plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk · optimasi suhu dan waktu ekstraksi dalam...

OPTIMASI SUHU DAN WAKTU EKSTRAKSI DALAM PROSES DIGESTI HERBA RUMPUT MUTIARA (Hedyotis corymbosa (L.) Lamk)

DENGAN APLIKASI DESAIN FAKTORIAL

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Lilia Cresensia Yuniarty Rogan

NIM : 088114167

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2012

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

OPTIMASI SUHU DAN WAKTU EKSTRAKSI DALAM PROSES DIGESTI HERBA RUMPUT MUTIARA (Hedyotis corymbosa (L.) Lamk)

DENGAN APLIKASI DESAIN FAKTORIAL

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Lilia Cresensia Yuniarty Rogan

NIM : 088114167

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2012


ii


iii


iv

Halaman Persembahan


v


vi


vii

PRAKATA

Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat, berkat, cinta,

ijin, dan penyertaanNya yang begitu besar, sehingga penulis dapat menyelesaikan

penelitian dan penyusunan skripsi berjudul “Optimasi Suhu dan Waktu Ekstraksi

dalam Proses Digesti Herba Rumput Mutiara (Hedyotis corymbosa (L.) Lamk)

Dengan Aplikasi Desain Faktorial”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi

persyaratan dalam meraih gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di Fakultas Farmasi,

Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Dalam menyelesaikan skripsi ini, penulis tidak henti-hentinya

mendapatkan banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu,

penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen pembimbing atas kesabaran dan

waktunya memberikan koreksi, pengarahan, dan masukan selama persiapan,

penelitian, sampai penyusunan skripsi ini di tengah kesibukan beliau yang

sangat padat.

3. Rini Dwiastuti, M.Sc., Apt. selaku dosen penguji yang telah memberikan

waktu, kesempatan, masukan, dan bimbingan selama penyelesaian skripsi ini.

4. Jeffry Julianus, M.Si. selaku dosen penguji dan dosen pendamping akademik,

atas waktu, masukan, dan semangat selama penyelesaian skripsi ini, dan atas

pendampingan dan perhatiannya terhadap perkembangan saya selama masa

kuliah ini.


viii

5. Sri Hartati Yuliani, M.Si., Apt. yang telah berkenan memberikan baku asam

ursolat untuk penelitian ini serta memberikan ide, bimbingan, dan bantuan

bagi penelitian ini.

6. Christine Patramurti, M.Si. atas waktu yang diluangkan untuk memberikan

masukan dan semangat selama penyusunan skripsi ini.

7. Bapak, Mama, Yohan, Yuda, Bulik, Dik Jati, dan Dik Dian, atas pengertian,

dukungan, doa, kesabaran, kasih, teguran, canda tawa, serta perhatian yang

selalu mengalir tanpa henti.

8. Seluruh dosen Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta atas

ilmu, pengalaman, semangat, dan persahabatan berharga yang diberikan.

9. Seluruh staf laboratorium, staf kebersihan, dan staf keamanan Fakultas

Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Terutama Mas Bimo, Pak

Musrifin, Pak Parlan, Mas Kunto, Pak Wagiran, Mas Otok, dan Pak Ketul

yang telah membantu kelancaran penulis dalam melakukan penelitian.

10. Elisa Aster Nugroho, sebagai partner selama kuliah dan skripsi. Terima kasih

atas kesabaran, kerja sama, masukan, persahabatan, dan semangat selama ini.

11. Sahabat-sahabat terbaik saya, Melisa Darmawan dan Eka Riusinta Wati.

Terima kasih untuk semua kasih sayang, perhatian, tawa, canda,

kebersamaan, pengalaman baru, bantuan, masukan, dan semangat di kala

sedih.

12. Felicia, Sari Tambunan, Prasilya, Regina Clarissa, Pius, Asti, Dian, dan

Chintya, yang telah banyak membantu selama proses penyusunan skripsi ini.


ix

13. Teman-teman Grup Antistres: Paul, Hepi, Adi, Velly, Vica, Rosi, Dhimas,

Usie, Sasa, Satya, Elisa, Novie, Ike, sebagai teman seperjuangan mengerjakan

skripsi di Laboratorium Analisis Instrumental. Terima kasih atas diskusi,

semangat, cerita, canda-tawa, masukan, dan kebersamaan selama kita bekerja

bersama.

14. Teman-teman kelompok praktikum C2: Usie, Sasa, Satya, Asti, Dian, Tika,

Seco, atas kekompakkan, kebersamaan, dan kerja sama selama kuliah,

praktikum, dan di luar itu.

15. Teman-teman angkatan 2008 yang bersedia mengisi sebagian cerita hidupku.

Terima kasih atas semua kebersamaan, bantuan selama perkuliahan, dan

pengalaman yang tak terlupakan. Semoga kita bisa berhasil lewat cara kita

masing-masing.

16. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu, atas segala bantuan,

semangat, dan doa yang menyertai penulis dari awal penelitian sampai akhir

terselesaikannya penulisan skripsi.

Penulis menyadari adanya kekurangan dalam penyusunan skripsi oleh

karena keterbatasan wawasan dan kemampuan. Penulis membuka diri untuk

menerrima saran yang membangun dari semua pihak. Dengan segala kerendahan

hati, penulis mengharapkan skripsi ini memberi manfaat bagi pembaca. Akhir

kata, penulis mempersembahkan skripsi ini bagi majunya ilmu pengetahuan

farmasi.

Penulis


x

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ................................................................................. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .......................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN .................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................. iv

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ........ v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..................................................... vi

PRAKATA ................................................................................................ vii

DAFTAR ISI ............................................................................................. x

DAFTAR TABEL ...................................................................................... xiv

DAFTAR GAMBAR ................................................................................. xv

DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................. xvii

INTISARI .................................................................................................. xviii

ABSTRACT ................................................................................................ xix

BAB I. PENDAHULUAN ......................................................................... 1

A. Latar Belakang .................................................................................... 1

B. Perumusan Masalah ............................................................................ 5

C. Keaslian Penelitian .............................................................................. 5

D. Manfaat Penelitian .............................................................................. 6

E. Tujuan Penelitian ................................................................................ 6

1. Tujuan umum ............................................................................... 6

2. Tujuan khusus .............................................................................. 7


xi

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ........................................................ 8

A. Rumput Mutiara .................................................................................. 8

1. Keterangan botani ........................................................................ 8

2. Morfologi ..................................................................................... 8

3. Kandungan kimia ......................................................................... 8

4. Bagian yang dapat digunakan ....................................................... 9

B. Terpenoid ............................................................................................ 9

C. Asam Ursolat dan Asam Oleanolat ...................................................... 10

D. Pembuatan Simplisia ........................................................................... 12

1. Pengumpulan bahan baku ............................................................. 12

2. Sortasi basah ................................................................................ 13

3. Pencucian ..................................................................................... 14

4. Pengeringan ................................................................................. 14

5. Sortasi kering ............................................................................... 15

E. Penyarian ............................................................................................ 15

1. Ekstrak ......................................................................................... 16

2. Cairan penyari .............................................................................. 17

3. Digesti........................................................................................... 18

4. Penguapan .................................................................................... 19

F. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ......................................................... 19

G. Densitometri ....................................................................................... 22

H. Desain Faktorial .................................................................................. 24

I. Landasan Teori ................................................................................... 26


xii

J. Hipotesis ............................................................................................. 27

BAB III METODE PENELITIAN ............................................................. 29

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................................... 29

B. Variabel Penelitian .............................................................................. 29

1. Variabel bebas .............................................................................. 29

2. Variabel tergantung ...................................................................... 29

3. Variabel pengacau ........................................................................ 29

C. Defenisi Operasional ........................................................................... 29

D. Bahan Penelitian ................................................................................. 31

E. Alat Penelitian .................................................................................... 31

F. Tata Cara Penelitian ............................................................................ 32

1. Determinasi rumput mutiara .......................................................... 32

2. Pembuatan simplisia rumput mutiara ............................................. 32

3. Pembuatan ekstrak rumput mutiara ................................................ 32

4. Penetapan kandungan triterpen total .............................................. 33

5. Analisis hasil ................................................................................. 37

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................... 38

A. Determinasi Tanaman ......................................................................... 38

B. Pengumpulan Bahan dan Pembuatan Serbuk Simplisia ........................ 38

1. Pengumpulan bahan ...................................................................... 38

2. Sortasi basah ................................................................................. 40

3. Pencucian ...................................................................................... 40

4. Pengeringan .................................................................................. 40


xiii

5. Sortasi kering ................................................................................ 41

6. Pembuatan serbuk ......................................................................... 42

C. Defatisasi ............................................................................................ 43

D. Digesti ................................................................................................ 45

E. Pengeringan Ekstrak Rumput Mutiara ................................................. 49

F. Analisis Kualitatif dengan KLT ........................................................... 52

1. Pengamatan nilai Retardation Factor (Rf) asam ursolat ................. 55

2. Perbandingan pola spektra baku asam ursolat dengan sampel ........ 58

G. Analisis Kuantitatif dengan KLT-Densitometri ................................... 59

1. Penetapan panjang gelombang maksimum (λmaks) .......................... 59

2. Validasi metode ............................................................................. 60

3. Kurva baku .................................................................................... 68

4. Penetapan kandungan triterpen total dalam sampel secara KLT-

Densitometri .................................................................................. 70

H. Analisis Hasil Kadar Triterpen Total ................................................... 72

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ..................................................... 78

A. Kesimpulan ......................................................................................... 78

B. Saran ................................................................................................... 78

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... 79

LAMPIRAN ............................................................................................. 84

BIOGRAFI PENULIS .............................................................................. 117


xiv

DAFTAR TABEL

Tabel I. Rancangan percobaan desain faktorial dengan dua faktor dan

dua level .................................................................................. 25

Tabel II. Perbandingan suhu dan waktu digesti ....................................... 33

Tabel III. Rendemen ekstrak ................................................................... 51

Tabel IV. Harga Rf masing-masing bercak dengan eluen toluen-aseton-

asam asetat (90:10:0,07) dan fase diam silika gel 60 F254 ......... 56

Tabel V. Data % recovery baku asam ursolat ......................................... 61

Tabel VI. Data % CV baku asam ursolat ................................................. 63

Tabel VII. Nilai r seri baku asam ursolat ................................................... 63

Tabel VIII. Perbandingan nilai Rf baku dan sampel, serta nilai resolusi ...... 65

Tabel IX. Data recovery dan CV baku asam ursolat dalam matriks

ekstrak ..................................................................................... 68

Tabel X. Data seri konsentrasi baku asam ursolat dengan AUC baku

asam ursolat ............................................................................ 69

Tabel XI. Kadar triterpen total dalam ekstrak pada setiap kondisi dan

replikasi ................................................................................... 71

Tabel XII. Kondisi desain faktorial dan respon yang dihasilkan ................ 73

Tabel XIII. Nilai efek dari faktor suhu, waktu, dan interaksinya terhadap

respon kadar triterpen total ...................................................... 73

Tabel XIV. Hasil uji ANOVA .................................................................... 74


xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Rumput mutiara (Hedyotis corymbosa (L.) Lamk) ................. 9

Gambar 2. Struktur kimia asam oleanolat dan asam ursolat ..................... 12

Gambar 3. Grafik orientasi waktu ekstraksi ............................................ 48

Gambar 4. Sistem digesti ........................................................................ 49

Gambar 5. Ekstrak kering ....................................................................... 50

Gambar 6. Bercak baku asam ursolat dan ekstrak rumput mutiara yang

telah diderivatisasi ................................................................. 55

Gambar 7. Kromatogram baku asam ursolat 300 ppm (nilai Rf = 0,38) ... 56

Gambar 8. Kromatogram ekstrak rumput mutiara (nilai Rf = 0,38) .......... 56

Gambar 9. Interaksi asam ursolat dengan fase diam silika gel 60 F254 ...... 57

Gambar 10. Interaksi asam ursolat dengan fase gerak toluen-aseton-asam

asetat (90:10:0,07) ................................................................. 57

Gambar 11. Perbandingan pola spektra ekstrak adisi dengan baku asam

ursolat ................................................................................... 58

Gambar 12. Pola spektra absorbsi seri baku asam ursolat pada panjang

gelombang 200-700 nm ......................................................... 59

Gambar 13. Rf baku asam ursolat konsentrasi 500 ppm = 0,34 .................. 65

Gambar 14. Rf ekstrak replikasi 1 = 0,34 .................................................. 66

Gambar 15. Range konsentrasi asam ursolat ............................................. 66

Gambar 16. Kromatogram ekstrak tanpa adisi baku asam ursolat .............. 67

Gambar 17. Kromatogram ekstrak dengan adisi baku asam ursolat ........... 67

Gambar 18. Kurva baku asam ursolat ....................................................... 69


xvi

Gambar 19. Profil KLT penetapan kadar triterpen total dalam ekstrak

etanolik herba rumput mutiara dilihat secara visual dengan

cahaya biasa .......................................................................... 71

Gambar 20. Grafik hubungan suhu dan waktu ekstraksi terhadap kadar

triterpen total ......................................................................... 74


xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Keterangan Determinasi ............................................. 85

Lampiran 2. Certificate of Analysis Baku Asam Ursolat .......................... 86

Lampiran 3. Data Penimbangan Bahan ................................................... 87

Lampiran 4. Sistem Kromatografi Lapis Tipis Densitometri yang

Digunakan .......................................................................... 88

Lampiran 5. Spektrum Baku Asam Ursolat pada 200-700 nm ................. 89

Lampiran 6. Data Orientasi Waktu Ekstraksi .......................................... 90

Lampiran 7. Validasi Metode .................................................................. 91

Lampiran 8. Perhitungan Kadar Triterpen Total ...................................... 94

Lampiran 9. Data Rendemen Ekstrak ...................................................... 97

Lampiran 10. Notasi Desain Faktorial dan Percobaan Desain Faktorial ..... 98

Lampiran 11. Data Desain Faktorial .......................................................... 98

Lampiran 12. Optimasi Fase Gerak ........................................................... 100

Lampiran 13. Kromatogram Kurva Baku Asam Ursolat Replikasi 3 ......... 103

Lampiran 14. Kromatogram Akurasi dan Presisi Metode .......................... 104

Lampiran 15. Kromatogram Akurasi dan Presisi dalam Matriks Sampel ... 107

Lampiran 16. Kromatogram Penetapan Kadar ........................................... 110

Lampiran 17. Dokumentasi ....................................................................... 114


xviii

INTISARI

Rumput mutiara (Hedyotis corymbosa (L.) Lamk) merupakan tanaman yang memiliki banyak manfaat untuk pengobatan, dengan kandungan utamanya adalah asam ursolat. Asam ursolat merupakan suatu senyawa triterpenoid yang telah diketahui memiliki banyak fungsi biologis seperti antikanker, antibakteri, hepatoprotektif, imunomodulator, antiproliferatif, anti-inflamasi, dan anti-angiogenik. Salah satu tahapan dalam proses isolasi asam ursolat adalah ekstraksi. Pada penelitian ini dilakukan ekstraksi terhadap serbuk herba rumput mutiara secara digesti dengan perbedaan suhu dan waktu ekstraksi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kondisi proses digesti herba rumput mutiara yang dapat memberikan kadar triterpen total yang optimal pada level yang diteliti.

Penetapan kadar triterpen total menggunakan metode KLT-Densitometri dengan fase diam silika gel 60 F254 dan fase gerak toluen – aseton – asam asetat (90:10:0,07). Analisis hasil dilakukan dengan metode desain faktorial dua faktor dan dua level menggunakan software ubuntu-10.04-DesFaktor-0,9® by ubuntu R OpenOffice.org (www.molmod.org).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa suhu digesti merupakan faktor yang diprediksi dominan dan signifikan mempengaruhi perolehan kadar triterpen total, sedangkan waktu ekstraksi diprediksi berpengaruh signifikan terhadap perolehan kadar triterpen total namun bukan merupakan faktor yang diprediksi dominan. Tidak diperoleh area prediksi proses digesti yang optimum untuk memperoleh kadar triterpen total pada level yang diteliti. Kata kunci : Hedyotis corymbosa (L.) Lamk, asam ursolat, digesti, suhu, waktu

ekstraksi, KLT-Densitometri, desain faktorial.


xix

ABSTRACK

Rumput mutiara (Hedyotis corymbosa (L.) Lamk) is a plant which has many benefit for medicinal treatment, with ursolic acid as its main compound. Ursolic acid is a triterpenoid which has been known has a lot of biological effects including antitumoral, antibacterial, hepatoprotective, immunomodulatory, antiproliferative, anti-inflammatory, and anti-angiogenic activities. One step in the isolation process of ursolic acid is extraction. This research shows an extraction process of rumput mutiara herb powder use digestion with different of temperature and time of extraction. The aim of this research is to know condition of digestion process of rumput mutiara herb which produce optimum concentration of total triterpenoid on the level studied.

Determination of total triterpenoid concentration use TLC-Densitometry method, with silica gel 60 F254 as stationary phase and toluene – acetone – acetic acid (90:10:0,07) as mobile phase. Analysis of the results use factorial design method with two factors and two levels, use software ubuntu-10.04-DesFaktor-0,9® by ubuntu R OpenOffice.org (www.molmod.org).

The analysis result show that digestion temperature is the predicted dominant factor which influences the achievement of total triterpenoid concentration significantly, while time of extraction is predicted to affect the achievement of total triterpenoid concentration significantly too, but not an predicted dominant factor. There are no providable predicted optimum digestion process area to get total triterpenoid on the level studied. Keywords : Hedyotis corymbosa (L.) Lamk, ursolic acid, digestion, temperature,

time of extraction, TLC-Densitometry, factorial design.


1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kanker merupakan salah satu penyakit tidak menular yang menjadi masalah

kesehatan masyarakat, baik dunia maupun di Indonesia. Di dunia, 12% dari

seluruh kematian disebabkan oleh kanker. Kanker adalah pembunuh nomor 2

setelah penyakit kardiovaskular. WHO dan Bank Dunia, pada tahun 2005,

memperkirakan setiap tahunnya 12 juta orang di seluruh dunia menderita kanker

dan 7,6 juta di antaranya meninggal dunia. Prevalensi kanker di Indonesia adalah

4,3 per 1000 penduduk. Berdasarkan data Sistem Informasi Rumah Sakit (SIRS)

tahun 2007, kanker payudara menempati urutan pertama pada pasien rawat inap di

seluruh rumah sakit di Indonesia (16,85%), disusul kanker leher rahim (11,78%),

sedangkan kasus kanker bronkus dan paru pada pasien rawat inap sebesar 5,8%

dari seluruh jenis kanker (Depkes RI, 2011). Hal ini menyebabkan kebutuhan

akan senyawa antikanker semakin tinggi.

Telah banyak dilakukan penelitian terhadap senyawa-senyawa antikanker,

terutama yang berasal dari alam, salah satunya adalah asam ursolat. Asam ursolat

(3b-hydroxy-urs-12-en-28-oic acid) merupakan suatu senyawa triterpenoid

pentasiklik, anggota famili cyclosqualenoid. Dari hasil penelitian, senyawa ini

telah diketahui memiliki banyak fungsi biologis selain sebagai antikanker, antara

lain aktivitas antibakteri, hepatoprotektif, imunomodulator, antiproliferatif, anti-

inflamasi, dan anti-angiogenik (Cardenas, Quesada, and Medina, 2004). Dalam

penelitian yang dilakukan oleh Haryanti, Junedi, dan Meiyanto (2009), diperoleh


2

hasil bahwa asam ursolat berpotensi untuk dikembangkan menjadi agen co-

kemoterapi. Sedangkan menurut Yamaguchi, Noshita, Kidachi, Umetsu, Hayashi,

dan Komiyama (2008), asam ursolat dapat menjadi suatu agen antitumor yang

menjanjikan, karena bekerja spesifik pada sel tumor dan menyebabkan kerusakan

yang sangat kecil pada sel normal.

Asam ursolat dapat ditemukan pada cukup banyak jenis tanaman obat. Salah

satu tanaman yang mengandung asam ursolat adalah rumput mutiara (Hedyotis

corymbosa (L.) Lamk). Rumput mutiara termasuk ke dalam famili Rubiaceae.

Gentry (1993) menyebutkan bahwa anggota suku Rubiaceae merupakan salah satu

sumber obat etnis. Di Indonesia tumbuhan ini belum dimanfaatkan secara optimal

dalam pengobatan. Rumput mutiara sendiri telah diketahui memiliki banyak

manfaat untuk pengobatan, seperti hepatoprotektif (Sadasivan, Latha, Sasikumar,

Rajashekaran, Shyamal, and Shine, 2006), antitumor (Liang et al., 2008),

menghilangkan panas dan toksik, antiradang, diuretik, menyembuhkan bisul

(anticarbuncular), dan mengaktifkan sirkulasi darah (Hariana, 2006). Rumput

mutiara sangat mudah ditemukan ataupun dibudidayakan di Indonesia,

menyebabkan tanaman ini berpotensi untuk dikembangkan menjadi salah satu

tanaman obat tradisional. Menurut Liang et al. (2008), asam ursolat dan asam

oleanolat merupakan kandungan utama dari rumput mutiara, oleh karenanya

digunakan sebagai marker bagi tanaman tersebut. Kandungan asam ursolat sendiri

lebih banyak dibandingkan asam oleanolat. Kedua senyawa tersebut merupakan

isomer dengan struktur kimia yang sangat mirip, menyebabkan keduanya sangat

sulit untuk dipisahkan.


