PENGANTAR KROMATOGRAFI

A. PENDAHULUAN

Takrif

Kromatografi merupakan teknik pemisahan senyawa campuran berdasarkan perbedaan

kecepatan migrasi, karena adanya perbedaan koefisien distribusi masing-masing senyawa di

antara dua fase yang saling bersinggungan dan tidak saling campur, yang disebut sebagai fase

gerak (mobile phase) yang berupa zat cair atau zat gas, dan fase diam (stationary phase) yang

berupa zat cair atau zat padat. Apabila pemilihan kedua fase dilakukan secara tepat, maka lambat

laun komponen sampel akan memisah. Aplikasi kromatografi berkembang dengan cepat

sehingga memungkinkan diperoleh suatu pemisahan, isolasi, dan identifikasi komponen-

komponen dengan struktur yang hampir sama satu dengan yang lain yang terdapat dalam suatu

sampel. Hal tersebut tidak mungkin diperoleh dengan cara pemisahan yang lain. Teknik

kromatografi digunakan pada hampir setiap metode analisis sampel kompleks karena

kemampuan pemisahannya, kecepatannya, dan penggunaan jumlah sampel yang sedikit.

Klasifikasi

Metode kromatografi secara umum dapat dibedakan berdasarkan fase gerak dan fase

diam yang digunakan. Berdasarkan fase gerak, kromatografi dibedakan menjadi kromatografi

gas (GC = gas chromatography) dan kromatografi cair (LC = liquid chromatography).

Berdasarkan fase diam dapat digunakan sebagai dasar klasifikasi selanjutnya. Padatan yang

bersifat sebagai adsorben, dapat digunakan sebagai fase diam dengan mekanisme pemisahan

berdasarkan kekuatan interaksi fisik permukaan (adsorpsi) di antara kedua fase. Bila fase

geraknya gas disebut kromatografi gas padat (GSC = gas solid chromatography), dan bila fase

geraknya cair disebut kromatografi cair padat (LSC = liquid solid chromatography). Fase diam

cair yang disalutkan pada penyangga padatan, dapat digunakan sebagai sebagai fase diam dengan

mekanisme pemisahan berdasarkan partisi komponen sampel di antara dua cairan yang tidak

saling campur. Bila fase geraknya gas disebut kromatografi gas cair (GLC = gas liquid

chromatography), dan bila fase geraknya cair disebut kromatografi cair cair (LLC = liquid liquid

chromatography). Dengan demikian, kromatografi cair-cair disebut juga sebagai kromatografi

partisi dan kromatografi cair padat disebut juga sebagai kromatografi penjerapan / adsorpsi.

Dalam kromatografi cair dikenal dua metode yang lain, yaitu kromatografi penukar ion (IEC =

ion exchange chromatography) dan kromatografi eksklusi (EC = exclusion chromatography).

Pada kromatografi penukar ion, komponen ionik sampel dipisahkan berdasarkan pertukaran

selektif dengan ion counter pada fase diam. Pada kromatografi eksklusi pemisahan terjadi

berdasarkan ukuran dan geometri molekul.

Berdasarkan kepolaran relatif fase diam terhadap fase gerak, maka kromatografi

dibedakan menjadi kromatografi fase normal (normal phase) dan fase terbalik (reversed phase).

1

Pada kromatografi fase normal digunakan fase diam polar dan fase gerak nonpolar, sedangkan

pada kromatografi fase terbalik, fase diam relatif nonpolar dibanding fase gerak.

Berdasarkan instrumen yang digunakan, kromatografi dibedakan menjadi kromatografi

kolom dan kromatografi planar. Apabila fase diam dipadatkan di dalam pipa gelas atau pipa

logam, kemudian fase gerak gas atau cair dialirkan melalui fase diam tersebut berdasarkan

gravitasi ataupun dengan tekanan, maka cara ini disebut sebagai kromatografi kolom. Apabila

fase diam berupa kertas berpori (kromatografi kertas) ataupun padatan halus yang diratakan pada

plat gelas atau plat aluminium (kromatografi lapis tipis), kemudian fase gerak cair akan bergerak

karena pengaruh daya kapilaritas (metode ascendens) atau gravitasi (metode descendes), maka

cara ini disebut sebagai kromatografi planar.

II. KOEFISIEN PARTISI ATAU KONSTANTA DISTRIBUSI

Apabila solut masuk ke dalam suatu sistem kromatografi, maka akan segera terdistribusi

di antara fase diam dan fase gerak. Bila aliran fase gerak dihentikan, maka akan terjadi

kesetimbangan di antara kedua fase. Distribusi molekul-molekul solut di antara kedua fase

ditentukan oleh tetapan kesetimbangan yang disebut koefisien partisi atau konstanta distribusi

(K), yang merupakan harga perbandingan konsentrasi solut pada tiap fase:

Cs adalah konsentrasi solut dalam fase diam (stationary phase), dan Cm adalah konsentrasi solut

dalam fase gerak (mobile phase).

2

KROMATOGRAFI KERTAS

A. PENDAHULUAN

Mekanisme pemisahan pada kromatografi kertas (KK) umumnya berdasarkan partisi

sehingga teknik ini dikenal dikenal sebagai Paper Partition Chromatography, dimana fase diam

adalah air yang disokong oleh molekul-molekul selulosa dari kertas, dan fase gerak biasanya

merupakan campuran dari satu atau lebih pelarut organik dan air. Namun pada kertas yang telah

dimodifikasi dengan penambahan alumina, silika gel, atau ion exchange resin, mekanisme

pemisahannya dapat menjadi berbeda dengan teknik pengerjaan yang sama.

B. PROSEDUR FUNDAMENTAL DALAM KROMATOGRAFI KERTAS

1. Penyiapan Fase Gerak / Eluen

Eluen biasanya merupakan campuran yang terdiri dari pelarut organik sebagai eluen

utama, air dan berbagai tambahan seperti asam, basa, atau pereaksi kompleks, untuk

memperbesar kelarutan dari beberapa komponen dan untuk mengurangi kelarutan komponen

lainnya. Idealnya eluen tidak mengandung air dan terdiri dari cairan yang tidak campur dengan

air, karena air merupakan komponen dari fase diam. Namun dalam praktek seringkali air

digunakan sebagai salah satu komponen campuran eluen, dengan pertimbangan bahwa air yang

berperan sebagai fase diam telah terikat kuat pada selulosa kertas melalui hidrogen bonding.

Eluen harus murni dan sangat mudah menguap tanpa meninggalkan residu / sisa / noda sehingga

tidak mengganggu dalam pendeteksian bercak. Karena mudah menguap, maka komponen sampel

akan cepat mencapai kesetimbangan distribusi di dalam fase gerak dan fase diam, namun

volatilitas yang terlalu tinggi akan membuat eluen lebih cepat hilang meninggalkan kertas setelah

bergerak sehingga komponen sampel tidak dapat mencapai kesetimbangan secara optimal.

Kecepatan bergeraknya harus tidak cepat dipengaruhi oleh perubahan suhu.

Tiap eluen memiliki perbandingan tertentu dalam campurannya, sehingga untuk

menghasilkan campuran dengan perbandingan yang sesuai harus dibuat secara hati-hati dan teliti

sekalipun dengan gelas ukur. Karena mudah menguap, maka eluen harus dibuat baru untuk

menjamin agar komposisi dalam campurannya tetap dapat dipertahankan hingga akhir elusi.

Eluen tidak boleh digunakan setelah selang beberapa lama. Untuk elusi selama satu malam, eluen

hanya digunakan satu kali pakai.

Berikut ini adalah contoh cara pemilihan eluen. Senyawa organik polar akan lebih mudah

larut dalam air daripada dalam zat cair organik. Oleh karena itu gerakan komponen akan lambat

jika digunakan pelarut anhidrida, namun penambahan air pada pelarut akan menyebabkan

komponen-komponen untuk bergerak. Oleh karena itu n-butanol bukan merupakan pelarut untuk

asam amino jika tidak dijenuhkan dengan air. Selain itu, penambahan asam cuka disertai dengan

pemberian lebih banyak air akan menjadi baik, karena menaikkan kelarutan asam amino

terutama yang bersifat basa. Campuran ketiga pelarut tersebut sangat baik digunakan untuk

3

pemisahan asam amino. Banyak senyawa polar lain yang memiliki karakteristik kelarutan yang

mirip asam amino, seperti indol, guanidin dan fenol, sehingga dapat dipisahkan menggunakan

campuran tersebut. Beberapa contoh dari macam-macam campuran eluen dapat dilihat seperti

dalam tabel berikut:

2. Penjenuhan Bejana / Chamber Kromatografi

Penjenuhan bejana dilakukan dengan melapisi dinding bagian dalam bejana kromatografi

dengan kertas saring, sekurang-kurangnya setengah keliling bejana dan hampir mencapai bagian

atas bejana, yang berperan sebagai parameter tingkat kejenuhan bejana terhadap uap eluen.

Setelah itu sejumlah eluen dimasukkan ke dalam bejana kromatografi hingga tinggi permukaan

eluen dalam bejana lebih kurang 2 cm. Tutup rapat bejana dan biarkan hingga seluruh isi bejana

jenuh dengan uap eluen, yang ditunjukkan oleh terbasahinya seluruh permukaan kertas saring

pada dinding bagian dalam bejana oleh eluen. Bejana harus berada dalam kondisi jenuh oleh uap

eluen sebelum digunakan untuk elusi agar elusi bejalan stabil. Sedapat mungkin menggunakan

bejana sekecil mungkin, sehingga kejenuhan dan homogenitas atmosfer dalam bejana lebih

mudah dicapai

3. Penyiapan Kertas Kromatografi

Kertas yang digunakan dalam kromatografi kertas adalah kertas berpori dari selulosa

murni, memiliki afinitas besar terhadap air atau pelarut polar lain dengan membentuk hidrogen

bonding. Bersifat reduktor sedang, dan bereaksi dengan oksidator bila kontak dalam waktu yang

lama. Oleh karena itu pereaksi yang korosif seperti H2SO4 pekat tidak dapat digunakan sebagai

spray reagent. Kertas yang banyak digunakan hingga sekarang adalah kertas saring Whatmann

No.1. Meskipun demikian jenis kertas Whatmann dengan berbagai nomor pun banyak

digunakan, dimana semuanya dibuat dengan kemurnian yang tinggi dan tebal yang merata.

