66

Lampiran 1. Pengambilan Sampel Daun Rhizophora mucronata Lamk. dari

Kawasan Wisata Alam Angke Kapuk, Jakarta Utara.

a. Stasiun Pengambilan Sampel Daun Rhizophora mucronata Lamk.

No Stasiun Plot Kualitas Air

1 Stasiun 1 S : 06° 06’ 14.9” S : 06° 06’ 12.6”

E : 106° 44’ 05.9”

Suhu : 33° C

pH : 7.49

Salinitas : 27-28 ‰

E : 106° 44’ 10.8”

2 Stasiun 2 S : 06° 06’ 15.3”

E : 106° 44’ 10.5”

3 Stasiun 3 S : 06° 06’ 11.4”

E : 106° 44’ 07.4”

b. Lokasi Pengambilan Sampel Daun Rhizophora mucronata Lamk.

Stasiun 1 Stasiun 2 Stasiun 3

67

Lampiran 2. Pembuatan Serbuk Kering Daun Rhizophora mucronata Lamk.

Sampel Basah Sampel Kering

Sampel Dihaluskan Serbuk Kasar Sampel Diayak

Serbuk Halus Daun Rhizophora mucronata Lamk.

68

Lampiran 3. Ekstraksi Daun Rhizophora mucronata Lamk. dengan Metode

Maserasi Bertingkat

Proses Maserasi Pemisahan Filtrat Pemasangan

dan Residu Labu Evaporasi

Filtrat n-heksan Hasil Maserasi ke- 1, ke-2, dan ke- 3

69

Filtrat Etil Asetat Hasil Maserasi ke- 1, ke-2, dan ke- 3

Filtrat Butanol Hasil Maserasi ke- 1, ke-2, dan ke- 3

Proses Evaporasi

70

Lampiran 4. Perhitungan Nilai Rendemen Ekstrak Daun Rhizophora

mucronata Lamk.

a.

b.

c.

71

Lampiran 5. Pembuatan Larutan Stok dan Pengenceran pada Uji In Vitro

A. Larutan Stok Ekstrak n-heksan/Ekstrak Etil Asetat/Ekstrak n-butanol 10.000

ppm dalam Akuades Steril

Konsentrasi Ekstrak 10.000 ppm =

x

x 10 ml

= 100 mg = 0,1 g

= ekstrak 0,1 g dilarutkan hingga 10 ml

B. Pengenceran Konsentrasi Ekstrak n-heksan/Ekstrak Etil Asetat/Ekstrak n-

butanol dari Larutan Stok 10.000 ppm

Konsentrasi 1000 ppm

V1 x M1 = V2 x M2

10 ml x 1000 = V2 x 10.000

V2 = 1 ml

1 ml dari larutan stok Ekstrak n-heksan/Ekstrak Etil Asetat/Ekstrak n-butanol

10.000 ppm ditambah akuades steril hingga 10 ml

Konsentrasi 100 ppm

V1 x M1 = V2 x M2

10 ml x 100 = V2 x 10.000

V2 = 0,1 ml

0,1 ml dari larutan stok Ekstrak n-heksan/Ekstrak Etil Asetat/Ekstrak n-

butanol 10.000 ppm ditambah akuades steril hingga 10 ml

Konsentrasi 10 ppm

V1 x M1 = V2 x M2

10 ml x 10 = V2 x 10.000

V2 = 0,01 ml

0,01 ml dari larutan stok Ekstrak n-heksan/Ekstrak Etil Asetat/Ekstrak butanol

10.000 ppm ditambah akuades steril hingga 10 ml

72

C. Larutan Kloramfenikol 30 ppm

Konsentrasi 30 ppm =

= 0,3 mg = 0,0003 g

= kloramfenikol 0,0003 g dilarutkan dalam 10 ml

Pengenceran Ekstrak n-heksan

Pengenceran Ekstrak Etil Asetat

Larutan konsentrasi dihomogenkan

73

Lampiran 6. Pembuatan Media Nutrien Agar Laut (NA Laut)

1. Siapkan erlenmeyer yang sudah steril

2. Masukkan Nutrien Agar (NA) sebanyak 7 gram ke dalam 250 ml air laut

yang sudah steril.