3

Yamaguchi et al. (2008) mengekstraksi asam ursolat dari kulit buah apel

menggunakan pelarut kombinasi n-heksana, kloroform, dan metanol sedangkan

Haryanti et al. (2009) mengekstraksi asam ursolat dari rumput mutiara

menggunakan pelarut etanol 96%. Schneider, Hosseiny, Szczotka, Jordan, dan

Schlitter (2008) menyebutkan bahwa pelarut alkohol, seperti metanol dan etanol

memberikan hasil yang tinggi dalam ekstraksi asam ursolat dari tanaman. Hasil

penelitian Xia, Wang, Xu, Zhu, Song, dan Li (2011) menunjukkan bahwa pelarut

etanol memberikan hasil ekstraksi asam ursolat terbanyak dibandingkan pelarut

metanol dan air dalam ekstraksi dengan metode Microwave-Assisted Extraction.

Dalam penelitian tersebut, disebutkan pula bahwa asam ursolat dapat terdegradasi

dalam waktu tertentu, menyebabkan menurunnya hasil ekstraksi, sehingga perlu

dilakukan optimasi lama waktu ekstraksi. Wang dan Weller (2006) menyebutkan

bahwa secara umum, suhu ekstraksi dapat mempengaruhi perolehan senyawa

aktif. Peningkatan suhu medium ekstraksi dapat meningkatkan kemampuan

berdifusi pelarut ke dalam sel dan akibatnya meningkatkan kelarutan senyawa.

Oleh karena itu, perlu dilakukan optimasi suhu dan lama waktu ekstraksi untuk

mendapatkan hasil yang optimum.

Kandungan asam ursolat yang cukup banyak dalam rumput mutiara dan

sifatnya yang mudah larut dalam larutan penyari (etanol 96%) menyebabkan

ekstraksi dengan metode digesti sangat sesuai. Selain itu, metode ini

menggunakan peralatan yang sederhana dan mudah dilakukan. Pemisahan asam

ursolat dan asam oleanolat sangat sulit untuk dilakukan sehingga dalam penelitian

ini kadar triterpen total yang akan dihitung sebagai asam ursolat, dengan asumsi


4

bahwa asam ursolat merupakan kandungan triterpen terbanyak dalam rumput

mutiara (Liang et al., 2008). Kadar triterpen total yang diperoleh dari setiap

kondisi ekstraksi akan dihitung dengan KLT-Densitometri. Terdapat banyak

keuntungan dari penggunaan Kromatografi Lapis Tipis (KLT), dimana salah satu

keuntungan utamanya adalah mampu memisahkan beberapa sampel secara

bersamaan, yang lebih menguntungkan dibandingkan Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi (KCKT) (Watson, 2009). Densitometri merupakan metode analisis

instrumental yang didasarkan pada interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit

yang merupakan bercak pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Densitometri

dimaksudkan untuk analisis kuantitatif analit dengan kadar kecil, yang

sebelumnya dilakukan pemisahan dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

(Gandjar and Rohman, 2009).

Penelitian ini dimulai dengan preparasi herba rumput mutiara meliputi

sortasi kering, pencucian, pengeringan, dan penyerbukan. Ekstraksi dilakukan

secara digesti dengan variasi suhu dan waktu ekstraksi. Analisis kuantitatif

kandungan triterpen dilakukan dengan metode KLT-Densitometri. Optimasi

proses digesti dengan variasi suhu dan waktu ekstraksi menggunakan aplikasi

desain faktorial dan dilanjutkan dengan uji ANOVA (taraf kepercayaan 95%).

Pengolahan data dilakukan dengan menggunakan software ubuntu-10.04-

DesFaktor-0,9® by ubuntu R OpenOffice.org (www.molmod.org). Kadar triterpen

total yang diperoleh dari tiap variasi suhu dan waktu ekstraksi akan dihitung dan

dianalisis menggunakan desain faktorial untuk menentukan faktor dominan,

kemudian dilanjutkan dengan uji ANOVA (taraf kepercayaan 95%) untuk


5

menentukan signifikansi faktor, dan pembuatan contour plot untuk memperoleh

area optimum suhu dan waktu ekstraksi yang menghasilkan kadar triterpen total

paling optimum pada level yang diteliti.

Tujuan penelitian ini adalah mencari area optimum kondisi proses digesti

dengan variasi suhu dan waktu ekstraksi sehingga dapat memberi solusi dalam

pengadaan ekstrak rumput mutiara yang memiliki kandungan triterpen yang

optimum.

B. Perumusan Masalah

Permasalahan dalam penelitian ini dapat dirumuskan sebagai berikut:

1. Apakah perbedaan suhu dan waktu ekstraksi pada proses digesti herba rumput

mutiara berpengaruh terhadap kadar triterpen total yang diperoleh?

2. Manakah faktor antara suhu, waktu ekstraksi, dan interaksi keduanya yang

paling dominan berpengaruh pada proses digesti herba rumput mutiara

sehingga diperoleh kadar triterpen total yang optimum?

3. Apakah diperoleh area suhu dan waktu ekstraksi yang optimum pada digesti

herba rumput mutiara terbatas pada level yang diteliti?

C. Keaslian Penelitian

Sejauh pengetahuan penulis, penelitian tentang optimasi suhu dan waktu

ekstraksi dalam proses digesti herba rumput mutiara terhadap kadar asam ursolat

maupun triterpen dengan aplikasi desain faktorial belum pernah dilakukan oleh

peneliti lain. Sejauh peneliti mengetahui, penetapan kadar asam ursolat pernah

dilakukan pada tanaman Oldenlandia diffusa dan Oldenlandia corymbosa (atau


6

Hedyotis corymbosa (L.) Lamk) dengan metode HPLC (Liang et al., 2009).

Dalam penelitian tersebut juga dilakukan validasi dan optimasi ekstraksi, dimana

pelarut yang digunakan adalah aseton dan metode penetapan kadarnya

menggunakan HPLC-DAD. Selain itu, pernah juga dilakukan isolasi terhadap

asam ursolat dari kulit apel (Yamaguchi et al., 2008), dan Ixora coccinea (Latha

et al., 2001), serta kuantifikasi asam ursolat dalam tanaman Ocimum sanctum

(Anandjiwala et al., 2006).

D. Manfaat Penelitian

Secara teoritis, penelitian ini bermanfaat untuk menambah informasi dalam

ilmu kefarmasian, khususnya mengenai pengaruh perbedaan suhu dan waktu

ekstraksi terhadap kadar triterpen total yang dihasilkan pada proses digesti serbuk

herba rumput mutiara.

Secara praktis, penelitian ini diharapkan dapat memberikan data mengenai

suhu dan waktu ekstraksi yang paling optimal untuk mendapatkan ekstrak herba

rumput mutiara yang paling optimum.

E. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum

Secara umum, penelitian ini bertujuan untuk menambah informasi mengenai

kondisi proses digesti yang optimal untuk memperoleh kadar triterpen total yang

paling optimum dari tanaman rumput mutiara.


7

2. Tujuan khusus

a. Mengetahui pengaruh perbedaan suhu dan waktu ekstraksi pada proses

digesti herba rumput mutiara terhadap kadar triterpen total yang

diperoleh.

b. Mengetahui faktor antara suhu, waktu ekstraksi, dan interaksi keduanya

yang paling dominan berpengaruh pada proses digesti herba rumput

mutiara sehingga diperoleh kadar triterpen total yang optimum.

c. Mengetahui area suhu dan waktu ekstraksi yang optimum pada digesti

herba rumput mutiara terbatas pada level yang diteliti.


8

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Rumput Mutiara

1. Keterangan botani

Rumput mutiara (Hedyotis corymbosa (L.) Lamk) termasuk dalam familia

Rubiaceae. Tanaman ini memiliki sinonim Oldenlandia corymbosa L. dan nama

daerah rumput siku-siku, bunga telor belungkas (Indonesia); daun mutiara,

rumput mutiara (Jakarta); katepan, urek-urek polo (Jawa); dan pengka (Makasar)

(Wijayakesuma, 1992).

2. Morfologi

Rumput mutiara merupakan rumput yang tumbuh rindang berserak, agak

lemah, tinggi 15-35 cm, tumbuh subur pada tanah yang lembab, mempunyai

banyak percabangan. Batang bersegi, daun berhadapan bersilang, tangkai daun

pendek/hampir duduk, panjang daun 2-3,5 cm, ujung runcing, tulang daun di

tengah. Ujung daun mempunyai rambut yang pendek. Bunga keluar dari ketiak

daun, bentuknya seperti payung berwarna putih, berupa bunga majemuk 2-5,

tangkai bunga (induk) keras, panjangnya 5-10 mm. Buah bulat, ujungnya pecah-

pecah (Wijayakesuma, 1992). Buahnya bulat kukuh dan dihiasi oleh 4 helai daun

kelopak (de Voogd, 1950).

3. Kandungan kimia

Herba rumput mutiara memiliki kandungan kimia berupa asam ursolat,

asam oleanolat, stigmasterol, β-sitosterol, dan glikosida flavonoid



9

Gambar 1. Rumput mutiara (Hedyotis corymbosa (L.) Lamk)

4. Bagian yang dapat digunakan

Bagian tanaman yang dapat digunakan dalam pengobatan adalah seluruh

bagian dari tanaman baik dalam keadaan segar atau yang telah dikeringkan


B. Terpenoid

Terpen merupakan senyawa hasil kondensasi linier asam asetat dengan dua

atom karbon. Asam asetat melalui berbagai cara akan menjadi asam malonat yang

akhirnya menjadi beberapa senyawa terpen. Terpen merupakan senyawa

hidrokarbon jenuh atau tak jenuh dengan jumlah atom C merupakan kelipatan

lima. Selanjutnya senyawa terpen digolongkan atas dasar jumlah atom C

penyusunnya. Istilah terpen diganti dengan terpenoid mengingat senyawa

hidrokarbon tersebut mempunyai gugus fungsional yang mengandung atom O,

dan diketahui bahwa biosintetik terpenoid merupakan polimerisasi senyawa

isoprena. Terpenoid digolongkan menjadi:

a. Monoterpenoid dengan jumlah atom C = 10

b. Seskuiterpenoid dengan jumlah atom C = 15


10

c. Diterpenoid dengan jumlah atom C = 20

d. Sesterpenoid dengan jumlah atom C = 25

e. Triterpenoid dengan jumlah atom C = 30

f. Tetraterpenoid dengan jumlah atom C = 40 (Mursyidi, 1990).

Secara kimia, terpenoid umumnya larut dalam lemak dan terdapat di dalam

sitoplasma sel tumbuhan. Biasanya terpenoid diekstraksi dari jaringan tumbuhan

dengan memakai eter minyak bumi, eter, atau kloroform, dan dapat dipisahkan

secara kromatografi pada silika gel atau alumina memakai pelarut di atas. Tetapi,

sering ada kesukaran sewaktu mendeteksi dalam skala mikro karena tidak

berwarna dan tidak ada pereaksi kromogenik semesta yang peka. Sering kali kita

harus mengandalkan cara deteksi yang nisbi tidak khas pada plat KLT, yaitu

penyemprotan dengan asam sulfat pekat, diteruskan dengan pemanasan (Harbone,

1987).

Triterpenoid adalah senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari enam

satuan isopren dan secara biosintesis diturunkan dari hidrokarbon C30 asiklik,

yaitu skualena. Senyawa ini berstruktur siklik yang nisbi rumit, kebanyakan

berupa alkohol, aldehida, atau asam karboksilat. Semua jenis triterpenoid

dipisahkan dengan cara yang serupa, terutama didasarkan kepada KLT dan KGC

(Harbone, 1987).

C. Asam Ursolat dan Asam Oleanolat

Asam ursolat, 3β-hydroxyurs-12-en-28-oic acid; urson; prunol;

micromerol; malol. C30H48O3; berat molekul 456,68 g/mol (C 78,90%, H 10,59%,

O 10,51%), ada di daun dan buah tanaman Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng


11

(bearberry), Vaccinium macrocarpon Art (cranberry), Rodhodendron

hymenanthas Makino, Ericaceae. Terdapat juga pada lapisan pelindung seperti

minyak pada apel, pir, prem, dan buah-buah lainnya. Larut pada suhu 15oC. 1

bagian larut dalam 88 bagian metanol, 178 bagian alkohol, 140 bagian eter, 388

bagian kloroform, 1675 bagian karbon disulfida. Cukup larut dalam aseton. Larut

dalam asam asetat glasial panas dan dalam NaOH 2% dalam alkohol. Tidak larut

dalam aquadest dan petroleum eter. Titik lebur 285o-288oC (Budavari, O`Neil,

Smith, and Heckelman, 1989).

Asam ursolat merupakan triterpenoid pentasiklik, anggota famili

cyclosqualenoid, ditemukan di banyak tanaman obat. Asam ursolat diketahui

dapat menghambat replikasi DNA, aktivitas tirosin kinase, dan ekspresi

lipoksigenase, siklooksigenase-2, menginduksi sintesis nitrit oksida, dan matriks

metalloproteinase-9. Semua efek molekuler ini dapat menyebabkan efek biologis

pleiotropis, termasuk aktivitas antibakteri, hepatoprotektif, imunomodulator,

antiproliferasi, antitumor, antiinflamasi, dan anti-angiogenik (Cardenas et al.,

2004).

Asam oleanolat, 3-hydroxyolean-12-en-28-oic acid; oleanol; caryophyllin.

C30H48O3; berat molekul 456,71 g/mol (C 78,90%, H 10,59%, O 10,51%). Berupa

serbuk halus, kristal berbentuk jarum.Titik lebur 310oC. K = 3x10-7. Tidak larut

dalam aquadest. Larut dalam 65 bagian eter, 106 bagian alkohol 95%, 35 bagian

alkohol 95% panas, 118 bagian kloroform, 180 bagian aseton, 235 bagian metanol

(Budavari et al., 1989).


12

Asam ursolat dan asam oleanolat adalah isomer dengan struktur kimia

yang mirip, dan akibatnya sulit untuk dipisahkan (Liang et al., 2009).

Perbedaannya hanya pada konfigurasi gugus metil pada cincin E (Du and Chen,

2008).

. Gambar 2. Struktur kimia asam oleanolat dan asam ursolat (Gbaguidi,

Accrombessi, Moudachirou, and Quetin-Leclercq, 2005)

D. Pembuatan Simplisia

Simplisia adalah bahan alamiah yang dipergunakan sebagai obat yang

belum mengalami pengolahan apapun juga dan kecuali dinyatakan lain simplisia

merupakan bahan yang dikeringkan. Simplisia dapat berupa simplisia nabati,

simplisia hewani, dan simplisia pelikan. Simplisia harus memenuhi persyaratan

minimal untuk menjamin keseragaman senyawa aktif, keamanan maupun

kegunaannya. Faktor yang berpengaruh adalah bahan baku simplisia, proses

pembuatan simplisia termasuk cara penyimpanan bahan baku simplisia dan cara

pengepakan dan penyimpanan simplisia (Depkes RI, 1986).

1. Pengumpulan bahan baku

Kadar senyawa aktif dalam suatu simplisia berbeda-beda, antara lain

tergantung pada :

ASAM URSOLAT ASAM OLEANOLAT


13

a. Umur tanaman yang dipanen. Umur tanaman yang dipanen berpengaruh

pada kadar senyawa aktif. Apabila umur tanaman pada saat panen sama,

maka mutu simplisia yang dihasilkan juga akan sama.

b. Lingkungan tempat tumbuh. Lingkungan tempat tumbuh yang berbeda

dapat mengakibatkan perbedaan kadar kandungan senyawa aktif.

Pertumbuhan tanaman dipengaruhi tinggi tempat, keadaan tanah, dan cuaca.

c. Waktu panen. Waktu panen sangat erat hubungannya dengan pembentukan

senyawa aktif di dalam bagian tanaman yang akan dipanen. Waktu panen

yang tepat adalah pada saat bagian tanaman tersebut mengandung senyawa

aktif dalam jumlah yang terbesar. Panen dapat dilakukan dengan tangan,

menggunakan alat atau mesin. Dalam hal ini ketrampilan pemetik

diperlukan, agar diperoleh simplisia yang benar, tidak tercampur dengan

bagian lain dan tidak merusak tanaman induk. Alat atau mesin yang

digunakan untuk memetik perlu dipilih yang sesuai. Alat yang terbuat dari

logam sebaiknya tidak digunakan bila diperkirakan akan merusak senyawa

aktif simplisia seperti fenol, glikosida, dan sebagainya (Depkes RI, 1986).

2. Sortasi basah

Dalam proses pembuatan simplisia, setelah bahan baku dikumpulkan,

kemudian dilakukan sortasi basah terhadap bahan baku tersebut. Sortasi basah

dilakukan untuk memisahkan kotoran-kotoran atau bahan-bahan asing lainnya

dan bahan simplisia. Misalnya pada simplisia yang dibuat dari akar suatu

tanaman obat, bahan-bahan asing seperti tanah, kerikil, rumput, batang daun,

akar yang telah rusak, serta pengotor lainnya harus dibuang. Tanah mengandung


14

bermacam-macam mikroba dalam jumlah yang tinggi, oleh karena itu

pembersihan simplisia dari tanah yang terikut dapat mengurangi jumlah mikroba

awal (Depkes RI, 1986).

3. Pencucian

Pencucian dilakukan untuk menghilangkan tanah dan pengotor lainnya

yang melekat pada bahan simplisia. Pencucian dilakukan dengan air bersih,

misalnya air dari mata air, air sumur, atau air PAM. Bahan simplisia yang

mengandung zat yang mudah larut dalam air yang mengalir, pencucian agar

dilakukan dalam waktu yang sesingkat mungkin. Pencucian sayur-sayuran 1 kali

dapat menghilangkan 25% dari jumlah mikroba awal. Jika dilakukan pencucian

3 kali, jumlah mikroba yang tertinggal hanya 42% dari jumlah mikroba awal.

Pencucian tidak dapat membersihkan semua mikroba karena air pencucian yang

digunakan biasanya mengandung sejumlah mikroba juga (Depkes RI, 1986).

4. Pengeringan

Tujuan pengeringan ialah untuk mendapatkan simplisia yang tidak mudah

rusak, sehingga dapat disimpan dalam waktu yang lebih lama. Dengan

mengurangi kadar air dan menghentikan reaksi enzimatik maka penurunan mutu

atau perusakan simplisia dapat dicegah. Air yang masih tersisa dalam simplisia

pada kadar tertentu dapat merupakan media pertumbuhan kapang dan jasad renik

lainnya. Pengeringan simplisia dilakukan dengan menggunakan sinar matahari

atau menggunakan suatu alat pengering. Hal-hal yang perlu diperhatikan selama

proses pengeringan adalah suhu pengeringan, kelembaban udara, aliran udara,

waktu pengeringan, dan luas permukaan bahan (Depkes RI, 1986).


15

Suhu pengeringan tergantung pada bahan simplisia dan cara

pengeringannya. Bahan simplisia dapat dikeringkan pada suhu 30-90oC, tetapi

suhu yang terbaik adalah tidak melebihi 60oC (Depkes RI, 1986).

5. Sortasi kering

Sortasi setelah pengeringan sebenarnya merupakan tahap akhir pembuatan

simplisia. Tujuan sortasi untuk memisahkan benda-benda asing seperti bagian-

bagian tanaman yang tidak diinginkan dan pengotor-pengotor lain yang masih

ada dan tertinggal pada simplisia kering (Depkes RI, 1986).

E. Penyarian

Penyarian (ekstraksi) merupakan kegiatan penarikan zat yang dapat larut

dari bahan yang tidak dapat larut dengan cairan penyari. Pada proses penyarian

terjadi perpindahan masa zat aktif yang semula berada di dalam sel akan ditarik

oleh cairan penyari. Hasil penyarian akan semakin baik apabila ukuran serbuk

semakin halus, karena permukaan serbuk simplisia yang bersentuhan dengan

cairan penyari semakin luas, tetapi dalam pelaksanaannya tidak selalu demikian,

karena penyarian masih tergantung juga pada sifat fisik dan kimia simplisia yang

bersangkutan. Simplisia yang terlalu halus akan memberikan kesulitan pada

proses penyaringan. Serbuk yang terlalu halus akan mempersulit penyaringan,

karena butir-butir halus tadi membentuk suspensi yang sulit dipisahkan dengan

hasil penyarian. Hasil penyarian tidak murni lagi tetapi tercampur dengan partikel-

partikel halus tadi. Penyerbukan yang terlalu halus menyebabkan banyak dinding

sel yang pecah, sehingga zat yang tidak diinginkan pun ikut ke dalam hasil

penyarian (Depkes RI, 1986).


16

Pada pengeringan tumbuhan segar maka protoplasma akan mengkerut.

Mengalirnya bahan pelarut ke dalam ruang sel juga menyebabkan protoplasma

membengkak, dan bahan kandungan sel akan terlarut sesuai dengan kelarutannya.

Bahan kandungan sel berpindah, sejauh bahan tersebut terlarut molekuler,

mengikuti difusi melalui ruang antarmiselar. Faktor pendorong yang bekerja

adalah adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan cairan

penyari yang mula-mula masih tanpa bahan aktif yang mengelilinginya. Bahan

kandungan sel akan mencapai ke dalam cairan di sebelah luar selama difusi

melintasi membran sampai terbentuknya suatu keseimbangan konsentrasi antara

larutan di sebelah dalam dan di sebelah luar sel (Voigt, 1994).

1. Ekstrak

Ekstrak adalah sediaan kering, kental atau cair yang dibuat dengan

menyari simplisia nabati atau hewani menurut cara yang cocok (Depkes RI,

1979). Menurut Voigt (1994), ekstrak dikelompokkan menurut sifat-sifatnya

menjadi:

a. Ekstrak encer (extractum tenue). Sediaan ekstrak encer ini memiliki

konsistensi madu dan mudah dituang.

b. Ekstrak kental (extractum spissum). Sediaan ekstrak kental ini memiliki

konsistensi liat dalam keadaan dingin dan tidak dapat dituang serta

kandungan airnya berjumlah sampai 30%.

c. Ekstrak kering (extractum siccum). Sediaan ekstrak kering ini memiliki

konsistensi kering dan mudah digosokkan dengan kandungan lembab tidak

lebih dari 5%.