4

Sekalipun berperan sebagai suport / penyokong / penyangga, namun kertas juga

memberikan efek-efek serapan yang disebabkan oleh sifat polar dari gugus-gugus hidroksil

sehingga kertas memiliki afinitas besar terhadap air atau pelarut polar lain dengan membentuk

hidrogen bonding. Selain itu sejumlah kecil gugus karboksil dalam selulosa dapat menaikkan

efek pertukaran ion. Dengan demikian kertas memiliki pengaruh terhadap kecepatan alir eluen.

Penurunan kerapatan dan kenaikkan ketebalan kertas akan menaikkan kecepatan alir eluen.

Kertas Whatmann no. 1 termasuk dalam kelompok medium sehingga memiliki karakter

medium flow rate. Kertas yang lebih tebal seperti Whatmann No. 3 atau 3 MM digunakan untuk

pemisahan pada jumlah yang lebih besar, karena dapat menampung cuplikan lebih banyak tanpa

menambah area noda awal. Sedangkan untuk penggunaan umum biasanya digunakan yang

medium flow rate. Berikut adalah macam-macam kertas Whatmann dengan karakteristik aliran

eluen yang dihasilkan :

Kertas tersedia dalam berbagai standar lembaran, bulatan, gulungan dan dalam bentuk

tertentu. Kertas harus disimpan di tempat yang jauh dari sumbar uap, terutama amonia yang

memiliki afinitas tertinggi terhadap selulosa, jangan disimpan di tempat yang memiliki

perubahan kelembaban yang tinggi, dan tidak boleh tersentuh oleh zat-zat yang tidak

dikehendaki. Jika dikehendaki pemisahan dengan sistem fase terbalik maka kertas dapat dilapisi

dengan senyawa hidrofobik, seperti lateks dari karet, minyak mineral, minyak silikon, dengan

pelarut polar sebagai eluen. Kondisi tersebut sesuai untuk pemisahan asam-asam lemak atau

senyawa nonpolar yang bergerak terlalu cepat karena sulit terpartisi pada fase diam polar.

Sebelum digunakan, kertas dipotong dengan ukuran yang disesuaikan dengan ukuran

chamber dan banyak sedikitnya cuplikan. Kertas diberi tanda berbentuk garis dengan jarak

tertentu dari bagian bawah sebagai tempat penotolan dan dimaksudkan agar saat kertas

dicelupkan pada eluen, maka spot tidak tercelup di dalam eluen. Tentukan jarak solvent front

yang merupakan garis batas akhir perambatan eluen, yang tidak lain adalah jarak atau waktu

yang dibutuhkan untuk melakukan elusi. Apabila eluen telah mencapai solvent front maka elusi

diakhiri. Komponen-komponen sampel harus dapat memisah sebelum eluen merambat hingga

solvent front. Tanda garis berjarak tertentu dari bagian atas kertas berfungsi sebagai tanda

dimana kertas akan dilipat kemudian digantungkan pada tutup chamber.

5

4. Penempatan Cuplikan pada Kertas

Larutan sampel yang akan dipisahkan, ditotolkan

pada kertas pada daerah yang telah diberi tanda sehingga

totolan membentuk noda / spot. Pada saat penotolan,

kertas dibiarkan pada kondisi mendatar sehingga spot

dalam keadaan kompak yang berbentuk bulat dengan

diameter tidak lebih dari 0,5 cm. Besarnya diameter

terkait dengan tebal dan karakteristik serapan kertas. Spot

yang lebih kecil akan menghasilkan pemisahan yang

lebih baik. Penotolan tidak boleh terlalu banyak karena

akan menyebabkan tidak tercapainya kesetimbangan

distribusi selama elusi sehingga terbentuk kedudukan

atau lokasi yang kabur. Hal yang diutamakan dalam

penotolan bukanlah jumlah volume, namun banyaknya

cuplikan yang tertinggal bila eluen telah menguap.

Apabila sampel terlalu encer untuk ditotolkan satu kali, maka spot sampel dipekatkan

dengan cara menotolkan berulang-ulang di tempat yang sama, dengan jarak waktu setelah totolan

sebelumnya mengering. Spot sebaiknya dibiarkan mengering di udara, namun bila mungkin

dapat pula dikeringkan dengan bantuan kipas angin. Pengeringan tidak boleh menggunakan

udara panas, terutama jika larutan bersifat asam karena kertas akan menjadi hitam. Pada analisis

kualitatif yang dilanjutkan dengan kuantitatif, penotolan dapat dilakukan dengan gelas pipet

mikro yang dapat diatur volume penotolan dengan diameter sama. Namun pada analisis kualitatif

sederhana dapat digunakan pipa kapiler / gelas kapiler atau bahkan batang tusuk gigi yang telah

dipotong bagian ujungnya.

5. Elusi

Setelah totolan terakhir kering, pasang kertas pada penggantung dan masukkan ke dalam

bejana hingga kertas tercelup di dalam fase gerak, namun tidak boleh melampaui totolan karena

komponen akan terlarut dari kertas. Kertas dapat digantung ataupun diletakkan sehingga pelarut

bergerak ke atas, atau ke bawah, atau mendatar tergantung pada teknik elusi yang dikerjakan.

Saat pencelupan, permukaan kertas jangan sampai terlalu terbasahi oleh eluen karena hal ini

tidak akan memisahkan sama sekali atau dapat menyebabkan daerah noda menjadi kabur. Tutup

bejana dengan rapat dan biarkan terjadi proses elusi. Bejana harus ditutup rapat selama proses

elusi agar bejana dipertahankan dalam kondisi jenuh oleh uap eluen. Selain itu, komposisi

campuran eluen tetap dapat dipertahankan hingga akhir elusi agar elusi berjalan stabil. Semakin

banyak komposisi eluen, maka akan semakin sulit mempertahankan komposisi campurannya.

6

Proses pemisahan yang terjadi dikenal sebagai analisa kapiler, karena eluen bergerak ke

atas (ascending) melalui serta-serat kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan komponen

sampel pada perbedaan jarak dalam arah aliran eluen, dengan laju perambatan lambat dan makin

lama menurun karena pengaruh dari gaya berat. Namun perambatan yang lambat akan

memperbesar kemungkinan untuk tercapainya kesetimbangan distribusi selama elusi sehingga

menghasilkan pemisahan yang semakin baik dengan bercak yang jelas dan tidak kabur.

Kecepatan aliran eluen akan meningkat seiring penurunan viskositas eluen dan kenaikan suhu.

Amati pemisahan komponen yang terjadi hingga

perambatan eluen mencapai jarak yang telah ditetapkan (solvent

front). Bila eluen telah bergerak sampai jarak yang cukup

jauhnya atau sampai pada jarak yang telah ditentukan sebagai

solvent front, maka kertas diambil dari bejana. Kedudukan dari

permukaan eluen harus selalu diberi tanda segera setelah kertas

diambil dari bejana. Penandaan dapat menggunakan pensil pada

sisi samping kertas. Seperti halnya pada pengeringan noda,

pengeringan eluen setelah elusi sebaiknya dibiarkan di udara.

Bila dikehendaki dapat menggunakan kipas angin. Pengeringan

tidak boleh menggunakan udara panas, karena dapat merusak

beberapa komponen.

Eluen harus cepat menguap tanpa meninggalkan residu sehingga

tidak mengganggu pengamatan. Penghilangan eluen harus

dilakukan secara sempurna untuk mencegah pengaruh

penambahan pereaksi saat deteksi. Selain itu penting pula terutama

dalam teknik kromatografi 2 arah, dimana jejak eluen yang

pertama harus hilang sebelum elusi yang kedua. Dalam hal ini

elusi dilakukan pada eluen yang lebih mudah menguap terlebih

dahulu.

7

6. Deteksi Daerah Noda

Senyawa yang berwarna dapat dilihat sebagai noda berwarna yang terpisah pada akhir

elusi. Sedangkan untuk senyawa yang tak berwana deteksi dapat dilakukan secara fisika ataupun

kimia. Secara fisika, deteksi bercak komponen umumnya dilakukan dengan melakukan

pengamatan di bawah sinar ultraviolet sebelum dan sesudah elusi. Panjang gelombang yang

umum digunakan adalah 366 nm dan 254 nm. Beberapa senyawa terlihat sebagai bintik

fosforescen atau fluorescen.

Secara kimia, deteksi bercak komponen dilakukan dengan penyemprotan pereaksi kimia

tertentu yang memberikan sebuah warna terhadap beberapa atau semua komponen.

Penyemprotan dilakukan dari samping ke samping atau dari atas ke bawah. Pada kondisi ideal,

tiap komponen memberikan warna yang khas bila diberi suatu pereaksi, kecuali untuk

komponen-komponen yang memiliki struktur kimia yang hampir sama akan memberikan warna

yang hampir sama pula. Penambahan pereaksi yang kedua dapat menghasilkan perubahan warna

yang khas terhadap beberapa komponen, namun menyebabkan lenyapnya komponen yang lain.

Penguapan yang cepat dari pelarut spray reagent dibutuhkan untuk mencegah difusi dari

bercak-bercak komponen. Pelarut pereaksi yang biasa digunakan yaitu etanol, propanol, n-

butanol, kloroform ataupun campuran dari pelarut-pelarut tersebut. Campuran berair dapat

digunakan namun harus seminimal mungkin karena dapat memberikan efek melemahkan kertas.

Penyemprotan spray reagent harus dilakukan di lemari asam. Selesai penyemprotan alat harus

segera dibersihkan untuk mencegah lubang penyemprot menjadi buntu.

