan Botol kultur 5 buah : media penanaman Saringan : menyaring bahan cairan yang menggumpal Spatula : mengaduk cairan Kacamata : pelindung mata Bunsen atau korek : Pembakaran pada proses penanaman

eksplan

b. Bahan Tunas krisan : bahan eksplan / penanaman Detergen : bahan sterilisasi dari kotoran Bayclean : bahan sterilisasi Aquades : penambah / pembuat larutan Fungisida : bahan sterilisasi dari jamur Etanol (C2H5OH) 70% : sterilisasi alat

Page 14: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

3.2 Cara Kerjaa. Sterilisasi Awal

Ambil eksplan dari tanaman hidup

Gosok eksplan dengan detergen 10% (10

gr/100%) selama 5 menit

Bilas dengan air yang mengalir

Cuci dengan Clorox (Bayclean) 10%

Aduk dengan spatula

Rendam dengan aquades steril

Page 15: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

b. Penanaman di LAFC

Potong-potong bagian eksplan

Tanam semua bagian tadi kedalam media MS (tidak

menancap hanya menempel)

Tutup botol kultur dengan plastik atau alumunium foil

Ikat dengan karet (NB : mulut botol dipanaskan terlebih

dahulu)

Lakukan pengamatan 3 hai sekali selama 2 minggu

Dokumentasi ke 5 botol kultur (lihat yang terkontaminasi)

Page 16: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

3.3 Analisa PerlakuanUntuk sterilisasi awal pada praktikum kultur organ, tanaman

yang di ambil sebagai bahan (eksplan) adalah tanaman krisan. Eksplan yang diambil adalah pada bagian tunas di ketiak daun. Kemudian eksplan diambil dengan dipotong menjadi 4 bagian kecil. Lalu eksplan tersebut di rendam dengan detergen selama kurang lebih 5 menit yang bertujuan untuk menghilangkan / mensterilisasi dari kotoran yang masih ada di eksplan. Kemudian setelah itu, bilas dengan air, tujuannya adalah untuk membersihkan dari sisa detergen yang terisisa. Setelah itu, cuci dengan klorox (bayclean) sebagai desinfektan / sterilisasi lagi, lalu bilas ulang dengan air untuk menghilangkan bayclean yang tersisa. Lanjutkan dengan merendam di dalam fungisida, sebagai bahan sterilisasi dari jamur yang kemungkinan melekat di eksplan.

Sedangkan pada proses berikutnya, yakni penananman eksplan pada LAFC). Diawali dengan memotong bagian eksplan menjadi 4 bagian kecil, tanam di dalam media MS yang sudah disiapkan secara menempel dengan tujuan agar eksplan bisa tumbuh dengan baik. Mulut botol dipanaskan untuk mensterilkan mulut botol dari bakteri atau kontaminan yang lain. Tutup dengan plastic atau alumunium foil.

Page 17: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil PengamatanPengamatan 9 November 2012

No.

Botol ke-

Dokumentasi Pengamatan

Kondisi Eksplan

Kontaminan

Tidak Kontamina

n

Keterangan

1. 1

Jenis Kontaminan: -Pertumbuhan: -

2. 2

Jenis Kontaminan: -Pertumbuhan: -

3. 3

Jenis Kontaminan: -Pertumbuhan: -

4. 4

Jenis Kontaminan: -Pertumbuhan: -

Page 18: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

5. 5

Jenis Kontaminan: -Pertumbuhan: -

Pengamatan 13 November 2012

No.

Botol ke-

Dokumentasi Pengamatan

Kondisi Eksplan

Kontaminan

Tidak Kontamina

n

Keterangan

1. 1

Jenis Kontaminan: -Pertumbuhan: -

2. 2

Jenis Kontaminan: jamurPertumbuhan: terbentuk hifa putih dan ada juga yang abu-abu agak kehitaman

3. 3

Jenis Kontaminan: -Pertumbuhan: -

Page 19: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

4. 4

Jenis Kontaminan: jamurPertumbuhan: terbentuk hifa putih

5. 5

Jenis Kontaminan: -Pertumbuhan: -

Pengamatan 19 November 2012

No.

Botol ke-

Dokumentasi Pengamatan

Kondisi Eksplan

Kontaminan

Tidak Kontamina

n

Keterangan

1. 1

Jenis Kontaminan: jamurPertumbuhan: terbentuk hifa putih

2. 2 Jenis Kontaminan: jamurPertumbuhan: terbentuk hifa putih dan ada juga yang abu-abu agak

Page 20: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

kehitaman3. 3

Jenis Kontaminan: jamurPertumbuhan: terbentuk hifa putih

4. 4

Jenis Kontaminan: jamurPertumbuhan: terbentuk hifa putih

5. 5

Jenis Kontaminan: jamurPertumbuhan: terbentuk hifa putih

4.2 PembahasanPada pengamatan pertama, tanggal 9 November 2012. Kami

tidak menemukan satupun adanya kontaminan didalam botol kultur yang berisikan eksplan yang kami letakkan didalamnya. Semua botol masih tampak steril. Kemudian pada pengamatan kedua, yakni pada tanggal 13 November 2012, kami mulai menemukan adanya kontaminan pada 2 botol kultur yang amati dari 5 botol kultur pengamatan. Adapun botol kultur yang didalamnya terdapat kontaminan adalah botol kultur 2 dan 4, sedangkan botol kultur 1, 3, dan 5 masih tampak steril. Setelah kami analisa lebih lanjut, maka kami dapat menarik kesimpulan bahwa botol kultur 2 dan 4 terkontaminasi oleh jamur. Hal ini dapat dilihat dari adanya hifa

Page 21: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

putih yang terbentuk didalamnya. Untuk botol kultur 4 hanya ditemukan hifa putih tipis diatas media agar, namun pada botol kultur 2 ditemukan cukup banyak hifa diatasnya (lebih banyak dari yang ditemukan pada botol kultur 4) serta terdapat warna abu-abu kehitaman pada beberapa hifa didalam botol kultur tersebut. untuk botol kultur yang masih steril (tidak terkontaminasi), tidak ditemukan ciri-ciri apapun yang menandakan bahwa botol tersebut terkontaminasi.

