I. Tujuan

Memahami metode isolasi DNA kromosom dari sel prokariot berupa bakteri

Gram negatif menggunakan GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit.

II. Prinsip

Sel bakteri Gram negatif dipecahkan menggunakan proteinase K dan

Digestion Solution atau Lysis solution. RNA dihilangkan dengan penambahan RNase

A. Lisat dicampurkan dengan etanol, lalu dituangkan dalam kolom purifikasi,

sehingga molekul DNA terikat pada membrane silica. Kolom dicuci dengan Wash

Buffer untuk membuang kontaminan. DNA kromosom dielusi dari membrane silica

pada kondisi kekuatan ionic yang rendah menggunakan Elution buffer.

III. Teori Dasar

Prinsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai

organisme pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan

bahan yang digunakan. Namun tahapan-tahapan isolasi DNA dalam setiap

langkahnya memiliki protokol sendiri yang disesuaikan dengan keperluan.

Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan manual memiliki kelebihan dan

kekurangan. Metode konvensional memiliki kelebihan harga lebih murah dan

digunakan secara luas sementara kekurangannya membutuhkan waktu yang relatif

lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel. 

  Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau

penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan

dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel. Tahap

penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik

seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen

cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi. Cara lain yakni

dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik.

Beberapa Metode Pemecahan Sel Cara Fisik

1. Dengan alat homogenizer, seperti waring blender, atau hammer mill.

Biasa digunakan untuk memecah dinding sel jaringan hewan dan tumbuhan.

Cara ini kurang baik untuk sel mikroba karena dinding selnya lebih keras.

Untuk membantu proses pemecahan digunakan : bubuk alumina, pasir atau

silica

Untuk preparat kecil digunakan mortar dan penumbuk

Untuk skala besar digunakan homogenizer atau penggiling bertekanan

ditambah bubuk metal sebagai pemecah

Sel dibasahi dengan buffer untuk mempermudah pemecahan

Dapat ditambah dengan proses agitasi

Letak enzim di dalam sel mempengaruhi waktu pemecahan

2. Pembekuan dan Pencairan

Jika pasta sel didinginkan pada -20 oC, maka ia akan mengalami perusakan

dinding sel akibat anomali air (volume membesar ketika air membeku).

Sekitar 50% protein periplasma akan dilepaskan ke dalam medium, tapi hanya

± 10% protein terlarut total.

Bila enzim dapat dilepaskan dengan cara ini, umumnya enzim tersebut

memiliki derajat kemurnian yang tinggi.

Senyawa kriopektan (laktosa, dekstran, rafinosa, gliserol) yang digunakan

pada proses pembekuan akan menghambat pemecahan sel

Sel yang sudah tua lebih mudah dipecah daripada sel muda

Bakteri gram negatif lebih mudah dipecah daripada gram positif

3. Kejutan Osmosis

Bakteri Gram negatif lebih rentan terhadap perubahan tekanan osmosa yang

besar dibandingkan bakteri Gram positif.

Bila bakteri diletakkan dalam media dengan tekanan osmosa tinggi (mis.

larutan sukrosa20%) sampai dicapai keadaan setimbang, kemudian

dipindahkan ke dalam air, maka akan timbul aliran air dari media ke dalam

sel, sehingga akan menyebabkan pecahnya dinding sel.

4. Sonifikasi

Sel dalam media cair diberi getaran di atas frekuensi batas pendengaran

manusia (> 20kHz, ultrasonik)

Getaran ini menimbulkan perapatan dan perenggangan yang menimbulkan

perubahan periodik tekanan dalam cairan medium dan plasma sel

5. Agitasi dengan Abrasi

Pasta ditempatkan pada wadah yang mengandung butir-butir gelas dan

digetarkan dengan cepat. Timbulnya gaya gesek akibat gradien kecepatan oleh

tumbukan antar butiran dan antara butiran dengan mikroorganisme

menyebabkan pecahnya sel.

Ekstraksi Secara Kimia

Lebih halus dari cara fisik.

Agitasi diterapkan hanya sekali-kali.