7. Identifikasi Senyawa

Identifikasi bercak komponen dilakukan dengan

menghitung harga Retardation Factor (Rf) sebagai derajat

retensi, yang didefinisikan sebagai angka banding antara jarak

tempuh bercak dari tempat totolan terhadap jarak tempuh

eluen. Dalam penentuan Rf, letak bercak komponen diukur

dari pusat bercak. Harga Rf adalah spesifik untuk masing-

masing senyawa, karena ditentukan oleh koefisien

distribusinya. Apabila sampel mengandung komponen yang

struktur kimianya hampir sama, maka akan diperoleh bercak

dengan harga Rf yang berdekatan. Dalam hal ini perlu

melakukan teknik dua dimensi.

Harga Rf dari komponen sampel kemudian

dibandingkan dengan harga Rf senyawa baku yang dielusi pada kondisi yang sama. Apabila

harga Rf keduanya relatif sama maka dapat diduga bahwa sampel mengandung senyawa yang

sama dengan senyawa baku. Guna memastikan hasil analisis kualitatif tersebut di atas, seringkali

diperlukan data analisis kualitatif metode lain sebagai data pendukung.

8

Harga Rf yang dihasilkan seringkali berbeda dari Rf yang dimuat dalam literatur, karena

harga ini ditentukan oleh kondisi percobaan seperti tempertur, ukuran spot, kualitas kertas,

kejenuhan bejana, dll. Oleh karena itu, bila harga Rf dibuat daftar untuk dipublikasikan maka

semua kondisi yang digunakan dalam elusi harus dipaparkan. Guna membandingkan data,

seringkali digunakan pula harga retensi relatif, Rr, yang didefinisikan sebagai angka banding

antara jarak tempuh bercak senyawa sampel terhadap jarak tempuh bercak senyawa baku.

Faktor-faktor yang menentukan harga Rf antara lain:

1. Eluen. Perubahan yang sangat kecil komposisi eluen dapat menyebabkan perubahan

harga Rf, karena perubahan komposisi eluen akan mempengaruhi koefisien distribusi.

2. Suhu. Perubahan suhu akan mempengaruhi harga koefisien distribusi dan kecepatan

aliran eluen.

3. Ukuran bejana. Volume bejana akan mempengaruhi homogenitas atmosfer dalam bejana

dan pencapaian tingkat kejenuhan bejana. Jika digunakan bejana besar maka ada tendensi

elusi terjadi lebih lama, terjadi perubahan komposisi pelarut sepanjang kertas, sehingga

akan mempengaruhi koefisien distribusi.

4. Kertas. Ketebalan dan kerapatan kertas akan mempengaruhi kecepatan aliran sehingga

akan mempengaruhi kesetimbangan partisi.

5. Sifat campuran. Berberapa senyawa akan mengalami partisi di antara volume-volume

yang sama dari fase diam dan fase gerak, sehingga hampir selalu mempengaruhi

karakteristik kelarutan satu terhadap yang lain.

C. TEKNIK ELUSI

1. Metode Penaikkan (Ascending)

Pada metode ini, eluen diletakkan di bagian bawah bejana, dan kertas dicelupkan di

atasnya. Eluen akan merambat ke atas dengan gaya kapiler dengan laju perambatan yang pelan,

dan makin lama menurun karena pengaruh dari gaya berat. Namun demikian perambatan yang

pelan memperbesar kemungkinan untuk tercapainya kondisi kesetimbangan sehingga

menghasilkan pemisahan yang baik.

Gambar (a) menunjukkan kertas diletakkan pada penggantung yang dikaitkan dengan

tutup bejana. Gambar (b) menunjukkan kertas berbentuk silinder dengan spot sampel ditotolkan

melingkar dekat ujung bawah kertas. Ujung pertemuan kertas dikaitkan dari atas ke bawah, dan

silinder didirikan dengan ujung bawah tercelup di dalam eluen. Gambar (c) menunjukkan bentuk

9

bejana berbentuk silinder, dimana gabus dengan lubang untuk batang pengait digunakan sebagai

tutup.

2. Metode Penurunan (Descending)

Pada metode ini di dalam bejana yang dapat terbuat dari

gelas, platina, atau logam tahan karat dilengkapi dengan lubang

untuk memasukkan eluen, bak eluen, dan batang gelas yang

berfungsi untuk menyangga agar kertas tidak lepas. Meskipun

desain bejana yang digunakan lebih rumit, namun cara ini lebih

cepat karena eluen mengalir dari atas ke bawah. Pada menit-

menit awal, eluen mengalir oleh gaya kapiler, dan akan mengalir

oleh gaya gravitasi setelah eluen melintasi batang gelas.

3. Metode Mendatar/Melingkar (Circular)

Pada metode ini, kertas berbentuk lingkaran dan di bagian tengahnya diberi lubang

sebagai tempat untuk meletakkan sumbu yang terbuat dari gulungan kertas ataupun benang.

Cawan petri dapat digunakan sebagai tempat eluen. Sampel diteteskan di sekitar pusat kertas,

kemudian kertas diletakkan horisontal sehingga sumbu tercelup dalam eluen. Melalui sumbu

tersebut eluen akan naik yang kemudian membasahi kertas, dan oleh daya kapiler eluen akan

mengembang melingkar ke arah tepi kertas sambil membawa komponen-komponen sampel.

Bercak-bercak yang terjadi berupa garis lengkung dengan diameter makin panjang bila bercak

makin ke tepi.

4. Metode Dua Dimensi (Two Dimensional)

Pada metode ini, elusi dilakukan secara berturut-turut dalam dua arah yang saling tegak

lurus. Kertas berbentuk persegi dan sampel ditotolkan pada salah satu sudut. Elusi dengan

campuran eluen 1, dengan ujung kertas AB dicelupkan sehingga memberikan pemisahan seperti

ditunjukkan pada gambar a. Setelah itu lembaran kertas diambil dan dikeringkan, kemudian

diputar 90o dan dielusi untuk kedua kalinya dengan ujung AC tercelup dalam eluen yang

berbeda. Dengan cara ini, komponen-komponen yang tidak terpisah sempurna dengan sistem

eluen pertama dapat menjadi sempurna bila digunakan kombinasi dengan sistem eluen kedua.

Hasil elusi ini akan memberikan bercak seperti pada gambar b.

10

D. MEKANISME PEMISAHAN DALAM KROMATOGRAFI KERTAS

Setelah eluen mengenai spot sampel, dengan segera sampel akan berinteraksi dengan

kedua fase dengan prinsip solve disolve like, dimana bagian polar dari senyawa akan berinteraksi

dengan fase yang polar sedangkan bagian nonpolar dari senyawa akan berinteraksi dengan fase

yang nonpolar. Dengan demikian senyawa akan terdistribusi di antara kedua fase dengan

perbandingan tertentu, tergantung pada besar kecilnya afinitas senyawa pada masing-masing

fase. Senyawa yang polar akan lebih banyak terdistribusi di dalam fase yang polar, demikian

pula sebaliknya. Adanya aliran fase gerak, maka fase gerak yang telah mengandung sebagian

komponen sampel akan terdesak ke atas (pada metode ascending), sehingga akan terjadi

distribusi baru antara fase gerak dengan fase diam yang baru. Pada waktu yang bersamaan,

distribusi baru juga terjadi pada daerah totolan antara fase gerak yang baru dengan fase diam

yang telah mengandung sebagian komponen sampel. Karena komponen-komponen sampel hanya

dapat bergerak bersama eluen, maka kecepatan perpindahan / migrasi komponen tergantung pada

fraksi waktu (lamanya) saat komponen berada dalam eluen. Apabila komponen mengalami

retensi pada fase diam maka lamanya komponen tersebut berada dalam eluen lebih kecil

dibanding dengan komponen yang tidak mengalami retensi pada fase diam. Pemisahan terjadi

karena salah satu komponen sampel tertahan oleh fase diam dan yang lain dibawa oleh fase

gerak. Dengan demikian akan terjadi perbedaan kecepatan migrasi (partisi) dari masing-masing

komponen sehingga akan diperoleh noda / bercak dari komponen-komponen sampel.

11

E. ANALISIS KUANTITATIF

Selain untuk keperluan analisis kualitatif, kromatografi kertas dapat pula digunakan untuk

analisis kuantitatif yang dalam hal ini ukuran spot dari sampel dan senyawa baku sedapat

mungkin sama. Analisis kuantitatif dapat dilakukan antara lain dengan:

1. Menggunakan grafik hubungan antara log konsentrasi dan area dari bercak. Pengukuran

area dapat dilakukan dengan planimeter, kertas bergaris-garis bujur sangkar, atau dengan

menggunting bercak kemudian ditimbang.

2. Mengukur transmisi cahaya yang melalui bercak dengan fotodensitometri.

3. Menggunting area dari bercak, kemudian diekstraksi dan ditetapkan kadarnya secara

spektrofotometri.

F. PENGGUNAAN KROMATOGRAFI KERTAS

Kromatografi kertas dapat digunakan untuk pemisahan senyawa anorganik (logam,

isomer dari kompleks logam), pemisahan senyawa organik (uji kemurnian obat, makanan,

kosmetik, deteksi kontaminan dalam makanan minuman, deteksi obat dan metabolitnya pada

hewan uji atau manusia), serta analisis pada bidang biokimia (pemisahan asam amino dan

peptida untuk menemukan struktur dari protein, pengujian asam amino atau gula dalam cairan

biologis) dimana jumlah sampel sangat terbatas.

12

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

A. PENDAHULUAN

Kromatografi Lapis Tipis (KLT), dapat digunakan dengan 2 tujuan yaitu sebagai metode

untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, preparatif dan untuk menjajaki sistem fase gerak dan

sistem fase diam yang akan digunakan pada kromatografi kolom ataupun kromatografi cair

kinerja tinggi. Teknik operasional pada KLT hampir sama dengan KK, namun sebagai pengganti

kertas adalah lapisan tipis dari partikel halus adsorben pada permukaan lempeng gelas, logam,

atau plastik. Fase diam pada KLT sering disebut adsorben, walaupun pada kondisi tertentu dapat

berfungsi sebagai penyangga zat cair pada sistem partisi. Dengan demikian penggunaan istilah

adsorben bukan berarti bahwa mekanisme pemisahan selalu berdasarkan adsorpsi. Pemisahan

dapat berdasarkan adsorpsi atau partisi, tergantung kondisi percobaan dan metode pembuatan

lempeng.