17

d. Ekstrak cair (extractum fluidum). Pada ekstrak cair memiliki konsistensi cair

dan mudah dituang.

Ekstrak kering adalah ekstrak dimana semua pelarutnya diuapkan sampai

semua pelarut menguap (Sumaryono, 2004).

2. Cairan penyari

Pelarut yang digunakan dalam proses ekstraksi harus memenuhi syarat

berikut:

a. Memiliki selektivitas tinggi terhadap zat yang akan diekstraksi.

b. Tidak bereaksi dengan zat yang akan diekstraksi dan dengan zat lain yang

ada dalam tanaman.

c. Murah.

d. Tidak berbahaya bagi manusia dan lingkungan.

e. Mudah menguap.

Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol, atau

pelarut lainnya. Penyarian pada perusahaan obat tradisional masih terbatas pada

penggunaan cairan penyari air, etanol, atau air-etanol. Etanol dipertimbangkan

sebagai penyari karena lebih selektif, kapang dan kuman sulit tumbuh dalam

etanol 20% ke atas, tidak beracun, netral, absorbsinya baik, etanol dapat

bercampur dengan air pada segala perbandingan, panas yang diperlukan untuk

pemekatan lebih sedikit (Depkes RI, 1986).

Etanol mengandung tidak kurang dari 92,3% b/b dan tidak lebih dari

93,8% b/b, setara dengan tidak kurang dari 94,9% v/v dan tidak lebih dari 96%

v/v, C2H5OH, pada suhu 15,56oC. Pemerian: cairan mudah menguap, jernih,


18

tidak berwarna. Bau khas dan menyebabkan rasa terbakar pada lidah. Mudah

menguap walaupun pada suhu rendah dan mendidih pada suhu 78oC. Bercampur

dengan air dan praktis larut dengan semua pelarut organik (Depkes RI, 1995).

3. Digesti

Digesti adalah cara maserasi dengan menggunakan pemanasan lemah,

yaitu pada suhu 40o-50oC. Cara maserasi ini hanya dapat dilakukan untuk

simplisia yang zat aktifnya tahan terhadap pemanasan. Dengan pemanasan akan

diperoleh keuntungan antara lain:

a. Kekentalan pelarut berkurang, yang dapat mengakibatkan berkurangnya

lapisan-lapisan batas.

b. Daya melarutkan cairan penyari akan meningkat, sehingga pemanasan

tersebut mempunyai pengaruh yang sama dengan pengadukan.

c. Koefisien difusi berbanding lurus dengan suhu absolut dan berbanding

terbalik dengan kekentalan, hingga kenaikan suhu akan berpengaruh pada

kecepatan difusi. Umumnya kelarutan zat aktif akan meningkat bila suhu

dinaikkan (Depkes RI, 1986).

Pada proses maserasi, cairan penyari akan menembus dinding sel dan

masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan

karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di luar sel dan di

dalam sel, maka larutan yang terpekat didesak keluar. Peristiwa tersebut

berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar dan di

dalam sel. Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol

atau pelarut lain (Depkes RI, 1986).


19

Pengadukan diperlukan untuk meratakan konsentrasi larutan di luar butir

serbuk simplisia, sehingga dengan pengadukan tersebut tetap terjaga adanya

derajat perbedaan konsentrasi yang sekecil-kecilnya antara larutan di dalam sel

dengan larutan di luar sel. Penggunaan mesin pengaduk yang berputar terus-

menerus dapat mempersingkat waktu proses ekstraksi menjadi 6 sampai 24 jam

(Depkes RI, 1986).

4. Penguapan

Penguapan merupakan proses terbentuknya uap dari permukaan cairan.

Kecepatan terbentuknya uap tergantung pada difusi uap melalui lapisan batas di

atas cairan yang diuapkan. Kecepatan penguapan tergantung pada kecepatan

pemindahan panas. Oleh karena itu luas permukaan penguapan harus seluas

mungkin dan lapisan batas dikurangi (Depkes RI, 1986).

F. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi adalah cara pemisahan zat khasiat dan zat lain yang ada

dalam sediaan dengan jalan penyarian berfraksi, penyerapan, atau penukaran ion

pada zat berpori, menggunakan cairan atau gas yang mengalir. Kromatografi lapis

tipis (KLT) digunakan untuk pemisahan senyawa secara cepat, dengan

menggunakan zat penjerap berupa serbuk halus yang dilapiskan rata pada

lempeng kaca (Depkes RI, 1979).

Campuran yang akan dipisahkan, berupa larutan, ditotolkan berupa bercak

atau pita. Setelah plat atau lapisan ditaruh di dalam bejana tertutup rapat yang

berisi fase gerak yang cocok, pemisahan terjadi selama pengembangan.

Selanjutnya, senyawa yang tidak berwarna harus dideteksi (Stahl, 1985).


20

Fase diam dibuat dari salah satu penjerap yang khusus digunakan untuk

KLT yang dihasilkan oleh berbagai perusahaan. Panjang lapisan tersebut 200 nm

dengan lebar 200 atau 100 mm. Untuk analisis, tebalnya 0,1-0,3 mm, biasanya 0,2

mm. Sebelum digunakan, lapisan disimpan dalam lingkungan yang tidak lembab

atau bebas dari uap laboratorium (Stahl, 1985).

Fase diam yang umum ialah silika gel, aluminium oksida, kieselgur,

selulosa dan turunannya, dan lain-lain. Silika gel paling banyak digunakan (Stahl,

1985). Silika gel GF254 artinya silika tersebut mengandung gypsum (CaSO4½H2O)

yang merupakan pengikat, dengan cara meningkatkan gaya adhesi antara partikel

senyawa dengan silika dan juga meningkatkan gaya adhesi antar partikel silika.

F254 adalah indikator fosforesensi pada panjang gelombang 254 nm yang berarti

silika tersebut dapat berfosforesensi pada panjang gelombang 254 nm (Jork,

1990).

Fase gerak ialah medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa pelarut.

Pelarut bergerak di dalam fase diam, yaitu suatu lapisan berpori, karena ada gaya

kapiler. Pelarut yang digunakan hanyalah bertingkat mutu analitik dan bila

diperlukan, sistem pelarut multikomponen ini harus berupa suatu campuran

sesederhana mungkin yang terdiri atas maksimum tiga komponen (Stahl, 1985).

Bercak ditotolkan pada jarak 15 mm dari tepi lapisan bawah. Jarak suatu

bercak awal, yang berukuran 3-5 mm, ke bercak awal lainnya dan jarak antara

bercak paling pinggir dengan tepi samping sekurang-kurangnya 10 mm. Lapisan

fase diam tidak boleh rusak selama penotolan cuplikan itu. Biasanya ditotolkan 1-

10 µL larutan cuplikan 0,1-1%. Untuk menotolkan disarankan agar menggunakan


21

mikropipet berujung runcing, khusus berskala 1 µL dan bervolume 10 µL (Stahl,

1985).

Di samping larutan cuplikan, selalu ada suatu campuran pembanding yang

dikembangkan pada waktu bersamaan. Campuran ini terdiri atas 1-5 senyawa

yang diketahui, dengan konsentrasi yang telah diketahui pula. Bila mungkin,

senyawa pembanding ini sama dengan senyawa yang terdapat dalam larutan

cuplikan (Stahl, 1985).

Bejana harus dapat menampung plat 200 x 200 mm dan harus tertutup

rapat. Untuk kromatografi dalam bejana yang jenuh, secarik kertas saring bersih

yang lebarnya 18-20 cm dan panjangnya 45 cm ditaruh pada dinding sebelah

dalam bejana berbentuk U dan dibasahi dengan pelarut pengembang. Tingkat

kejenuhan bejana mempunyai pengaruh yang nyata pada pemisahan dan letak

bercak (Stahl, 1985).

Proses kerja dengan KLT yaitu dengan menempatkan pada dua sisi bejana

kromatografi, 2 helai kertas saring, tinggi 18 cm, lebar sama dengan panjang

bejana. Larutan fase gerak dimasukkan kurang lebih 100 mL ke dalam bejana

kromatografi hingga tinggi pelarut 0,5 cm sampai 1 cm, kemudian ditutup rapat

dan kertas saring harus basah seluruhnya. Pada dasar bejana, kertas saring harus

tercelup ke dalam pelarut. Tahap selanjutnya yaitu dilakukan penotolan larutan

sampel dan standar, menurut cara yang tertera pada masing-masing monografi

dengan jarak kira-kira 1,5-2 cm dari tepi bawah lempeng, biarkan kering. Bejana

kemudian ditutup rapat dan dibiarkan hingga pelarut merambat 10-15 cm di atas

titik penotolan, keluarkan dan keringkan (Depkes RI, 1979).


22

Terdapat berbagai kemungkinan untuk deteksi senyawa tak berwarna pada

kromatogram. Deteksi paling sederhana adalah jika senyawa menunjukkan

penyerapan di daerah UV 254 nm atau jika senyawa itu dapat dieksitasi ke

fluorosensi radiasi UV 365 nm. Selain itu, senyawa juga dapat dideteksi dengan

pereaksi semprot dan pemanasan (Stahl, 1985).

Identifikasi senyawa pada lempeng KLT dinyatakan dengan harga Rf.

Angka ini diperoleh dengan membagi jarak yang ditempuh oleh totolan cuplikan

dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut. Keduanya diukur dari titik awal, dan

harga Rf beragam mulai dari 0 sampai 1 (Gritter, 1985). Penilaian visual

kromatogram diperoleh dengan pengamatan 2 bercak dengan harga Rf dan ukuran

yang hampir sama (Depkes RI, 1979). Selain itu, beberapa sifat, misalnya

fluorosensi atau pemadaman fluorosensi, dan terutama warna hasil reaksi warna

juga dapat dijadikan penilaian visual. Informasi mengenai identitas seringkali

dapat juga diperoleh dengan membandingkan perubahan warna pada pemanasan,

dan selanjutnya pada penyimpanan plat (Stahl, 1985).

Dengan menggunakan KLT, pemisahan senyawa yang amat berbeda

seperti senyawa organik alam dan senyawa organik sintetik, kompleks anorganik-

organik, dan bahkan ion anorganik, dapat dilakukan dalam beberapa menit dengan

biaya yang tidak terlalu mahal. Kelebihan KLT yang lain ialah pemakaian pelarut

dan cuplikan yang jumlahnya sedikit (Gritter, 1985).

G. Densitometri

Densitometri merupakan salah satu metode analisis KLT kuantitatif.

Metode ini dilakukan dengan cara mengukur kerapatan bercak senyawa uji yang


23

dipisahkan, dibandingkan dengan kerapatan bercak senyawa standar yang dielusi

bersama-sama. Syarat-syarat senyawa standar adalah murni, inert, dan stabil

(Hardjono, 1983).

Alat densitometri mempunyai sumber sinar yang bergerak di atas bercak

pemisahan pada lempeng kromatografi yang akan ditetapkan kadar komponennya.

Lazimnya lempeng itu digerakkan menyusuri berkas sinar tersebut. Bercak yang

kecil dan intensif akan menghasilkan suatu puncak kurva absorbsi yang sempit

dan tajam, sebaliknya bercak yang lebar akan menghasilkan puncak kurva

absorbsi yang melebar dan tumpul (Sudjadi, 1988).

Banyak sinar yang direfleksikan akan ditangkap oleh suatu alat yang

disebut reflection photomultiplier yang akan diteruskan ke pencatat atau rekorder

untuk diubah menjadi suatu puncak atau kromatogram. Luas puncak atau tinggi

puncak sesuai dengan konsentrasi senyawa pada noda yang dukur kerapatannya

(Mintarsih, 1990).

Penelusuran bercak akan mendapatkan hasil yang baik apabila dilakukan

pada panjang gelombang maksimum, karena perubahan konsentrasi pada bercak

sedikit saja sudah dapat terdeteksi. Pengukuran dilakukan dengan menelusuri

bercak yang akan ditetapkan kadarnya pada kisaran panjang gelombang zat

tersebut (Mintarsih, 1990).

Plat yang digunakan untuk KLT-densitometri sebaiknya digunakan plat

buatan pabrik karena pada plat buatan sendiri fase diamnya kurang kompak,

sehingga akan mempengaruhi hasil penelusuran dengan densitometri yaitu berupa

puncak yang lebar dan kasar. Puncak yang lebar disebabkan kurang kompaknya


24

fase diam sedangkan puncak yang kasar disebabkan permukaan plat yang kurang

rata (Mintarsih, 1990).

Teknik pengukuran dapat didasarkan atas pengukuran intensitas sinar yang

diserap (absorbansi), intensitas sinar yang dipantulkan (reflaktansi), atau intensitas

sinar yang difluorosensikan. Teknik pengukuran berdasarkan refleksi dimana sinar

datang sebagian diserap dan sebagian lagi dipantulkan (Mintarsih, 1990).

Ada dua cara penetapan kadar dengan alat densitometer. Pertama, setiap

kali penetapan ditotolkan sediaan baku dari senyawa yang bersangkutan dan

dielusi bersama dalam satu lempeng, kemudian AUC (luas daerah di bawah

kurva) sampel dibandingkan dengan harga AUC zat baku. Yang kedua, dengan

membuat kurva baku hubungan antara jumlah zat baku dengan AUC. Kurva baku

diperoleh dengan membuat totolan zat baku pada plat KLT dengan bermacam-

macam konsentrasi (minimal 3 macam konsentrasi). Bercak yang diperoleh dicari

AUC nya dengan alat densitometer. Dari kurva baku diperoleh persamaan y = bx

+ a, dimana x adalah banyaknya zat yang ditotolkan dan y adalah AUC

(Supardjan, 1987).

H. Desain Faktorial

Metode desain faktorial adalah sistem desain eksperimental dimana faktor-

faktor yang terlibat dalam suatu reaksi atau proses dapat dievaluasi secara

simultan dan mengukur efek dari faktor-faktor tersebut. Teknik ini bisa diterapkan

dalam masalah farmasi, dan menjadi dasar bagi berbagai macam percobaan atau

penelitian untuk mencari pemecahan yang optimum (Amstrong and James, 1996).


25

Desain faktorial sederhana salah satunya adalah dengan dua faktor pada

dua level (rendah dan tinggi). Hal ini berarti ada dua faktor yang masing-masing

faktor diuji pada dua level yang berbeda, yaitu pada level rendah dan tinggi

(Bolton, 1990).

Optimasi campuran dua bahan (berarti ada dua faktor) dengan desain

faktorial (two level factorial design) dilakukan berdasarkan:

Y = bo + b1X1 + b2X2 + b12X1X2

Dengan : Y = respon hasil atau sifat yang diamati

X1, X2 = level bagian A, level bagian B

bo, b1, b2, b12 = koefisien dapat dihitung dari hasil percobaan

bo = rata-rata hasil semua percobaan

b1, b2, b12 = koefisien yang dihitung dari hasil percobaan

Pada desain faktorial dua level dan dua faktor diperlukan empat percobaan

(2n = 4, dengan 2 menunjukkan level dan n menunjukkan jumlah faktor).

Penamaan formula untuk 4 percobaan adalah formula (1) untuk percobaan I,

formula a untuk percobaan II, formula b untuk percobaan III, dan formula ab

untuk percobaan IV (Bolton, 1990).

Rancangan percobaan desain faktorial sebagai berikut:

Tabel I. Rancangan percobaan desain faktorial dengan dua faktor dan dua level Percobaan Faktor A Faktor B Interaksi

1 - - + a + - - b - + - ab + + +

Keterangan: (-) = level rendah (+) = level tinggi Percobaan (1) = faktor A level rendah, faktor B rendah


26

Percobaan a = faktor A level tinggi, faktor B rendah Percobaan b = faktor A level rendah, faktor B tinggi Percobaan ab = faktor A level tinggi, faktor B tinggi (Bolton, 1997).

Efek masing-masing faktor dan interaksinya dapat dihitung sebagai rata-

rata selisih antara respon pada level rendah dengan respon pada level tinggi. Efek

dan interaksi faktor yang diteliti dapat dirumuskan menjadi persamaan berikut :

Efek faktor A = (푎푏+푎)−(푏+1)2

Efek faktor B = ( ) ( )

Interaksi = (1+푎푏)−(푎+푏)2 (Bolton, 1997).

Desain faktorial memiliki beberapa keuntungan. Metode ini memiliki

efisiensi yang maksimum untuk memperkirakan efek yang dominan dalam

menentukan respon. Keuntungan utama desain faktorial adalah bahwa metode ini

memungkinkan untuk mengidentifikasi efek masing-masing faktor, maupun efek

interaksi antar faktor. Metode ini ekonomis, dapat mengurangi jumlah penelitian

jika dibandingkan dengan meneliti dua efek faktor secara terpisah (Bolton, 1997).

I. Landasan Teori

Rumput mutiara memiliki kandungan kimia utama berupa asam ursolat

dan asam oleanolat (Liang et al., 2008). Asam ursolat memiliki banyak fungsi

antara lain antibakteri, hepatoprotektif, imunomodulator, antiproliferasi,

antitumor, antiinflamasi, dan anti-angiogenik (Cardenas et al., 2004). Satu bagian

asam ursolat larut dalam 178 bagian etanol (Budavari et al., 1989). Dalam

penelitian yang dilakukan Schneider, Hosseiny, Szczotka, Jordan, dan Schlitter


27

(2008) disebutkan bahwa pelarut alkohol, seperti metanol dan etanol memberikan

hasil yang tinggi dalam ekstraksi asam ursolat dari tanaman.

Asam ursolat dan asam oleanolat adalah isomer dengan struktur kimia

yang mirip, dan akibatnya sulit untuk dipisahkan (Liang et al., 2009). Oleh karena

itu, dalam penelitian ini, kadar triterpen total yang akan dihitung sebagai kadar

asam ursolat.

Optimasi pada penelitian ini dilakukan pada faktor suhu dan waktu

ekstraksi sebab kedua faktor ini merupakan faktor yang berpengaruh dan dapat

dikendalikan dalam proses digesti, untuk mendapatkan kadar triterpen total yang

optimum. Kedua faktor ini penting untuk dioptimasi sebab dalam penelitian yang

dilakukan oleh Xia et al. (2011), disebutkan bahwa asam ursolat dapat

terdegradasi dalam waktu tertentu, menyebabkan menurunnya hasil ekstraksi,

sehingga perlu dilakukan optimasi lama waktu ekstraksi. Selain itu, Wang dan

Weller (2006) menyebutkan bahwa secara umum, suhu ekstraksi dapat

mempengaruhi perolehan senyawa aktif. Peningkatan suhu medium ekstraksi

dapat meningkatkan kemampuan berdifusi pelarut ke dalam sel dan akibatnya

meningkatkan kelarutan senyawa, namun tidak semua senyawa tahan terhadap

suhu yang tinggi.

J. Hipotesis

Hipotesis yang dapat diajukan pada penelitian ini antara lain:

1. Perbedaan suhu dan waktu ekstraksi pada proses digesti herba rumput mutiara

berpengaruh terhadap kadar triterpen total yang diperoleh.


28

2. Dapat diketahui faktor antara suhu, waktu, atau interaksi keduanya yang

diprediksi paling dominan berpengaruh pada proses digesti herba rumput

mutiara sehingga diperoleh kadar triterpen total yang optimum.

3. Diperoleh area prediksi suhu dan waktu ekstraksi yang optimum pada digesti

herba rumput mutiara terbatas pada level yang diteliti.


29

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental ganda karena ada

intervensi atau perlakuan terhadap subyek uji, dengan dua faktor yaitu suhu dan

waktu ekstraksi, menggunakan aplikasi desain faktorial.

B. Variabel Penelitian

1. Variabel bebas

Suhu dan waktu ekstraksi, masing-masing dengan 2 macam level. Suhu

ekstraksi yang digunakan untuk level rendah adalah 30oC sedangkan untuk level

tinggi adalah 60oC. Waktu ekstraksi untuk level rendah adalah 2 jam sedangkan

untuk level tinggi adalah 4 jam.

2. Variabel tergantung

Kadar triterpen total dalam ekstrak.

3. Variabel pengacau

a. Variabel pengacau terkendali. Varietas tumbuhan, kecepatan pengadukan,

lingkungan tempat tumbuh, waktu panen.

b. Variabel pengacau tidak terkendali. Umur tumbuhan.

C. Definisi Operasional

1. Simplisia adalah bahan tanaman yang belum mengalami pengolahan apapun

kecuali dinyatakan lain merupakan bahan yang telah dikeringkan.


30

2. Simplisia rumput mutiara yang dimaksud ialah serbuk simplisia dari herba

rumput mutiara (Hedyotis corymbosa (L.) Lamk) yang telah mengalami

pencucian, sortasi basah, pengeringan selama 5 hari pada suhu 60oC, sortasi

kering, penyerbukan, dan pengayakan dengan ayakan no. mesh 12 dan 50.

3. Digesti adalah suatu metode ekstraksi dengan cara merendam dan mengaduk

dengan stirrer simplisia rumput mutiara dalam cairan penyari etanol 96% dan

perbandingan simplisia dan cairan penyari (1:10), dengan menggunakan

variasi suhu dan waktu ekstraksi.

4. Ekstrak yang dimaksudkan dalam penelitian ini adalah ekstrak kering yang

diperoleh dari digesti simplisia rumput mutiara yang sebelumnya telah

didefatisasi dengan petroleum eter (40o-60oC), yang telah disaring dengan

kertas saring dan dibantu dengan vacuum, serta diuapkan cairan penyarinya,

pertama-tama dengan waterbath hingga kental lalu dilanjutkan dengan oven

hingga bobot tetap.