3. Letakkan erlenmeyer yang sudah berisi NA laut tersebut ke atas hot plate,

panaskan sampai mendidih sambil diaduk dengan menggunakan magnet

stirrer.

4. Setelah mendidih, Nutrien Agar Laut diangkat kemudian ambil magnet

stirrer. Nutrien Agar Laut siap digunakan.

Media Nutrien Agar Laut

74

Lampiran 7. Pembiakan Bakteri Vibrio harveyi

1. Siapkan stok koloni bakteri Vibrio harveyi awal.

2. Siapkan media Nutrien Agar (NA) laut.

3. Siapkan cawan petri yang sudah steril, kemudian masukkan media NA laut

ke dalam cawan petri.

4. Tunggu media NA laut sampai berbentuk agar.

5. Setelah terbentuk agar, ambil koloni bakteri Vibrio harveyi pada media

stok dengan menggunakan jarum ose (1-2 ose) dan oleskan ke media NA

laut.

6. Kemudian tutup kembali cawan petri media NA laut dan media stok koloni

bakteri Vibrio harveyi.

7. Media NA laut pembiakan bakteri Vibrio harveyi dimasukkan ke dalam

inkubator dengan temperatur 37° C sedangkan media stok koloni bakteri

Vibrio harveyi dimasukkan ke dalam lemari pendingin.

8. Tunggu sampai 1-2 hari biakan bakteri di inkubator.

9. Pembiakan berhasil dapat dilihat dari permukaan media berwarna putih.

10. Pembiakan siap digunakan dan apabila belum dipakai masukkan ke dalam

lemari pendingin.

Semua proses yang dilakukan berada di ruang laminar dan aseptis, hal ini

dilakukan untuk menjaga setiap perlakuan tidak terjadi kontaminasi.

Bakteri Vibrio harveyi yang telah diremajakan

75

Lampiran 8. Pembuatan Larutan Bakteri Vibrio harveyi Kepadatan 107

CFU/ml

1. Isolat bakteri uji dengan kepadatan 107

sel bakteri yang telah dikultur

diambil dengan menggunakan jarum ose (2-3 ose) kemudian dilarutkan ke

dalam air laut steril sebanyak 10 ml.

2. Bandingkan larutan bakteri yang telah dilakukan dengan larutan Mc

Farland.

Larutan Mc Farland 0,5 terdiri dari:

0,05 ml larutan BaCl2 + 9,95 ml larutan H2SO4

Perbandingan kekeruhan Larutan Bakteri dengan Mc Farland 0,5

76

Lampiran 9. Proses Uji In Vitro

(a) (b)

(a) Proses Penambahan Larutan Bakteri sebanyak 0,1 ml

(b) Larutan Bakteri diratakan dengan Menggunakan L glass

Perendaman paper disk pada masing-masing konsentrasi ekstrak

Paper disk diangin-anginkan sebelum diletakkan pada media NA

yang telah dioleskan larutan bakteri Vibrio harveyi

77

Lampiran 10. Pengukuran Besar Zona Hambat pada Uji In Vitro

Pengukuran Besar Zona Hambat dengan Menggunakan Jangka Sorong

a. Zona Hambat Ekstrak n-heksan

10 ppm 100 ppm

1000 ppm 10.000 ppm

78

b. Zona Hambat Ekstrak Etil Asetat

10 ppm 100 ppm

1000 ppm 10.000 ppm

c. Zona Hambat Ekstrak Butanol

10 ppm 100 ppm

79

1000 ppm 10.000 ppm

d. Zona Hambat Kontrol Positif

Kloramfenikol (Kontrol +)

