Laporan Praktikum Hari/Tanggal : Selasa, September 2013

Biokimia Waktu : 09:00-10:40 WIB

PJP : Syaefudin,M.si

Asisten : Lusianawati,S.si

Resti Siti Muthmainah,S.si

ISOLASI DNA KROMOSOM

Kelompok 2

Mhd Ali Aman.Siregar J3L112002

Indryani Rahayu Kuswardhani J3L112080

Emilia Anisa J3L112153

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIAPROGRAM DIPLOMA

INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR

2013

Pendahuluan

Isolasi DNA adalah tahap awal dalam mempelajari DNA sequence yang spesifik dengan

populasi DNA yang lengkap, dan dalam analisa struktur gen dan ekspresi gen ( Surzycki, 1936 ).

DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana

dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik

secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan

untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan.

DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi (Zubaidah

2004). Isolasi DNA kromosom secara umum dibagi atas 3 tahap yaitu pemecahan sel atau

jaringan/sel dilisis untuk membebaskan isinya, ekstrak sel diberi perlakuan untuk menghilangkan

semua komponen kecuali DNA,dan pemekatan larutan DNA yang telah diperoleh (Benyamin

1960).

Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Pemecahan dinding sel secara

mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil.

Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair

dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang

berisi DNA (Machmud, 2006).

Sentrifugasi adalah metode sedimentasi untuk memisahkan partikel-partikel dari suatu

fluida berdasarkan berat jenisnya dengan memberikan gaya sentripetal (Robinson 1975).

Sentrifugasi bertujuan untuk memisahkan sel menjadi organel-organel utama sehingga fungsinya

dapat diketahui (Miller 2000). Substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan

substansi yang lebih ringan akan terletak di atas (Miller 2000). Substansi hasil sentrifugasi

terbagi menjadi dua, yaitu supernatan dan pelet. Supernatan adalah substansi hasil sentrifugasi

yang memiliki bobot jenis yang lebih rendah. Posisis dari substansi ini berada pada lapisan atas

dan warnanya lebih jernih. Sementara pelet adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki

bobot jenis yang lebih tinggi. Posisisnya berada pada bagian bawah (berupa endapan) dan

warnanya lebih keruh. Sentrifugasi bertujuan untuk memisahkan sel menjadi organel-organel

utama sehingga fungsinya dapat diketahui (Miller 2000). Sentrifugasi ini biasa digunakan untuk

memisahkan molekul-molekul yang perbedaan densitasnya hingga 0,02 g/mL/ molekul-molekul

tersebut seperti molekul protein, DNA, dan RNA yang densitasnya pada larutan sesium klorida

ialah 1.3 g/mL , 1.6-1.7 g/mL, dan 1.75-1.8 g/Ml (Collen et al 1996).

Tujuan

Percobaan bertujuan menunjukan sifat dan struktur DNA memlalui proses isolasi

Alat dan Bahan

Alat alat yang digunakan yaitu Pipet mikro,corong pisah, mortar,tabung reaksi,gelas piala

100 mL, pisau, Sentrifus kecepatan tinggi, tabung sentrifius, Penangas air.

Bahan-bahan yang digunakan yaitu Umbi bawang merah, NaCl, Larutan lisis, SDS 10%,

Buffer elusi/buffer TE, dH2O steril, larutan EtOH.

Prosedur percobaan

Pembuatan larutan. Larutan lisis terdiri dari 50 mM Tris HCl, pH 8,0 yang

mengandung 50 mM EDTA. Sedangkan larutan elusi atau buffer TE dibuat dari 10 mM Tris-HCl

pH 8,0 yang mengandung 0.1 mM EDTA pH 8.0. Setelah itu, larutan disimpan di pendingin.

Prosedur isolasi DNA kromosom. Sebanyak 25 gram umbi bawang digerus dengan

menggunakan mortar, ditambahkan 40 mL larutan lisis dan 2,5 gram garam dapur digerus

sampai halus. Setelah itu, dituang ke dalam gelas piala 250 mL dan ditambahkan 5 mL larutan

SDS 10%. Larutan dicampur secara homogen dan diinkubasi pada suhu 60°C dalam water bath

selama 20 menit. Hasil inkubasi lalu disaring ke dalam gelas beaker yang ditempatkan diatas es

sehingga larutan tersebut segera menjadi dingin. Setelah larutan menjadi dingin kemudian

ditambahkan 0,5 gram protease, aduk secara sempurna dan biarkan selama 15 menit. Kemudian

larutan dibiarkan 5 menit lalu diambil larutan atas dengan menggunakan pipet tetes dan

dipindahkan ke dalam 4 tabung baru. EtOH dingin sebanyak 10 mL ditambahkan melalui sisi

tabung. Kemudian, tabung ditempatkan secara perlahan di atas es dan dibiarkan selama 2-5

menit. DNA kromosom akan mengendap pada bagian atas dari EtOH dan tampak sebagai

benang-benang putih. DNA kromosom diambil dengan pipet tetes secara hati-hati dengan

sesedikit mungkin larutan EtOH yang terambil dan ditempatkan pada 2 tabung eppendorf 1.5

mL. Keempat tabung disentrifugasi selama 1 menit. EtOH dibuang pada lapisan atas secara hati-

hati tanpa merusak pellet dan ditambahkan 1 mL EtOH ke pellet DNA kromosom. Resuspen

pelet DNA kromosom dengan cara vortex dalam 1 mL EtOH dan disentrifugasi kembali selama

1 menit. EtOH dituang dan DNA kromosom dikeringkan dalam bech selama 10 menit. Setelah

kering, buffer TE atau dH2O steril 1 mL untuk melarutkan DNA kromosom.