5. Cairan penyari yang digunakan dalam penelitian ini adalah etanol 96%.

6. Faktor adalah besaran yang mempengaruhi respon, dalam penelitian ini

digunakan 2 faktor, yaitu suhu dan waktu ekstraksi.

7. Level yang dimaksud adalah nilai dari faktor. Terdiri dari level rendah dan

level tinggi. Level rendah suhu digesti adalah 30oC dan level rendah waktu

digesti adalah 2 jam. Level tinggi suhu digesti adalah 60oC dan level tinggi

waktu digesti adalah 4 jam.


31

8. Respon adalah besaran yang akan diamati perubahan efeknya. Dalam

penelitian ini respon yang diamati adalah kadar triterpen total dalam ekstrak

yang ditentukan secara KLT-Densitometri.

D. Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah herba rumput

mutiara yang dikumpulkan dari lingkungan Kampus III Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta pada bulan Juni - Agustus 2011, baku asam ursolat (Sigma-

Aldrich, No. Lot BCBD0299V, kemurnian 99,0 %), etanol 96% teknis (Brataco

Chemica), metanol p.a. (E. Merck), toluen p.a. (E. Merck), aseton p.a. (E. Merck),

asam asetat glasial p.a. (E. Merck), petroleum eter p.a. (E.Merck, b.p. 40-60oC),

asam sulfat p.a. (E. Merck), plat KLT silika gel 60 F254 (E. Merck).

E. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat

KLT-Densitometri (Camag TLC Scanner 3 CAT. No. 027.6485 SER. No.

160602), autosampler (Linomat 5 No. 170610), mikropipet Scorex, lemari

pengering, blender, ayakan dengan no. mesh 12 dan 50 (Retsch), neraca analitik

(Mettler Toledo AB204), termometer, waterbath (Gerhardt), hotplate magnetic

stirrer (Cenco Instrumenten b.v.), vacuum, oven (Marius Instrumenten), dan alat-

alat gelas.


32

F. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi rumput mutiara

Determinasi tumbuhan rumput mutiara dilakukan dengan mencocokan

ciri-ciri tumbuhan dengan kunci determinasi menurut Backer dan van Der Brink

(1965).

2. Pembuatan simplisia rumput mutiara

a. Pengumpulan bahan. Rumput mutiara dikumpulkan dari lingkungan

sekitar Kampus III Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada bulan Juni –

Agustus 2011.

b. Sortasi Basah. Sortasi basah dilakukan dengan cara dipisahkan dari benda-

benda asing seperti bagian tumbuhan yang tidak diinginkan (akar, ranting kering,

dan daun kering) dan juga dari pengotor lain yang masih tertinggal.

c. Pencucian. Pencucian dilakukan dengan air mengalir hingga bersih.

d. Pengeringan. Pengeringan awal dilakukan dengan mengangin-anginkan

hingga tidak ada lagi air sisa pencucian di permukaan tanaman. Pengeringan

dilanjutkan dalam lemari pengering dengan suhu 60oC selama 5 hari.

e. Pembuatan serbuk. Pembuatan serbuk dilakukan dengan menggunakan

blender lalu diayak dengan ayakan no. mesh 12-50.

3. Pembuatan ekstrak rumput mutiara

a. Defatisasi serbuk simplisia. Serbuk simplisia dipisahkan dari senyawa-

senyawa non polar menggunakan pelarut petroleum eter dengan maserasi selama

1 jam, dengan perbandingan serbuk-penyari 1:10 dan kecepatan pengadukan 250

rpm. Residu sampel disaring menggunakan kertas saring dengan bantuan vaccum,


33

kemudian dioven pada suhu 60oC untuk menguapkan petroleum eter. Residu

sampel kering siap diekstraksi.

b. Optimasi kondisi pembuatan ekstrak rumput mutiara. Sebanyak 5 gram

serbuk simplisia yang telah didefatisasi dimasukkan masing-masing ke dalam 4

Erlenmeyer bertutup. Etanol 96% dengan volume 50 mL ditambahkan ke dalam

masing-masing Erlenmeyer.

Tabel II. Perbandingan suhu dan waktu digesti Suhu (oC) Waktu (jam)

30 2 60 2 30 4 60 4

Digesti dilakukan di atas waterbath yang diletakkan di atas hotplate

magnetic stirrer dan dilakukan 3 kali replikasi. Kecepatan putaran stirrer diatur

250 rpm. Hasil digesti disaring dengan bantuan vacuum, lalu dimasukkan ke

dalam labu ukur 50 mL. Etanol 96% ditambahkan ke dalam labu ukur 50 mL

hingga tanda batas. Sebanyak 5 mL filtrat diuapkan di atas waterbath (suhu 70oC)

hingga didapatkan ekstrak kental. Penguapan dilanjutkan di dalam oven dengan

suhu 80oC hingga bobot tetap.

4. Penetapan kandungan triterpen total

a. Pembuatan fase gerak. Dibuat campuran toluen – aseton – asam asetat

(90:10:0,07 v/v).

b. Pembuatan pelarut. Dibuat campuran metanol dan kloroform dengan

perbandingan 4:1.

c. Pembuatan reagen deteksi. Dibuat H2SO4 10% dalam etanol.


34

d. Pembuatan larutan baku asam ursolat

1) Pembuatan larutan stok asam ursolat 1000 ppm

Sejumlah lebih kurang 10,0 mg baku asam ursolat ditimbang seksama

kemudian dilarutkan dalam pelarut hingga volume tepat 10,0 mL.

2) Pembuatan larutan baku asam ursolat

Sebanyak 0,500 mL; 1,000 mL; 1,500 mL; 2,000 mL; dan 2,500 mL;

larutan stok asam ursolat diambil dan dimasukkan ke dalam labu ukur 5

mL kemudian diencerkan dengan pelarut hingga tanda, sehingga diperoleh

konsentrasi 100 ppm, 200 ppm, 300 ppm, 400 ppm, dan 500 ppm.

e. Penetapan panjang gelombang serapan maksimum. Seri larutan baku

konsentrasi 100 ppm, 300 ppm, dan 500 ppm masing-masing ditotolkan dengan

volume penotolan 2 µL pada plat KLT dengan fase diam silika gel 60 F254 dan

setelah kering dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi

dengan fase gerak. Setelah mencapai jarak rambat 10 cm, plat dikeluarkan dari

bejana dan dikeringkan. Pengembangan dengan cara yang sama dilakukan

sebanyak 3 kali. Selanjutnya, bercak ditampakkan dengan menggunakan reagen

pendeteksi yang dilanjutkan dengan pemanasan dalam oven suhu 110oC selama 3

menit. Plat KLT discanning panjang gelombang serapan maksimumnya dengan

densitometer.

f. Pembuatan kurva baku, pengamatan nilai Retardation Factor (Rf) asam

ursolat, dan penentuan linearitas. Seri larutan baku konsentrasi 100 ppm, 200

ppm, 300 ppm, 400 ppm, dan 500 ppm, diperlakukan seperti poin 4e. Plat KLT

kemudian diukur AUC dan tinggi peaknya dengan densitometer. Replikasi


35

dilakukan sebanyak 3 kali dan pilih persamaan kurva baku yang paling baik.

Selain itu dilihat pula nilai Rf dari masing-masing seri baku asam ursolat dan

linearitas metode (dilihat dari harga r (koefisien korelasi) hasil pengukuran seri

baku asam ursolat).

g. Penentuan recovery, resolusi, Coefficient of Variations (CV), dan range.

Seri larutan baku konsentrasi 100 ppm, 300 ppm, dan 500 ppm diberi perlakuan

seperti pada poin 4.e. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. Selanjutnya kadar

terukur dihitung dengan menggunakan persamaan kurva baku. Berdasarkan data

ini dapat ditentukan:

1) Perhitungan recovery

% 푟푒푐표푣푒푟푦 = kadar terukur

kadar sebenarnya× 100%

2) Perhitungan resolusi

Resolusi = 2 (R − R )

w + w

3) Perhitungan CV

% CV = simpangan baku harga rata− rata

× 100%

4) Penentuan range. Range merupakan interval konsentrasi analit yang

memenuhi persyaratan linearitas, akurasi, dan presisi.

h. Penentuan recovery dan Coefficient of Variations (CV) baku dalam

matriks sampel.

1) Preparasi larutan sampel (LS). Ekstrak kering dilarutkan dengan pelarut

hingga 10 mL. Kemudian 3,5 mL larutan tadi diambil dan dimasukkan ke

dalam labu ukur 5 mL dan ditambah pelarut hingga tanda.


36

2) Pembuatan larutan sampel dengan adisi (LSAU). Sebanyak 3,5 mL larutan

sampel (LS) diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 5 mL. Larutan

tersebut ditambah dengan 0,5 mL larutan stok asam ursolat 1000 ppm dan

diencerkan dengan pelarut hingga tanda sehingga diperoleh kadar ± 375

ppm.

3) Pengembangan dan pengukuran. LS dan LSAU diberi perlakuan seperti pada

poin e.4. Setelah itu dihitung kadar baku asam ursolat dalam sampel. Kadar

baku asam ursolat dalam sampel adalah selisih kadar LSAU dengan kadar LS.

Selanjutnya dihitung recovery dan CVnya.

% recovery = 푘푎푑푎푟 (푏푎푘푢+푠푎푚푝푒푙 푡푒푟푢푘푢푟) − 푘푎푑푎푟 푠푎푚푝푒푙 푡푒푟푢푘푢푟푘푎푑푎푟 푏푎푘푢 푡푒표푟푖푡푖푠 x 100%

i. Analisis kualitatif. Ekstrak kering dilarutkan menggunakan pelarut

kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan ditambahkan pelarut hingga

tanda batas. Larutan ekstrak bersama baku asam ursolat (300 ppm), diperlakukan

seperti poin 4e. Setelah proses derivatisasi tersebut, bercak diamati di bawah

cahaya biasa. Analisis kualitatif juga dilakukan dengan cara menghitung Rf tiap

bercak dibandingkan dengan harga Rf baku asam ursolat serta membandingkan

pola spektra bercak yang memiliki Rf identik dengan baku dengan pola spektra

baku.

j. Analisis Kuantitatif. Ekstrak kering dilarutkan menggunakan pelarut

kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan ditambahkan pelarut hingga

tanda batas. Larutan ekstrak diperlakukan seperti poin 4e. Plat KLT diukur AUC

dan tinggi peaknya dengan densitometer. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.


37

5. Analisis hasil

Kadar triterpen total (% b/b) dalam sampel dari setiap kondisi dan setiap

replikasi yang didapat, kemudian dianalisis dengan menggunakan aplikasi desain

faktorial menggunakan software Ubuntu-10.04-DesFaktor-0.9® by Ubuntu R

OpenOffice.org (www.molmod.org). Pendekatan desain faktorial yang digunakan

untuk menghitung koefisien a, b, ab, sehingga didapatkan persamaan Y = b0 +

b1(XA) + (b2(XB) + b12(XA)(XB). Dari persamaan ini dapat dibuat suatu profil yang

menggambarkan profil kadar triterpen total (% b/b) dari hasil digesti herba rumput

mutiara dengan adanya perbedaan kondisi perlakuan antara suhu dan waktu

ekstraksi yang digunakan. Hasil profil yang diperoleh berdasarkan rumus

digunakan untuk menentukan kombinasi antara suhu dan waktu ekstraksi yang

menghasilkan kadar triterpen total (% b/b) yang paling optimum. Penentuan

signifikansi faktor dilakukan dengan uji ANOVA dengan taraf kepercayaan 95%.


38

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman dilakukan untuk mendapatkan kepastian kebenaran

tanaman yang diselidiki sesuai dengan yang dimaksud dalam penelitian.

Determinasi dilakukan oleh Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas

Farmasi, Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, dengan mencocokkan ciri-ciri

tanaman dengan kunci determinasi yang ada dalam buku Flora of Java (Backer

and van Der Brink, 1965). Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang

digunakan dalam penelitian ini adalah Hedyotis corymbosa (L.) Lamk (Lampiran

1).

B. Pengumpulan Bahan dan Pembuatan Serbuk Simplisia

1. Pengumpulan bahan

Herba rumput mutiara yang digunakan dalam penelitian ini diambil dari area

Kampus III Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada bulan Juni - Agustus

2011. Tanaman ini belum dibudidayakan sehingga faktor umur tanaman tidak

dapat dikendalikan. Dalam penelitian ini, faktor yang dikendalikan adalah waktu

panen, lingkungan tempat tumbuh dan varietas tanaman.

Waktu panen sangat erat hubungannya dengan pembentukan senyawa aktif

di dalam bagian tanaman yang akan dipanen. Waktu panen yang tepat adalah pada

saat bagian tanaman tersebut mengandung senyawa aktif dalam jumlah yang

terbesar (Depkes RI, 1985). Pemanenan herba rumput mutiara dilakukan dengan


39

tangan pada pagi hari sebab pada waktu tersebut tanaman melakukan fotosintesis

dengan bantuan sinar matahari, sehingga kandungan zat aktif herba rumput

mutiara yang diperoleh diharapkan optimal. Herba yang dipilih ialah herba dengan

kondisi yang baik. Pemanenan dilakukan pada bulan Juni – Agustus 2011 sebab

bulan-bulan tersebut merupakan penghujung musim hujan, dimana menurut Anam

(2008), ketersediaan air memberikan pengaruh nyata pada pertumbuhan rumput

mutiara serta meningkatkan jumlah kandungan asam ursolat pada tanaman ini.

Lingkungan tempat tumbuh yang berbeda dapat mengakibatkan perbedaan

kadar kandungan senyawa aktif. Pertumbuhan tanaman dipengaruhi tinggi tempat,

keadaan tanah, dan cuaca (Depkes RI, 1986). Lingkungan tempat tumbuh

dikendalikan dengan cara hanya memanen rumput mutiara yang tumbuh di area

Kampus III Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Hasil panen dari beberapa

lokasi di area Kampus III Universitas Sanata Dharma Yogyakarta sepanjang bulan

Juni – Agustus 2011 dikumpulkan dan dihomogenkan untuk memperkecil

pengaruh lingkungan tempat tumbuh dan umur tanaman.

Rumput mutiara secara kasat mata cukup sulit untuk dibedakan dengan

tanaman lidah ular (Hedyotis diffusa (Willd.) Roxb) yang juga merupakan

tanaman dalam genus Hedyotis. Salah satu perbedaan antara kedua tanaman ini

ialah jumlah bunga per tangkai bunga. Rumput mutiara memiliki jumlah bunga

lebih dari satu pada tiap tangkai bunganya, sedangkan tanaman lidah ular hanya

memiliki satu bunga di setiap tangkai bunganya. Pada saat pemanenan, hal ini

sangat penting untuk diperhatikan sehingga tanaman yang diambil benar-benar

rumput mutiara dan faktor varietas tanaman dapat dikendalikan.


40

2. Sortasi basah

Tujuan sortasi basah ialah untuk memisahkan kotoran-kotoran atau bahan-

bahan asing lainnya dari bahan simplisia. Pada tahap sortasi basah ini, herba

rumput mutiara yang telah dikumpulkan, dibersihkan dari tanah, akar, serta

ranting dan daun yang sudah rusak. Tanah merupakan pengotor dengan

kandungan mikroba yang tinggi, sehingga tanah perlu dihilangkan untuk

mengurangi jumlah mikroba awal (Depkes RI, 1986). Akar juga dihilangkan

untuk mengurangi jumlah tanah dan dengan demikian dapat mengurangi jumlah

mikroba awal.

3. Pencucian

Pencucian dilakukan untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang masih

menempel. Pencucian dilakukan dengan air bersih, misalnya air dari mata air, air

sumur, atau air PAM (Depkes RI, 1986). Dalam penelitian ini, pencucian herba

rumput mutiara dilakukan menggunakan air PAM yang dialirkan terus-menerus

agar kotoran yang sudah terlepas dari herba dapat terbawa air. Pencucian

dilakukan sedikit demi sedikit sehingga herba benar-benar bersih. Herba yang

sudah dicuci kemudian diangin-anginkan agar sisa air pencucian hilang.

4. Pengeringan

Herba rumput mutiara yang telah dicuci kemudian dikeringkan. Pengeringan

dapat mengurangi kadar air sehingga menghambat reaksi enzimatik. Adanya

reaksi enzimatik dapat menyebabkan peruraian kandungan aktif aktif yang

berakibat pada penurunan kualitas simplisia. Air yang masih tersisa juga dapat

menjadi media bagi pertumbuhan kapang dan mikroba sehingga dengan adanya


41

proses pengeringan pertumbuhan kapang dan mikroba dapat dihambat dan

akibatnya simplisia tidak mudah rusak dan dapat disimpan dalam waktu yang

lebih lama.

Pengeringan dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain: suhu

pengeringan, kelembaban udara, aliran udara, waktu pengeringan, dan luas

permukaan bahan. Dalam penelitian ini, pengeringan dilakukan dengan

menggunakan lemari pengering sehingga faktor-faktor tersebut dapat dikontrol.

Menurut Depkes RI (1986), bahan simplisia dapat dikeringkan pada suhu 30-

90oC, tetapi suhu yang terbaik adalah tidak melebihi 60oC, oleh karena itu suhu

pengeringan yang digunakan ialah 60oC. Bila suhu pengeringan terlalu tinggi

dapat mengakibatkan rusak atau hilangnya kandungan zat aktif dalam simplisia,

terutama zat aktif yang tidak tahan panas dan yang mudah menguap. Pengeringan

dilakukan hingga herba benar-benar kering dimana herba yang kering akan dapat

dipatahkan dan gemerisik jika diremas. Pengeringan membutuhkan waktu ± 5 hari

untuk mendapatkan herba yang benar-benar kering.

Pengeringan dapat dilakukan dengan cara lain, yaitu dengan menggunakan

sinar matahari, namun hal ini tidak dilakukan sebab faktor suhu, kelembaban

udara, aliran udara, dan waktu pengeringan sulit untuk dikendalikan.

5. Sortasi kering

Sortasi kering dilakukan untuk memisahkan benda-benda asing seperti

bagian-bagian tanaman yang tidak diinginkan dan pengotor-pengotor lain yang

masih ada dan tertinggal pada herba kering sehingga diperoleh herba rumput

mutiara tanpa kontaminan. Dalam tahap ini, pengotor lain yang mungkin


42

tertinggal dipisahkan kembali seperti akar maupun bagian simplisia lain yang

mungkin tercampur.

6. Pembuatan serbuk

Herba rumput mutiara yang telah kering diserbuk menggunakan blender.

Simplisia disiapkan dalam bentuk serbuk untuk memperbesar luas permukaan

kontak antara simplisia dengan larutan penyari, sehingga senyawa aktif yang

terambil semakin banyak. Serbuk diayak dengan ayakan no. mesh 12 dan 50

untuk memperkecil distribusi ukuran partikel. Pada umumnya ekstraksi akan

semakin baik bila luas permukaan simplisia yang bersentuhan dengan larutan

penyari semakin besar. Bila ukuran partikel terlalu besar, maka kontak dengan

cairan penyari tidak optimal, namun ukuran partikel yang terlalu kecil pun tidak

menjamin suatu proses ekstraksi akan semakin baik. Terdapat batas minimum

ukuran serbuk yang diperbolehkan sebab serbuk yang terlalu halus akan

menimbulkan masalah dalam proses ekstraksi. Serbuk yang terlalu halus dapat

membentuk suspensi yang sulit dipisahkan dengan hasil ekstraksi. Hasil ekstraksi

tidak murni lagi tetapi tercampur dengan partikel-partikel halus tadi. Penyerbukan

yang terlalu halus menyebabkan banyak dinding sel yang pecah, sehingga zat

yang tidak diinginkan pun ikut ke dalam hasil ekstraksi (Depkes RI, 1986).

Menurut Depkes RI (1977), kecuali dinyatakan lain, seluruh simplisia harus

dihaluskan menjadi serbuk dengan derajat halus 4/18. Derajat halus dinyatakan

dengan nomor pengayak, yang dinyatakan dengan dua nomor. Pengertian nomor

pengayak 4/18 (cm) ialah semua serbuk dapat melewati pengayak dengan nomor 4

dan tidak lebih dari 40% melewati pengayak dengan nomor 18. Penentuan jenis


43

ayakan, yang dinyatakan dengan nomor mesh, dilakukan melalui konversi angka

derajat halus yaitu mengalikan 4/18 dengan 2,54 (1 inchi). Hasil konversi

menunjukkan nomor mesh yang digunakan adalah 10 dan 45, namun karena

keterbatasan alat maka digunakan pengayak dengan nomor mesh 12 dan 50.

C. Defatisasi

Setelah diperoleh serbuk herba rumput mutiara dengan ukuran partikel

yang diinginkan, maka selanjutnya dilakukan proses defatisasi. Prinsip dari

defatisasi sebenarnya sama dengan proses ekstraksi, namun bila pada ekstraksi

yang diambil adalah larutan ekstraknya dan serbuk sisa ekstraksi dibuang, namun

pada defatisasi yang diambil adalah serbuk hasil defatisasi dan larutan defatnya

dibuang.