1. Detergent

Detergent-detergent anionik, kationik, dan nonionik cukup efektif untuk

merusak membran sel.

Contoh detergent yang sering digunakan untuk isolasi enzim a.l: setiltrimetil

amonium bromida (kationik), natrium laurel sulfat (anionik), tweens, spans

dan triton (non-ionik)

Pada kondisi pH dan kekuatan ion yang sesuai, detergent akan berinteraksi

dengan lipoprotein untuk membentuk misel. Akibatnya lipoprotein yang

merupakan konstituen membrane dapat larut dan enzim dapat dikeluarkan.

Pemilihan dan penggunaan detergent ini harus cukup selektif, karena beberapa

enzim dapat menjadi tak aktif akibat denaturasi protein dan pengendapan oleh

detergen.

Umumnya detergent harusa segera dipisahkan sebelum enzim hasil isolasi

digunakan.

2. Enzim Litik

Pemecahan dinding sel dengan cara ini merupakan cara yang paling efektif.

Enzim litik yang umum digunakan adalah lisozim yang diperoleh dari putih

telur.

Enzim ini memecah ikatan -1,4 glikosida dari polisakarida (asam muramat)

penyusun dinding sel.

Dinding sel bakteri gram positif lebih banyak mengandung polisakarida

dibandingkan dengan bakteri gram negatif, sehingga penggunaan enzim litik

lebih efektif untuk memecah dinding sel bakteri gram positif.

EDTA perlu ditambahkan pada media sebelum enzim ini digunakan untuk

memecah dinding sel bakteri gram negatif, untuk mengikat ion-ion divalen

yang dapat menginaktifkan enzim ini.

Enzim lisozim sudah digunakan secara komersial pada ekstraksi enzim

glukosa isomerase dari Streptomyces sp.

Jenis enzim lain : papain

Mudah dikendalikan dan bersifat selektif

3. Alkali

Penempatan sel pada medium dengan pH 11 –12,5 selama 20 menit

menyebabkan pecahnya dinding sel.

Penggunaan cara ini hanya berhasil diterapkan untuk enzimenzim yang stabil

pada pH tinggi (Julianti, 2012).

Pada proses lisis dengan menggunakan detergen, sering digunakan sodium

dodecyl sulphate (SDS) sebagai tahap pelisisan membran sel. Detergen tersebut selain

berperan dalam melisiskan membran sel juga dapat berperan dalam mengurangi

aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim pendegradasi DNA. Selain

digunakan SDS, detergen yang lain seperti cetyl trimethylammonium bromide

(CTAB) juga sering dipakai untuk melisiskan membran sel pada isolasi DNA

tumbuhan. Parameter keberhasilan dalam penggunaan CTAB bergantung pada

beberapa hal. Pertama, Konsentrasi NaCl harus di atas 1.0 M untuk mencegah

terbentuknya kompleks CTAB-DNA. Karena jumlah air dalam pelet sel sulit

diprediksi, maka penggunaan CTAB sebagai pemecah larutan harus dengan NaCl

dengan konsentrasi minimal 1.4 M. Kedua, ekstrak dan larutan sel yang mengandung

CTAB harus disimpan pada suhu ruang karena kompleks CTAB-DNA

bersifatinsolublepada suhu di bawah 15°C. Ketiga, penggunaan CTAB dengan

kemurnian yang baik akan menentukan kemurnian DNA yang didapatkan dan dengan

sedikit sekali kontaminasi polisakarida. Setelah ditambahkan CTAB, sampel

diinkubasikan pada suhu kamar. Tujuan inkubasi ini adalah untuk mencegah

pengendapan CTAB karena CTAB akan mengendap pada suhu 15°C. Karena

efektivitasnya dalam menghilangkan polisakarida, CTAB banyak digunakan untuk

purifikasi DNA pada sel yang mengandung banyak polisakarida seperti terdapat pada

sel tanaman dan bakteri gram negatif seperti Pseudomonas, Agrobacterium, dan

Rhizobium.