B. PROSEDUR FUNDAMENTAL DALAM KROMATOGRAFI KERTAS

1. Penyiapan Adsorben

Adsorben yang umum digunakan adalah silika gel (asam silikat), alumina (aluminium

oksida), kieselguhr (tanah diatome), dan selulosa. Silika gel relatif asam sehingga sering

digunakan untuk senyawa asam, dan umumnya digunakan untuk kromatografi adsorpsi maupun

partisi. Sedangkan alumina relatif basa sehingga sering digunakan untuk pemisahan basa. dan

umumnya digunakan untuk kromatografi adsorpsi. Hal tersebut dilakukan untuk meminimumkan

reaksi asam basa antara adsorben dan senyawa yang dipisahkan. Kieselguhr dan selulosa

merupakan bahan penyangga lapisan zat cair pada sistem partisi, sehingga sering digunakan

untuk pemisahan senyawa polar seperti asam amino, karbohidrat, nukleotida, dan senyawa

hidrofil alam. Beberapa contoh adsorben yang dapat digunakan beserta penggunaannya adalah

sebagai berikut :

Di antara adsorben tersebut di atas, silika gel adalah yang paling banyak digunakan.

13

Gambar di samping menunjukkan bahwa silika gel

(SiO2) merupakan rantai -O-Si-O- dimana pada bagian

permukaan silika berupa gugus-gugus hidroksil -OH, oleh

karena itu silika gel relatif bersifat polar. Oleh karena itu,

KLT umumnya menggunakan sistem fase normal. Namun

tidak menutup kemungkinan bahwa dalam KLT digunakan

sistem fase terbalik. Dalam hal ini permukaan silika gel terlebih dahulu dimodifikasi agar tidak

lagi mengandung gugus hidroksil, melalui reaksi silanisasi menggunakan dichlorodimethyl silane

seperti terlihat pada gambar berikut:

Semakin panjang rantai karbon yang diikatkan pada silika, maka akan semakin hidrofobik.

Silika gel yang digunakan umumnya ditambah dengan binding agent / binder / perekat

untuk memberikan kekuatan pada lapisan, menambah adhesi terhadap penyangga, dan membuat

lapisan menjadi lebih kohesi. Binding agent yang banyak digunakan yaitu kalsium sulfat,

CaSO4.½ H2O 10 – 15 %, yang lebih dikenal sebagai gipsum sehingga silika gel ini diberi kode

G. Pengikat lain yang dapat dipakai yaitu pati 3% dan polimer organik, seperti polivinil alkohol.

Lapisan yang tidak mengandung pengikat dapat melekat dengan dukungan keseragaman ukuran

partikel.

Selain itu silika gel juga sering ditambah dengan indikator luminescence (fosforescence

pada λ 254 nm ; fluorescence pada λ 366 nm) untuk membantu penampakan bercak tak

berwarna. Silika gel yang telah ditambah indikator luminescence kemudian diberi kode F atau

UV. Indikator luminescence merupakan senyawa yang apabila dikenai radiasi elektromagnetik

ultraviolet (UV) pada λ 254 nm atau λ 366 nm, maka akan menyerap energi radiasi tersebut

untuk mengeksitasikan elektron-elektronnya ke tingkat energi yang lebih tinggi (exited state).

Saat elektron-elektron yang tereksitasi tersebut kembali ke tingkat energi dasar (ground state),

maka akan mengemisikan cahaya. Emisi cahaya dari senyawa yang menyerap energi radiasi

dengan λ 254 nm berupa peristiwa fosforescence, sedangkan emisi cahaya dari senyawa yang

menyerap energi dengan λ 366 nm berupa peristiwa fluorescence. Oleh karena itu silika gel yang

telah ditambah indikator luminescence akan berpendar dengan penampakan warna tertentu. Jika

di atas lempeng tersebut terdapat suatu noda / bercak senyawa yang terlelusi, maka sinar UV

tidak dapat mencapai indikator luminescence, sehingga indikator luminescence yang berada di

bawah noda tersebut tidak dapat menyerap energi radiasi elektromagnetik yang mengenainya.

Hal tersebut terjadi karena silika gel yang telah mengandung indikator luminescence tertutup

14

oleh noda. Akibatnya tidak terjadi eksitasi elektron, yang secara otomatis tidak terjadi emisi

cahaya. Dengan demikian pada bagian tersebut akan tampak peredaman bercak, yaitu pada

bagian bercak tampak gelap dengan latar belakang yang berpendar. Hal inilah yang menjadi

dasar deteksi bercak dengan sinar ultraviolet pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm.

Fluorescen & fosforescen, keduanya merupakan bentuk luminescence dengan ciri-ciri:

Fosforescence - terdiri dari

senyawa anorganik

- radiasi emisi rusak lebih dari 10-8 detik setelah radiasi eksitasi dihentikan

- disertakan pada lapisan penyerap secara homogen

Fluorescence - terdiri dari senyawa organik

- radiasi emisi rusak dalam 10-8 detik setelah radiasi eksitasi dihentikan

- disertakan pada lapisan penyerap melalui penyemprotan atau pencelupan

Inorganics Phosporescence Indicators (Kode : F254 atau UV254) yang umum digunakan untuk

lapisan silica gel, alumina, dan selulose antara lain :

Warna Senyawa yang ditambahkan

1. Biru - Senyawa strontium yang diaktivasi dg Sn

2. Kuning - Uranil asetat

3. Hijau kuning - Seng silikat yang diaktivasi Mn

- Seng kadmium sulfat

4. Senyawa - senyawa pengemisi pada λ 254 nm

Organics Fluorescence Indicators (Kode : F366 atau UV366) yang umum digunakan untuk

lapisan silika gel, alumina, dan selulose antara lain :

Natrium 3 – hidroksipiren – 5,8,10 – trisulfonat

Natrium 3,5 – dihidroksipiren – 8,10 – disulfonat

Natrium fluorescein ; fluorescein atau 2’,7’ – diklorofluorescein

Rhodamin, Rhodamin 6 G

Morin

Zat warna Cyanin

Derivat stilben, contoh: diaminostilbentriazin

Pencegah optik (ultraphor WT BASF) Calcofluor R – white, Leukophor

Keterangan porous size silika gel pun seringkali ditambahkan sebagai kode berupa angka

dalam satuan Amstrong. Dengan demikian apabila disebutkan bahwa silika gel yang digunakan

adalah Silika Gel 60 GF254 atau Silika gel 60 UV254, hal tersebut menunjukkan bahwa:

Ukuran pori : 60 Å

G : CaSO4.½ H2O

sebagai binder

F : bahan indikator

fluorescence / fosforescence yg ditambahkan

15

254 : dituliskan sesudah F

atau UV untuk menandakan λ eksitasi bahan

indikator fosforescence yang ditambahkan

Dua sifat penting dari adsorben adalah ukuran partikel dan homogenitasnya karena sangat

berpengaruh pada adhesi terhadap penyangga, laju perambatan, dan hasil pemisahan. Ukuran

partikel yang umum digunakan adalah 1 – 25 mikron. Partikel yang sangat kasar tidak akan

memberikan hasil yang memuaskan, sehingga salah satu alasan untuk menaikkan hasil

pemisahan adalah menurunkan ukuran partikel menjadi butiran halus. Perbedaan adsorben yang

digunakan akan memberikan perbedaan yang besar pada harga Rf meskipun menggunakan eluen

yang sama.

Sebelum digunakan untuk membuat lapisan pada penyangga, khususnya lempeng KLT

kuantitatif dan preparatif, adsorben harus terbebas dari cemaran / pengotor. Pengotor dapat

dihilangkan dengan mencuci adsorben dengan metanol. Pemurnian dapat dilakukan dengan

mendidihkan bubur adsorben dalam metanol beberapa menit, kemudian dibiarkan beberapa jam

pada suhu kamar. Setelah itu adsorben disaring, dikeringkan pada suhu kamar, kemudian pada

suhu 110 oC selama 1 jam. Selain itu penghilangan cemaran dapat pula dilakukan dengan pra-

elusi menggunakan eluen yang lebih polar daripada eluen yang akan digunakan pada pemisahan,

contoh : sebelum digunakan untuk pemisahan senyawa, lempeng adsorben yang telah aktif

dielusi dengan metanol untuk membawa cemaran ke salah satu ujung, setelah itu diaktifkan

kembali.

Berdasarkan aktivitas adsorpsi relatif terhadap alumina, disusun tingkat aktivitas

Brockmann, sehingga adsorben digolongkan ke dalam golongan I (aktivitas tertinggi) hingga V

(aktivitas terendah). Silika gel dan alumina yang sering digunakan pada KLT memiliki aktivitas

adsorpsi antara II dan III dengan kelembaban relatif antara 40 – 65%.

Adsorben dari industri yang

berbeda memiliki sifat yang

berbeda, seperti pH, ukuran pori,

laju aliran, kemurnian, dan daya

memisahnya. Tabel di samping

adalah contoh adsorben yang ada di

pasaran berikut dengan industri

penghasilnya.

16

2.Pembuatan Lempeng KLT

Penyangga yang digunakan dapat berupa kaca / gelas, logam, ataupun plastik. Ukuran

penyangga disesuaikan dengan jenis pemisahan yang hendak dilakukan dan ukuran bejana yang

digunakan. Bahkan untuk analisis kualitatif yang sederhana dapat digunakan obyek glas.

Kebanyakan penyangga yang dijual berupa lempeng kaca dengan ukuran 20 x 20 cm, 20 x 10 cm

atau 20 x 5 cm. Sedangkan lempeng siap pakai umumnya menggunakan lembaran plastik atau

lembaran aluminium sebagai penyangga. Permukaan penyangga harus halus dan rata.