Defatisasi bertujuan untuk menghilangkan senyawa-senyawa non polar

yang terdapat pada simplisia, oleh karena itu pelarut yang digunakan adalah

pelarut yang dapat melarutkan senyawa-senyawa non polar tersebut. Pelarut yang

digunakan untuk proses defatisasi adalah petroleum eter. Asam ursolat tidak larut

dalam petroleum eter (Budavari et al., 1989), oleh karena itu proses defatisasi ini

tidak akan menghilangkan kandungan asam ursolat dalam simplisia, namun akan

menghilangkan senyawa-senyawa non polar pada herba rumput mutiara, antara

lain: klorofil, stigmasterol, dan β-sitosterol (Wijayakesuma, 1992). Senyawa-

senyawa non polar ini perlu untuk dihilangkan agar nantinya tidak mengganggu

perhitungan kadar triterpen total karena ekstraksi dengan cairan penyari (etanol

96%) juga dapat melarutkan senyawa-senyawa lipid (Depkes RI, 1986). Proses

defatisasi ini juga tidak menghilangkan senyawa isomer asam ursolat yaitu asam


44

oleanolat sebab asam oleanolat juga tidak larut dalam petroleum eter, sehingga

dalam penelitian ini yang akan ditetapkan adalah kadar triterpen total terhitung

sebagai kadar asam ursolat.

Pelarut lain yang dapat digunakan dalam proses defatisasi adalah heksan,

namun tidak digunakan heksan sebab kelarutan asam ursolat dalam heksan tidak

diketahui sedangkan kelarutan senyawa tersebut dalam petroleum eter telah

diketahui yaitu tidak larut, sehingga lebih dipilih petroleum eter sebagai larutan

defat.

Defatisasi dilakukan dengan metode maserasi karena cara pengerjaan dan

peralatan yang digunakan sederhana. Defatisasi dilakukan selama 1 jam pada suhu

kamar dengan perbandingan serbuk dan volume larutan penyari adalah 1:10.

Perbandingan ini digunakan sebab merupakan perbandingan standar yang

digunakan pada maserasi, dimana 10 bagian larutan penyari digunakan untuk 1

bagian serbuk. Petroleum eter bersifat mudah menguap sehingga digunakan suhu

kamar saat proses defatisasi untuk mencegah hilangnya petroleum eter.

Hasil defatisasi disaring dengan bantuan vaccum untuk mempercepat

proses penyaringan. Serbuk yang tersaring dikeringkan dengan menggunakan

oven pada suhu 60oC karena titik didih petroleum eter adalah 40o-60oC sehingga

dengan menggunakan suhu tersebut petroleum eter dapat seluruhnya menguap.

Serbuk perlu dikeringkan agar pada saat ditimbang untuk ekstraksi yang terukur

benar-benar massa dari serbuk herba rumput mutiara kering tanpa sisa larutan

defat. Pengeringan juga bertujuan agar petroleum eter tidak mengganggu proses


45

ekstraksi dengan pelarut etanol 96% karena secara teori etanol juga dapat

mengekstraksi senyawa non polar (Depkes RI, 1986).

D. Digesti

Digesti merupakan salah satu metode ekstraksi yang dilakukan dengan

cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari menggunakan pemanasan

lemah. Metode ini adalah hasil modifikasi metode maserasi dengan adanya

pengadukan dan pemanasan. Metode digesti dipilih sebab senyawa aktif yang

ingin diekstraksi dari herba rumput mutiara yaitu asam ursolat merupakan

kandungan utama dari herba ini. Jumlahnya yang banyak menyebabkan asam

ursolat pada rumput mutiara dapat diekstraksi secara digesti. Metode ini juga

memiliki beberapa keunggulan lain yaitu cara pengerjaan dan peralatan yang

digunakan sederhana.

Prinsip metode digesti sama seperti maserasi yaitu terekstraksinya senyawa

dari dalam simplisia karena adanya perbedaan konsentrasi senyawa di dalam dan

di luar sel. Pelarut akan masuk ke dalam sel-sel simplisia dan karena adanya

perbedaan konsentrasi tadi maka senyawa kimia akan tersari keluar dari dalam sel.

Pemanasan akan memberikan energi bagi cairan penyari untuk melarutkan

senyawa dari simplisia. Pada peningkatan suhu kekentalan pelarut akan berkurang

sehingga akan mengurangi lapisan batas. Selain itu, kelarutan zat akan meningkat

apabila suhu dinaikkan (Depkes, 1986). Menurut Masushita (1979) ekstraksi

dengan menggunakan pemanasan dapat dilakukan 1 sampai 2 jam atau lebih.

Digesti dilakukan terhadap 5 gram serbuk dengan volume cairan penyari

sama untuk setiap kondisi yaitu sebanyak 50 mL. Alasan pemilihan perbandingan


46

serbuk – volume larutan penyari 1:10 karena perbandingan tersebut merupakan

perbandingan standar pada proses maserasi. Cairan penyari yang digunakan

adalah etanol 96% sebab asam ursolat dapat larut dalam etanol. Menurut Budavari

et al. (1989) 1 bagian asam ursolat larut dalam 178 bagian etanol.

Proses digesti dilakukan dengan bantuan pengadukan secara otomatis

dengan stirrer. Pengadukan ini bertujuan untuk menjaga derajat perbedaan

konsentrasi yang sebesar-besarnya antara larutan di dalam dan di luar sel. Pada

keadaan diam akan terjadinya kesetimbangan perpindahan massa dari sel ke

dalam pelarut dan dari pelarut ke dalam sel. Keadaan ini dapat dihindari dengan

melakukan pengadukan atau dengan pemanasan (Stahl, 1985). Kecepatan

pengadukan yang digunakan adalah 250 rpm berdasarkan hasil optimasi.

Digesti dilakukan dengan variasi kondisi ekstraksi sebanyak 4 macam.

Faktor yang divariasi adalah suhu dan waktu ekstraksi dimana akan dilihat

pengaruhnya terhadap perolehan asam ursolat dengan analisis desain faktorial.

Setiap kondisi dilakukan 3 kali replikasi. Suhu yang digunakan untuk level rendah

adalah 30oC dan untuk level tinggi adalah 60oC. Proses maserasi biasanya

dilakukan pada suhu kamar namun suhu kamar relatif tidak tetap. Dalam

penelitian ini suhu ekstraksi merupakan faktor yang diteliti oleh karena itu suhu

kamar diatur sama pada suhu 30oC. Pengaturan suhu ini memerlukan pemanasan

lemah sehingga sudah termasuk dalam proses digesti. Suhu 60oC dipilih sebagai

suhu level tinggi berdasarkan hasil orientasi. Asam ursolat merupakan senyawa

yang tahan terhadap suhu tinggi (titik lebur asam ursolat 285o-288oC), namun

hasil orientasi menunjukkan suhu di atas suhu 60oC dapat menyebabkan rusaknya


47

hasil ekstraksi dan kesulitan pada saat proses penyaringan karena hasil ekstraksi

berbentuk seperti bubur. Dinding sel tumbuhan terdiri dari selulosa. Serabut

selulosa pada simplisia segar dikelilingi oleh air, namun pada simplisia yang

dikeringkan lapisan air menguap sehingga terjadi pengerutan dan terbentuk pori-

pori. Pori-pori ini diisi oleh udara. Bila serbuk simplisia dibasahi dengan cairan

penyari, maka serabut selulosa tadi akan dikelilingi oleh cairan penyari sehingga

simplisia akan mengembang kembali. Mengembangnya sel ini akan makin besar

jika penyari yang digunakan mengandung gugusan –OH. Adanya peningkatan

suhu dapat memperbesar kemungkinan terjadinya interaksi antara selulosa dengan

gugusan –OH. Hal inilah yang menyebabkan hasil ekstraksi memiliki konsistensi

seperti bubur.

Waktu yang digunakan sebagai level rendah adalah 2 jam dan sebagai

level tinggi adalah 4 jam. Pemilihan waktu ini juga merupakan hasil optimasi.

Menurut Depkes RI (1986), penggunaan mesin pengaduk yang berputar terus-

menerus dapat mempersingkat waktu proses digesti menjadi 6 sampai 24 jam.

Orientasi waktu dilakukan pada waktu 1, 2, 4, 6, dan 8 jam dengan mengukur

rendemen ekstrak yang diperoleh. Terjadi peningkatan rendemen ekstrak sampai

waktu 4 jam namun tidak lagi terjadi peningkatan setelah waktu tersebut. Oleh

karena itu, waktu ini dipilih sebagai waktu level tinggi sedangkan waktu 2 jam

dipilih untuk melihat apakah asam ursolat sudah dapat terekstrak seluruhnya

dengan waktu setengah dari level tinggi. Bila dalam waktu 2 jam seluruh asam

ursolat sudah dapat tersari maka dalam aplikasinya nanti waktu ekstraksi dapat

dihemat.


48

Gambar 3. Grafik orientasi waktu ekstraksi

Sistem digesti menggunakan waterbath dan hotplate magnetic stirrer

untuk mempermudah pengontrolan suhu dan kecepatan pengadukan. Suhu

waterbath diatur 5oC lebih tinggi dari suhu percobaan sebab pada saat orientasi

diketahui bahwa terdapat selisih suhu air pada waterbath dengan suhu di dalam

Erlenmeyer yang berisi serbuk simplisia dan larutan penyari. Suhu di dalam

Erlenmeyer lebih rendah 5oC dari pada suhu air waterbath. Pemanasan tidak

dilakukan langsung di atas hotplate melainkan dengan menggunakan waterbath

sebab bila hanya dengan hotplate pemanasan yang diberikan tidak merata. Pada

sistem ini, Erlenmeyer juga ditutup dengan rapat dengan menggunakan plastik

untuk mencegah berkurangnya volume etanol untuk mengekstraksi. Selain dengan

cara tersebut, hilangnya cairan penyari juga dapat dicegah dengan penggunaan

kondensator. Dalam penelitian ini tidak digunakan kondensator karena dengan

kondensator masih dimungkinkan adanya uap cairan penyari yang hilang.

Orientasi yang dilakukan menunjukkan bahwa penggunaan plastik dapat

mencegah hilangnya etanol karena penguapan.

Hasil proses digesti selanjutnya disaring dengan bantuan vaccum untuk

mendapatkan ekstrak etanol cair. Penggunaan vaccum dapat mempercepat proses

0.00

0.10

0.20

0.30

0 5 10

Ren

dem

enek

stra

k(g

)

Waktu (Jam)

Grafik Orientasi Waktu Ekstraksi


49

penyaringan karena vaccum akan menarik udara dalam ruang penampung cairan

sehingga tekanan dalam ruang penampung akan berkurang dan cairan akan

mengalir dengan mudah. Filtrat kemudian dipindahkan ke dalam labu ukur 50 mL

dan ditambah dengan cairan penyari hingga tanda batas sehingga volumenya sama

seperti volume cairan penyari awal. Hal ini perlu dilakukan untuk kepentingan

analisis kuantitatif kadar asam ursolat dalam herba rumput mutiara.

Gambar 4. Sistem digesti

E. Pengeringan Ekstrak Rumput Mutiara

Pengeringan ekstrak cair sebanyak 5 mL untuk setiap perlakuan dilakukan

menggunakan waterbath dengan bantuan kipas angin dan dilanjutkan dengan

menggunakan oven hingga bobot tetap. Suhu waterbath diatur pada 70oC. Suhu

tidak akan merusak ekstrak sebab tidak terdapat lagi serbuk simplisia yang akan

menjadi bubur. Asam ursolat sendiri merupakan senyawa yang tahan terhadap

suhu tinggi. Titik lebur senyawa ini adalah 285o-288oC (Budavari et al., 1989).

Kipas angin membantu mengurangi tekanan di permukaan cairan ekstrak sehingga

mempercepat proses penguapan cairan penyari.


50

Gambar 5. Ekstrak kering

Ekstrak diuapkan di dalam botol timbang sebab ekstrak kering nantinya

bersifat higroskopis, sangat mudah menyerap lembab sehingga mempengaruhi

bobot ekstrak. Dengan menggunakan botol timbang, kontak antara ekstrak dengan

udara akan berkurang karena botol timbang dilengkapi dengan tutup.

Penyimpanan ekstrak juga menggunakan wadah yang dilengkapi silika gel untuk

tujuan yang sama. Dalam penelitian ini diharapkan bobot ekstrak kering tidak

berubah-ubah sebab diperlukan data untuk perhitungan rendemen ekstrak dan

penimbangan bobot tetap.

Proses pengeringan dengan waterbath akan menghasilkan ekstrak kental.

Pengeringan dilanjutkan dengan menggunakan oven pada suhu 80oC. Suhu ini

digunakan sebab berada di atas titik didih etanol yaitu 78,5oC sehingga etanol

dapat menguap seluruhnya (Depkes RI, 1995). Pengeringan dilanjutkan dengan

oven untuk memaksimalkan proses pengeringan sehingga didapatkan ekstrak

kering. Ekstrak kering yang diperoleh lalu ditimbang untuk mendapatkan nilai

rendemen ekstrak. Ekstrak kering ini yang kemudian digunakan untuk

menetapkan kandungan asam ursolat.

Hasil percobaan menunjukkan digesti dengan suhu dan waktu level tinggi

(60oC, 4 jam) memberikan rendemen ekstrak terbesar sedangkan digesti dengan

suhu dan waktu level rendah (30oC, 2 jam) memberikan rendemen ekstrak yang


51

terkecil. Nilai rendemen ekstrak untuk tiap simplisia memang tidak diketahui

secara pasti, namun hasil ini mendukung teori bahwa semakin tinggi suhu dan

semakin lama waktu ekstraksi perolehan senyawa aktif semakin banyak pula (Xia

et al., 2011; Banik and Pandey, 2008).

Tabel III. Rendemen ekstrak

Perlakuan % rendemen ekstrak kering

Rata-rata % rendemen ekstrak

kering

1 Replikasi 1 4,720

4,873 Replikasi 2 4,560 Replikasi 3 5,340

a Replikasi 1 7,261


b Replikasi 1 5,260


ab Replikasi 1 7,160


Keterangan : 1 = perlakuan suhu dan waktu level rendah (30oC, 2 jam) a = perlakuan suhu level tinggi dan waktu level rendah (60oC, 2 jam) b = perlakuan suhu level rendah dan waktu level tinggi (30oC, 4 jam) ab = perlakuan suhu dan waktu level tinggi (60oC, 4 jam)

Rendemen ekstrak merupakan salah satu parameter kualitas ekstrak.

Dalam penelitian ini, rendemen ekstrak tidak dijadikan sebagai variabel

tergantung sebab yang menjadi sasaran adalah senyawa asam ursolat sehingga

yang menjadi variabel tergantung adalah kadar senyawa aktif. Rendemen ekstrak

perlu diperhatikan apabila tidak ada senyawa tertentu yang ingin dituju. Dengan

kata lain, rendemen ekstrak memberikan gambaran kualitas ekstrak yang lebih

umum dibandingkan kadar senyawa aktif.


52

F. Analisis Kualitatif dengan KLT

Analisis kualitatif kandungan asam ursolat dilakukan dengan KLT-

Densitometri menggunakan fase diam silika gel 60 F254 dengan penyangga logam

dan fase gerak toluen – aseton – asam asetat (90:30:0,07) %. Metode KLT-

Densitometri dipilih sebab metode ini telah diketahui dapat digunakan untuk

pemisahan senyawa-senyawa triterpen (Harbone, 1987; Stahl, 1969). Metode ini

telah divalidasi dan dapat digunakan untuk penetapan kadar triterpen total. Selain

itu metode ini memiliki beberapa kelebihan seperti pemakaian pelarut dan

cuplikan yang jumlahnya sedikit, instrumennya sederhana, dan relatif tidak terlalu

mahal.

Analisis kualitatif perlu dilakukan untuk memastikan bahwa ekstrak yang

diperoleh mengandung asam ursolat. Analisis kualitatif dilakukan dengan melihat

warna bercak setelah diderivatisasi dengan reagen H2SO4 10% dalam etanol dan

dilanjutkan dengan pemanasan di dalam oven pada suhu 110oC selama 3 menit

(Wojciak-Kosior, 2007), serta membandingkan nilai Rf dan pola spektra serapan

bercak pada sampel dengan bercak baku asam ursolat.

Alasan pemilihan fase diam silika gel 60 F254 karena silika gel merupakan

fase diam yang dapat digunakan untuk memisahkan senyawa golongan terpen

(Stock and Rice, 1974). Penggunaan silika gel F254 tidak diharuskan sebab asam

ursolat tidak memiliki gugus kromofor, sehingga tidak dapat diamati di bawah

sinar UV. Namun penggunaan silika gel F254 dalam penelitian ini dimaksudkan

untuk pengamatan kerataan penyemprotan reagen pendeteksi untuk proses

derivatisasi. Silika gel F254 yang telah disemprot H2SO4 tidak berfluorosensi


53

sehingga dapat dijadikan indikator untuk melihat apakah reagen pendeteksi yang

disemprotkan sudah merata atau belum.

Pada penelitian ini digunakan penyangga logam dengan tujuan agar plat

KLT tahan terhadap pemanasan pada proses derivatisasi. Fase gerak yang

digunakan yaitu toluen – aseton – asam asetat (90:30:0,07) merupakan fase gerak

hasil optimasi. Menurut Stahl (1969) pemisahan senyawa triterpen khususnya

senyawa isomer dapat dilakukan dengan menggunakan menggunakan fase gerak

toluen – aseton – asam asetat dengan perbandingan 100:3:0,07 dimana akan

diperoleh nilai Rf untuk bercak asam ursolat sebesar 0,42. Hasil orientasi fase

gerak menunjukkan bahwa fase gerak dengan perbandingan tersebut

menghasilkan bercak asam ursolat yang bulat solid namun memiliki Rf di bawah

nilai 0,2. Nilai Rf ini tidak cukup untuk menjamin bahwa bercak telah terpisah

sempurna. Menurut Rohman (2009), fase gerak harus diatur daya elusinya

sedemikian rupa sehingga nilai Rf senyawa analit terletak antara 0,2-0,8 untuk

memaksimalkan pemisahan. Bila nilai Rf kurang dari 0,2 kemungkinan bercak

belum terpisah sempurna, sedangkan bila nilai Rf lebih dari 0,8 artinya bercak

sudah terelusi mendekati batas akhir elusi, dimana biasanya di batas akhir elusi

fase gerak ini bercak analit sulit diamati karena banyaknya pengotor yang

terkumpul di sana. Oleh karena itu dilakukan modifikasi komposisi fase gerak

tersebut dan diperoleh perbandingan 90:30:0,07 yang memberikan nilai Rf masuk

dalam rentang 0,2-0,8 dengan hasil pemisahan yang lebih baik. Fase gerak ini

relatif lebih non polar dibandingkan fase diam, oleh karena itu sistem KLT yang

digunakan adalah fase normal.


54

Plat KLT perlu diaktifkan terlebih dahulu sebelum digunakan. Pengaktifan

dilakukan dengan memanaskan plat di dalam oven pada suhu 110oC selama 1 jam.

Tujuan pengaktifan adalah untuk menghilangkan molekul air di permukaan silika.

Molekul air ini bersifat sangat polar dan membentuk ikatan hidrogen, oleh karena

itu molekul air perlu dihilangkan dengan pemanasan agar tidak mengganggu

proses pengelusian bercak, biasanya pengaktifan dilakukan pada suhu 100o-110oC

paling sedikit selama 1 jam (Gritter, 1985).

Plat KLT dielusi dalam bejana yang telah jenuh oleh fase gerak dengan

jarak elusi sepanjang 10 cm. Dengan jarak elusi ini maka senyawa asam ursolat

dalam sampel sudah dapat terelusi dan terpisah dengan baik. Penjenuhan bejana

perlu dilakukan untuk mempercepat proses elusi. Uap dalam bejana yang telah

jenuh akan memberikan hasil elusi yang lebih baik. Bila bejana tidak jenuh, maka

dapat terjadi edge effect, yaitu terjadinya perbedaan tinggi bercak untuk senyawa

yang sama, dimana bercak di bagian tepi plat biasanya lebih tinggi daripada

bercak di bagian tengah plat (Stahl, 1969). Hal ini dapat terjadi sebab uap fase

gerak lebih cepat terkonsentrasi pada daerah yang dekat dengan dinding bejana.

Oleh karena itu bejana harus dijenuhkan terlebih dahulu untuk menyamakan

konsentrasi uap fase gerak di seluruh bagian bejana. Elusi dilakukan berulang

sebanyak 3 kali untuk menghasilkan bercak yang tidak berekor dan untuk

meningkatkan nilai Rf bercak.

Bercak asam ursolat tidak berwarna sehingga perlu dilakukan derivatisasi

untuk menampakkan bercak. Bercak hasil derivatisasi akan berwarna ungu dengan

pengamatan visual. Pada hasil percobaan, diketahui bahwa pada sampel juga


55

terdapat bercak berwarna ungu sama seperti baku asam ursolat. Bercak antara

sampel dan baku kemudian dibandingkan harga Rf nya.

Gambar 6. Bercak baku asam ursolat dan ekstrak rumput mutiara yang telah diderivatisasi

Keterangan Fase diam : silika gel 60 F254 Fase gerak : toluen – aseton – asam asetat (90:10:0,07) Deteksi : disemprot H2SO4 10 % dalam etanol dilanjutkan pemanasan pada suhu 110oC selama 3 menit

a : baku asam ursolat 300 ppm replikasi 1 b : baku asam ursolat 300 ppm replikasi 2 c : baku asam ursolat 300 ppm replikasi 3 d : sampel ekstrak rumput mutiara replikasi 1 e : sampel ekstrak rumput mutiara replikasi 2 f : sampel ekstrak rumput mutiara replikasi 3 1. Pengamatan nilai Retardation Factor (Rf) asam ursolat

Pengamatan nilai Rf merupakan parameter analisis kualitatif yang nantinya

digunakan untuk mengetahui ada tidaknya analit dalam sampel. Harga Rf dihitung

dengan membandingkan jarak titik pusat bercak dari titik awal penotolan bercak

dengan jarak elusi fase gerak. Dalam penelitian ini, perhitungan nilai Rf dilakukan

secara otomatis oleh alat scanner densitometer dan diperoleh nilai Rf sampel dan

a b c d e f


56

baku yang identik (Tabel IV). Hal ini membuktikan bahwa dalam ekstrak

terkandung senyawa asam ursolat.

