Kromatografi Kolom Vakumabstrak

Pemurnian kromatografi merupakan bagian terpadu dari sintesis organik. Kering Kolom Vacuum Chromatography disajikan di sini, memiliki kekuatan menyelesaikan baik, mudah diterapkan pada kromatografi skala besar (hingga 100 g) dan cepat. Selain itu, teknik ini ekonomis dan ramah lingkungan karena penurunan yang signifikan dalam pelarut dan jumlah silika digunakan. Oleh karena itu, alternatif yang sangat baik untuk umum digunakan flash Kolom Kromatografi untuk pemurnian dalam sintesis organik.Dalam upaya kami untuk mensintesis jumlah besar dari LNA NRTI, 1,2 kita secara teratur memurnikan jumlah hingga 100 g sangat functionalised nukleosida dan karbohidrat derivatif. Silika gel teknik kromatografi kolom konvensional termasuk flash Kolom Chromatography3 mampu pemisahan miskin nilai yang melebihi 10 g menuntut pemurnian campuran reaksi setelah pembagian ke dalam beberapa batch kecil. Hal ini tidak layak karena jumlah besar silika gel, pelarut dan waktu yang dibutuhkan.Dalam pencarian kami untuk metode yang sederhana dan efisien untuk pemisahan skala besar campuran kompleks, kami menemukan kembali dan selanjutnya mengembangkan teknik pertama kali dijelaskan oleh LM Harwood disebut "Kolom kering" flash Chromatography.4 Teknik ini telah terutama digunakan untuk perusahaan kecil hingga menengah pemurnian skala ( 95% murni dengan HPLC. Jika pemisahan yang lebih baik yang diinginkan gradien pelarut yang berbeda dan koleksi fraksi yang lebih kecil biasanya meningkatkan hasilnya.Untuk mendapatkan pemisahan yang baik, pilihan jenis silika yang benar adalah penting. Resolusi ditentukan oleh ukuran partikel. Sebagai panduan kasar, mengurangi ukuran partikel memberikan resolusi yang lebih baik. Di sisi lain, partikel yang terlalu kecil akan menghasilkan kolom yang sangat kompak yang terelusi sangat lambat. Menurut inventor6 dan lain-lain, 7 TLC silika tanpa pengikat gipsum (5-25 m) harus digunakan untuk DCVC karena lebih murah daripada silika digunakan untuk kromatografi biasa (misalnya flash Kolom Kromatografi) dan karena "biasa" silika terlalu bebas mengalir untuk memungkinkan mudah kolom packing. Hal ini juga berlaku di tangan kita untuk Merck Silica Gel 60 (40-63 mm) digunakan untuk Flash Kolom Kromatografi karena prosedur kemasan normal tidak menghasilkan kolom yang cukup kompak. Akibatnya, pelarut hanya menuangkan melalui kolom affording pemisahan sangat miskin. Jika kolom dikemas menggunakan pompa vakum tinggi, kolom kompak dengan pemisahan yang baik dapat disiapkan. Namun, pendekatan ini tidak diinginkan karena beberapa alasan, sebagian besar dari semua karena waktu yang lama diperlukan untuk mempersiapkan kolom tersebut.Jika Merck Silica Gel 60 (15-40 mm) digunakan, masalah dihindari. Kami telah mengalami masalah ketika menggunakan Merck Silica Gel 60 (15-40 m) bukan TLC silika (5-25 m) dan di tangan kita saat yang sama diperlukan untuk mempersiapkan kolom dengan kedua jenis silika. Meskipun sulit untuk mereproduksi kondisi kromatografi yang tepat, data menunjukkan bahwa TLC silika (5-25 m) tanpa pengikat gipsum menawarkan pemisahan sedikit