Lalu pada pengamatan hari terakhir, yaitu pada tanggal 19 November 2012. Ternyata semua botol kultur terkontaminasi. Hal ini dapat dilihat dari tedapatnya hifa didalam botol kultur pada masing-masing botol kultur. Untuk botol kultur 1, 3, dan 5 hanya terdapat benang-benang hifa putih halus. Namun pada botol kultur 2, banyak sekali terdapat kontaminan jamur didalamnya, hal ini dapat dilihat dari banyaknya hifa dan warna hifanya sendiri sudah mulai mengitam. Sedangkan pada botol 4, walaupun sama-sama terkontaminas, namun keadaannya tidak separah pada botol kultur dua. Hanya saja hifa yang sebelumnya putih kini sudah mulai menghitam. Dan pada masing-masing botol kultur, disekeliling ekspan terdapat warna coklat.

Menurut Zakaria, sebagian besar eksplan diserang oleh bakteri, dengan ciri-ciri terdapat bercak berlendir berwarna putih dan berlendir pada eksplan maupun pada media. Bercak ini semakin melebar dan membuat koloni-koloni pada bagian-bagian dari eksplan dan media. Sedangkan pada eksplan yang terkontaminasi oleh bakteri terdapat hyfa berwarna putih yang hitam. Seperti bakteri, jamur ini pun terdapat pada eksplan dan mulai menyebar ke media. Kontaminasi ini bisa terjadi karena beberapa faktor diantaranya adalah kurang sempurnanya proses sterilisasi baik ruangan, peralatan, eksplan, maupun praktikan (aliran udara yang berasal dari pernafasan dan pembicaraan, debu atau partikel yang terhambur dari tubuh praktikan atau bahan steril yang tersentuh oleh praktikan). Oleh sebab itu, sebelum melakukan kegiatan kultur jaringan para praktikan harus memahami prosedur dan aturan dalam kultur jaringan.

Masalah-masalah yang juga sering muncul dalam kultur jaringan adalah pencoklatan. Pencoklatan adalah suatu karakter munculnya coklat atau warna hitam yang sering menghambat

Page 22: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

pertumbuhan eksplan. Pencoklatan ini dapat terjadi akibat kurangnya perendaman eksplan oleh larutan pemutih atau pembersih yang dapat mengurangi terjadinya browning atau dapat juga disebabkan oleh terlalu lamanya kontak eksplan dengan udara luar sebelum eksplan ditanam.

(Zakaria, 2007)

BAB V

Page 23: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

PENUTUP5.1 Kesimpulan

Jadi, kesimpulan dari praktikum kultur organ kali ini adalah semua dari botol kultur kami terdapat kontaminan didalamnya yang setelah diamati lebih lanjut ternyata kontaminannya berupa bakteri karena tedapat hifa didalamnya.

Pada awal pengamatan tidak ditemukan kontaminan sama sekali pada masing-masing botol kultur, namun pada pengamatan kedua, botol kultur 2 dan 4 mulai terkontaminasi oleh jamur. Kemudian pada pengamatan terakhir, diketahui bahwa semua botol sudah terkontaminasi oleh jamur, bahkan ada salah satu botol yang hifa dari jamurnya sudah berwarna kehitaman. Sedangkan pada masing-masing eksplan di tiap-tiap botol terdapat warna coklat disekotarnya.5.2 Saran

Saran untuk praktikum. Apabila kita akan melakukan pengamatan yang dilakukan selama interval beberapa hari dalam beberapa minggu, sebaiknya jangan memilih waktu yang bertepatan dengan hari libur nasional. Seperti pengamatan kita untuk kultur organ ini tidak bisa optimal lantaran kita sempat memiliki hari libur 4 hari. Jadi proses terdapatnya kontaminan pada hari apa (persisnya) sulit untuk diketahui.

Saran untuk asisten. Sebenarnya tidak ada catatan khusus untuk asisten. Tapi kenapa kultur kita gagal semua? Apa mungkin dalam melakukan proses-prosesnya ada kesalahan? Seperti sterilisasi eksplan dll. Untuk itu mari kita koreksi bersama agar kedepannya mendapatkan hasil yang lebih baik lagi.

DAFTAR PUSTAKA

Page 24: LAPORAN BIOTEKNOLOGI KULTUR ORGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

Gunawan, L.W. 1987. Teknik Kultur Jaringan. Pusat antar fakultas pertanian, IPB : bogor

Hendaryono, Daisy P. Sriyanti. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Yogyakarta: Penerbit Kanisius.

Sarwijo, RM. 2000. Jurnal : Multiplikasi Empat Varietas Krisan Melalui Teknik Kultur Jaringan. Institut Pertanian Bogor : Bogor

Smith, R.H. 2000. Plant Tissue Culture : techniques and experiments. Academic press : London.

Suryowinoto, M., 1996. Pemuliaan Tanaman Secara In Vitro. Kanisius. Yogyakarta.

Wattimena, G.A, 1992. Bioteknologi Tanaman. IPB. Bogor.Zakaria, F. 2007. Perbanyakan Bibit Jati (Tectona Grandis) Kultur

Jaringan Di Pusat Pengembangan Sumber Daya Hutan. PKL tidak diterbitkan. Malang: Program Strata 1 UMM.