Gambar 7. Kromatogram baku asam ursolat 300 ppm (nilai Rf = 0,38)

Gambar 8. Kromatogram ekstrak rumput mutiara (nilai Rf = 0,38)

Tabel IV. Harga Rf masing-masing bercak dengan eluen toluen-aseton-asam asetat

(90:10:0,07) dan fase diam silika gel 60 F254 Baku Sampel

Bercak a b c d e f Rf 0,38 0,38 0,38 0,38 0,38 0,38

Warna bercak ungu ungu ungu ungu ungu ungu Nilai Rf asam ursolat dari sistem KLT ini dipengaruhi oleh interaksi asam

ursolat dengan fase gerak dan fase diam. Interaksi asam ursolat dengan fase diam

dan fase gerak dapat dilihat pada gambar 9 dan 10.


57

O

Si

O

Si

O

Si

O

Si

OO

OO

OO H

H

H

O

Si

OHO

O

OHO

O

H

O

O

H

H

H

Gambar 9. Interaksi asam ursolat dengan fase diam silika gel 60 F254 Keterangan : interaksi hidrogen

toluene

O

acetone

O

O acetic acidH

O

H

O

O

Hursolic acid

H

OO H

O

H

O

O

H

O

OO

HO

Gambar 10. Interaksi asam ursolat dengan fase gerak toluen-aseton-asam asetat (90:10:0,07)

Keterangan : interaksi hidrogen : interaksi van der Waals


58

Interaksi yang terjadi antara asam ursolat dengan fase gerak lebih dominan

dibandingkan interaksinya dengan fase diam. Interaksi yang terjadi antara asam

ursolat dengan fase diam tidak hanya interaksi hidrogen melainkan juga interaksi

van der Waals. Hal ini menyebabkan asam ursolat dapat terelusi oleh fase gerak.

Interaksi yang sesuai antara asam ursolat dengan fase diam dan fase gerak

menghasilkan nilai Rf yang baik yaitu antara 0,2-0,8.

2. Perbandingan pola spektra baku asam ursolat dengan sampel

Analisis kualitatif juga dilakukan dengan melihat kemiripan spektra

serapan bercak sampel dengan bercak baku asam ursolat. Pengukuran spektra ini

dilakukan sama seperti pengukuran panjang gelombang maksimal, dimana bercak

akan discan oleh densitometer pada panjang gelombang 200-700 nm. Adanya

kemiripan pola spektra antara bercak sampel dan bercak baku asam ursolat

menunjukkan bahwa bercak tersebut benar bercak asam ursolat.

Gambar 11. Perbandingan pola spektra ekstrak adisi dengan baku asam ursolat

Keterangan A : baku asam ursolat replikasi 1 B : baku asam ursolat replikasi 2 C : ekstrak replikasi 1 D : ekstrak replikasi 2 E : ekstrak replikasi 3


59

Hasil scan densitometer (gambar 11) menunjukkan kemiripan pola spektra

antara bercak adisi dengan bercak baku asam ursolat, sehingga dapat dipastikan

bahwa bercak tersebut benar merupakan bercak asam ursolat.

G. Analisis Kuantitatif dengan KLT-Densitometri

1. Penetapan panjang gelombang maksimum (λmaks)

Penetapan panjang gelombang maksimum bertujuan untuk menentukan

panjang gelombang yang akan digunakan dalam deteksi bercak asam ursolat oleh

densitometer. Pengukuran untuk mencari panjang gelombang maksimum

dilakukan dengan deteksi baku asam ursolat pada panjang gelombang 200-700 nm

yang termasuk panjang gelombang daerah ultraviolet (UV) hingga visibel. Secara

teori, panjang gelombang bercak asam ursolat hasil derivatisasi berada pada

daerah visibel karena bercak berwarna ungu.

Gambar 12. Pola spektra absorbsi seri baku asam ursolat pada panjang gelombang 200-700 nm

Keterangan A : spektra absorbsi baku asam ursolat 100 ppm (seri rendah) B : spektra absorbsi baku asam ursolat 300 ppm (seri menengah) C : spektra absorbsi baku asam ursolat 500 ppm (seri tinggi)


60

Hasil pengukuran panjang gelombang bercak asam ursolat dari tiga

konsentrasi baku (100 ppm, 300 ppm, dan 500 ppm) sebanyak masing-masing 3

kali replikasi menunjukkan bahwa panjang gelombang maksimum (λmaks) asam

ursolat hasil derivatisasi adalah 537 nm (gambar 12).

2. Validasi metode

Suatu metode analisis harus divalidasi ketika suatu metode menggunakan

sistem baru yang belum divalidasi sebelumnya. Validasi ini bertujuan untuk

memberikan jaminan bahwa metode analisis dengan sistem yang digunakan

tersebut memenuhi parameter-parameter validasi sehingga dapat memberikan

hasil analisis yang valid atau dapat dipercaya. Oleh karena itu, validasi metode

merupakan tahapan yang penting untuk dilakukan sebelum metode ini

diaplikasikan untuk analisis kadar asam ursolat dalam herba rumput mutiara.

Menurut Liang et al. (2008), asam ursolat merupakan kandungan utama

dari rumput mutiara dan digunakan sebagai marker bagi tanaman tersebut. Oleh

karena itu, metode penetapan kadar asam ursolat dalam herba rumput mutiara

termasuk dalam metode analisis kategori I menurut The United States

Pharmacopeia 30th tahun 2007. Parameter-parameter validasi yang perlu dipenuhi

oleh metode analisis kategori I adalah akurasi, presisi, selektivitas, linearitas, dan

range.

Validasi dilakukan dengan 3 seri konsentrasi sebanyak 3 replikasi.

Konsentrasi yang digunakan merupakan konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi

dari konsentrasi seri baku yaitu 100 ppm, 300 ppm, dan 500 ppm. Pemilihan

ketiga seri konsentrasi ini adalah untuk mewakili setiap konsentrasi dari seri baku,


61

yaitu 100 ppm sampai 500 ppm. Berikut adalah hasil pengujian validasi metode

analisis:

a. Akurasi

Akurasi dimaksudkan untuk mengetahui seberapa dekat hasil

pengukuran suatu metode analisis dengan hasil yang sebenarnya. Semakin

kecil selisih antara keduanya maka akurasi metode tersebut semakin baik.

Akurasi metode dinyatakan dengan perolehan kembali atau recovery. Jika %

recovery baku asam ursolat 100 ppm berada pada rentang 90-107% (United

States Pharmacopeial Convention, 2007), maka metode ini memiliki akurasi

yang baik. Pengukuran akurasi dari percobaan ini disajikan pada tabel V.

Tabel V. Data % recovery baku asam ursolat

Konsentrasi

Recovery (%) Nilai recovery yang diterima (United States Pharmacopeial

Convention, 2007)

Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 3

100 ppm 90,967 94,265 109,417 90-107% 300 ppm 97,878 96,361 111,778 91-106,6% 500 ppm 100,764 102,401 98,447 93-106%

Dari tabel dapat dilihat bahwa % recovery asam ursolat untuk replikasi

1 dan 2 masuk pada rentang yang dipersyaratkan namun untuk replikasi 3

hanya konsentrasi tinggi (500 ppm) yang memenuhi persyaratan. Hal ini

kemungkinan terjadi akibat kesalahan pada saat penyiapan baku untuk

replikasi 3 dimana terjadi kesalahan dalam pemilihan timbangan.

Pada pembuatan larutan stok asam ursolat 1000 ppm, baku asam ursolat

ditimbang secara seksama lebih kurang 10,0 mg. Pengertian lebih kurang

dalam pernyataan untuk jumlah bahan yang harus yang diperlukan dalam


62

pemeriksaan atau penetapan kadar, berarti bahwa jumlah yang harus

ditimbang atau diukur tidak boleh kurang dari 90% dan tidak boleh lebih dari

110% dari jumlah yang tertera, sedangkan pernyataan timbang seksama

dimaksudkan bahwa penimbangan dilakukan sedemikian rupa sehingga batas

kesalahan penimbangan tidak lebih dari 0,1% dari jumlah yang ditimbang

(Depkes RI, 1977). Hal ini berarti untuk menimbang 10,0 mg asam ursolat,

rentang yang diperbolehkan adalah 9-11 mg dengan kesalahan tidak lebih dari

0,01 mg (0,00001 g), dan oleh karena itu dibutuhkan timbangan semimicro

(ketelitian 5 angka di belakang koma). Namun karena keterbatasan alat, maka

timbangan yang digunakan adalah timbangan analitik (ketelitian 4 angka di

belakang koma), sehingga kesalahan pada saat penimbangan bisa tidak

terdeteksi. Secara umum, metode ini memiliki akurasi yang baik pada

konsentrasi rendah, menengah, dan tinggi.

b. Presisi

Presisi menunjukkan keterulangan hasil yang diperoleh. Presisi

dinyatakan dalam coefficient of variation (CV). Menurut United States

Pharmacopeial Convention (2007), % CV yang dapat diterima untuk

konsentrasi analit 1000 ppm adalah <16%. Semakin kecil % CV yang

diperoleh maka semakin baik presisi metode yang digunakan.

Hasil menunjukkan bahwa metode yang digunakan memiliki presisi

yang baik. Hal ini dapat dilihat dari nilai % CV dari setiap konsentrasi yang

berada di bawah nilai maksimum yang diperbolehkan literatur.


63

Tabel VI. Data % CV baku asam ursolat

Konsentrasi % CV Nilai % CV yang diterima

(United States Pharmacopeial Convention, 2007)

100 ppm 3,013 < 14,9 300 ppm 0,565 < 12,7 500 ppm 1,057 < 10,5

c. Linearitas

Linearitas menyatakan hubungan korelasi antara kadar dengan respon

yang diukur instrumen. Untuk metode KLT-Densitometri, respon terukur

yang dimaksud adalah nilai AUC. Linearitas dinyatakan dari nilai r yang

diperoleh dari kurva baku. Jika nilai r ≥0,99 (APVMA, 2004) maka dikatakan

memiliki linearitas yang baik. Semakin baik nilai r artinya peningkatan kadar

proporsional dengan peningkatan nilai AUC.

Tabel VII. Nilai r seri baku asam ursolat

Replikasi Nilai r 1 0,9816 2 0,9893 3 0,9933

Dari tabel diketahui bahwa nilai r seri baku asam ursolat replikasi 3

memenuhi persyaratan. Oleh karena itu, untuk selanjutnya digunakan seri

baku replikasi 3 untuk membuat persamaan kurva baku.

d. Selektivitas

Selektivitas menunjukkan kemampuan suatu metode untuk mengukur

senyawa tertentu secara akurat dan presisi dalam sampel yang terdiri dari

banyak senyawa lain. Metode dengan selektivitas yang baik hanya akan

mengukur kadar analit yang dimaksud. Penelitian ini membutuhkan metode

yang selektif sebab matriks ekstrak rumput mutiara cukup kompleks. Proses


64

ekstraksi yang dilakukan dengan menggunakan cairan penyari etanol 96%

selain dapat mengekstraksi asam ursolat juga dapat mengekstraksi senyawa-

senyawa lain dalam herba rumput mutiara yang juga larut dalam etanol 96%.

Dalam herba rumput mutiara, selain terkandung asam ursolat juga

terkandung senyawa isomer dari asam ursolat yaitu asam oleanolat.

Kemiripan struktur kimia menyebabkan kedua senyawa triterpen ini sulit

untuk dipisahkan, terutama dengan KLT. Terdapat beberapa sistem

kromatografi untuk analisis triterpen namun belum ada yang dapat

memisahkan asam ursolat dan asam oleanolat (Wojciak-Kosior, 2007).

Pada proses defatisasi, asam oleanolat tidak terekstraksi oleh petroleum

eter seperti asam ursolat karena sifatnya yang tidak larut petroleum eter,

sedangkan pada proses digesti senyawa ini juga dapat larut dalam etanol 96%.

KLT tidak mampu memisahkan kedua senyawa isomer ini sehingga metode

ini tidak selektif untuk penetapan kadar asam ursolat. Bercak kedua senyawa

ini tidak terpisah sama sekali sehingga dalam penelitian ini yang ditetapkan

adalah kadar triterpen total terhitung sebagai kadar asam ursolat.

Selektivitas metode KLT-Densitometri ini untuk penetapan kadar

triterpen total dapat dilakukan dengan membandingkan nilai Rf baku dengan

Rf analit dalam ekstrak. Nilai Rf merupakan parameter analisis kualitatif suatu

senyawa pada metode KLT, sehingga dapat digunakan sebagai parameter

selektivitas. Selektivitas metode juga dapat dilihat dari resolusi, dimana suatu

metode dikatakan memiliki selektivitas yang baik apabila memiliki nilai


65

resolusi >1,5 (Swartz and Krull, 1997). Perbandingan nilai Rf antara baku dan

analit dalam sampel serta nilai resolusi dapat dilihat pada tabel VIII.

Tabel VIII. Perbandingan nilai Rf baku dan sampel, serta nilai resolusi Konsentrasi seri larutan baku asam

ursolat (ppm)

Rf baku Replikasi sampel Rf sampel Resolusi

100 0,35 1 0,34 1,58 200 0,34 2 0,34 1,50 300 0,34 3 0,34 1,53 400 0,34 4 0,34 1,62 500 0,34 5 0,34 1,67

Rata-rata 0.34 0.34 1,58

Tabel VIII menunjukkan nilai Rf baku dan analit dalam ekstrak yang

identik, dimana nilai Rf rata-rata dari baku adalah 0,34 dan Rf rata-rata dari

analit dalam ekstrak adalah 0,34. Nilai rata-rata resolusi antara peak bercak

triterpen dengan peak terdekat adalah 1,58. Nilai ini lebih dari nilai resolusi

yang dipersyaratkan, yaitu >1,5. Oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa

metode KLT-Densitometri ini memenuhi parameter selektivitas dalam

menetapkan kadar triterpen total.

Gambar 13. Rf baku asam ursolat konsentrasi 500 ppm = 0,34


66

Gambar 14. Rf ekstrak replikasi 1 = 0,34

e. Range

Range adalah interval antara konsentrasi analit pada level rendah dan

level tinggi dalam sampel yang masih memenuhi parameter linearitas,

akurasi, dan presisi. Hasil analisis menunjukkan bahwa range konsentrasi

metode ini adalah 100-500 ppm dimana pada konsentrasi terkecil dan

terbesarnya masih memenuhi persyaratan linearitas, akurasi, dan presisi yang

baik. Oleh karena itu, analit dalam sampel dapat diukur dalam range

konsentrasi ini.

Gambar 15. Range konsentrasi asam ursolat

y = 18.591x + 2699.3

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

0 100 200 300 400 500 600

AU

C

Kadar baku asam ursolat (ppm)

Linearitas, akurasi, dan presisi


67

f. Akurasi dan presisi dalam matriks sampel

Akurasi dan presisi dalam matriks sampel perlu ditentukan untuk

mengetahui pengaruh matriks sampel terhadap pengukuran analit, apakah

metode tetap dapat mengukur analit secara akurat dan seksama di dalam

matriks sampel.

Gambar 16. Kromatogram ekstrak tanpa adisi baku asam ursolat

Gambar 17. Kromatogram ekstrak dengan adisi baku asam ursolat

Penentuan akurasi dan presisi baku asam ursolat dilakukan dengan

menambahkan sejumlah tertentu baku asam ursolat dalam matriks ekstrak

(adisi). Tahap ini juga bertujuan untuk menentukan bahwa bercak dengan Rf

yang identik dengan baku asam ursolat memang merupakan bercak asam


68

ursolat. Bila terjadi penambahan luas area (AUC) pada peak bercak yang

semula diduga sebagai bercak asam ursolat berarti bercak tersebut memang

merupakan bercak asam ursolat. Hasil yang diperoleh menunjukkan adanya

penambahan luas area untuk peak dengan nilai Rf identik dengan baku asam

ursolat (gambar 16 dan 17). Oleh karena itu dapat dipastikan bahwa bercak

tersebut merupakan bercak asam ursolat.

Akurasi dan presisi baku asam ursolat yang ditambahkan dalam ekstrak

herba rumput mutiara dapat dilihat pada tabel IX. Dalam percobaan ini, kadar

baku asam ursolat yang ditambahkan pada ekstrak herba rumput mutiara

sebesar 100 ppm. Menurut United States Pharmacopeial Convention (2007),

% recovery konsentrasi 100 ppm berada pada rentang 90-107% sedangkan %

CV harus lebih rendah dari 14,9%. Metode ini dapat mengukur analit dalam

matriks ekstrak dengan akurat dan seksama dilihat dari nilai % recovery dan

% CV yang memenuhi syarat.

Tabel IX. Data recovery dan CV baku asam ursolat dalam matriks ekstrak Replikasi Recovery (%) CV (%)

1 100,617 2,426 2 99,067

3 103,876

3. Kurva baku

Kurva baku asam ursolat dibuat dengan cara menotolkan suatu seri kadar

baku asam ursolat (dalam ppm) pada plat silika gel 60 F254 dan dikembangkan

dengan fase gerak toluen – aseton – asam asetat (90:10:0,07). Kadar larutan induk

baku asam ursolat yang dibuat sebesar 1000 ppm. Dari larutan induk tersebut

dibuat seri kurva baku konsentrasi 100 ppm, 200 ppm, 300 ppm, 400 ppm, dan


69

500 ppm. Setelah dikembangkan hingga mencapai jarak elusi 10 cm, plat

dikeluarkan dari bejana kromatografi dan dikeringkan. Selanjutnya dilakukan

langkah-langkah pendeteksian bercak seperti pada analisis kualitatif sebelumnya.

Plat dengan bercak yang telah ditampakkan discan dengan densitometer dan

diperoleh nilai AUC untuk setiap konsentrasi baku. Nilai AUC tersebut akan

digunakan untuk menentukan persamaan kurva baku. Persamaan kurva baku

dirumuskan dengan: y = bx + a.

Tabel X. Data seri konsentrasi baku asam ursolat dengan AUC baku asam ursolat Konsentrasi baku asam ursolat (ppm) AUC baku

99.99 4332,5 199,98 6655,8 299,97 8615,4 399,96 9644,0 499,95 12133,1

Persamaan Kurva Baku

A = 2699,34 B = 18,5913 r = 0,9931 y = 18,5913x + 2699,34

Gambar 18. Kurva baku asam ursolat

Kurva baku ditotolkan bersama dengan sampel pada plat KLT yang sama

sehingga mengalami perlakuan yang sama dengan sampel. Hal ini perlu dilakukan

y = 18.591x + 2699.3R = 0,9931

02000400060008000

100001200014000

0 200 400 600

AU

C

Konsentrasi (ppm)

Kurva Baku Penetapan Kadar


70

sebab besar kemungkinan terjadi perbedaan respon (nilai AUC) untuk sampel

yang sama namun berbeda kondisi pengerjaan. Dengan menyamakan kondisi

antara baku dan sampel akan mengurangi variabilitas dalam pengukuran.

4. Penetapan kandungan triterpen total dalam sampel secara KLT-

Densitometri

Kadar triterpen (x) dalam ekstrak diperoleh dengan mensubstitusikan nilai

AUC sampel sebagai nilai y pada persamaan kurva baku y = 18,5913x + 2699,34.

Dalam perhitungan kadar ini tidak dilakukan ekstrapolasi data dimana ekstrak

dipreparasi sehingga memberikan respon dalam rentang kurva baku. Preparasi

ekstrak dilakukan dengan cara melarutkan ekstrak kering yang diperoleh dengan

10 mL pelarut metanol – kloroform (4:1) sehingga kadarnya tidak sepekat kadar

awal. Ekstrapolasi data sebaiknya tidak dilakukan pada penetapan kadar sebab

tidak ada jaminan bahwa linearitas kurva baku masih memenuhi persyaratan yang

ditetapkan di luar rentang yang telah ditentukan, atau dengan kata lain respon

yang diberikan instrumen belum tentu proporsional dengan kadar senyawa yang

mau ditetapkan, sehingga hasil perhitungan kadar belum tentu sama dengan kadar

yang sebenarnya.

Dari tabel dilihat bahwa kadar triterpen tertinggi diperoleh pada proses

digesti dengan suhu 60oC (suhu level tinggi) selama 4 jam (waktu level tinggi)

sedangkan kadar triterpen terendah diperoleh pada proses digesti dengan suhu

30oC (suhu level rendah) selama 2 jam (waktu level rendah).


71

Tabel XI. Kadar triterpen total dalam ekstrak pada setiap kondisi dan replikasi

Kondisi Replikasi Konsentrasi (ppm)

Jumlah asam ursolat dalam 5

gram serbuk (mg)

Kadar asam ursolat

terhadap berat serbuk

(% b/b)

Rata-rata (% b/b)

30oC 2 jam

1 352,066 35,207 0,704 0,699 2 357,213 35,721 0,714

3 339,727 33,973 0,680

60oC 2 jam

1 357,896 35,790 0,716 0,738 2 368,073 36,807 0,736

3 381,241 38,124 0,763

30oC 4 jam

1 359,596 35,960 0,719 0,727 2 360,134 36,013 0,720

3 370,661 37,066 0,741

60oC 4 jam

1 401,718 40,172 0,803 0,798 2 368,025 36,803 0,736

3 427,262 42,726 0,855

Gambar 19. Profil KLT penetapan kadar triterpen total dalam ekstrak etanolik herba rumput mutiara dilihat secara visual dengan cahaya biasa

Keterangan 1.Baku 100 ppm 2. Baku 200 ppm 3. Baku 300 ppm 4. Baku 400 ppm 5. Baku 500 ppm 6. Ekstrak kondisi (1) R 1 7. Ekstrak kondisi (1) R 2 8. Ekstrak kondisi (1) R 3 9. Ekstrak kondisi (a) R 1

10. Ekstrak kondisi (a) R 2 11. Ekstrak kondisi (a) R 3 12. Ekstrak kondisi (b) R 1 13. Ekstrak kondisi (b) R 2 14. Ekstrak kondisi (b) R 3 15. Ekstrak kondisi (ab) R 1 16. Ekstrak kondisi (ab) R 2 17. Ekstrak kondisi (ab) R 3

Hasil yang diperoleh ini sesuai dengan teori peningkatan suhu dan waktu

ekstraksi akan semakin meningkatkan perolehan senyawa aktif. Secara umum

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17


72

suhu ekstraksi dapat mempengaruhi perolehan senyawa aktif. Peningkatan suhu

medium ekstraksi dapat meningkatkan kemampuan berdifusi pelarut ke dalam sel

dan akibatnya meningkatkan kelarutan senyawa (Wang and Weller, 2006).