Konsentrasi dan pH dari bufer yang digunakan harus berada dalam rentang pH

5 sampai 12. Larutan buffer dengan pH rendah akan mengkibatkan depurifikasi dan

mengakibatkan DNA terdistribusi ke fase fenol selama proses deproteinisasi.

Sedangkan pH larutan yang tinggi di atas 12 akan mengakibatkan pemisahan untai

ganda DNA. Fungsi larutan buffer adalah untuk menjaga struktur DNA selama proses

penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan dalam menghilangkan protein

dan RNA serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA dan mencegah

perubahan pada molekul DNA. Untuk mengoptimalkan fungsi larutan buffer,

dibutuhkan konsentrasi, pH, kekuatan ion, dan penambahan inhibitor DNAase dan

detergen.

Pada tahapan ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent seperti

ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim DNase

yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim

nuklease dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai

kofaktor enzim DNAse. DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu

dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan

protein agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Fenol seringkali

digunakan sebagai pendenaturasi protein, ekstraksi dengan menggunakan fenol

menyebabkan protein kehilangan kelarutannya dan mengalami presipitasi yang

selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi. Bettelheim dan

Landesberg menyebutkan bahwa setelah sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang

terpisah yakni fase organik pada lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan

atas sedangkan DNA dan RNA akan berada pada fase aquoeus setelah sentrifugasi

sedangkan protein yang terdenaturasi akan berada pada interfase dan lipid akan

berada pada fase organik (Gambar 1). Selain fenol, dapat pula digunakan campuran

fenol dan kloroform atau campuran fenol, kloroform, dan isoamil alkohol untuk

mendenaturasi protein. Ekstrak DNA yang didapat seringkali juga terkontaminasi

oleh RNA sehingga RNA dapat dipisahkan dari DNA ekstrak dengan cara pemberian

RNAse.

Gambar 1. Asam nukleat berada pada lapisan air setelah disentrifugasi 

pada tahapan ekstraksi. 

Isolasi dan Purifikasi DNA Genom

Molekul DNA yang sering digunakan dalam teknologi DNA rekombinan

adalah DNA plasmid dan DNA genom yang berasal dari sel bakteri. Pada dasarnya

isolasi DNA genom total dari sel bakteri terdiri dari beberapa tahap yaitu:

1. Kultivasi sel dalam media yang sesuai

2. Pemecahan dinding sel

3. Ekstraksi DNA genom

4. Purifikasi DNA

Pemecahan dinding sel bakteri dilakukan secara fisik misalnya dengan cara

sonikasi, maupun dengan cara kimia yaitu dengan menggunakan enzim lisozim, etilen

diamin tetra asetat (EDTA), atau kombinasi dari keduanya. Pada kondisi tertentu

pemecahan dinding sel cukup dilakukan dengan lisozim dan EDTA, akan tetapi

sering ditambahkan bahan lain yang dapat melisiskan dinding sel antara lain deterjen

triton X-100 atau sodium dedosil sulfat (SDS). Setelah sel mengalami lisis, tahap

selanjutnya adalah memisahkan debris sel dengan cara sentrifugasi. Komponen sel

yang tidak larut diendapkan dengan sentrifugasi sehingga meninggalkan ekstrak sel

dalam supernatan yang jernih (Radji, 2011).

Tahap akhir dari isolasi DNA adalah proses pemurnian DNA. Disamping

DNA, ekstrak sel mengandung protein dan RNA dalam jumlah yang cukup besar.

Umumnya cara pemurnian DNA dilakukan dengan penambahan larutan fenol atau

campuran fenol dan kloroform dengan perbandingan 1:1, untuk mengendapkan

protein dengan cara di sentrifugasikan dan dihancurkan secara enzimatis dengan

proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein masih tercampur dengan RNA

sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul

DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan cara “presipitasi

etanol”. Dengan adanya larutan garam (kation monovalen seperti Na+), pada suhu

20oC etanol absolut dapat mengendapkan DNA dengan baik sehingga mudah

dipisahkan dengan cara sentrifugasi (Radji, 2011).

