85

Lampiran 1: Skema Pembuatan Stok Kultur Agar Miring

Di ambil satu ose lalu dicelupkan ke dalam MRS broth 10 ml

Dihomogenisasi dengan vortex

Di inkubasi pada suhu 300C selama 48 jam

Dihomogenisasi dengan vortex

Di celupkan ujung oose steril pada larutan kultur cair

Digoreskan pada MRS agar miring

Lactobacillus plantarum pada MRS agar miring

Isolat Lactobacillus plantarum dalam MRS broth

Stok kultur agar miring Lactobacillus plantarum

86

Lampiran 2: Skema Uji Ketahanan Lactobacillus plantarum Terhadap pH

Asam

Hasil

Dihomogenisasi dengan vortex

Diinokulasikan sebanyak 1 ml ke dalam 10 ml MRS broth baru

Diinkubasi pada 300C selama 18 jam

Ditumbuhkan dalam MRS agar

Diinkubasi pada suhu 300C selama 24 jam

Dihitung jumlah koloni yang tumbuh

Kultur stok cair Lactobacillus plantarum yang

tumbuh pada MRS broth (300C, 24 jam)

Diinokulasikan sebanyak 1 ml ke dalam 9 ml MRS

broth baru (pH diatur menjadi 2, 3, dan 4 dengan

menambahkan HCl 1 N

Dilakukan kurva pertumbuhan bakteri Lactobacillus

plantarum sebelum perlakuan terhadap uji probiotik

87

Lampiran 3: Skema Uji Ketahanan Lactobacillus plantarum Terhadap

Garam Empedu 0,3 % (b/v)

Dihomogenisasi dengan vortex

Diinokulasikan sebanyak 1 ml ke dalam 10 ml MRSB baru

Diinkubasi pada suhu 300C selama 18 jam

Ditumbuhkan dalam MRSA

Diinkubasi pada suhu 300C selama 24 jam

Dihitung jumlah koloni yang tumbuh

Kultur stok cair bakteri asam laktatyang tumbuh pada

MRS broth (300 C, 24 jam)

Diinokulasikan sebanyak 1 ml ke dalam 9 ml MRSB baru

yang mengandung Oxgall 0,3% (b/v) garam empedu

88

Lampiran 4: Skema Uji Ketahanan Lactobacillus plantarum Terhadap

Bakteri Patogen

a) Langkah ke-1

Dinokulasikan sebanyak 1 oose ke dalam 10 ml NB

Diinkubasi pada suhu 300C selama 24 jam

b) Langkah ke-2

Diinokulasikan sebanyak 1 ml ke dalam 10 ml MRS broth baru

Diinkubasi pada suhu 300C selama 18 jam

c) Langkah ke-3

Diinokulasikan ke dalam NA sebanyak 25 µl secara pour plate

Dituang media NA dan dibiarkan sampai padat

d) Langkah ke-4

Dinokulasikan sebanyak 50 µl di dalam lubang sumuran tersebut

Diinkubasi pada suhu 300C selama 24 jam

Masing-masing kultur bakteri patogen (Escherichia coli,

Staphylococcus aureus dan Salmonella typhi)

Kultur stok cair Lactobacillus plantarum hasil isolasi dari usus itik

Mojosari yang tumbuh pada MRS broth (300C, 24 jam)

Bakteri patogen (Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan

Salmonella typhi) yang tumbuh dalam NB (300C, 24 jam)

Diukur zona hambat yang terbentuk

Dibuat sumuran (diameter 6 mm) dalam media NA

89

Lampiran 5: Skema Uji Interaksi Lactobacillus plantarum Terhadap Bakteri

Non-Patogen

a) Langkah ke-1

Dinokulasikan sebanyak 1 oose ke dalam 10 ml MRS broth

b) Langkah ke-2

Diinokulasikan sebanyak 1 ml ke dalam 10 ml MRS broth baru

c) Langkah ke-3

Lactobacillus paracasei diinokulasikan ke dalam cawan petri sebanyak 50µl

secara pour plate

Dituang MRS agar dan dibiarkan sampai padat

Diinkubasi pada suhu 300C selama 18 jam

Diinkubasi pada suhu 300C selama 24 jam

Bakteri non-patogen (Lactobacillus paracasei) yang

tumbuh dalam MRS broth (300C, 24 jam)

Kultur stok cair Lactobacillus plantarum hasil isolasi dari

usus itik Mojosari yang tumbuh pada MRS broth (300C,

24 jam)

Kultur bakteri non-patogen (Lactobacillus paracasei)

90

d) Langkah ke-4

Diinokulasikan sebanyak 50 µl kultur Lactobacillus plantarum didalam

lubang sumuran tersebut

Diinkubasi pada suhu 300C selama 24 jam

Diamati dengan hasil kedua koloni bakteri menyatu

Dibuat sumuran (diameter 6 mm) dalam media MRSA

91

Lampiran 6: Data Hasil Uji Probiotik

6.1 Data awal jumlah sel bakteri Lactobacillus plantarum sebelum perlakuan

Jam ke- OD

(optical density)

fp ∑ sel bakteri

(sel/ml)