Peningkatan suhu akan meningkatkan energi kinetik dalam sistem sehingga

tumbukan antara cairan penyari dengan senyawa aktif meningkat, kelarutan

senyawa akan meningkat, dan akibatnya meningkatkan efektivitas ekstraksi.

Menurut Xia et al. (2011), peningkatan suhu medium ekstraksi dapat

meningkatkan kemampuan difusi cairan penyari ke dalam sel dan mempengaruhi

kelarutan senyawa.

Waktu ekstraksi juga memberikan pengaruh terhadap perolehan senyawa

aktif. Dalam penelitian yang dilakukan Banik dan Pandey (2008) diperoleh hasil

bahwa perolehan senyawa aktif meningkat seiring dengan meningkatnya waktu

ekstraksi. Hal ini disebabkan semakin lama waktu ekstraksi, semakin banyak pula

kesempatan bagi cairan penyari untuk berinteraksi dengan senyawa aktif.

H. Analisis Hasil Kadar Triterpen Total

Faktor yang diprediksi berpengaruh signifikan dalam menentukan respon

kadar triterpen total dapat ditentukan dari perhitungan desain faktorial, grafik

hubungan faktor – respon, dan analisis statistik dengan menggunakan ANOVA

dengan taraf kepercayaan 95%. Data yang dianalisis adalah kadar rata-rata yang

diperoleh dari setiap kondisi percobaan.


73

Tabel XII. Kondisi desain faktorial dan respon yang dihasilkan

Perhitungan desain faktorial merupakan perhitungan efek rata-rata dari

setiap faktor dan interaksinya terhadap respon. Nilai efek positif menunjukkan

bahwa faktor berpengaruh dalam meningkatkan respon, sedangkan nilai efek

negatif menunjukkan bahwa faktor berpengaruh dalam menurunkan respon.

Hasil perhitungan nilai efek menunjukkan faktor yang diprediksi dominan

dalam mempengaruhi perolehan kadar triterpen total adalah suhu dimana faktor

ini berpengaruh dalam meningkatkan perolehan kadar triterpen total. Hal ini dapat

dilihat dari nilai efeknya yang lebih besar dibandingkan waktu ekstraksi dan

interaksi keduanya. Waktu ekstraksi dan interaksi juga meningkatkan perolehan

kadar triterpen total dilihat dari nilai efeknya yang bernilai positif, namun bukan

merupakan faktor dominan.

Tabel XIII. Nilai efek dari faktor suhu, waktu, dan interaksinya terhadap respon kadar triterpen total

Faktor Nilai efek untuk respon kadar triterpen total

Suhu 0,055 Waktu 0,044

Interaksi 0,016 Pengaruh suhu dan waktu ekstraksi terhadap respon kadar triterpen total

juga dapat dilihat dari grafik hubungan faktor – respon (gambar 20). Dari

interpretasi grafik hubungan antara kedua faktor dengan kadar triterpen total

diketahui bahwa dengan semakin meningkatnya suhu pada waktu level rendah dan

Kondisi Suhu (oC) Waktu (jam) Rata-rata kadar triterpen total

(% b/b) 1 30 2 0,699 a 60 2 0,738 b 30 4 0,727 ab 60 4 0,798


74

0.68

0.73

0.78

20 40 60Kada

r tr

iter

pen

tota

l (%

b/b

)

Suhu (oC)

Grafik Hubungan Suhu Terhadap Kadar Triterpen Total

waktu level tinggi waktu level rendah

0.68

0.73

0.78

1 3 5Kada

r tr

iter

pen

tota

l (%

b/b)

Waktu (Jam)

Grafik Hubungan Waktu Terhadap Kadar Triterpen Total

suhu level tinggi suhu level rendah

level tinggi akan meningkatkan kadar triterpen total, dan demikian pula dengan

waktu ekstraksi dimana semakin lama waktu ekstraksi pada suhu level rendah dan

level tinggi akan meningkatkan kadar triterpen total.

Gambar 20. Grafik hubungan suhu (a) dan waktu ekstraksi (b) terhadap kadar triterpen total

Hasil perhitungan desain faktorial dilanjutkan dengan uji ANOVA untuk

mengetahui apakah faktor yang berpengaruh signifikan terhadap respon. Taraf

kepercayaan yang digunakan adalah 95%, dimaksudkan jika terjadi kesalahan

maksimal hanya 5% saja. Dari uji ANOVA ini, yang diperhatikan adalah nilai F

hitung (F-value) dan F tabel. Bila F hitung suatu faktor lebih besar daripada F

tabel, maka dapat disimpulkan bahwa faktor tersebut diprediksi berpengaruh

signifikan terhadap respon. Berikut merupakan hasil uji ANOVA.

Tabel XIV. Hasil uji ANOVA Factor or

interaction Experiment F-value F tabel

Suhu a 7,964 5,320 Waktu ekstraksi b 5,020

Interaksi ab 0,685

Gambar 20a Gambar 20b


75

Pada tabel XIV dapat diketahui bahwa faktor suhu diprediksi berpengaruh

signifikan terhadap respon kadar triterpen total, dilihat dari nilai F hitung-nya

yang lebih besar daripada F tabel. Sedangkan waktu ekstraksi dan interaksi kedua

faktor diprediksi tidak memiliki pengaruh yang signifikan terhadap perolehan

kadar triterpen total. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa suhu merupakan

faktor yang diprediksi dominan dalam digesti herba rumput mutiara, yang

berpengaruh signifikan dalam meningkatkan perolehan kandungan senyawa

triterpen dalam herba rumput mutiara.

Waktu ekstraksi tidak memiliki pengaruh yang signifikan mungkin

disebabkan telah jenuhnya cairan penyari pada waktu ekstraksi level rendah (2

jam), sehingga jumlah triterpen total yang terambil tidak berbeda bermakna antara

waktu ekstraksi level rendah (2 jam) dan waktu ekstraksi level tinggi (4 jam).

Perhitungan statistik diperlukan untuk membuktikan bahwa waktu ekstraksi level

rendah dan level tinggi benar tidak berbeda bermakna dalam mempengaruhi

respon perolehan kadar triterpen total sehingga dapat dipastikan pengaruh waktu

ekstraksi terhadap perolehan kadar triterpen total. Dalam penelitian ini, uji

statistik yang digunakan untuk membuktikan hal tersebut adalah uji independent t-

test (Welch two sample t-test).

Pengujian statistik dilakukan menggunakan data rendemen ekstrak pada

orientasi waktu ekstraksi. Pengujian statistik diawali dengan uji normalitas dengan

metode Shapiro-Wilk untuk mengetahui distribusi data, apakah normal atau tidak.

Data yang normal merupakan syarat untuk bisa dilakukan uji beda parametrik,

dalam hal ini uji independent t-test. Bila nilai p-value >0,05 artinya data


76

terdistribusi normal dan sebaliknya, bila nilai p-value <0,05 artinya data

terdistribusi tidak normal. Dari pengujian data rendemen ekstrak pada orientasi

waktu ekstraksi 2 jam dan 4 jam, diperoleh nilai p-value untuk waktu 2 jam dan 4

jam berturut-turut adalah 0,8894 dan 0,1386. Kedua nilai p-value ini lebih dari

0,05 maka data rendemen ekstrak yang diperoleh terdistribusi normal dan dapat

dilanjutkan dengan uji independent t-test.

Uji independent t-test diperlukan untuk menguji kesamaan rata-rata dari

dua populasi yang bersifat independen, dimana populasi yang satu tidak

dipengaruhi atau tidak berhubungan dengan populasi yang lain. Kesimpulan

mengenai kesamaan kedua subyek uji juga dilihat dari nilai p-value. Bila p-value

>0,05 artinya kedua subyek yang dibandingkan tidak berbeda bermakna,

sedangkan bila p-value <0,05 artinya kedua subyek berbeda bermakna. Hasil

analisis dengan uji independent t-test menunjukkan nilai p-value kurang dari 0,05

yaitu 0,01362 dimana hal ini berarti rendemen ekstrak untuk waktu ekstraksi 2

jam dan 4 jam berbeda bermakna, atau dengan kata lain cairan penyari belum

jenuh pada waktu ekstraksi 2 jam sehingga terdapat penambahan jumlah

rendemen ekstrak yang berarti bila ekstraksi dilanjutkan hingga waktu 4 jam. Oleh

karena itu, dapat dipastikan bahwa waktu ekstraksi memang tidak memiliki

pengaruh yang signifikan dalam proses digesti herba rumput mutiara.

Analisis desain faktorial dilakukan dengan menggunakan software ubuntu-

10.04-DesFaktor-0,9® by ubuntu R OpenOffice.org (www.molmod.org) dan

diperoleh persamaan desain faktorial y = 0.6652 + 0.00022xa - 0.0023667xb +

0.0005378xaxb, dengan p-value = 0,03834; multiple R-squared = 0,6308; dan


77

adjusted R-squared = 0,4924. Multiple R-squared menggambarkan kelinearan

persamaan desain faktorial yang diperoleh, bagaimana korelasi antara faktor dan

respon. Suatu persamaan memiliki kelinearan yang baik bila nilai multiple R-

squared ≥0,64 (Zhao, Bin, Yang, Liu, Zhou, Chen, and Lai, 2011). Adjusted R-

squared menggambarkan seberapa besar pengaruh faktor terhadap respon. Dalam

penelitian ini, nilai adjusted R-squared = 0,4924 artinya sebanyak 49,24%

perubahan pada kadar triterpen total disebabkan oleh perubahan suhu dan waktu

ekstraksi.

Persamaan desain faktorial tersebut signifikan sebab nilai p-value

persamaan tersebut kurang dari 0,05 namun tidak dapat diteruskan pada

pembuatan contour plot sebab nilai multiple R-squared yang kurang dari nilai

yang dipersyaratkan yaitu ≥0,64. Oleh karena itu, dalam penelitian ini tidak dapat

ditemukan area prediksi kondisi ekstraksi herba rumput mutiara yang optimum

untuk ekstraksi triterpen total.

Dalam penelitian yang dilakukan Liang et al. (2008) diketahui bahwa

kadar asam ursolat dalam herba rumput mutiara sekitar 0,7544 %b/b. Bila

diperoleh contour plot, yang termasuk dalam area prediksi kondisi ekstraksi

optimum adalah area yang menghasilkan kadar triterpen total ≥0,7544 %b/b.


78

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Perbedaan suhu pada proses digesti herba rumput mutiara berpengaruh

terhadap kadar triterpen total yang diperoleh, namun perbedaan waktu

ekstraksi tidak berpengaruh terhadap kadar triterpen total yang diperoleh.

2. Suhu digesti merupakan faktor yang diprediksi dominan berpengaruh pada

proses digesti herba rumput mutiara sehingga diperoleh kadar triterpen total

yang optimum.

3. Tidak diperoleh area prediksi suhu dan waktu ekstraksi yang optimum pada

digesti herba rumput mutiara terbatas pada level yang diteliti.

B. Saran

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai usaha pemisahan asam

ursolat dengan senyawa isomernya yaitu asam oleanolat.

2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai standarisasi terhadap

simplisia dan ekstrak rumput mutiara.


79

DAFTAR PUSTAKA

Amstrong, N.A. and James, K.C., 1996, Pharmaceutical Experimental Design and Interpretation, Taylor and Francis, USA, pp. 131-165.

Anam, K., 2008, Pertumbuhan dan Kandungan Ursolic Acid Rumput Mutiara

(Hedyotis corymbosa (L.) Lamk) pada Variasi Ketersediaan Air, http://digilib.uns.ac.id/pengguna.php?mn=detail&d_id=13874, diakses tanggal 14 September 2011.

Anandjiwala, S., Kalola, J., and Rajani, M., 2006, Quantification of Eugenol,

Luteolin, Ursolic Acid, and Oleanolic Acid in Black (Krishna Tulasi) and Green (Sri Tulasi) Varieties of Ocimum sanctum Linn. Using High-Performance Thin-Layer Chromatography, Journal of AOAC International, 89 (6) 1467-1474.

APVMA, 2004, Guidelines for the Validation of Analytical Methods for Active

Constituent, Agricultural and Vetenary Chemical Products, Australian Pesticides & Vetenary Medicines Authority, Australia, pp. 4.

Backer, C.A. and van Der Brink, R.C.B., 1965, Flora of Java, Volume II, N.V.P.

Noordhoof-Groningen-The Netherlands Published under The Auspices of The Rijksher Barium, Leyden, pp. 284-286.

Banik, R. M., and Pandey, D. K., 2008, Optimizing Conditions for Oleanolic Acid

Extraction from Lantana camara Roots Using Response Surface Methodology, Industrial Crops and Products, 27 (2008) 241-248.

Bolton, S., 1990, Pharmaceutical Statistic Practical and Clinical Application, 2nd

ed., Marcell Dekker Inc., New York, pp. 308-553, 591-601. Bolton, S., 1997, Pharmaceutical Statistic Practical and Clinical Application, 3rd

ed., Marcell Dekker Inc., New York, pp. 326. Budavari, S., O`Neil, M.J., Smith, A., and Heckelman, P.Z., 1989, The Merck

Index an encyclopedia of chemicals, drugs, and biologicals. 11th ed., Merck & Co.,Inc Rahway, N. J., USA, pp. 1079, 1556.

Cardenas, C., Quesada, A.R., and Medina, M.A., 2004, Effects of Ursolic Acid on

Different Steps of the Angiogenic Process, Biochemical and Biophysical Research Communications, 320 (2004) 402–408.

Depkes RI, 1977, Materia Medika, Jilid I, Departemen Kesehatan Republik

Indonesia, Jakarta, hal. xx.


80

Depkes RI, 1979, Farmakope Indonesia, Edisi III, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, hal. 9, 782, 784.

Depkes RI, 1985, Cara Pembuatan Simplisia, Departemen Kesehatan Republik

Indonesia, Jakarta, hal. 1-15, 105-123. Depkes RI, 1986, Sediaan Galenik, Departemen Kesehatan Republik Indonesia,

Jakarta, hal. 25-26. Depkes RI, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan

Republik Indonesia, Jakarta, hal. 9. Depkes RI, 2011, Jika Tidak Dikendalikan 26 Juta Orang di Dunia Menderita

Kanker, http://www.depkes.go.id/index.php/berita/press-release/1060-jika-tidak-dikendalikan-26-juta-orang-di-dunia-menderita-kanker-.html, diakses tanggal 25 Agustus 2011.

de Voogd, C.N.A., 1950, Tanaman Apakah Ini Gerangan, diterjemahan oleh

Soetan Sanif, Penerbit N.V. Uitgeverij W. Van Hoeve, Bandung, hal. 22. Du, H. and Chen, X.G., 2008, A Comparative Study of the Separation of

Oleanolic Acid and Ursolic Acid in Prunella vulgaris by High-Performance Liquid Chromatography and Cyclodextrin-Modified Micellar Electrokinetic Chromatography, J. Iran. Chem. Soc., Vol. 6, No. 2, June 2009, 334-340.

Gbaguidi, F., Accrombessi, G., Moudachirou, M., and Quetin-Leclercq, J., 2005,

HPLC Quantification of Two Isomeric Triterpenic Acids Isolated from Mitracarpus scaber and Antimicrobial Activity on Dermatophilus congolensis, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 39 (2005) 990–995.

Gandjar, I.G. and Rohman, A., 2009, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,

Yogyakarta, hal. 333-337, 359. Gentry, A.H., 1993, Tropical Forest Biodiversity and The Potential For New

Medicine Plant in Suryanto, D., Kelana, T.B., Munir, E., and Nani, N., 2006, Uji Brine Shrimp dan Pengaruh Ekstrak Metanol Daun Tumbuhan Pradep (Psycothria stipulacea Wall (Familia: Rubiaceae) Terhadap Mikroba, Media Farmasi 14 (1): 85-92.

Gentry, A.H., 1993, Tropical Forest Biodiversity and The Potential For New

Medicine Plant in Suryanto, D., Kelana, T.B., Munir, E., and Nani, N., 2006, Uji Brine Shrimp dan Pengaruh Ekstrak Metanol Daun Tumbuhan Pradep (Psycothria stipulacea Wall (Familia: Rubiaceae) Terhadap Mikroba, Media Farmasi 14 (1): 85-92.


81

Gritter, R.J., 1985, Introduction to Chromatography, 2nd ed., diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB, Bandung, pp. 6, 8, 107-155.

Hardjono, S., 1983, Kromatografi, Laboratorium Analisa Kimia Fisika Pusat,

Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, hal. 32-34, 45. Harbone, J.B., 1987, Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwung Soediro, terbitan kedua, Penerbit ITB, Bandung, hal. 125, 147, 153.

Hariana, A., 2006, Tumbuhan Obat dan Khasiatnya Seri 3, Penebar Swadaya,

Depok, hal. 144. Haryanti, S., Junedi, S., and Meiyanto, E., 2009, Ethanolic Extract of Hedyotis

corymbosa L. Increase Cytotoxic Activity of Doxorubicin on MCF-7 Breast Cancer Cell, I.J. Biotech., 14 (1) 1146-1154.

Jork, H., 1990, Thin-Layer Chromatography Reagents and Detection Methods,

VCH, New York, pp. 12. Latha, P.G., Nayar, M.N.S., Singh, O.V., George, V., Panikkar, K.R., and

Pushpangadan, P., 2001, Isolation of Antigenotoxic Ursolic Acid from Ixora coccinea Flowers, Actual Biol, 23 (74) 21-24.

Liang, Z., Jiang, Z., Fong, D.W., and Zhao, Z., 2009, Determination of Oleanolic

Acid and Ursolic Acid in Oldenlandia diffusa and Its Substitute Using High Performance Liquid Chromatography, Journal of Food and Drug Analysis, 17 ( 2) 69-77.

Masushita, 1979, Separation of Sweet Component from Natural Sweet Extracts,

pp. 1-5. Mintarsih, E.R.R., 1990, Penetapan Kadar Alkaloid Kinina dalam Akar, Batang,

dan Daun Chinchona succirubra Pavon et Klotzsch dari Daerah Kaliurang secara Spektrodensitometri (TLC-Scanner), Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Mursyidi, A., 1990, Analisis Metabolit Sekunder, Proyek Pengembangan Pusat

Fasilitas Bersama Antar Universitas (Bank Dunia XVII)-PAU Bioteknologi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, hal. 192-193, 245.

Rohman, A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, Graha Ilmu, Yogyakarta,

hal. 2-3, 47, 49-50, 53-54.


82

Sadasivan, S., Latha, P.G., Sasikumar, J.M., Rajashekaran, S., Shyamal, S., and Shine, V.J., 2006, Hepatoprotective Studies on Hedyotis corymbosa (L.) Lam., Journal of Ethnopharmacology, 106 (2006) 245–249.

Schneider, P., Hosseiny, S.S., Szczotka, M., Jordan, V., and Schlitter, K., 2008,

Rapid Solubility Determination of the Triterpenes Oleanolic Acid and Ursolic Acid by UV-Spectroscopy in Different Solvents, Phytochemistry Letters, 2 (2009) 85–87.

Skrzypek, Z. and Wysokinska, H., 2003, Sterol and Triterpenes in Cell Culture of

Hyssopus officinalis L., www.znaturforsch.com, diakses tanggal 23 September 2011.

Stahl, E., 1969, Thin Layer Chromatography (A Laboratory Handbook), 2nd

Edition, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, New York, pp. 244. Stahl, E., 1985, Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi, Penerbit

ITB, Bandung, hal. 3-17, 205-207. Stock, R. and Rice, C. B. F., 1974, Chromatographic Methods, Third Edition,

Chapman and Hall and Science Paper Backs, Great Britain, pp. 283. Sudjadi, 1988, Metode Pemisahan, Penerbit Kanisius, Yogyakarta, hal. 75. Sumaryono, W., 2004, Strategi Pengembangan Teknologi Formulasi dan

Manufaktur Obat Alami, Seminar Nasional XXV Tumbuhan Obat Indonesia, Surakarta.

Supardjan, A.M., 1987, Pemisahan Tetrasiklin dan Hasil Pemisahannya dalam

Sediaan Tetrasiklin secara KLT-Densitometri, Lembaga Penelitian Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Swartz and Krull, 1997, Chromatographic Analysis of Pharmaceuticals, 2nd

Edition, Marcel Dekker, USA. United States Pharmacopeial Convention, 2007, The United States Pharmacopeia,

30th Edition, United States Pharmacopeial Convention Inc., New York, pp. 335-887.

Voigt, 1994, Buku Pelajaran Teknologi Farmasi, Edisi 5, Gadjah Mada

University Press, Yogyakarta, hal. 579-582. Wang, L. and Weller, C.L., 2006, Recent Advances in Extraction of

Nutraceuticals from Plants, Trends Food Sci. Technol, 17(2006) 300–312.