Pada isolasi dan purifikasi DNA sel total yang berasal dari sel eukariot,

misalnya sel tanaman atau sel hewan, walaupun pada dasarnya tahapan isolasi dan

purifikasinya sama, namun memerlukan suatu modifikasi cara isolasi sehubungan

dengan sifat-sifat khusus dari sel yang digunakan. Modifikasi yang sering dilakukan

adalah pada proses pemecahan sel eukariot. Senyawa kimia yang digunakan untuk

memecah sel bakteri tidak selalu dapat digunakan untuk memecah sel tanaman

maupun sel hewan. Untuk memecah sel tanaman dibutuhkan ezim-enzim degeneratif

yang spesifik dan sering dikombinasi dengan cara pemecahan dinding sel secara fisik

antara lain menggunakan butiran-butiran gelas. Sedangkan untuk mengisolasi DNA

total dari sel hewan yang tidak memiliki dinding sel umumnya hanya digunakan

deterjen untuk memecah membran sel dan membran nukleusnya (Radji, 2011).

Ekstraksi dan purifikasi DNA pada prinsipnya adalah suatu cara atau metoda

untuk memisahkan DNA total dari komponen sel lainnya (Sulandari & Zein 2003).

Ekstraksi dan purifikasi DNA pada prinsipnya adalah suatu cara atau metoda

untuk pemisahan DNA total dari komponen sel lainnya. Setiap sel atau jaringan yang

memiliki DNA memungkinkan untuk dilakukan ekstraksi DNA akan tetapi kualitas

atau jumlah DNA yang diperoleh dapat bervariasi tergantung asala jaringan, metode

penyimpangan, dan cara ekstraksi. Ekstraksi DNA dari fosil, spesimen museum,

sample forensic, rambut atau bulu dan feses biasanya lebih sulit dilakukan (Taberlet,

et al. 1996)

Pada prinsipnya, metode purifikasi pada semua jaringan makhluk hidup tidak

jauh berbeda, yaitu terdiri atas tiga tahapan utama. Tiga tahapan tersebut secara

berurutan adalah penghancuran (lisis) membran sel, pemisahan material DNA dari

material organik sel lain, dan pemisahan DNA dari larutannya (presipitasi)

(Sambrook et al. 1989).

Keberadaan plasmid dan kromosom dalam sel bakteri menyebabkan perlunya

teknik isolasi yang tepat untuk dapat membedakan plasmid dan kromosom. Pada

dasarnya prinsip isolasi keduanya memiliki persamaan yaitu memisahkan DNA dari

semua protein sel dan molekul RNA dengan cara lisis, ekstraksi, sentrifugasi dan

pengendapan. Pemisahan DNA plasmid dari DNA kromosom dilakukan berdasarkan

perbedaan ukuran dan konformasinya. Ukuran kromosom sel bakteri lebih besar dari

DNA plasmid, sehingga dapat dipisahkan bersama dengan protein sel menggunakan

sentrifugasi. Tahap pemurnian selanjutnya dilakukan dengan memperhatikan

konformasi keduanya yang berbeda (Viani, 2010).

Molekul DNA plasmid umumnya berada dalam bentuk supercoil (covalently

closed circular-ccc form). Sedangkan fragmen DNA kromosom memiliki bentuk

linier. Konformasi ccc tersebut dapat dirubah menjadi relaks atau open circular (cc)

bila rantai nukleotida plasmid ada yang terputus. Bentuk ccc plasmid dapat

dipisahkan dari fragmen linier dengan cara ultrasentrifugasi dalam larutan cesium

klorida dengan bantuan interkelar etidium bromida. Dalam kondisi ini, konformasi

ccc memiliki bouyant density yang lebih besar dari fragmen liniar dan oc plasmid,

sehingga pita ccc DNA plasmid akan terletak dibawah pita linier dan oc DNA (Viani,

2010).

Ukuran kromosom bervariasi dari satu spesies ke spesies yang lain. Panjang

kromosom berkisar antara 0,2-0,5 mikro meter, dengan diameter 0,2 sampai 20

mikrometer. Misalnya kromosom manusia mempunyai panjang sampai 6 mikrometer.