Sebelum digunakan, penyangga dicuci dengan detergen, dibilas dengan air, kemudian

dengan akuades dan keringkan. Bila perlu bilas pula dengan aseton atau dibersihkan dengan

tissue yang dibasahi aseton ataupun heksana untuk menghilangkan lemak atau pengotor yang

mungkin masih tertinggal. Selain itu, dengan aseton permukaan penyangga akan semakin cepat

kering. Suatu hal yang perlu diperhatikan adalah jangan menyentuh permukaan penyangga yang

telah bersih dengan jari-jari.

Ada 4 cara yang dapat digunakan untuk pembuatan lapisan tipis, yaitu penuangan,

penyemprotan, pencelupan, dan pembentangan, yang dapat dilakukan secara manual ataupun

machinal. Sebelum digunakan untuk membuat lapisan pada suatu penyangga, adsorben harus

dibuat bubur / slurry terlebih dulu. Kekentalan optimum bubur untuk membuat lapisan adsorben

tergantung pada metode yang digunakan untuk membuat lapisan.

Jika adsorben sangat halus dan partikel-partikelnya homogen, dan jika tidak

menggunakan pengikat, maka bubur dapat dituang di atas lempeng hingga melapisinya.

Adsorben yang umum digunakan pada metode penuangan tersebut adalah alumina yang dalam

pembuatan bubur tidak menggunakan air, melainkan cairan volatil seperti etanol, etil asetat.

Lempeng-lempeng kecil seperti obyek glas dapat dilapisi

dengan cara mencelupkan 2 obyek glas dalam keadaan berhimpit

ke dalam bubur adsorben dalam pelarut organik, seperti kloroform

atau campuran kloroform:metanol (2:1) atau cairan volatil lain,

kemudian angkat dan biarkan bubur yang berlebih mengalir

melalui sisi bawah. Setelah itu pisahkan obyek glas dan bersihkan

bubur yang terdapat pada bagain tepi. Biarkan mengering selama

5-20 menit. Lapisan silika gel dan alumina yang dibuat dengan

cara ini sudah cukup teraktifkan tetapi tidak sempurna. Lapisan

tersebut harus dibuat baru setiap hari atau disimpan dalam wadah

bertutup baik dan lingkungan kering (desikator). Dalam hal ini tebal lapisan yang pasti tidak

diketahui dan lapisan yang dihasilkan tidak cukup baik. Bubur yang kental akan menghasilkan

lapisan yang tebal, sedangkan bubur yang encer akan menghasilkan lapisan yang tipis dan

17

berbutir-butir. Meskipun demikian, metode ini cukup memuaskan untuk membuat sejumlah

lempeng untuk pemisahan kualitatif secara cepat. Jika lapisan dikehendaki untuk sistem partisi,

maka lapisan harus dihidrasi terlebih dahulu sebelum digunakan, karena pada hakikatnya lapisan

tersebut dibuat dalam sistem kering. Hal tersebut dapat dilakukan dengan memegang lempeng di

atas air mendidih, kemudian dibiarkan mengering di udara pada suhu kamar.

Metode pembentangan umumnya

digunakan untuk lempeng yang berukuran sedang

ataupun besar. Pembuatan bubur adsorben pada

metode pembentangan umumnya dilakukan dengan

perbandingan x gram adsorben dan 2x ml air atau

pelarut organik, kemudian diaduk dan dilumatkan

dalam mortir atau digojog perlahan hingga

homogen (hindari terbentuknya buih) dalam gelas piala bertutup. Jika mengandung gips, maka

makin lama makin kental. Oleh karena itu waktu pengocokan sebaiknya seragam ± 45 detik.

Contoh : untuk membuat lapisan tipis pada 6 lempeng kaca berukuran 20 x 10 cm dan 2 lempeng

20 x 5 cm dengan tebal lapisan 0,25 mm, dapat digunakan 30 g adsorben yang dibuat bubur

dengan 60 ml air. Lempeng kaca yang telah bersih dan kering diatur secara membujur pada

aligning tray. Setelah itu bubur dimasukkan ke dalam spreader. Atur ketebalan spreader sesuai

dengan ketebalan adsorben yang akan dibuat, kemudian letakkan pada lempeng kaca bagian

ujung depan. Masukkan bubur adsorben ke dalam spreader. Tutup spreader yang telah berisi

bubur adsorben, kemudian dorong dengan kecepatan tetap sampai ujung lempeng bagian

belakang. Angkat spreader dan biarkan lempeng mengering pada suhu kamar selama 15 – 30

menit, kemudian aktifkan. Perbandingan adsorben dan air untuk membuat bubur adsorben pada

metode pembentangan dapat dilihat pada tabel berikut:

Jika diperlukan, perbandingan dapat diubah karena

jumlah air yang tepat tergantung pula pada jenis dan pra

perlakuan pada adsorben.

Karena lapisan dibuat dari bubur adsorben

dalam air, maka apabila mekanisme pemisahan yang

diharapkan adalah adsorpsi, lempeng KLT harus

diaktifkan dahulu yaitu dengan pemanasan di dalam oven pada suhu ±100 – 110 oC selama 1 – 3

jam. Hal tersebut bertujuan untuk menghilangkan molekul-molekul air yang menempati pusat-

pusat serapan pada adsorben, yang selanjutnya akan membuka pori-pori adsorben sehingga luas

permukaan spesifiknya meningkat. Luas permukaan spesifik adalah luas permukaan yang diukur

dalam meter persegi tiap gram. Adsorben yang aktif dapat memiliki permukaan spesifik ratusan

meter persegi. Aktivitas tersebut berkaitan dengan kekuatan menyerap dari adsorben, yaitu

adsorben dengan luas permukaan yang besar akan menyerap dengan kuat. Adanya air pada

pusat-pusat serapan akan mengurangi kemampuan adsorpsi sehingga menghambat tertambatnya

18

komponen sampel ke dalam adsorben. Dengan demikian lamanya pemanasan dan suhu yang

digunakan akan menentukan mekanisme pemisahan, yaitu adsorpsi atau partisi.

Jika suhu pengaktifan jauh di atas 110 oC dapat menyebabkan terjadinya dehidrasi yang

ireversibel sehingga pemisahan justru menjadi tidak efektif. Lempeng yang telah diaktifkan

harus disimpan dalam lingkungan kering, yaitu desikator. Lempeng komersial siap pakai,

memiliki keaktifan yang beragam. Namun umumnya dapat digunakan langsung atau dapat

diaktifkan kembali dengan pemanasan.

Pada sistem partisi, lapisan diaktifkan pada suhu ±100 – 110 oC selama 10 menit

sehingga memungkinkan masih tertinggalnya air di dalam lapisan. Selain itu, adanya air di dalam

lapisan tipis dapat diperoleh melalui proses dihidrasi. Dalam hal ini yang berperan sebagai fase

diam adalah air, sedangkan butir-butir lapisan tipis berperan sebagai penyangga. Selain air, zat

cair lain juga dapat digunakan sebagai fase diam, baik zat cair polar, seperti formamida, etilen

glikol; maupun zat cair nonpolar, seperti minyak silikon, minyak parafin. Pada umumnya lapisan

diaktifkan terlebih dahulu untuk menghilangkan air dari lapisan, kemudian dicelupkan secara

perlahan ke dalam larutan zat cair 20% di dalam formamida atau etilen glikol di dalam aseton,

minyak silikon 5% dalam eter. Setelah itu lapisan dibiarkan mengering tanpa pemanasan.

Lempeng KLT berukuran obyek glas dapat digunakan untuk memisahkan campuran

hingga 4 komponen dalam waktu 5 menit. Lapisan mudah dibuat, umumnya tidak memerlukan

pengaktifan dan menghasilkan pemisahan yang tajam hanya dengan alat gelas sederhana.

Kekurangan lempeng KLT berukuran obyek glas antara lain: lapisan yang dihasilkan tidak cukup

baik dan lapisan relatif tipis dengan ketebalan lapisan yang tidak dapat ditentukan (jika dibuat

dengan metode pencelupan), jarak elusi relatif pendek. Dengan demikian diameter totolan harus

sekecil mungkin, sehingga satu lempeng hanya dapat digunakan untuk 3 macam totolan.

Pada penggunaan lempeng besar dibutuhkan bejana yang besar pula, sehingga selain

secara ekonomi lebih mahal dan membutuhkan volume eluen yang lebih banyak, waktu untuk

penjenuhan lama dan biasanya memerlukan waktu elusi selama 30 menit hingga 1jam. Selain itu

pada penggunaan lempeng dengan ukuran sedang atau besar (20 x 20 cm, 20 x 10 cm atau 20 x 5

cm) memerlukan alat khusus dalam membuat lapisan. Namun lempeng besar memiliki beberapa

kelebihan, antara lain lapisan lebih tebal dengan ketebalan yang dapat diatur karena dibuat

dengan metode pembentangan, lapisan melekat secara lebih baik, memungkinkan untuk

melakukan analisis cuplikan lebih banyak secara serempak, jarak elusi lebih panjang sehingga

memungkinkan pemisahan campuran yang lebih kompleks.

Tebal lapisan merupakan faktor penting dalam KLT. Tebal standar adalah 250 mikron

atau 0,25 mm, sedangkan lapisan yang lebih tebal (0,5 – 2,0 mm) digunakan untuk pemisahan

yang bersifat besar dengan jumlah adsorben hingga 250 mg untuk lempeng berukuran 20 x 20

cm. Tebal optimum untuk lapisan KLT preparatif ± 1 – 1,5 mm. Lapisan tebal sulit untuk dibuat

dan menghasilkan pemisahan yang relatif buruk. Pada umumnya bubur adsorben yang digunakan

untuk mencetak lapisan KLT preparatif agak lebih kental daripada untuk KLT biasa. Pada

19

lapisan yang mengandung perekat kalsium sulfat, pengentalan dapat terjadi dengan membiarkan

bubur lebih lama sebelum lapisan dicetak. Cara lain harus digunakan adsorben lebih banyak

dalam pembuatan bubur. Salah satu kesulitan dalam penggunaan lapisan yang tebal yaitu

tendensi mengelupas bila telah kering. Oleh karena itu lapisan harus dibiarkan mengering selama

beberapa jam sebelum diaktifkan, sehingga dapat mencegah peretakan dan pengerasan bagian

luar. Dalam hal ini dianjurkan untuk menyimpan lapisan tanpa diaktifkan terlebih dahulu, dan

diaktifkan menjelang digunakan.

