KULIAH PVMA FARMASI 8

VALIDASI METODE PENGUJIAN KIMIA(VALIDASI MAK)

1. VALIDASI

VALIDASI ADALAH SUATU KEGIATAN PEMBUKTIAN KESESUAIAN DENGAN PRINSIP-PRINSIP CRM (Certified Reference Materials) BAHWA PROSEDUR, PROSES, PERALATAN, MATERIAL, AKTIVITAS, ATAU SISTEM SECARA NYATA MEMBERIKAN HASIL SESUAI DENGAN YANG TELAH DITETAPKAN.

VALIDASI ADALAH SUATU PROSES UNTUK MEMAS TIKAN BAHWA SUATU PROSEDUR DILAKUKAN SESUAI DENGAN SYARAT VALIDASI

VALIDASI MAK ADALAH SUATU TINDAKAN PENILAIAN TERHADAP PARAMETER TERTENTU, BERDASARKAN PERCOBAAN LABORATORIUM, UNTUK MEMBUKTIKAN BAHWA PARAMETER TERSEBUT MEMENUHI PERSYARATAN UNTUK PENGGUNAANNYA.

TUJUAN UNTUK MEMBUKTIKAN BAHWA SUATU PROSEDUR PADA PELAKSANAANNYA YANG TEPAT MENGHASILKAN HASIL ANALISIS YANG FIT FOR PURPOSE YAITU SELALU MEMBERIKAN HASIL YANG DAPAT DIPERCAYA SESUAI TUJUAN PENGGUNANNYA/ HANDAL/ABSAH.

1

2

RUANG LINGKUP METODE YANG MEMERLUKAN VALIDASI ADALAH :

a. METODE YANG BARU DIKEMBANGKAN KARENA KARAKTERISTIK UNTUK KERJANYA BELUM DIKETAHUI.

b. METODE STANDAR YANG DIMODIFIKASI UNTUK PENGGUNAAN LAIN (MENGKONFIRMASI BAHWA METODE TERSEBUT SESUAI PENGGUNAAN YANG DIMAKSUD).

c. METODE STANDAR ATAU NON-STANDAR YANG DIGUNAKAN DI LABORATORIUM YANG BERBEDA, OLEH ANALIS YANG BERBEDA, ATAU MENGGUNA KAN INSTRUMEN YANG BERBEDA.

PARAMETER VALIDASI PARAMETER VALIDASI METODE YANG UMUM DILAKUKAN ADALAH :

a. SELEKTIVITAS (SPESIFISITAS)b. LINEARITASc. RANGEd. AKURASIe. PRESISIf. LIMIT OF DETECTION/LOD (BATAS DETEKSI)g. LIMIT OF QUANTITATION/LOQ (BATAS KUANTITASI)h. ROBUSTNESS (KETAHANAN)i. RUGGEDNESS (KETANGGUHAN).

j. KOST (BIAYA)

3

a. SELEKTIVITAS (SPESIFISITAS)

SELEKTIVITAS (SPESIFISITAS) ADALAH KEMAM PUAN UNTUK MENGUKUR ANALIT DALAM SUATU SAMPEL YANG MENGANDUNG KOMPONEN-KOM PONEN LAIN TANPA ADANYA INTERAKSI ANTAR KOMPONEN. JADI, HANYA ANALIT TERTENTU SAJA YANG TERUKUR DENGAN AKURAT. SELEKTIVITAS METODE DITENTUKAN DENGAN MEMBANDINGKAN HASIL ANALISIS SAMPEL YANG MENGANDUNG CEMARAN, HASIL URAI, SENYAWA SEJENIS, SENYAWA ASING LAINNYA DENGAN HASIL ANALISIS SAMPEL TANPA PENAMBAHAN BAHAN- BAHAN TERSEBUT.

b. LINEARITASLINEARITAS ADALAH KEMAMPUAN METODE

ANALISIS UNTUK MEMBERIKAN HASIL PENGUKU RAN YANG SECARA LANGSUNG PROPORSIONAL DENGAN RENTANG KONSENTRASI YANG DIBERI KAN (ATAU DENGAN BANTUAN TRANSFORMASI MATEMATIK). UNTUK PRODUK OBAT, LINEARITAS DITENTUKAN DENGAN MENGANALISIS TIGA REPLIKAT STANDAR DENGAN MINIMAL LIMA KONSENTRASI ANTARA 50%-150% KADAR ANALIT DALAM SAMPEL. KURVA DIANGGAP LINEAR JIKA KOEFISIEN KORELASI ≥ 0.98.[3]