Pada umumnya makhluk dengan jumlah kromosom sedikit memiliki kromosom

dengan ukuran lebih besar dari pada kepunyaan makhluk dengan jumlah kromosom

lebih banyak. Kromosom yang berada didalam sebuah sel tidak pernah sama

ukurannya. Pada umumnya tumbuhan mempunyai ukuran kromosom lebih besar

daripada hewan (Viani, 2010).

Plasmid merupakan molekul DNA yang berantai ganda, berbentuk lingkaran

yang tertutup, dapat bereplikasi sendiri diluar kromosom dan tidak mengandung gen-

gen esensial. Plasmid memungkinkan mikroba mampu merespon berbagai tantangan

seperti antibiotic atau substrat baru yang potensial. Jumlah plasmid di dalam sel

berbeda-beda, tergantung spesies organismenya. Ukuran plasmid berkisar antara 1kb

hingga lebih dari 250 kb (Viani, 2010).

IV. Alat dan Bahan

Bahan

1. Biakan bakteri E.coli DH5a berumur 18-24 jam

2. Medium Lurea Bertani (LB) cair (biogen)

3. Ampisilin 100 µg/ml dalam medium LB cair

4. GeneJETTM Genomic DNA purification kit (Fermentas Life Science)

5. Etanol 50%

Alat

1. Tabung eppendorf 1,5 ml

2. Mikrosentrifuga

3. Mikropipet 100-100 µl, 50-200 µl, dan 10-100 µl

4. Tip mikropipet biru dan kuning

5. Lemari es 1 buah dan freezer -25°C

6. Waterbath

7. Thermometer

8. Incubator

9. Sarung tangan

10. Beaker glass

11. Pengocok orbital

12. Bunsen

13. Vortex

V. Prosedur

Sebanyak 1,5 ml biakan bakteri dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf 1,5

ml, disentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm ( 5.000 x g) selama 5 menit, lalu

supernatannya dibuang. Sebanyak 1 ml biakan bakteri ditambahkan ke dalam pelet

bakteri, disentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm ( 5.000 x g) selama menit, lalu

supernatannya dibuang. Pelet bakteri ditambahkan 1 ml aquabides, disentrifugasi

dengan kecepatan 8.000rpm (5.000 x g) selama 5 menit, lalu supernatannya dibuang.

Tahap pencucian ini dilakukan 2x sehingga didapatkan pelet bakteri.

Pelet sel bakteri diresuspensi dalam 45 μl Digestion Solution, lalu

ditambahkan 5 μl Proteinase K. Campuran dikocok menggunakan vortex atau melalui

pemipetan berulang untuk menghasilkan suspensi yang homogen. Suspensi

diinkubasi pada suhu 560C sambil sesekali divortex atau dimasukkan ke dalam

shaking water bath sampai sel lisis secara sempurna (kira-kira 30 menit). Sebanyak 5

μl RNase A Solution ditambahkan ke dalam suspense, lalu dikocok menggunakan

vortex. Campuran diinkubasi selama 10 menit pada suhu runag.

Sebanyak 50 μl Lysis Solution ditambahkan ke dalam campuran, lalu dikocok

menggunakan vortex selama 15 detik hingga diperoleh campuran yang homogen.

Sebanyak 100 μl etanol 50% ditambahkan ke dalam campuran, lalu dikocok

menggunakan vortex atau melalui pemipetan berulang. Lisat dituangkan ke Genomic

DNA Purification Column dalam tabung kolektor. Kolom disentrifugasi selama 1

menit pada kecepatan 7.000 rpm (6.000 x g). Supernatan dalam tabung kolektor

dibuang dan kolom dimasukkan kembali ke dalam tabung kolektor yang sama.

