LABORATORIUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN 2011

TUJUANUntuk memisahkan senyawa-senyawa kimia

yang terdapat pada ekstrak tumbuhan (non-polar)

TEORIKromatografi kolom adalah kromatografi

yang dilakukan di dalam kolom, berupa tabung kaca, tabung logam, atau tabung plastik, dimana campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom, yang berisi penjerap. Pelarut atau fase gerak dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan gaya gravitasi. Pita senyawa linarut bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah, dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari kolom.

CARA MENGEMAS KOLOM1. Cara Basah

- selapis pasir/kapas/gelas wool dimasukkan ke dalam kolom- tabung diisi 2/3-nya dengan pelarut- penjerap dibuat lumpuran pada wadah lain- lumpuran dituangkan ke dalam kolom sedikit demi sedikit dan dibiarkan memadat- kolom dibiarkan atau dikondisikan paling sedikit selama satu jam dan paling lama 24 jam

2. Cara Kering- selapis pasir/kapas/gelas wool dimasukkan ke dalam kolom- penjerap dituangkan ke dalam kolom sedikit demi sedikit- setiap penambahan permukaan diratakan dan dimampatkan sampai 2/3 bagian kolom.- setelah semua penjerap dimasukkan, di atasnya diletakkan kertas saring dan ditambahkan lagi selapis pasir sehingga jika ditambahkan pelarut, permukaan penjerap tidak terganggu

- pelarut pengelusi dibiarkan mengalir ke bawah melalui penjerap dengan keran terbuka sampai pelarut tepat sedikit di atas bagian atas kolom- kolom dibiarkan atau dikondisikan paling sedikit selama satu jam dan paling lama 24 jam

MENAMBAHKAN SAMPELDalam keadaan biasa, sampel dilarutkan

dalam sedikit pelarut, ditambahkan ke bagian atas kolom dan dibiarkan mengalir ke bagian atas penjerap. Ditambahkan lagi pelarut dan kromatogram dikembangkan atau dilakukan pengelusian.

Jika sampel tidak begitu larut di dalam pelarut pengelusi atau pelarut yang kurang polar, maka sampel dapat dicampur dengan sedikit penjerap yang kemudian diletakkan pada bagian atas kolom

MENGELUSI/ MENGEMBANGKAN KROMATOGRAM

1. Pengelusi Landaian- berdasarkan deret eluotropi dimulai dari pelarut non polar sampai ke pelarut polar, - atau dengan mengkombinasi dua pelarut yang berbeda kepolarannya- untuk mendapatkan fraksi2 berdasarkan

kepolarannya2. Pengelusian Isokratik

- dipakai pelarut atau campuran pelarut yang sama untuk keseluruhan pengelusiannya- untuk mendapatkan isolat murni

MENDETEKSI SENYAWA YANG SUDAH DIPISAHKAN

1. Berdasarkan warnanya, jadi ditampung ke dalam vial dengan volume yang sama kemudian dilihat warnanya. Warna yang sama digabung selanjutnya di KLT, kromatogram yg sama digabung lagi

2. Ditampung ke dalam vial dengan volume yang sama kemudian di KLT dan dilihat kromatogramnya. Apabila sudah terdapat satu noda/isolate dianggap sudah murni.

SAMPEL

Dihaluskan

Disokletasi dalam n-Hexan sampai terendam hingga pelarutnya jernih

Disaring

RESIDU FILTRAT

Diuapkan hingga kering

Ditambahkan Silika Gel

Diaduk hingga menjadi serbuk yang siap di kromatografi kolom

HASIL

PROSEDUR PERCOBAAN

KOLOM

Dimasukkan kapas /gelas wool yang telah dibebaslemakkan dengan pelarut dan dikeringkan, ke dasar kolom

Ditambahkan fase gerak dan fase diam yang telah dibuat menjadi bubur

Diisi 2/3 bagian dari panjang kolom

Dialirkan fase gerak

Dibuka keran

Dialirkan pelarut hingga sekitar 1 cm di atas permukaan kolom

Ditutup kranKOLOM YANG TELAH

DIKEMAS

PENGEMASAN KOLOM

KOLOM YANG TELAH DIKEMAS

Dimasukkan sampel

Dibiarkan sampel turun

Ditambahkan pelarut perlahan-lahan melalui dinding kolom sampai jernih sambil keran dibuka

Dialirkan pelarut terus menerus

Ditampung eluen ke dalam vial, masing-masing 10 mL

Dihentikan elusi sampai semua pita (sampel) dalam kolom habis

ELUEN

ELUEN

Di KLT

Di gabung pola kromatogram yang sama menjadi 1 fraksi

Digambarkan kromatogram

Ditentukan harga Rf

HASIL

Fase Diam : Silika Gel Gf 254 (plat 20x20 cm)

Fase Gerak : n-Heksan : Etil Asetat (7 : 3) 100 mL

Visualisasi : H2SO4 50% dalam Metanol Pereaksi Liebermann- Bouchard