lebih baik dibandingkan dengan Merck Silica Gel 60 (15-40 mm) seperti yang diharapkan karena partikel yang lebih kecil ukuran. TLC silika (5-25 m) adalah sekitar 10-15% lebih murah daripada Merck Silica Gel 60 (15-40 mm). Selain itu, kolom dikemas dengan TLC silika (5-25 m) membutuhkan sekitar 10-15% lebih sedikit silika massa dibandingkan dengan Merck 60 (15-40 mm). Namun, kolom dikemas dengan TLC silika menjadi sangat kompak dan karena itu secara signifikan lebih lambat di eluting.Silika pilihan kami adalah Merck Silica Gel 60 (15-40 m) karena menawarkan resolusi yang sangat baik dan memberikan jauh lebih cepat eluting kolom daripada yang dikemas dengan TLC silika.Sebuah contoh khas dari campuran senyawa yang dipisahkan berhasil ditunjukkan pada Gambar 3. TLC analisis dari campuran senyawa dalam 10% n-heptana, 90% etil asetat (v / v) menunjukkan 4 senyawa dengan nilai Rf: 0,45 (1 ), 0,25 (2), 0,20 (3) dan 0,10 (4). Senyawa yang berhasil dipisahkan dan terisolasi pada skala 10 g dalam 1,5 jam termasuk kemasan kolom, elusi dan penguapan fraksi pelarut yang mengandung senyawa murni. Kolom (diameter 10 cm, tinggi 5 cm, Merck silika gel 60, 15-40 mm) dielusi dengan 0-100% etil asetat dalam n-heptana (v / v) dengan 5% kenaikan konsentrasi etil asetat untuk setiap fraksi dikumpulkan (dua puluh satu fraksi 100 mL). Setelah isolasi, identitas senyawa digambarkan di bawah ini didirikan oleh NMR. Senyawa yang diinginkan 2 diisolasi di 98 +% kemurnian oleh HPLC dan 1H-NMR.Kesimpulannya, DCVC menyediakan metode yang kuat, cepat dan ekonomis untuk besar serta pemisahan skala kecil. Selain itu, teknik ini unggul dalam kekuatan resolusi Flash Kromatografi Kolom karena mengurangi difusi selama pemisahan kromatografi. Ini berarti bahwa setiap senyawa terelusi dalam pecahan lebih sedikit dan kurang kontaminasi silang dari fraksi diamati.Kami telah menggunakan Kolom Dry Vacuum Chromatography untuk pemurnian berbagai campuran kompleks terdiri nukleosida sangat functionalised dan karbohidrat dengan hasil yang sangat baik. Hal ini dimungkinkan untuk melakukan DCVC menggunakan campuran nonchlorinated, pelarut nonvolatile seperti n-heptana, etil asetat dan metanol. Ini dan jumlah sangat berkurang silika digunakan dibandingkan dengan teknik lain mengurangi dampak lingkungan dari proses. Pemisahan senyawa dengan Rf ~ 0.05 (oleh analitis TLC) setidaknya harus diharapkan, tetapi dengan pengalaman pemisahan seefisien mereka dengan analisis TLC dapat dicapai.Peralatan kromatografi dirakit seperti yang digambarkan pada Gambar 2a atau 2b. Analytical TLC dilakukan dengan menggunakan Merck 5554 lembar silika 60 aluminium. Silika digunakan untuk DCVC adalah Merck 15.111 silika gel 60 (15-40 mm) dan Merck 9385 silika gel 60 (40-63 m) yang dibeli dari Merck Eurolab. TLC silika tanpa pengikat (5-25 m) dibeli dari Sigma-Aldrich Denmark. Pelarut yang kelas HPLC dari LABSCAN. Vacuum diaplikasikan dengan pompa Vacuubrand MZ 2C diafragma vakum (1,7 m3 / h, 10 mbar) bukannya aspirator air untuk alasan enviromental. Corong kaca masir (porositas 3) dengan diameter hingga 17 cm tersedia secara komersial.