Lempeng komersial siap pakai yang tersedia umumnya dalam bentuk lembaran dengan

penyangga logam, sehingga dapat dipotong dengan ukuran sesuai kebutuhan. Selain dapat

menghemat waktu yang diperlukan untuk pembuatan lempeng, penggunaan lempeng komersial

lebih disukai karena lebih terjamin homogenitas dan ketebalannya, lapisan fase diam lebih

kompak dan stabil sehingga tidak mudah lepas, seringkali dapat langsung digunakan tanpa harus

pengaktifan lagi, serta hasil lebih reprodusibel. Penyentuhan dengan jari-jari pada lempeng akan

merusak permukaan lapisan dan melepaskan partikel-partikel dari permukaan. Namun hal

tersebut lebih banyak terjadi pada lempeng buatan sendiri daripada lempeng siap pakai.

Penggunaan lempeng komersial siap pakai pada KLT preparatif lebih disukai, karena

tersedia dalam ukuran besar, dengan lapisan tebal dan berkualitas tinggi, sehingga mudah ditotoli

tanpa merusak lapisan. Penggunaan lapisan ini memungkinkan diperoleh modifikasi dengan

lapisan tirus, yaitu dengan lapisan yang lebih tebal pada daerah ujung atas yang bertujuan untuk

memperkuat pemisahan. Lapisan buatan sendiri hanya memiliki satu keuntungan yaitu lebih

murah.

3. Penyiapan Fase Gerak

Eluen yang digunakan umumnya bersifat non polar, sehingga KLT lebih banyak dijumpai

sebagai sistem fase normal. Salah satu alasannya adalah untuk mengurangi serapan dari setiap

komponen dalam campuran eluen. Jika komponen campuran eluen memiliki polaritas yang

tinggi, terutama akuades, akan dapat mengubah mekanisme pemisahan menjadi partisi dan tidak

lagi adsorpsi. Pada sebagian besar kasus, eluen tunggal akan menggerakkan bercak terlalu jauh

atau bahkan tidak dapat menggerakkan. Oleh karena itu seringkali harus mencampur eluen untuk

memperoleh kepolaran yang diinginkan. Campuran yang baik akan menghasilkan eluen yang

memiliki kekuatan bergerak sedang, namun sebaiknya tidak mencampur lebih dari 2 eluen,

karena campuran yang kompleks akan cepat mengalami perubahan dengan adanya perubahan

suhu. Pencampuran eluen dengan perbedaan kepolaran yang sangat berbeda dapat menyebabkan

terpisahnya eluen. Hal tersebut dapat ditunjukkan dengan terbentuknya bercak berbentuk bulan

setengah yang aneh, atau diperoleh 2 garis depen eluen pada lapisan. Namun dalam beberapa

kasus , fenomena ini digunakan untuk upaya peningkatan pemisahan. Tingkat kualitas kemurnian

eluen harus diperhatikan terutama untuk KLT kuantitatif. Bila memungkinkan gunakan eluen

pro-kromatografi, atau setidaknya pro-analisis. Sedangkan untuk keperluan sehari-hari dapat

20

digunakan eluen dengan tingkatan yang lebih rendah, namun harus diingat bahwa keberadaan

pencemar terkadang memberikan perubahan yang berarti. Pertimbangan lain dalam pemilihan

eluen, umumnya sama dengan KK.

Pemisahan yang optimal sangat ditentukan oleh pasangan fase gerak dan fase diam yang

sesuai dengan komponen yang akan dipisahkan, contoh bila komponen yang akan dipisahkan

adalah:

1. Hidrokarbon jenuh hampir tidak diabsorpsi sehingga merambat paling cepat.

Hidrokarbon tak jenuh diserap makin kuat. Semakin banyak ikatan rangkap dalam

molekul, maka penyerapan akan semakin kuat. Oleh karena itu, untuk pemisahan

hidrokarbon dipilih adsorben yang aktif dengan pelarut yang agak polar, atau

digunakan sistem fase terbalik.

2. Adanya gugus fungsional pada hidrokarbon mengakibatkan adsorpsi makin kuat

sesuai urutan berikut: -CH3 < -OR < C=O < -NH2 < -OH < -COOH. Apabila benzena

sebagai eluen dan silika gel atau alumina sebagai adsorben maka eter atau ester akan

merambat paling cepat, disusul oleh aldehid / keton, kemudian alkohol, dan yang

paling lambat adalah asam karboksilat

Sebagai pegangan dalam pemilihan adsorben dan eluen untuk suatu sampel dalam KLT,

dapat menggunakan diagram tringular berikut:

Dengan memutar segitiga pada diagram di atas, maka fase diam dan eluen yang sesuai untuk

berlangsungnya suatu pemisahan ditunjukkan oleh masing-masing sudut segitiga tersebut.

Misalnya, apabila senyawa yang hendak dipisahkan relatif non polar maka digunakan fase diam

yang aktif dan eluen yang nonpolar, dan sebaliknya.

4. Penjenuhan Chamber Kromatografi

Tujuan dan langkah-langkah dalam penjenuhan bejana dilakukan seperti halnya pada KK.

5. Penempatan Cuplikan pada Lempeng

Campuran yang akan ditotolkan dilarutkan terlebih dulu dalam pelarut yang agak

nonpolar, dengan titik didih antara 50 – 90 oC, sehingga mudah menguap dari lapisan.

Konsentrasi larutan yang dibuat umumnya 0,1 – 1%. Air digunakan jika tidak ada pilihan lain.

21

Penempatan cuplikan umumnya dilakukan seperti pada KK dengan dasar pertimbangan yang

serupa. Penggunaan pipa kapiler ataupun mikropipet yang dapat diatur volume penotolannya

akan menghasilkan noda dengan konsentrasi senyawa yang lebih seragam.

Pada umumnya jumlah yang ditotolkan sekitar 50 – 100 µg setiap

bercak untuk mekanisme adsorpsi, sedangkan 5 – 20 µg setiap bercak

untuk mekanisme partisi. Pada penotolan, ujung penetes diusahakan

sedekat mungkin dengan permukaan adsorben namun sedapat mungkin

tidak menyentuh adsorben agar tidak merusak permukaan adsorben di

tempat totolan. Penandaan tempat totolan dengan pensil sebaiknya

dihindari untuk mencegah terlepasnya permukaan adosben. Oleh karena itu

gunakan multi purpose template untuk pemberian tanda dan penotolan.

Ketepatan yang diperlukan untuk penotolan tergantung pada tujuan kromatografi. Pada

KLT kualitatif, akan lebih bermakna apabila pemeriksaan campuran dilakukan pada beberapa

konsentrasi daripada memeriksa cuplikan dengan jumlah yang tepat.. Perbedaan konsentrasi

dapat diperoleh dengan penotolan berulang pada tempat yang sama, misalnya 2 penotolan pada 1

tempat, 4 penotolan pada 1 tempat, dst. Pemeriksaan yang dilakukan dengan berbagai

konsentrasi dapat memberikan informasi tentang jumlah komponen dan konsentrasi relatifnya.

Pada konsentrasi yang lebih besar akan memberikan informasi komponen yang lebih kompleks,

sehingga beberapa komponen belum terlihat jelas pada konsentrasi rendah.

Jika hendak diketahui jumlah cuplikan yang tepat yang ditotolkan

pada lapisan, maka perlu dibuat larutan cuplikan dengan konsentrasi tepat

dan ditotolkan dengan volume yang tepat pula. Hal ini penting khususnya

untuk pengerjaan KLT kuantitatif. Penyediaan larutan yang volumenya

kecil dan banyaknya diketahui secara tepat untuk menghasilkan cuplikan

pada lapisan merupakan masalah sulit yang menjadi sumber kesalahan

utama pada KLT kuantitatif. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan

pipa kapiler yang diameter dalamnya diketahui dan akan menyedot

larutan dengan volume yang dapat diketahui ketika dicelupkan ke dalam

larutan, seperti mikropipet di atas. Tersedia pula mikropipet yang dapat menyedot volume

larutan 1 – 100 μl.

Kesalahan dalam penotolan dapat diminalisir menggunakan penotol otomatis dengan

ketepatan dan ketelitian tinggi seperti pada gambar berikut:

Pada

KLT

22

preparatif, cuplikan ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi lempeng besar, kemudian dielusi

secara tegak lurus terhadap garis cuplikan sehingga campuran memisah menjadi beberapa pita.

Volume penotolan dapat mencapai 2 ml dengan lebar 1 – 5 mm. Pita yang seragam dapat

diperoleh dengan bantuan mikropipet atau alat penotol berikut:

Jumlah cuplikan yang ditotolkan pada

KLT preparatif dapat mencapai 50 mg

pada lapisan 20 x 20 cm tebal 1 mm untuk

mekanisme adsorpsi, sedangkan untuk

partisi 5 mg. Lapisan dengan tebal 1cm

panjang 1 m dapat digunakan untuk

memisahkan cuplikan hingga 100 g.

Cara ini digunakan untuk memisahkan

campuran sehingga diperoleh senyawa

murni untuk analisis lebih lanjut, untuk meneliti bahan alam yang umumnya berjumlah kecil dan

campurannya kompleks, untuk memperoleh cuplikan murni guna mengkalibrasi KLT uantitatif.

Pelarut untuk penotolan harus benar-benar hilang dari lapisan sebelum dielusi, jika perlu

dengan dibantu dengan hairdryer terutama jika menggunakan air sebagai pelarut.

6. Elusi

Proses elusi pun berjalan seperti halnya pada KK, namun

lempeng KLT tidak digantung melainkan diletakkan pada bejana

dengan ujung bagian atas menyandar pada dinding bejana.

Penandaan solvent front dapat dilakukan dengan menggoreskan

pensil sehingga goresan tersebut akan menahan aliran eluen.

Eluen akan bergerak melalui proses adsorpsi (dan atau partisi)

pada fase diam.