0 0,14 1 1,7. 109

1 0,642 1 7,8. 108

3 1,432 1 4,7. 109

4 2,049 1 7,8. 109

6 3,169 1 1,3. 1010

8 3,604 1 1,6. 1010

13 4 1 1,8. 1010

16 11,14 1 5,3. 1010

18 11,75 1 5,6. 1010

24 14,6 1 7,1. 1010

6.2 Data Uji Ketahanan Terhadap pH asam

pH Jumlah awal sel bakteri

(CFU/ml)

Jumlah sel bakteri

(CFU/ml)

2 1. 109 4,3. 10

7

3 1. 109 3,8. 10

9

4 1. 109 2,7. 10

10

6.3 Data Uji Ketahanan Terhadap Garam Empedu 0,3 % (b/v)

Perlakuan Jumlah awal sel bakteri

(CFU/ml)

Jumlah sel bakteri

(CFU/ml)

0,3 % 1. 108 1,2. 10

9

Kontrol 1,4. 109 CFU/ml

2.3 Data Uji Ketahanan Terhadap Bakteri Patogen

Perlakuan Bakteri

patogen

Diameter zona hambat (mm) Rata-rata

Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3

Escherichia coli 10 13 15 12,7

Staphylococcus aureus 17 14 9 13,3

Salmonella typhi 9 9 10 9,3

92

Lampiran 7: Gambar Hasil Pengamatan

7.1 Gambar uji interaksi Lactobacillus plantarum dengan Lactobacillus paracasei

7.2 Gambar sel bakteri Lactobacillus plantarum (anak panah) yang diisolasi dari

usus halus itik Mojosari (Anas plathyrinchos) berbentuk batang

7.3 Gambar uji ketahanan Lactobacillus plantarum terhadap pH 2, 3 dan 4

Uji ketahanan L. plantarum

terhadap pH 2 setelah inkubasi

Uji ketahanan L. plantarum

terhadap pH 2 sebelum inkubasi

a

a b

a

Koloni antara L. plantarum (a) dengan L. paracasei (b) menyatu

93

7.4 Gambar uji ketahanan Lactobacillus plantarum terhadap garam empedu 0,3%

(b/v)

Uji ketahanan L. plantarum

terhadap garam empedu sebelum

inkubasi

Uji ketahanan L. plantarum

terhadap garam empedu setelah

inkubasi

Uji ketahanan L. plantarum

terhadap pH 3 sebelum inkubasi

Uji ketahanan L. plantarum

terhadap pH 4 setelah inkubasi

Uji ketahanan L. plantarum

terhadap pH 4 sebelum inkubasi

Uji ketahanan L. plantarum

terhadap pH 3 setelah inkubasi

94

7.5 Gambar uji ketahanan Lactobacillus plantarum terhadap bakteri patogen

7.5.1 Uji Ketahanan Terhadap Escherichia coli (tanda anak panah menunjukkan

zona hambat Lactobacillus plantarum terhadap bakteri uji)

7.5.2 Uji Ketahanan Terhadap Staphylococcus aureus (tanda anak panah

menunjukkan zona hambat Lactobacillus plantarum terhadap bakteri uji)

7.5.3 Uji Ketahanan Terhadap Salmonella typhi (tanda anak panah menunjukkan

zona hambat Lactobacillus plantarum terhadap bakteri uji)

Ulangan 1 Ulangan 3 Ulangan 2

Ulangan 1 Ulangan 3 Ulangan 2

Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3

95

Lampiran 8: Komposisi Media

No Media Komposisi gr/l

1 MRSB (deMan Rogosa

Sharpe Broth) Merck GaA,

Germany 100 ml

20 g/l dektrosa

10 g/l pepton

8 g/l beef extract

5 g/l Na-asetat

4 g/l yeast extract

2 g/l dipotasium fosfat

1 g/l tween 80

2 g/l diamonium sitrat

0,2 g/l magnesium sulfat dan

0,05 g/l mangan sulfat

2 MRSA (deMan Rogosa

Sharpe Agar) Merck GaA,

Germany 100 ml

20 g/l dektrosa

10 g/l pepton

8 g/l beef extract

5 g/l Na-asetat

4 g/l yeast extract

2 g/l dipotasium fosfat

1 g/l tween 80

2 g/l diamonium sitrat

0,2 g/l magnesium sulfat dan

0,05 g/l mangan sulfat

14 g/lAgar

3 NB (Nutrient Broth) 1 g/l beef extract

2 g/l yeast extract

5 g/l pepton

5 g/l NaCl

pH 7,4±0,2

4 NA (Nutrient Agar)

1 g/l beef extract

2 g/l yeast extract

5 g/l pepton

5 g/l NaCl

pH 7,4±0,2 serta 0,85% agar

96

Lampiran 9: Alat dan Bahan Penelitian

Autoclave Hot plate Laminar Air Flow

Shaker incubator Timbangan analitik Vortex mixer

Mikropipet 1000 µL dan 200µL

a

a c

b

e

d f

6) a). Rak tabung reaksi,

b. Blue tip, c. Sendok,

d. Gunting, e. Spatula,

f. Penggaris, g. Stirer,

h. Jarum oose,

i. Pipet tetes

5) Peralatan gelas

(a. Gelas ukur, b. Erlenmeyer,

c. Beaker glass, d. Corong,

e. Tabung reaksi, f. Cawan

petri)

a

a b

a d

a

e

a

f

a

g

a h

a i

a

c

97

Colony counter Kulkas penyimpan bahan Isolat Bakteri asam laktat

Bor (sumuran) Spektrofotometer Media MRSA dan MRSB