Sebanyak 250 μl Wash Buffer I ditambahkan ke dalam kolom, lalu

disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 9.400 rpm ( 8.000 x g). Supernatan

dalam tabung kolektor dibuang, lalu kolom purifikasi ditempatkan kembali dalam

tabung kolektor yang sama. Sebanyak 250 μl Wash Buffer II (dengan penambahan

etanol) ditambahkan ke dalam kolom, lalu disentrifugasi selama 3 menit pada

kecepatan 14.000 rpm (12.000 x g). Jika larutan residu masih terlihat dalam kolom

purifikasi, maka tabung kolektor dikosongkan dan disentrifugasi kembali pada

kecepatan yang sama selama 1 menit. Supernatan pada tabung kolektor dibuang dan

kolom dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf 1,5 ml baru.

Sebanyak 100 μl Elution Buffer ditambahkan ke bagian tengah membran

kolom plasmid (tip mikropipet tidak boleh menyentuh membrane kolom). DNA

kromosom dielusi dengan cara kolom diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang,

lalu disentrifugasi pada kecepatan 9.400 rpm (8.000 x g) selama 1 menit. Tahap ini

dilakukan sebanyak 2 kali. Kolom purifikasi dilepaskan dari tabung Eppendorf dan

disimpan pada suhu -200C.

VI. Data Pengamatan

VII. Pembahasan

Pembahasan prosedural

Praktikum kali ini adalah Isolasi DNA Kromosom, yang bertujuan untuk

memahami metode isolasi DNA kromosom dari sel prokariot berupa bakteri Gram

negatif menggunakan GeneJET TM Genomic DNA Purification Kit. Dalam rekayasa

genetika, isolasi DNA kromosom adalah tahap yang paling penting yang sering kali

harus dilakukan. Hal ini dikarenakan DNA kromosom merupakan sumber DNA yang

umumnya kita kehendaki untuk diklon. Prinsip dari isolasi DNA kromosom adalah

memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain.

Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Isolasi DNA

kromosm bakteri secara garis besar meliputi tahap-tahap perusakan dan pembuanagn

dinding sel, lsiis sel, pembuangan remukan sel, serta pemisahan DNA dari protein

dan RNA.

Bakteri yang digunakan pada percobaan ini adalah Escherichia coli. Hal ini

dikarenakan bakteri tersebut mudah didapatkan dan dapat menghasilkan keturunan

yang banyak dalam waktu yang singkat. Dalam memudahkan pengisolasian, DNA

kromosom diperlukan Escherichia coli dalm jumlah yang besar, karena apabila sel

bakteri yang tersedia jumlahnya sedikit maka proses pengisolasdian DNA kromosom

akan sulit dilakukan, oleh klarena itu sel Escherichia coli harus dibiakkan terlebih

dahulu. Medium yang digunakan dalam percobaan ini adalah Lurea Bertani (LB) cair

yang didalamnya ditambahkan Ampisilin µg/mL dan telah diinkubasi selama 18-24

jam pada suhu 37 C sehingga pada akhirnya akan diperoleh jumlah bakteri⁰

Escherichia coli yang lebih banyak.

Langkah pertama yang dilakukan adalah 1,5 mL biakan bakteri dimasukkan

ke dalam tabung Eppendorf 1,5 mL dengan menggunakan mikropipet dengan tip

yang berwarna biru yang kemudian disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 5

menit, lalu supernatannya dibuang. Pada saat melakukan sentrifugasi, tabung lain

yang kemungkinan memiliki bobot yang sama disimpan dengan posisi yang

berhadapan. Hal ini dimaksudkan untuk menghindari kerusakan alat sentrifuga.

Sentrifugasi merupakan suatu teknik pemisahan yang dilakukan untuk

memisahkan suspensi yang jumlahnya sedikit. Suspensi ini dimasukan ke dalam

tabung Eppendorf yang kemudian dimasukkan ke dalam sentrifuga. Prinsip utama

sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan

cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di

dasar yang disebut dengan pelet, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak

di atas yang disebut dengan supernatan. Sentrifugasi yang cepat menghasilkan sel

bakteri Escherichia coli berada pada pelet, sedangkan supernatan yang merupakan

media bakteri dibuang. Kemudian sebanyak 1 mL suspensi bakteri Escherichia coli

ditambahkan ke dalam pelet bakteri dan disentrifugasi kembali pada kecepatan dan

dalam jangka waktu yang sama dan supernatan kembali dibuang. Hal ini dilakukan

untuk mendapatkan jumlah pelet bakteri yang lebih banyak.