Kolom kering Vacuum Chromatography

Kolom Packing: Sebagai panduan kasar, 1 cm2 permukaan silika dapat diisi sampai dengan kira-kira. 500 mg campuran senyawa. Namun, ukuran sampel per cm2 dapat meningkat secara substansial jika resolusi kurang diperlukan. Corong kaca harus minimal 7 cm dari sinter ke bibir memungkinkan setiap fraksi pelarut yang akan ditambahkan dalam satu batch bukan perlahan-lahan dituangkan ke permukaan silika. Sebuah silinder disinter corong kaca (porositas 3) diisi dengan 6-7 cm longgar Merck 15.111 silika gel 60 (15-40 mm) dan kemudian mengetuk untuk memberikan tingkat permukaan silika. Corong kaca ditempatkan dalam labu Buchner dan vakum diterapkan. Silika ditekan tegas dengan benda datar (kaca misalnya. Atau stopper karet) untuk memberikan datar, kolom silika yang dipadatkan sekitar. Tinggi 4,5-5,5 cm. Perhatian khusus harus diambil untuk kompres silika di lingkar corong kaca dengan spatula. Kolom diperiksa untuk void dan saluran dengan menuangkan n-heptana ke permukaan (dilindungi oleh kertas saring) sambil menerapkan vakum. Jika kolom telah disiapkan dengan baik, pelarut akan turun dalam garis horizontal. Jika hal ini tidak terjadi, kolom harus tersedot kering dan prosedur kemasan di atas diulang. Dengan senyawa asam sensitif, silika dapat pra-diobati dengan campuran 1-5% Et3N, n-heptana (v / v) selama prosedur kemasan.Dalam pengalaman kami, kolom tinggi dari sekitar. 4,5-5,5 cm tidak meningkatkan resolusi dan kolom pendek harus dihindari karena secara signifikan mengurangi daya pemisahan. Kolom pendek (app. 1-3 cm tinggi) bisa sangat baik untuk pemisahan yang sangat sederhana tapi benar-benar menyediakan lebih dari penyaringan dari langkah kromatografi yang sebenarnya.Contoh Aplikasi: Sambil menyiapkan kolom, campuran senyawa harus pra-teradsorpsi pada Merck silika gel 60 (15-40 mm) .11 Campuran dilarutkan dalam volume kecil menggunakan pelarut yang sesuai (misalnya campuran EtOAc dan MeOH) dan silika ditambahkan. Untuk mendapatkan pemisahan yang optimal diinginkan untuk menerapkan sampel pada kolom di setipis lapisan mungkin. Untuk alasan ini, tidak lebih dari ca. 1: 1 (w / w) silika harus digunakan untuk pra-adsorbsi. Pelarut dihapus dari bubur dengan pengurangan tekanan pada evaporator rotary. Sebuah splashguard harus digunakan karena silika memiliki kecenderungan untuk bertemu ketika hampir kering. Bubur tidak harus diuapkan untuk menyelesaikan kering dalam satu langkah karena ini dapat mengakibatkan kerak yang keras. Sebaliknya silika harus tergores bawah sisi labu sebelum pelarut terakhir telah dihapus (jika jenis kasar silika digunakan untuk pra-adsorpsi hal ini sangat mudah dihapus dari labu). Ketika silika kering, itu dipindahkan ke mortar dan tanah untuk memberikan bubuk halus yang ditambahkan dalam lapisan seragam tipis di atas kolom. Vakum diterapkan dan permukaan ditekan kuat seperti pada langkah kolom packing.Sistem Pelarut: Kolom ini dikembangkan oleh elusi gradien menggunakan sistem pelarut yang cocok. Bagi sebagian besar pemisahan, campuran n-heptana, EtOAc dan MeOH sangat baik. Campuran pelarut paling polar ditambahkan pertama diikuti oleh fraksi pelarut biasanya dengan 1-10% kenaikan dalam komponen yang paling polar. Sistem pelarut kami pilihan untuk kebanyakan pemisahan adalah 0-100% EtOAc dalam n-heptana (v / v) - dengan penambahan sebesar 5%. Untuk campuran yang sangat polar, adalah lebih baik untuk memulai dalam campuran pelarut yang lebih polar dari n-heptana, EtOAc dan beralih ke pelarut campuran EtOAc, MeOH ketika 100% EtOAc tercapai.Elusi: Ketika sistem pelarut telah diputuskan, vakum diterapkan pada kolom. Fraksi pelarut pertama dituangkan pada permukaan dilindungi kertas filter kolom. Sementara fraksi yang eluting fraksi berikutnya siap. Fraksi pelarut tidak boleh disiapkan sebelumnya karena ini terlalu memakan dan penguapan dapat mengakibatkan miskin gradien elusi waktu. Fraksi pelarut pertama biasanya hilang karena adsorpsi pada silika. Ketika fraksi telah tersedot melalui kolom (yaitu pelarut menetes perlahan dari kolom), udara diizinkan masuk ke setup dengan memutar tiga arah kran (Gambar 2) dan fraksi pelarut dikumpulkan. Vakum diterapkan lagi dan fraksi pelarut selanjutnya dituangkan ke permukaan kolom. Elusi senyawa dipantau oleh TLC.Sebagai aturan praktis, senyawa akan mengelusi dalam campuran pelarut di mana mereka memiliki nilai Rf sekitar 0,5 pada analisis TLC. Elusi senyawa sering co-terjadi dengan buih di bawah sinter tersebut. Ukuran pecahan dan peningkatan komponen yang lebih polar dalam sistem pelarut bervariasi dengan pemisahan yang diinginkan. Fraksi yang lebih kecil dan peningkatan lambat dalam polaritas meningkatkan resolusi signifikan, tetapi juga membutuhkan waktu lebih lama.