Elusi sebaiknya dilakukan pada suhu tetap untuk

mencegah perubahan komposisi campuran eluen yang

disebabkan oleh penguapan ataupun perubahan fase. Seperti

halnya pada KK, kejenuhan atmosfer dalam bejana oleh uap eluen harus senantiasa

dipertahankan selama elusi karena akan mempengaruhi kesetimbangan distribusi. Suatu gejala

apabila atmosfer dalam bejana tidak dengan uap eluen yaitu terjadinya pengembangan dengan

permukaan eluen yang berbentuk cekung dimana eluen bagian tepi lebih cepat bergerak daripada

bagian tengah.

Ada 2 cara untuk memekatkan bercak cuplikan yang bundar menjadi garis tipis sebelum

elusi dilaksanakan, yaitu:

1. Lapisan yang telah ditotoli diletakkan di dalam eluen yang sangat polar, seperti metanol.

Kemudian dikembangkan hingga titik yang terletak sedikit di atas titik asal, sehingga

23

cuplikan akan bergerak bersama eluen dan membentuk garis. Setelah lapisan diangkat

dan dikeringkan, lalu dielusi pada eluen normal.

2. Cuplikan ditotolkan pada lapisan siap pakai dengan penyangga yang tidak menjerap yang

berbentuk pita di sepanjang salah satu sisinya. Eluen akan membawa seluruh cuplikan

dari pita yang tidak menjerap tersebut menuju sisi bagian lapisan yang menjerap, berupa

garis atau pita.

Garis tipis akan memisah menjadi pita, dan menghasilkan pemisahan yang tajam dari cuplikan

berkomponen banyak.

Pada saat elusi, akan dijumpai 3 macam gerakan eluen yang berlainan, yaitu:

1. Eluen bergerak ke atas melalui lapisan, yang dapat

dilihat dengan mudah berupa garis depan yang maju.

2. Uap eluen akan terjerap oleh lapisan di atas garis depan.

Dengan demikian saat garis depan mencapai bagian

atas lapisan, maka uap eluen akan bergerak ke penjerap

yang hampir jenuh dengan komponen eluen yang lebih

volatil.

3. Penguapan pelarut dari lapisan di bawah garis depan.

Gerakan eluen tersebut akan menentukan berapa banyak

pelarut yang benar-benar melewati cuplikan, karena merupakan penjumlahan dari ketiganya.

Namun faktor tersebut dapat dikendalikan dengan penjenuhan bejana.

7. Deteksi Daerah Noda

Deteksi daerah noda dapat dilakukan seperti halnya pada KK. Kebanyakan reagen lokasi

yang digunakan untuk senyawa atau gugus tertentu pada KK dapat digunakan pada KLT dengan

cara yang sama. Selain itu, reagen lokasi yang sering digunakan pada KLT antara lain:

1. Uap iodium. Lempeng diletakkan dalam bejana atau gelas piala tertutup yang berisi

kristal iodium sehingga uap iodium akan terjerap oleh bercak pada lapisan yang

mengandung senyawa organik. Warna bejana akan menjadi ungu. Senyawa tak jenuh

akan memberikan noda tak berwarna, sedangkan senyawa organik yang jenuh akan

memberikan noda berwarna coklat dengan latar belakang putih. Iodium akan menyublim

bila lempeng dikeluarkan dari bejana dan bercak memudar perlahan, namun kedudukan

noda dapat diberi tanda dan dibuat permanen dengan disemprot menggunakan larutan

0,5% benzidina dalam alkohol absolut.

2. Asam sulfat pekat. Senyawa organik dapat dideteksi dengan asam sulfat pekat, kemudian

dipanaskan pada suhu ±100 oC. Pada pemanasan, senyawa organik pada lapisan terbakar

hangus menjadi karbon (arang) dan tampak sebagai bercak hitam pada latar belakang

putih. Dalam hal ini dapat digunakan larutan asam sulfat 10% dalam etanol atau 50 –

80% dalam air. Kekorosifan asam sulfat dapat dihindari dengan menggunakan amonium

24

sulfat. Panas menguraikan amonium menjadi amonia yang menguap dan asam sulfat yang

menghanguskan senyawa organik.

3. Campuran asam sulfat dan kalium bikromat atau dengan asam nitrat.

4. Reagen semprot yang akan menimbulkan warna jika bereaksi dengan bercak cuplikan.

Pada cara ini maka dapat diperoleh informasi gugus fungsi penyusun senyawa, contoh

dugaan adanya aldehid atau keton dapat dipastikan dnegan 2,4-dinitrofenilhidrazin, atau

fenol dapat dipastikan denga reagen besi (III) klorida. Macam-macam reagen dan

penggunaannya dapat dilihat sebagai berikut:

Deteksi bercak pada KLT preparatif tidak boleh merusak senyawa yang dipisahkan,

sehingga cara yang paling sesuai dalam hal ini adalah deteksi di bawah sinar UV. Metode

alternatif yaitu dengan menempelkan selotif pada lapisan sedemikian hingga tegak lurus bercak

pita. Saat diangkat, selotif akan membawa sedikit adsorben yang mengandung pita senyawa yang

selanjutnya dapat dideteksi dengan reagen warna. Alternatif lain yaitu dengan menyemprot

lapisan silika gel dengan air sehingga menjadi tembus cahaya (bening) dan bercak pita terlihat

sebagai daerah buram pada latar belakang tembus cahaya.

8. Identifikasi Senyawa

Identifikasi bercak dilakukan seperti halnya pada KK, dengan parameter harga Rf atau

Rr. Faktor yang memperngaruhi gerakan noda dalam KLT, antara lain:

1. Struktur kimia senyawa yang akan dipisahkan.

2. Sifat adsorben dan derajat aktifitasnya.

3. Homogenitas dan tebal lapisan adsorben, karena akan mempengaruhi aliran eluen.

4. Derajat kemurnian eluen dan perbandingan eluen dalam campuran.

5. Derajat kejenuhan uap eluen dalam bejana.

6. Teknik elusi berdasarkan arah aliran eluen.

7. Cara penotolan dan jumlah sampel yang ditotolkan.

8. Suhu.

9. Kesetimbangan distribusi komponen sampel di antara dua fase.

Jika sampel terdiri dari komponen yang sangat kompleks dan baku pembanding adalah

senyawa murni, maka komponen-komponen senyawa lain dalam sampel akan mempengaruhi Rf

senyawa yang sedang dianalisis. Salah satu pengatasannya adalah dengan metode yang disebut

dengan spiking. Spiking dilakukan dengan menambahkan sejumlah tertentu senyawa baku ke

dalam sampel, dan ketiga cuplikan dielusi bersama, yaitu baku murni, sampel, dan sampel yang

telah dispiking. Hasilnya dapat dilihat pada gambar berikut:

25

Apabila sampel memang mengandung senyawa yang sama dengan senyawa baku, maka noda

senyawa tersebut akan menjadi lebih besar (positif).

9. Dokumentasi

Selain dengan melukis kromatogram dan mencatat harga Rf, kromatogram berukuran

obyek glas dapat didokumentasikan pada buku laporan dengan cara menutup seluruh lapisan

dengan isolatip. Setelah seluruh lapisan menempel pada solatip, kemudian selimuti bagian

belakang lapisan dengan solatip lagi sehingga bentuknya seperti kartu yang dilaminasi. Hasilnya

dapat ditempel pada laporan. Jika digunakan lapisan dengan penyangga plastik atau logam, maka

hasil dapat langsung ditempel setelah permukaan lapisan ditutup dengan solatip.

C. TEKNIK ELUSI

Teknik yang banyak digunakan dalam KLT adalah ascending, namun tidak menutup

kemungkinan dilakukan teknik elusi lain seperti descending dan circular sekalipun alat yang

digunakan menjadi agak sulit. Pada teknik penurunan, tempat eluen diletakkan di bagian atas

bejana dan untuk mengalirkan eluen ke lempeng KLT diperlukan perantara yang dapat berupa

kapas atau gulungan kertas. Setelah elusi, lempeng diambil dari bejana dan dibiarkan kering

tanpa pemanasan. Bila diperlukan dapat digunakan aliran udara yang diarahkan pada permukaan

yang mendatar. Seperti dalam KK, pada teknik elusi 2 arah, maka eluen pertama harus hilang

terlebih dahulu sebelum elusi berikutnya.

D. MEKANISME PEMISAHAN DALAM KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Pemisahan pada KLT terjadi dengan mekanisme yang sama seperti pada KK. Mekanisme

yang sering terjadi pada KLT adalah adsorpsi, namun tidak menutup kemungkinan terjadi proses

partisi, tergantung pada kondisi percobaan dan derajat keaktifan fase diam.

E. ANALISIS KUANTITATIF

26

Prinsip analisis kuantitatif pada KLT sama dengan KK. Sebelum dilakukan analisis,

komponen yang telah dipisahkan harus diisolasi terlebih dahulu. Isolasi komponen sampel dapat

dilakukan dengan:

1. Bercak disedot dengan alat khusus berupa vakum, seperti Craig Tube, kemudian disari.

2. Bercak dikorek dengan spatula, disari dengan pelarut yang sesuai, kemudian disaring.

Analisis kuantitatif dapat dilakukan antara lain dengan:

1. Menggunakan grafik hubungan antara log konsentrasi dan area dari bercak.

2. Mengukur transmisi cahaya yang melalui bercak dengan fotodensitometri.

3. Bercak yang telah diisolasi dan disari kemudian ditetapkan kadarnya secara

spektrofotometri.

Pada KLT preparatif, adsorben yang mengandung pita senyawa yang dianaslis dikerok

dengan spatula, silet, atau pengaduk karet pipih. Pengerokan yang lebih sempurna dapat

dihasilkan dengan bantuan alat sebagai berikut:

Hal ini diutamakan pada pekerjaan kuantitatif. Kemudian senyawa disari dari adsorben dengan

pelarut yang sesuai. Pada pekerjaan preparatif, setelah disari maka pelarut diuapkan dan senyawa

diisolasi. Sedangkan pada pekerjaan kuantitatif, pelarut yang telah mengandung senyawa

dimasukkan ke dalam labu dan diencerkan hingga tanda, kemudian ditetapkan kadarnya secara

spektrofotometri.