4

c. RENTANG (Range)

RANGE ADALAH INTERVAL ANTARA KONSENTRASI TERTINGGI TERHADAP KONSENTRASI TERENDAH YANG DAPAT DIDETEKSI SECARA AKURAT DAN CERMAT UNTUK MEMBUKTIKANBAHWA METODE ANALISIS MENGHASILKAN PRESISI, AKURASI, DAN LINEARITAS YANG TEPAT.

d. AKURASI (KECERMATAN)

AKURASI ADALAH TINGKAT KEDEKATAN NILAI HASIL ANALISIS DENGAN NILAI YANG SEBENARNYA.AKURASI HARUS DITETAPKAN MENGGUNAKAN CRM (Certified Reference Materials) SEBAGAI SUMBER NILAINYA.PENGUJIAN AKURASI DILAKUKAN DENGAN:

1. MEMBUAT SATU KONSENTRASI LARUTAN STAN DAR CRM KEMUDIAN UJI SEBANYAK TUJUH KALI PENGULANGAN, HITUNG RATAAN KONSENTRASI YANG DIPEROLEH DAN STANDAR DEVIASINYA.

2. MEMBUAT SATU KONSENTRASI spiked sample (SAMPLE YANG DITAMBAHKAN ANALIT YANG DIKETAHUI JUMLAHNYA) DARI CRM KEMUDIAN UJI SEBANYAK TUJUH KALI PENGULANGAN, HITUNG RATAAN KONSENTRASI YANG DIPEROLEH DAN STANDAR DEVIASINYA.

5

AKURASI DINYATAKAN DENGAN :

RSD (Relative Standard Deviation/Simpangan Baku Relatif)

%Recovery (Perolehan kembali), dengan rumus :

(A – B) % Recovery = ----------- x 100 ................1.1 XKETERANGAN :

A = JUMLAH ANALIT TOTALB = JUMLAH ANALIT DALAM SAMPELX = BAHAN BAKU YANG DITAMBAHKAN

PADA SAMPEL KRITERIA PENERIMAAN AKURASI TERGANTUNG KEPADA JUMLAH ANALIT DALAM SAMPEL MATRIKSNYA. KRITERIA TERSEBUT TERTERA PADA TABEL SEBAGAI BERIKUT :

TABEL 1.1. HUBUNGAN ANTARA % ANALIT DALAM MATRIKS SAMPEL DENGAN RENTANG RATA- RATA Recovery YANG MASIH DAPAT DITERIMA

No % Analit dalam matriks sampel Rentang % Rata-rata Recovery1 100 98 – 1022 > 10 98 – 1023 > 1 97 – 1034 > 0,1 95 – 1055 0,01 90 – 1076 0,001 80 – 1107 0,0001 (1 ppm) 80 – 1108 0,00001 (100 ppb) 80 – 1109 0,000001 (10 ppb) 60 – 11510 0,0000001 (1 ppb) 40 – 120

Sumber: Validasi dan Verifikasi Metode Analisis, Prasetyaningtyas, A., Pelatihan Analisis dengan Instrumen, BPOM, 2003

6e. PRESISI (KESEKSAMAAN)

PRESISI ADALAH UKURAN YANG MENUNJUKKAN DERAJAT KESESUAIAN ANTAR HASIL UJI INDIVIDUAL, DIUKUR MELALUI PENYEBARAN HASIL INDIVIDUAL DARI RATA-RATA JIKA PROSEDUR DITERAPKAN SECARA BERULANG PADA SAMPEL YANG DIAMBIL DARI CAMPURAN YANG HOMOGEN. PRESISI DIUKUR DENGAN SIMPANGAN BAKU ATAU SIMPANGAN BAKU RELATIF. ADA TIGA KARAKTERISTIK YANG PERLU DIUKUR DALAM PENENTUAN PRESISI, YAITU : KEBERULANGAN/RIPITABILITAS (RESPON INSTRUMEN DAN SAMPEL), KETANGGUHAN, DAN REPRODUSIBILI TAS. KEBERULANGAN RESPON INSTRUMEN DIUJI DENGAN MEMBUAT STANDAR DENGAN KONSENTRASI MINIMAL DETEKSI, KEMUDIAN UJI DENGAN PENGU LANGAN ENAM SAMPAI SERATUS KALI. DATA YANG DIPEROLEH DIHITUNG %RSD (RELATIVE STANDARD DEVIATION/ SIMPANGAN BAKU RELATIF).[9]SECARA UMUM, NILAI RSD YANG MASIH DAPAT DITERIMA UNTUK RIPITABILITAS ADALAH :