Tips dan Trik untuk Lab: Kolom Troubleshooting dan AlternatifKromatografi kolom adalah teknik pemurnian yang biasa digunakan di laboratorium di seluruh dunia. Dilakukan dengan benar sederhana dan cepat dapat mengisolasi senyawa yang diinginkan dari campuran. Tapi seperti banyak aspek kimia praktis, pengaturan cepat dan efisien dan berjalan kolom adalah sesuatu yang dapat mengambil tahun untuk menguasai. Berikut kami berikan beberapa tips dan trik untuk menjalankan kolom, tips untuk beberapa masalah umum yang dihadapi selama kromatografi kolom, dan beberapa "cepat dan kotor" alternatif untuk kolom penuh.Menjalankan KolomKami sebelumnya telah melihat bagaimana pak kolom dan bagaimana memilih peralatan dan pelarut yang diperlukan. Setelah Anda telah mengatur ini, Anda akan siap untuk memuat dan menjalankan kolom Anda. Memuat kolom melibatkan menempatkan sampel langsung ke bagian atas kolom dan memungkinkan untuk menyerap ke silika.Untuk memuat kolom:1.Dissolve sampel dalam jumlah minimum pelarut (5-10 tetes). Sebuah pelarut sedikit lebih polar daripada yang akan Anda gunakan untuk kolom dapat digunakan jika ini membantu dengan pembubaran sampel. Jika Anda perlu menggunakan pelarut seperti diklorometana atau sesuatu yang lebih kuat, metode kering-loading dijelaskan di bawah ini mungkin lebih.2.Dengan menggunakan pipet atau jarum suntik dengan jarum tebal, menetes sampel langsung ke atas silika. Cobalah untuk tidak mengganggu permukaan. Idealnya, sampel harus merata di seluruh permukaan secara sehingga membentuk sebuah band horisontal tipis.3.Setelah seluruh sampel telah ditambahkan, memungkinkan kolom untuk mengeringkan sehingga tingkat pelarut menyentuh bagian atas silika.4.Hati-hati menambahkan lapisan pasir (approx. 2-5 mm). Ini akan membantu mencegah permukaan silika dari yang terganggu sebagai pelarut lebih ditambahkan.5.Gunakan pipet untuk hati-hati menambahkan lebih pelarut sehingga tingkat pelarut adalah sekitar 10 mm di atas puncak pasir.6.Biarkan pelarut ini untuk mengalirkan sampai tingkat pelarut adalah sekitar 1-2 mm di atas puncak pasir.7.Ulangi langkah 5 dan 6 sekali atau dua kali lagi. Ini akan memastikan bahwa sampel Anda diserap ke silika.8.Akhirnya, tambahkan sebanyak pelarut yang diperlukan. Anda sekarang telah siap untuk mulai menjalankan kolom Anda.

Jika senyawa Anda memiliki kelarutan miskin dalam sistem pelarut yang memberikan pemisahan terbaik, adalah mungkin untuk mengeringkan memuat sampel ke kolom.

Untuk mengeringkan memuat senyawa Anda, Anda akan perlu:

Labu bulat-dipercaya

silika kering

Sebuah pelarut dimana sampel larut sepenuhnya

rotary evaporator

metode:

Larutkan sampel dalam pelarut yang sesuai. Transfer ke labu bulat-dipercaya jika tidak sudah dalam satu.Menambahkan silika kering untuk sampel terlarut (approx. 10-20 kali massa sampel).Swirl atau aduk perlahan untuk memastikan semua silika ditangguhkan dalam larutan.Lembut menguap pelarut dengan menggunakan rotary evaporator sampai silika kering dan bebas mengalir. Jika masih minyak, menambah silika dan ulangi prosedur.Hati-hati menambahkan pelarut untuk kolom Anda sehingga tingkat pelarut adalah sekitar 2-3 cm di atas bagian atas silika. Gunakan pipet untuk memastikan permukaan silika tidak terganggu.Tuangkan silika kering yang jenuh dengan sampel Anda ke dalam kolom dan memungkinkan untuk menetap. Pastikan bahwa tingkat pelarut selalu tetap di atas puncak silika dan tidak ada gelembung yang hadir. Cara terbaik untuk melakukannya adalah dengan menambahkan silika jenuh perlahan.Ikuti langkah 4-8 dari metode basah-loading yang dijelaskan di atas untuk sepenuhnya menyerap sampel ke kolom.