80

Lampiran 11. Pengenceran Konsentrasi Ekstrak Butanol Daun Rhizophora

mucronata Lamk. pada saat LC50

Larutan Stok Ekstrak Butanol 10.000 ppm dalam 300 ml Air Laut

Konsentrasi Ekstrak 10.000 ppm =

x

x 300 ml

= 3000 mg = 3 g

= ekstrak 3 g dilarutkan dalam 300 ml air laut

Pengenceran Konsentrasi Ekstrak Butanol dari Larutan Stok 10.000 ppm

Konsentrasi 1000 ppm

V1 x M1 = V2 x M2

300 ml x 1000 = V2 x 10.000

V2 = 30 ml

30 ml dari larutan stok Ekstrak butanol 10.000 ppm ditambah air laut hingga

300 ml

Konsentrasi 100 ppm

V1 x M1 = V2 x M2

300 ml x 100 = V2 x 10.000

V2 = 3 ml

3 ml dari larutan stok Ekstrak butanol 10.000 ppm ditambah air laut hingga

300 ml

Konsentrasi 10 ppm

V1 x M1 = V2 x M2

300 ml x 10 = V2 x 10.000

V2 = 0,3 ml

0,3 ml dari larutan stok Ekstrak butanol 10.000 ppm ditambah air laut hingga

300 ml

81

Pengenceran Ekstrak Butanol

Pengamatan Mortalitas Udang Windu pada Saat LC50

82

Lampiran 12. Mortalitas Udang Windu pada Saat LC50 48 jam

Menggunakan Ekstrak Butanol Daun Rhizophora

mucronata Lamk.

Waktu

Dedah

Konsentrasi

Kontrol 10 ppm 100 ppm 1000 ppm 10000 ppm

1 2 1 2 1 2 1 2 1 2

15 menit - - - - - - - - - -

30 menit - - - - - - - - 1 -

1 jam - - - - - - - - - -

2 jam - - - - - - - - 1 1

4 jam - - - - - - 1 - 4 -

6 jam - - - - - - - - - 4

8 jam - - - - - - - - - -

16 jam - - - - - 1 2 1 - 1

24 jam - - - - - 1 1 1 - -

48 jam - - - - - - 1 1 - -

Total - - - - - 2 5 3 6 6

Keterangan: dalam setiap akuarium terdapat 6 ekor benih udang windu

83

Lampiran 13. Hasil Perhitungan LC50 dengan Menggunakan EPA Probit

EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM

USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES

Version 1.5

LC5048_Penaeusmonodon_EkstrakButanol

Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 0.411

Chi - Square for Heterogeneity

(tabular value at 0.05 level) = 5.991

Mu = 2.658747

Sigma = 0.604690

Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits

---------------------------------------------------------------------

Intercept 0.603124 1.139670 ( -1.630629, 2.836878)

Slope 1.653740 0.416391 ( 0.837612, 2.469867)

Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000

Conc. Number

Exposed

Number

Resp.

Observed

Proportion

Responding

Proportion

Responding

Adjusted

for Controls

Predicted

Proportion

Responding

10.0000 12 0 0.0000 0.0000 0.0030

100.0000 12 2 0.1667 0.1667 0.1380

1000.0000 12 8 0.6667 0.6667 0.7137

10000.0000 12 12 1.0000 1.0000 0.9867

84

LC5048_Penaeusmonodon_EkstrakButanol

Estimated LC/EC Values and Confidence Limits

Point Exposure

Conc.

95% Confidence Limits

Lower Upper

LC/EC 1.00 17.867 0.646 61.680

LC/EC 5.00 46.142 3.950 123.948

LC/EC 10.00 76.520 10.157 183.629

LC/EC 15.00 107.658 18.932 242.951

LC/EC 50.00 455.772 192.028 1087.165

LC/EC 85.00 1929.515 852.930 11109.386

LC/EC 90.00 2714.677 1127.719 20721.266

LC/EC 95.00 4501.962 1669.646 53311.152

LC/EC 99.00 11626.200 3353.197 326115.875

85

Lampiran 14. Konsentrasi Ekstrak Butanol Daun Rhizophora mucronata

Lamk. pada saat Uji In Vivo

Berdasarkan hasil dari LC50 didapat nilai konsentrasi yang digunakan adalah

455,772 ppm, maka:

A. Kontrol 0% = (tanpa perendaman ekstrak)

B. Konsentrasi 25% = 455,772 x 0,25 = 113,943 ppm

C. Konsentrasi 50% = 455,772 x 0,5 = 227,886 ppm

D. Konsentrasi 75% = 455,772 x 0,75 = 341,829 ppm

E. Konsentrasi 100% = 455,772 x 1 = 455,772 ppm

Larutan Ekstrak Butanol Untuk Perendaman Udang Windu Saat In Vivo

Tata Letak Penempatan Akuarium Saat Uji In Vivo