Pelet bakteri Escherichia coli yang didapatkan ditambah dengan aquabides

sebanyak 1 mL dan disentrifugasi kembali pada kecepatan 8000 rpm selama 5 menit,

dan supernatannya kembali dibuang. Tahap ini merupakan tahap pencucuian karena

kemungkinan pelet bakteri masih mengandung supernatan. Tahapan ini dilakukan

sebanyak dua kali.

Selanjutnya, 90 µL Digestion Solution ditambahkan ke dalam tabung

Eppendorf yang berisi pelet bakteri. Hal ini dimaksudkan untuk meresuspensi bakteri

agar sel bakteri yang sebelumnya berbentuk pelet menjadi suspensi bakteri kembali.

Lalu ditambahkan 10 µL Proteinase K yang bertujuan untuk merusak protein yang

dimiliki oleh bakteri dan kemudian campuran dikocok dengan menggunakan vortex

untuk menghasilkan suspensi bakteri yang homogen. Suspensi tersebut kemudian

diinkubasi pada suhu 56 C sambil sesekali di vortex atau diamsukkan ke dalm⁰

shaking water bath. Dengan proses inkubasi pada shaking water bath akan didapatkan

dua keuntungan, yaitu melakukan inkubasi dan juga melakukan proses pengocokan

dengan alat tersebut, sehingga yang diharapkan adalah sel bakteri dapat lisis secara

sempurna (selama kira-kira 30 menit).

Langkah selanjutnya adalah menambahkan 10 µL RNAse A Solution ke dalam

suspensi, lalu dikocok dengan menggunakan vortex agar campuran menjadi homogen

. campuran ini kemudian diinkubasi kembali selama 10 menit pada suhu ruang.

Penambahan RNAse A Solution pada suspensi ini bertujuan untuk memecahkan atau

merusak RNA yang kemungkinan terdapat dalam sel bakteri, sehingga RNA akan

terdenaturasi dan kehilangan bentuknya. Inkubasi campuran pada suhu ruang

bertujuan untuk membiarkan RNAse A Solution dapat bekerja lebih maksimal,

sehingga yang diperoleh setelah proses ini adalah hanya DNA.

Kemudian tahap selanjutnya adalah penambahan 100 µL Lysis Solution ke

dalam campuran, dan kemudian dikocok kembali dengan menggunakan vortex agar

campuran menjadi homogen. Penambahan Lysis Solution ini bertujuan untuk merusak

atau membuat lisis dinding sel bakteri yang kemungkinan belum rusak pada tahap

yang dilakukan sebelumnya. Lalu 200 µL etanol 50% ditambahkan ke dalam

campuran dan dikocok kembali dengan menggunakan vortex agar menjadi homogen.

Penambahan etanol 50% ini bertujuab untuk merekristalisasi molekul DNA dan

mengakibatkan terbentuknya endapan sehingga lisat DNA terbentuk.

Tahap selanjutnya yaitu lisat atau campuran tersebut dituang ke dalam

GeneJETTM Genomic DNA Purification Column dalam tabung kolektor. Pada saat

memindahkan lisat, usahakan tidak menyentuh dasar atau membran kolom, hal ini

untuk mencegah terjadinya kerusakan pada kolom dan juga menghindari terjadinya

kontaminasi. Kolom disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 7000 rpm agar

DNA kromosom menempel atau terjerap didalam kolom dan supernatan yang ada

dalam lisat jatuh ke dalam tabung kolektor, sehingga supernatan dalam tabung

kolektor dapat dibuang dan kolom dimasukkan kembali dalam tabung kolektor yang

sama.