TABEL 1.2 NILAI % RSD DARI BEBERAPA JENIS SAMPEL

No Jenis Sampel % RSD1 Bahan Baku Obat ≤ 1,0%2 Sediaan Obat ≤ 2,0%

3Cemaran/produk

degradasi (impurity)≤ 5,0%

Sumber: Validasi dan Verifikasi Metode Analisis, Prasetyaningtyas, A., Pelatihan Analisis dengan Instrumen, BPOM, 2003

7

KEBERULANGAN SAMPEL DIUJI DENGAN MEMBUAT SPIKED SAMPLE SEBANYAK TUJUH SAMPLE PADA SATU KONSENTRASI. UJI MASING-MASING SAMPEL DAN HITUNG KONSENTRASI YANG DIPEROLEH. KEMUDIAN HITUNG RATAAN KONSENTRASI DAN STANDAR DEVIASI. HITUNG BATAS KENDALI ATAS DAN BATAS KENDALI BAWAH DENGAN RUMUS : x ± 3σ

BATAS KENDALI = ---------- √n

KRITERIANYA MASING-MASING NILAI HARUS BERADA DIANTARA BATAS KENDALI ATAS(UPPER LIMIT) DAN BATAS KENDALI BAWAH(LOWER LIMIT).

f. BATAS DETEKSI (LIMIT OF DETECTION/LOD)

BATAS DETEKSI ADALAH JUMLAH TERKECIL ANALIT DALAM SAMPLE YANG DAPAT DIDETEKSI YANG MASIH MEMBERIKAN RESPON SIGNIFIKAN DIBANDINGKAN DENGAN BLANKO. BATAS DETEKSI METODE/METHOD DETECTION LIMIT (MDL) TERGAN TUNG PADA MATRIKS DAN PERLU DITETAPKAN UNTUK MASING-MASING TIPE MATRIKS DIMANA METODE TERSEBUT AKAN DIGUNAKAN. MDL DIHITUNG SEBAGAI NILAI T X SD (STANDAR DEVIASI) DARI KONSENTRASI HITUNG TUJUH SPIKED SAMPLE PADA SATU KONSENTRASI. NILAI T DIPEROLEH BERDASARKAN DERAJAT KEBEBASAN DATA DAN TINGKAT KEPER CAYAAN YANG DIGUNAKAN. BATAS DETEKSI INSTRUMEN/INSTRUMENT DETECTION LIMIT (IDL) MERUPAKAN KONSENTRASI ANALIT YANG

8

MENGHASILKAN SINYAL YANG SAMA DENGAN 3 KALI SIMPANGAN BAKU (standar deviasi) RESPON TERENDAH DARI ANALIT. RESPON TERENDAH INSTRUMEN TERSEBUT DIPEROLEH DARI PERCOBAAN.

g. BATAS KUANTITASI (Limit of Quantitation/LOQ)

BATAS KUANTITASI MERUPAKAN PARAMETER PADA ANALISIS RENIK DAN DIARTIKAN SEBAGAI KUANTITAS TERKECIL ANALIT DALAM SAMPEL YANG MASIH DAPAT MEMENUHI KRITERIA CERMAT DAN SEKSAMA. BATAS KUANTITASI DITENTUKAN DENGAN MENGUJI COBA RESPON TERENDAH ANALIT PADA KONSENTRASI TERTENTU, BIASANYA SEBANYAK 6 SAMPAI 10 KALI. KEMUDIAN DIHITUNG STANDAR DEVIASINYA HARUS LEBIH KECIL DARI 20%. NILAI LOQ ADALAH RATA-RATA RESPON TERENDAH DITAMBAH 10 KALI STANDAR DEVIASI.