Data dan Hasil Percobaan

Tabel 1 Data hasil pengukuran konsentrasi DNA dari umbi bawang

Larutan A 280 A koreksi [DNA] [RNA] [DNA/RNA]

Blanko (TE)

Sampel 1

Sampel 2

Pembahasan

. Prinsip isolasi DNA kromosom itu sendiri didasarkan pada pemisahan DNA kromosom

dari pengotor lain berupa protein atau RNA menggunakan teknik sentrifugasi. Secara umum

isolasi DNA kromosom terbagi atas tiga tahapan proses yaitu pemecahan sel atau pelisisan sel,

menghilangan komponen lain selain DNA kromosom, dan pemekatan larutan DNA yang

diperoleh (David et al. 1983).

Isolasi DNA kromosom merupakan tahap yang paling penting yang harus dilakukan. Hal

ini dikarenakan DNA kromosom merupakan sumber DNA yang umumnya kita kehendaki untuk

diklon yang harus bersih dari pengotor-pengotor seperti protein dan RNA. Prinsip dari proses

isolasi DNA kromosom adalah memisahkan DNA kromosom dari komponen-komponen sel lain.

Sumber DNA dapat berasal dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia.

Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada

ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase

(yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya

ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 60°C untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi

DNA (DNase). Larutan DNA kemudian dipresipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi

dengan air (Brush 1994). 

Isolasi DNA kromosom dilakukan pada umbi bawang merah pada praktikum kali ini.

Penggunaan umbi bawang merah sebagai sumber pengisolasian DNA kromosom disebabkan

umbi bawang memiliki sedikit pati sehingga DNA akan terlihat akan lebih jelas dan mudah

diisolasi. Beberapa pereaksi digunakan dalam proses isolasi DNA kromosom dari umbi bawang

merah, diantaranya garam untuk melarutkan DNA, larutan lisis yang berfungsi melisis dinding

sel, SDS 10% berfungsi untuk memecahkan dinding sel dengan mengemulsi lipid dan protein

merusak interaksi polar pada membran sel, penambahan alkohol dingin berfungsi untuk

mengikat DNA dan membentuk suatu matriks kental seperti lem putih akibat pemekatan DNA,

dan larutan buffer TE atau dH2O untuk merutkan DNA kromosom.

Garam yang digunakan adalah garam NaCl. NaCl dapat menyebabkan menyebabkan

DNA menjadi larut karena ion Na + mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif

fosfat DNA yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak menolak satu

sama lain sehingga pada saat ion Na + membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA. Hal

ini akan menyebabkan DNA akan terkumpul (Doyle & Doyle 1990).

Penambahan alkohol dingin pada ekstrak ekstrak sel melalui dinding tabung akan

membentuk gumpalan putih. Etanol dingin berfungsi dalam pengikatan strand DNA yang telah

terkumpul kerena pemekatan oleh garam. Hal ini karena kerapatan alkohol lebih kecil

dibandingkan kerapatan air maka alkohol akan berada di bagian atas larutan pada tabung reaksi.

Strand-strand DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak sebagi benang-benang putih yang

terapung di atas filtrat.

Benang-benang DNA berwarna putih pada lapisan atas larutan diambil dan dimasukkan

dalam tabung eppendorf 1.5 ml untuk selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm.

Sentrifugasi berfungsi untuk memisahkan DNA kromosom dari komponen lain seperti protein

ataupun RNA. Pemisahan dengan sentrifus didasarkan perbedaan bobot molekul. DNA

kromosom yang memiliki bobot molekul lebih besar akan berada dibagian dasar setelah

disentrifugasi. Pada tahap akhir pelet dikering-anginkan untuk menghilangkan EtOH dan DNA

kromosom yang didapatkan ditambahkan dengan dH2O steril.

Simpulan

Berdasarkan hasil percobaan uji ketengikan menunjukkan hasil positif untuk minyak

kelapa tengik, minyak kelapa,margarin, sedangkan lemak hewan dan margarin menghasilkan

hasil uji yang negative dan ketengikan dipengaruhi oleh oksidasi,kegiatan enzim,dan hidrolisis.

Uji salkowski menunjukkan hasil yang positif terdapat kolestrol, dan uji Lieberman Buchard

menunjukan hasil yang negatif.

Daftar pustaka

Brush A. 1994. Biologi Molekular Sel Edisi ke-2. Jakarta: Gramedia.

David AM, Freyer GA, Crotty DA. 1983. DNA Science: A First Course. New York: Laboratory Press.

Doyle J.J and Doyle J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. Moscow. 12(1):13-15.

Miller J.N. 2000. Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 4th ed. Harlow:

Prentice. Hall.

Robinson J.R. 1975. Fundamental Of Acid-Base Regulation, 5th edition. Oxford: Blackwell

Scientific Publication.