83

Watson, D.G., 2009, Analisis Farmasi : buku ajar untuk mahasiswa farmasi dan praktisi kimia farmasi, Ed. 2, EGC, Jakarta, hal. 378.

Wojciak-Kosior, M., 2007, Application of High Performance Thin-Layer

Chromatography to Separation of Oleanolic, Ursolic, and Betulinic Acids, Journal of Pre-Clinical and Clinical Research, Vol. 1, No. 2, 176-178.

Wijayakesuma, H.M., 1992, Tanaman Berkhasiat Obat Indonesia, Penerbit

Pustaka Kartini, Jakarta, hal. 11-12, 86-87. Yamaguchi, H., Noshita, T., Kidachi, Y., Umetsu, H., Hayashi, M., Komiyama,

K., et al., 2008, Isolation of Ursolic Acid from Apple Peels and Its Specific Efficacy as a Potent Antitumor Agent, Journal of Health Science, 54 (6) 654-660.

Xia, E.Q, Wang, B.W., Xu, X.R., Zhu, L., Song, Y., and Li, H.B., 2011,

Microwave-Assisted Extraction of Oleanolic Acid and Ursolic Acid from Ligustrum lucidum Ait, Int. J. Mol. Sci., 12 (2011) 5319-532.

Zhao, J.L., Ying, G.G., Yang, B., Liu, S., Zhou, L.J., Chien, Z.F., and Lai, H.J.,

2011, Screening of Multiple Hormonal Activities in Surface Water and Sediment from the Pearl River System, South China, Using Effect-Directed In Vitro Bioassays, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 30, No. 10, 2208–2215.


84

LAMPIRAN


85

Lampiran 1. Surat Keterangan Determinasi


86

Lampiran 2.Certificate of Analysis Baku Asam Ursolat


87

Lampiran 3. Data Penimbangan Bahan

1. Baku Asam Ursolat

Penimbangan Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Berat kertas (g) 0,2427 0,2547 0,2401 Berat kertas + zat (g) 0,2533 0,2650 0,2503 Berat kertas + sisa (g) 0,2433 0,2548 0,2402 Berat zat (g) 0,0100 0,0102 0,0101

2. Serbuk Rumput Mutiara Hasil Defatisasi

Kondisi Ekstraksi Replikasi Berat kertas

(g) Berat kertas

+ zat (g) Berat kertas

+ sisa (g) Berat zat

(g)

1 (30oC, 2 jam)

1 0,2466 5,2469 0,2468 5,0001 2 0,2439 5,2440 0,2439 5,0001 3 0,2495 5,2497 0,2497 5,0000

a (60oC, 2 jam)

1 0,2455 5,2456 0,2461 4,9995 2 0,4078 5,4081 0,4084 4,9997 3 0,4170 5,4174 0,4178 4,9996

b (30oC, 4 jam)

1 0,2470 5,2471 0,2471 5,0000 2 0,2428 5,2429 0,2428 5,0000 3 0,4161 5,4165 0,4163 5,0002

ab (60oC, 4 jam)

1 0,2506 5,2506 0,2506 5,0000 2 0,2456 5,2457 0,2457 5,0000 3 0,4266 5,4271 0,4274 4,9997


88

Lampiran 4. Sistem Kromatografi Lapis Tipis Densitometri yang Digunakan


89

Lampiran 5. Spektrum Baku Asam Ursolat pada 200-700 nm

Track Baku Λmaks 1 Seri rendah 538 nm 2 Seri tengah 537 nm 3 Seri tinggi 537 nm


90

Lampiran 6. Data Orientasi Waktu Ekstraksi 1. Rendemen ekstrak

1 jam (g) 2 jam (g) 4 jam (g) 6 jam (g) 8 jam (g) Replikasi 1 0,2002 0,2232 0,2877 0,2749 0,2771 Replikasi 2 0,1956 0,2501 0,2666 0,2790 0,2803 Replikasi 3 0,2000 0,2353 0,2860 0,2828 0,2799 Rata-rata 0,1986 0,2362 0,2801 0,2789 0,2791

2. Grafik orientasi waktu ekstraksi

3. Uji statistik untuk rendemen ekstrak waktu 2 jam dan 4 jam a. Uji normalitas dengan metode Shapiro-Wilk

2 jam 4 jam W 0,9967 0,8100

p-value 0,8894 0,1386 Kesimpulan normal normal

b. Uji beda dengan metode Independent T-Test

T test (rendemen ekstrak 2 jam, rendemen ekstrak 4 jam, alternative=’two sided’, conf. level=.95, +paired=TRUE) Welch Two Sample t-test data: rendemen ekstrak 2 jam and rendemen ekstrak 4 jam t= -4.2578, df= 3.925, p-value= 0.01362 alternative hypothesis: true difference in means is not equal to 0 95 percent confidence interval: -0.07274374 0.01505626 sample estimates: mean in group K1 mean in group K2 0.2362 0.2801

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0 2 4 6 8 10

Rend

emen

eks

trak

(g)

Waktu (jam)

Grafik Orientasi Waktu Ekstraksi


91

Lampiran 7. Validasi Metode

1. Pembuatan Larutan Stok dan Seri Larutan Baku Asam Ursolat (AU)

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Hasil penimbangan (g) 0,0100 0,0102 0,0101 Faktor koreksi 99% 99% 99% Konsentrasi stok (ppm) 990 1009,8 999,9

Konsentrasi seri 1 (ppm) C1 V1 = C2 V2

990x0,5 = C2x5 C2 = 99

C1 V1 = C2 V2 1009,8x0,5 = C2x5

C2 = 100,98

C1 V1 = C2 V2 999,9x0,5 = C2x5

C2 = 99,99

Konsentrasi seri 2 (ppm) C1 V1 = C2 V2 990x1 = C2x5

C2 = 198

C1 V1 = C2 V2 1009,8x1 = C2x5

C2 = 201,96

C1 V1 = C2 V2 999,9x1 = C2x5

C2 = 199,98


990x1,5 = C2x5 C2 = 297

C1 V1 = C2 V2 1009,8x1,5 = C2x5

C2 = 302,94

C1 V1 = C2 V2 999,9x1,5 = C2x5

C2 = 299,97

Konsentrasi seri 4 (ppm) C1 V1 = C2 V2 990x2 = C2x5

C2 = 396

C1 V1 = C2 V2 1009,8x2 = C2x5

C2 = 403,92

C1 V1 = C2 V2 999,9x2 = C2x5

C2 = 399,96


990x2,5 = C2x5 C2 = 495

C1 V1 = C2 V2 1009,8x2,5 = C2x5

C2 = 504,9

C1 V1 = C2 V2 999,9x2,5 = C2x5

C2 = 499,95

2. Linearitas

Baku asam ursolat Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Seri baku (ppm) AUC Seri baku

(ppm) AUC Seri baku (ppm) AUC

99 5372,3 100,98 3799,9 99,99 4827,6 198 8513,7 201,96 6414 199,98 7929,2 297 10876,4 302,94 8375,7 299,97 10252,4 396 11673 403,92 9301,5 399,96 11668,8 495 13860,3 504,9 11491,7 499,95 14614,9

A 4018,55 A 2395,23 A 2864,32 B 20,3387 B 18,0938 B 23,3165 r 0,9816 r 0,9893 r 0,9933


92

3. Akurasi dan Presisi

Seri baku (ppm) AUC 99,99 4225,8 A = 2666,87

B = 19,3136 r = 0,9952

y = 19,3136x + 2666,87

199,98 6906,2 299,97 8596 399,96 10478,3 499,95 12095,6

Kadar

sebenarnya (ppm)

AUC Kadar terukur (ppm)

Recovery

(%)

Rendah 99

100,98 99,99

4406,2 4505,3 4779,9

90,057 95,188 109,406

90,967 94,265 109,417

SD = 3023,26 CV = 3,013

Rata-rata 98,217 98,216

Tengah 297

302,94 299,97

8281,3 8304,8 9142,7

290,698 291,915 335,299

97,878 96,361 111,778

SD = 1811,57 CV = 0,563

Rata-rata 305,971 102,005

Tinggi 495

504,9 499,95

12300,1 12652,4 12172,7

498,780 517,021 492,183

100,764 102,401 98,447

SD = 5338,94 CV = 1,057

Rata-rata 502,661 100,537

y = 19.314x + 2666.9R² = 0.9905

02000400060008000

100001200014000

0 100 200 300 400 500 600

AU

C

Konsentrasi (ppm)

Kurva Baku untuk Akurasi dan Presisi


93

4. Selektivitas

Replikasi sampel

Rf1 Rf2 Resolusi

2(max 푅푓2 − max 푅푓1)(푒푛푑 푅푓1 − 푠푡푎푟푡 푅푓1) + (푒푛푑 푅푓2 − 푠푡푎푟푡 푅푓2)

Max Start End Max Start End

1 0,34 0,31 0,38 0,43 0,40 0,46 1,58 2 0,34 0,31 0,38 0,43 0,40 0,45 1,50 3 0,34 0,31 0,38 0,42 0,40 0,45 1,53 4 0,34 0,31 0,38 0,43 0,41 0,45 1,62 5 0,34 0,31 0,38 0,43 0,40 0,45 1,67

Keterangan Rf1 : retardation factor untuk bercak asam ursolat Rf2 : retardation factor untuk bercak yang paling dekat dengan bercak asam ursolat

5. Akurasi dan Presisi dalam Matriks Sampel

Seri baku (ppm) AUC 99,99 5087,9 A = 3265,75

B = 21,8803 r = 0,9932

y = 21,8803x + 3265,75

199,98 7789,7 299,97 10468,7 399,96 11755,6 499,95 14044

Sampel AUC Kadar (ppm) Ekstrak replikasi 1 9265 274,18 Ekstrak replikasi 2 9226,3 272,42 Ekstrak replikasi 3 9219,2 272,09

Ekstrak adisi replikasi 1 11466,3 374,79 Ekstrak adisi replikasi 2 11393,7 371,47 Ekstrak adisi replikasi 3 11491,8 375,96

y = 21.88x + 3265.7R² = 0.9864

0

5000

10000

15000

0 100 200 300 400 500 600

AU

C

Konsentrasi (ppm)

Kurva Baku untuk Akurasi dan Presisi dalam Matriks Sampel


94

Sampel Recovery baku (%) Rata-rata SD CV (%)

Ekstrak adisi replikasi 1 100,617 101,187 2,45 2,426 Ekstrak adisi replikasi 2 99,067

Ekstrak adisi replikasi 3 103,876 Lampiran 8. Perhitungan Kadar Triterpen Total 1. Kurva Baku Penetapan Kadar Triterpen Total

Seri baku (ppm) AUC

99,99 4332,5 A = 2699,34 B = 18,5913 r = 0,9931

y = 18,5913x + 2699,34

199,98 6655,8 299,97 8615,4 399,96 9644 499,95 12133,1

2. Contoh Perhitungan Kadar Sampel perlakuan a (30oC, 2 jam) replikasi 1 (AUC = 9244,7) - Kadar triterpen total terukur (x)

y = 18,5913x + 2699,34 9244,7 = 18,5913x + 2699,34 6545,36 = 18,5913x x = 352,066 ppm = 352,066 mg/1000 mL

y = 18.591x + 2699.3R² = 0.9862

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

0 100 200 300 400 500 600

AU

C

Konsentrasi (ppm)

Kurva Baku Penetapan Kadar


95

- Jumlah triterpen total dalam 10 mL larutan sampel (a) a = 352,066 mg / 100 = 3,521 mg

- Jumlah triterpen total dalam 5 mL ekstrak (b) b = a = 3,521 mg

- Jumlah triterpen total dalam 50 mL ekstrak (c) c = b x 10 = 35,21 mg

- Jumlah triterpen total dalam 5 gram serbuk simplisia (d) d = c = 35,21 mg = 0,0352 g

- % b/b triterpen total terhadap berat serbuk simplisia (e) e = (c / berat serbuk simplisia awal) x 100% = (0,0352 g / 5,0001 g) x 100% = 0,704 % b/b


96

3. Hasil Perhitungan Kadar Triterpen Total (TT)

Perlakuan Replikasi AUC Kadar (ppm)

Jumlah TT dalam 5 mL ekstrak (mg)

Volume Etanol (mL)

Jumlah TT dalam 5 g

serbuk (mg)

Berat serbuk

(g)

% b/b TT terhadap

berat serbuk

Rata-rata kadar TT (% b/b)

SD % CV

1 1 9244,7 352,066 3,521 50 35,207 5,0001 0,704

0,699 0,018 2,569 2 9340,4 357,213 3,572 50 35,721 5,0001 0,714 3 9015,3 339,727 3,397 50 33,973 5,0000 0,679

a 1 9353,1 357,896 3,579 50 35,790 4,9995 0,716

0,738 0,023 3,170 2 9542,3 368,073 3,681 50 36,807 4,9997 0,736 3 9787,1 381,241 3,812 50 38,124 4,9996 0,763

b 1 9384,7 359,596 3,596 50 35,960 5,0000 0,719

0,727 0,012 0,170 2 9394,7 360,134 3,601 50 36,013 5,0001 0,720 3 9590,4 370,661 3,707 50 37,066 5,0012 0,741

ab 1 10167,8 401,718 4,017 50 40,172 5,0000 0,803

0,798 0,059 7,449 2 9541,4 368,025 3,680 50 36,802 5,0000 0,736 3 10642,7 427,262 4,273 50 42,726 4,9997 0,855


97

Lampiran 9. Data Rendemen Ekstrak

Perlakuan Replikasi Berat botol timbang (g) Berat botol timbang + ekstrak kering (g)

Berat ekstrak kering (g)

Rendemen ekstrak kering (%)

Rata-rata rendemen (%)

1 1 19,2750 19,2986 0,0236 4,720

4,873 2 19,8265 19,8493 0,0228 4,560 3 19,2215 19,2482 0,0267 5,340

a 1 20,9205 20,9568 0,0363 7,261

7,154 2 19,0054 19,0412 0,0358 7,160 3 18,0738 18,1090 0,0352 7,041

b 1 21,0709 21,0972 0,0263 5,260

5,186 2 18,7993 18,8255 0,0262 5,240 3 18,6869 18,7122 0,0253 5,059

ab 1 21,7222 21,7580 0,0358 7,160

7,273 2 19,6371 19,6735 0,0368 7,280 3 20,7362 20,7731 0,0369 7,380


98

Lampiran 10. Notasi Desain Faktorial dan Percobaan Desain Faktorial 1. Notasi

Formula Faktor A Faktor B Interaksi

1 -1 -1 +1 a +1 -1 -1 b -1 +1 -1 ab +1 +1 +1

Keterangan: Tanda (+) : Level tinggi Tanda (-) : Level rendah Faktor A : Suhu Faktor B : Waktu ekstraksi

2. Percobaan Desain Faktorial

Formula Suhu (oC) Waktu Ekstraksi 1 30 2 a 60 2 b 30 4 ab 60 4

Lampiran 11. Data Desain Faktorial lm(formula = respon ~ a + b + a * b, data = data) Coefficients: (Intercept) a b a:b 0.6652000 0.0002200 -0.0023667 0.0005378 Residual standard error: 0.03376 on 8 degrees of freedom Multiple R-squared: 0.6308, Adjusted R-squared: 0.4924 F-statistic: 4.556 on 3 and 8 DF, p-value: 0.03834 Analysis of Variance Table Response: respon Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) a 1 0.0090750 0.0090750 7.9640 0.02242 * b 1 0.0057203 0.0057203 5.0200 0.05538 . a:b 1 0.0007809 0.0007809 0.6853 0.43178 Residuals 8 0.0091161 0.0011395 P<0,05 (significant) 1. Persamaan Desain Faktorial

Intercept : 0.6652000 a : 0.0002200 b : -0.0023667 a:b : 0.0005378


99

0.68

0.73

0.78

20 40 60Kada

r tr

iter

pen

tota

l (%

b/b

)

Suhu (oC)

Grafik Hubungan Suhu Terhadap Kadar Triterpen Total

waktu level tinggi waktu level rendah

0.68

0.73

0.78

1 3 5Kada

r tr

iter

pen

tota

l (%

b/b)

Waktu (Jam)

Grafik Hubungan Waktu Terhadap Kadar Triterpen Total

suhu level tinggi suhu level rendah

y = 0.6652 + 0.00022xa - 0.0023667xb + 0.0005378xaxb

2. Perhitungan Nilai Efek

Formula Suhu Waktu Interaksi Rata-rata kadar TT (% b/b) 1 -1 -1 +1 0,699 a +1 -1 -1 0,738 b -1 +1 -1 0,727 ab +1 +1 +1 0,798

Efek suhu = , , , , = 0,055 Efek waktu ekstraksi = , , , , = 0,044 Efek interaksi = , , , , = 0,016

3. Signifikansi

Factor or interaction Experiment df M of squares F value Suhu a 1 0.0090750 7.9640 Waktu ekstraksi b 1 0.0057203 5.0200 Interaksi ab 1 0.0007809 0.6853 Experimental error 8 0.0011395 Total 11

F tabel dengan tingkat kepercayaan 95% adalah 5,32

4. Grafik Hubungan Nilai Efek


100

Lampiran 12. Optimasi Fase Gerak 1. Kromatogram hasil elusi dengan fase gerak toluen - aseton - asam asetat (100:3:0,07

v/v)

2. Kromatogram hasil elusi dengan fase gerak toluen - aseton - asam asetat (95:5:0,07 v/v)


101




102


Perbandingan (v/v) Rf As Rs Indeks Polaritas 100 : 3 : 0,07 0,06 1,00 1.38 2.4812 97 : 3 : 0,07 0,09 0,80 1,14 2,4836 96 : 4 : 0,07 0,15 0,91 1,23 2,5106 95 : 5 : 0,07 0,26 0,83 1,29 2,5376 90 : 10 : 0,07 0,50 1,00 1,67 2,6725


103

Lampiran 13. Kromatogram Kurva Baku Asam Ursolat Replikasi 3 1. Seri 1 (99,99 ppm)

2. Seri 2 (199,98 ppm)

3. Seri 3 (299,97 ppm)


104

4. Seri 4 (399,96 ppm)

5. Seri 5 (499,95 ppm)

Lampiran 14. Kromatogram Akurasi dan Presisi Metode 1. Kadar Rendah Replikasi 1


105

2. Kadar Tengah Replikasi 1

3. Kadar Tinggi Replikasi 1

4. Kadar Rendah Replikasi 2


106



7. Kadar Rendah Replikasi 3


107



Lampiran 15. Kromatogram Akurasi dan Presisi dalam Matriks Sampel 1. Sampel Tanpa Adisi Replikasi 1


108

2. Sampel Tanpa Adisi Replikasi 2

3. Sampel Tanpa Adisi Replikasi 3

4. Sampel Dengan Adisi Baku Replikasi 1


109




110

Lampiran 16. Kromatogram Penetapan Kadar 1. Ekstrak Kondisi (1) (30oC, 2 jam) Replikasi 1

2. Ekstrak Kondisi (1) (30oC, 2 jam) Replikasi 2

3. Ekstrak Kondisi (1) (30oC, 2 jam) Replikasi 3


111

4. Ekstrak Kondisi (a) (60oC, 2 jam) Replikasi 1




112

7. Ekstrak Kondisi (b) (30oC, 4 jam) Replikasi 1




113

10. Ekstrak Kondisi (ab) (60oC, 4 jam) Replikasi 1

11. Ekstrak Kondisi (ab) ( 60oC, 4 jam) Replikasi 2

12. Ekstrak Kondisi (ab) (60oC, 4 jam) Replikasi 3


114

Lampiran 17. Dokumentasi 1. Rumput Mutiara (Hedyotis corymbosa

(L.) Lamk)

2. Sistem Digesti

3. Penyaringan dengan vaccum 4. Defatisasi

5. Serbuk Simplisia 6. Ekstrak Cair


115

7. Pengeringan Ekstrak dengan Waterbath

8. Ekstrak Kering

9. Instrumen KLT-Densitometri

10. Sampel yang Siap Ditotol 11. Sistem KLT


116

12. Hasil Elusi Sebelum Derivatisasi 13. Plat yang telah disemprot Reagen Pendeteksi, diamati di bawah UV 254 nm

14. Hasil Derivatisasi pada Sampel Penetapan Kadar


117

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul Optimasi Suhu dan Waktu Ekstraksi Dalam Proses Digesti Herba Rumput Mutiara (Hedyotis corymbosa (L.) Lamk) Dengan Aplikasi Desain Faktorial ini bernama lengkap Lilia Cresensia Yuniarty Rogan. Penulis dilalahirkan di Kupang pada tanggal 6 Juni 1991 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara, dari pasangan Robertus Rogan dan Eleonora Iswantinah. Pendidikan formal yang pernah ditempuh penulis adalah menyelesaikan pendidikannya di SDK St. Yoseph 2 Kupang (1997-2003), di SMPK St. Theresia Kupang (2003-2006), dan di SMAK

Giovanni Kupang (2006-2008). Penulis kemudian melanjutkan pendidikannya di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2008. Selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, penulis terlibat dalam berbagai kegiatan dan kepanitiaan, antara lain Kampanye Informasi Obat 2008 (peserta), Kampanye Informasi Obat 2009 (Sie Humas), Pengobatan Gratis 2010 (Sekretaris). Di bidang akademik, penulis pernah melakukan magang penelitian di Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun akademik 2010/2011, menjadi asisten dosen praktikum Kimia Dasar (2009 dan 2010), asisten dosen praktikum Spektroskopi (2010), asisten dosen praktikum Farmasi Fisika (2011), dan asisten dosen praktikum FTS Semi Solid Liquid (2011).


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk · optimasi suhu dan waktu ekstraksi dalam...

Documents