h. KETAHANAN (Robustness)

ROBUSTNESS ADALAH KEPEKAAN DARI SUATU METODE ANALITIK TERHADAP PENYIMPANGAN MINOR DALAM KONDISI EKSPERIMENTAL DARI METODE.PENYIMPANGAN MINORNYA BERUPA PH, SUHU, LAMA EKSTRAKSI, DAN LAIN-LAIN, YANG DILAKUKAN DE NGAN SENGAJA DENGAN MEMBUAT VARIASI DALAM PARAMETER METODE ANALISIS UNTUK MENGETAHUI KETAHANANNYA.

9

i. KETANGGUHAN (Ruggedness)

RUGGEDNESS ADALAH DERAJAT KEBERULANGAN HASIL PENGUJIAN YANG DIPEROLEH DARI SAMPEL YANG SAMA DAN DIUJI PADA KONDISI YANG BERBEDA, SEPERTI LABORATORIUM YANG BERBEDA, ANALIS YANG BERBEDA, INSTRUMEN YANG BERBEDA, LOT REAGEN/PEREAKSI YANG BERBEDA, WAKTU PENGU JIAN YANG BERBEDA, TEMPERATUR PENGUJIAN YANG BERBEDA, HARI PENGUJIAN YANG BERBEDA, DAN LAIN-LAIN.

j. KOST (BIAYA)

PENENTUAN BIAYA UNTUK MELAKSANAKAN PENGU KURAN DENGAN MAK TERMASUK HAL PERLU DIPERHA TIKAN AGAR BIAYA JANGAN TERLALU TINGGI DAN DAPAT DILAKSANAKAN DENGAN MURAH.

2. KATAGORI MAK UNTUK FARMASI

PADA INDUSTRI FARMASI PENGEMBANGAN PRO DUK OBAT BIASANYA MELIBATKAN BANYAK PROSE DUR ANALISIS YANG BERBEDA. METODE ANALISIS MEMERLUKAN PARAMETER VALIDASI YANG SESUAI DENGAN TUJUAN METODE ATAU JENIS PENGUJIANNYA.

10

MENURUT USP (United States Pharmacopoeia), METODE ANALISIS TERDIRI DARI EMPAT KATEGORI, YAITU :

KATEGORI I : METODE ANALISIS UNTUK KUANTITASI (PENETAPAN KADAR) KOMPONEN UTAMA BAHAN BAKU, TAMBAHAN PANGAN ATAU BAHAN PENOLONG, TERMASUK PENGA WET.KATEGORI II:METODE ANALISIS UNTUK PENETAPAN KETIDAKMURNIAN (CEMARAN) DALAM BAHAN BAKU, ATAU SENYAWA TERURAI DALAM PRODUK JADI.KATEGORI III: METODE ANALISIS UNTUK PENETAPAN KARAKTERISTIK PERFORMA SEPERTI KELARUTAN, DAN TITIK LEBUR.KATEGORI IV : UJI IDENTIFIKASI.

TABEL 2.4. PARAMETER VALIDASI YANG DIPERLUKAN DALAM VALIDASI METODE ANALISIS

NoParameter

ValidasiKategori

I

Kategori IIKategori

IIIKategori

IVUji

Kuantitatif

Uji batas

1 Akurasi Ya Ya * * Tidak2 Presisi Ya Ya Tidak Ya Tidak3 Selektivitas Ya Ya Ya * Ya4 Batas Deteksi Tidak Tidak Ya * Tidak5 Batas Kuantitasi * Ya Tidak * Tidak6 Linearitas Ya Ya Tidak * Tidak7 Rentang Ya Ya * * Tidak

Sumber: Guidliness for The Validation of Analytical Methods for Active Constituent, Agricultural and Veterinary Chemical Products. APVMA (Australian Pesticides and Veterinary Medicines Authority).Kingston.2004.KETERANGAN : *= MUNGKIN DIPERLUKAN TERGAN TUNG PADA JENIS/SIFAT SPESIFIK UJI. YA= PERLU DILAKUKAN.

TIDAK = TIDAK PERLU DILAKUKAN.