Sebanyak 250 µL Wash Buffer I ditambahkan ke dalam kolom yang bertujuan

untuk mencuci atau membersihkan DNA kromosom, sehingga lisat yang diperoleh

terbebas dari zat-zat lain dan untuk membuang komponen-komponen selain DNA

yang sudah lisis sebelumnya. Wash Buffer I ini bersifat iritan sehingga harus hati-hati

dalam penambahannya. Lalu disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 9400 rpm

(8000 x g). Supernatan dalam tabung kolektor dibuang, lalu kolom dipurifikasi

ditempatkan kembali dalam tabung kolektor yang sama. Lalu sebanyak 250 µL Wash

BufferII (dengan penambahan etanol) ditambahkan ke dalam kolom untuk

memastikan bahwa didalam kolom hanya ada DNA yang terjerap didalamnya dan

juga untuk merekristalisasi DNA kromosom yang kemungkinan belum terekristalisasi

pada tahapan sebelumnya, sehingga diharapkan semua DNA kromosom menempel

pada kolom. Kemudian disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 14000 rpm

(12000 x g). Jika laruran residu masih terlihat dalam kolom purifikasi, maka tabung

kolektor dikosongkan dan disentrifugasi kembali pada kecepatan yang lebih rendah

selama 1 menit. Hal ini dilakukan untuk memastikan dan mengoptimalkan DNA

kromosom yang akan diisolasi. Lalu supernatan dalam tabung kolektor dibuang dan

kolom yang sudah berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf 1,5mL baru.

Sebanyak 200µL Elution Buffer ditambahkan ke bagian tengah membran

kolom plasmid dan tip mikropipet tidak boleh menyentuh membran kolom, selain

akan merusak kolom juga menghindari terjadinya kontaminasi yang nantinya akan

mengganggu proses pengelusian. Penambahan Elution Buffer ini untuk mengelusi

DNA kromosom yang menempel pada kolom, sehingga DNA yang sebelumnya telah

terjerap dalam silika akan terlepas dan akan tertampung dalam tabung Eppendorf

tersebut. Kolom diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang, lalu disentrifugasi pada

kecepatan 9400 rpm (8000 x g) selama 1 menit. Tahap tersebut dilakukan sebanyak 2

kali, dengan catatan jika diperlukan konsentrasi DNA yang lebih pekat atau DNA

diisolasi dari sampel yang jumlahnya sedikit, maka volume Elution Buffer dapat

dikurangi menjadi 50-100 µL. Semakin sedikit volume Elution Buffer, semakin

sedikit pula kadar DNA yang terelusi. Kemudian kolom purifikasi dilepaskan dari

tabung Eppendorf. DNA murni dapat langsung digunakan atau disimpan pada suhu -

20oC pada freezer yang bertujuan agar sampel DNA yang telah diekstraksi dapat

disimpan dalam jangka waktu yang lama. DNA kromosom yang telah diisolasi dapat

dilihat dengan metode elektroforesis.

Pembahasan Hasil

VIII. Kesimpulan

DAFTAR PUSTAKA

Julianti, Elisa. 2012. Isolasi dan Pemurnia Enzim. Available online at

http://elisajulianti.files.wordpress.com/2012/09/isolasi-dan-pemurnian-enzim1.pdf

Radji, M. (2011). Rekayasa Genetika; Pengantar untuk Profesi Kesehatan. Sagung

Seto: Jakarta.

Sambrook J, Fritschi EF and Maniatis T (1989) Molecular cloning: a

laboratorymanual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Sulandari S & Zein MSA (2003). Protocols in DNA Laboratory, Center of Biology

Research, The Indonesian Institute of Sciences. Pp. 23–45.

Taberlet P, Griffin S, Goossens B et al. 1996 .Reliable genotyping of samples with

very low DNA quantities using PCR. Nucleic Acids Research.

Tamam, Badrut. 2012. Isolasi DNA. Available online at http://biology-

community.blogspot.com/2012/08/isolasi-dna.html

Viani. 2010. materi biologi kuliah teknologi DNA rekombinan. Available online at

http://bima.ipb.ac.id/~tp

b - ipb/materi/genetika/dnarekombinan/textdnarekombinanpdf.pdf (diakses

tanggal 6 oktober 2012)