Terdapat hubungan antara ukuran bercak / kromatogram dengan konsentrasi senyawa.

Bercak dapat dikuantitasi secara spektroskopi dengan transmisi atau pemantulan. Pada ragam

transmisi, lapisan dilewati cahaya elektromagnetik pada panjang gelombang yang sesuai, dan

energi yang ditransmisikan diukur sebagai transmitan. Alternatif cara di atas adalah dengan

mengukur energi yang diserap senyawa pada lapisan, dimana absorbansi berbanding lurus

dengan konsentrasi. Sedangkan pada ragam pemantulan, sinar disorotkan pada lapisan dan

berkas sinar yang diantulkan diukur. Metode ini terutama dilakukan untuk senyawa yang

berfluoresensi. Energi yang ditransmisikan ataupun dipantulkan diukur dan dicatat sedemikian

hingga bercak tampak sebagai puncak kromatogram, menggunakan instrumen TLC scanner.

27

Luas area kromatogram sebanding dengan konsentrasi. Luas area kromatogram senyawa sampel

dibandingkan dengan luas area kromatogram senyawa baku yang konsentrasinya telah diketahui.

Dengan demikian konsentrasi senyawa sampel dapat dihitung. Berikut adalah contoh

kromatogram yang dihasilkan dari beberapa penelitian:

28

29

KROMATOGRAFI KOLOM

A. PENDAHULUAN

Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan (sampel) diletakkan berupa

pita atau lapisan pada bagian atas adsorben di dalam kolom yang berupa tabung. Eluen dibiarkan

mengalir melalui kolom dengan aliran yang dipengaruhi oleh gaya gravitasi, gaya berat, dan

mekanisme adsorpsi. Pita senyawa komponen sampel akan bergerak melalui kolom dengan laju

yang berbeda, memisah, kemudian dikumpulkan berupa fraksi pada saat keluar dari akhir kolom.

B. PROSEDUR FUNDAMENTAL DALAM KROMATOGRAFI KOLOM

1. Penyiapan Adsorben

Adsorben hendaknya memenuhi persyaratan berikut:

1. Tidak larut dalam eluen yang digunakan.

2. Inert, tidak bereaksi dengan sampel.

3. Cukup aktif, sehingga mampu mengadsorpsi sekaligus memungkinkan perambatan

sampel.

4. Memungkinkan aliran yang baik dari eluen.

5. Reprodusibel, dapat diproduksi dengan sifat yang konstan.

Adsorben yang banyak digunakan antara lain:

30

Adsorben yang paling banyak digunakan adalah alumina dan silika.

Mekanisme pemisahan pada kromatografi kolom umumnya terjadi karena adsorpsi,

sehingga sebelum dibuat menjadi bubur, serbuk adsorben harus diaktifkan terlebih dahulu

dengan pemanasan. Suhu dan lama waktu pemanasan menentukan derajat keaktifan. Tujuan

pengaktifan ini sama seperti pengaktifan lapisan adsorben pada KLT. Sifat adsoben terutama

tergantung pada pH dan derajat keaktifannya. Berdasarkan aktivitas adsorpsi relatif terhadap

alumina, disusun suatu tingkat aktivitas Brockmann, sehingga adsorben digolongkan ke dalam

golongan I (aktivitas tertinggi) hingga V (aktivitas terendah).

Kekuatan adsorpsi gugus polar pada senyawa-senyawa polar akan meningkat dengan

urutan sebagai berikut:

-CO2R, =C=O, -NH2, -OH, -CO2H

Gugus polar pada pemukaan alumina dan silika, terutama gugus hidroksi, akan menarik molekul

komponen sampel melalui interaksi dipol-dipol dan ikatan hidrogen. Jika titik-titik tersebut

diduduki oleh air atau pelarut berproton seperti alkohol dan amina, maka permukaan tidak dapat

berfungsi lagi sebagai adsorben dan dikatakan menjadi nonaktif. Selain itu afinitas adsorben

dapat dimodifikasi secara kimia dengan penambahan asam.

Berdasarkan sifatnya, adsorben tertentu dapat berperan sebagai katalisator. Hal ini

penting untuk diperhatikan karena dapat menyebabkan terjadinya reaksi dengan komponen

sampel. Meskipun alimina basa lingkup penggunaannya paling luas, namun alumina basa, dapat

menyebabkan perubahan kimia dan menimbulkan reaksi, seperti kondensasi aldehid dan keton.

Oleh karena itu tidak dianjurkan menggunakan aseton sebagai eluen jika adsorben yang

digunakan adalah alumina basa, karena akan terkondensasi menjadi diaseton alkohol. Alumina

basa dapat dimodifikasi menggunakan asam klorida untuk mengubah menjadi bentuk asam, atau

31

menggunakan asam nitrat untuk mengubah menjadi netral. Alumina basa yang mengandung

aluminat dan alumina asam yang mengandung ion klorida dapat berfungsi sebagai penukar ion,

yaitu alumina basa tukar-menukar dengan kation anorganik dan organik, sedangkan alumina

asam tukar-menukar dengan anion anorganik dan organik. Alumina dengan derajat keaktifan I

dapat diperoleh dengan pemanasan pada 380 – 400 oC selama 3 jam.

Silika gel juga dapat digunakan secara luas dengan berbagai eluen. Namun, silika gel

dapat menyebabkan isomerisasi senyawa tertentu seperti terpen dan sterol. Silika gel dengan

keaktifan I dapat diperoleh dengan pemanasan pada 150 – 160 oC selama 3-4 jam.

Pada pemilihan adsorben dan eluen, sebagai pegangan digunakan adsorben yang

polaritasnya sama dengan komponen sampel yang hendak dipisahkan, sedangkan eluen

sebaliknya. Bila digunakan eluen yang kurang polar, pemisahan sempurna tetapi lambat sehingga

diperlukan volume eluen yang lebih banyak, dan waktu analisis yang lebih panjang. Perambatan

komponen dapat dipercepat dengan penambahan eluen yang lebih polar. Tabel berikut memuat

adsorben dan eluen yang disusun berdasarkan kekuatan adsorpsi dan kekuatan elusinya:

2. Penyiapan Eluen

Pemilihan pertama dari eluen adalah bagaimana sifat kelarutannya. Kekuatan zat elusi

adalah daya adsorpsi pada adsorben dalam kolom. Umumnya adsorben polar seperti alumina dan

silika gel, maka kekuatan adsorpsi naik dengan kenaikan polaritas zat yang diserap. Kekuatan

elusi dari eluen pada karbon aktif dalam kolom untuk asam amino dan sakarida diturunkan dalam

urutan berikut: etil asetat < dietil eter < propanol < aseton < etanol < metanol < air. Urutan

tersebut adalah kenaikan polaritas atau penurunan panjang rantai homolog. Sedangkan untuk

alumina dan silika gel urutannya adalah sebaliknya, yaitu: air < metanol < etanol < propanol <

aseton < etil asetat < dietil eter < kloroform < metilen klorida < benzena < toluen < trikloroetilen

< karbon tetraklorida < sikloheksana < heksana. Kemurnian pelarut harus setinggi mungkin.

32

3. Penyiapan Kolom

Kolom kromatografi dapat berupa pipa gelas, logam atau plastik. Namun umumnya

berupa tabung gelas yang dilengkapi dengan kran pada bagian bawah dan plat penyaring di

dalamnya. Dalam kondisi tertentu, buret pun dapat digunakan sebagai kolom. Beberapa bentuk

kolom dapat dilihat pada gambar berikut:

Kolom (a) bagian bawahnya dapat dilepas untuk mengambil adsorben dan membersihkan kolom.

Kolom (b) seperti buret sederhana. Kolom (c) memiliki sambungan kaca pada bagian atas untuk

tandon eluen. Kolom (d) memiliki tabung plastik kecil untuk mengeluarkan eluen langsung dari

dasar kolom. Kolom (e) memiliki bentuk tabung berupa torpedo. Pada tiap rancangan kolom

dilengkapi dengan penopang atau piringan plat di dalamnya, tepatnya di atas kran untuk

menahan adsorben. Selain itu sebagai penahan adsorben dapat pula digunakan glass wool atau

kapas yang ditutupi pasir bersih 50 – 100 mesh setebal 30 – 60 mm. Kadang dapat pula

digunakan piringan kaca masir.

Ukuran kolom sangat beragam, tergantung pada banyaknya senyawa yang akan

dipisahkan. Umumnya memiliki panjang minimal 10 kali diameter dalam, dan bahkan mungkin

hingga 100 kalinya. Bentuk dan ukuran kolom yang umum digunakan, antara lain:

Perbandingan jumlah adsorben : sampel 30 : 1

Perbandingan panjang : diameter kolom 10 – 15 : 1

Panjang kolom:

a. Sistem multikomponen

b. Komponen-komponen dengan afinitas yang sama terhadap adsorben

c. Komponen-komponen dengan afinitas yang berbeda terhadap adsorben

Kolom panjang

Kolom panjang

Kolom pendek

33

4. Pengisian Kolom

Adsorben dapat dikemas di dalam kolom dengan cara kering ataupun cara basah. Pada

cara kering, selapis pasir / penahan adsorben yang lain diletakkan ke dalam kolom, kemudian

adsorben dituang sedikit-demi sedikit. Setelah setiap penambahan adsorben, permukaannya harus

diratakan dan dimampatkan dengan alat pemampat. Jika semua adsorben telah dimasukkan, di

permukaan atas diletakkan kertas saring dan ditambah selapis pasir lagi, sehingga tetap menjaga

kerataan permukaan adorben jika eluen dialirkan. Setelah itu eluen dialirkan dari atas kolom

dengan kran kolom dalam kondisi terbuka sehingga memungkinkan eluen meresap hingga ujung

akhir kolom. Setelah eluen mencapai ±1 cm di atas bagian atas kolom, maka kran ditutup dan

aliran eluen dihentikan.

Pada cara basah, adsorben dicampur dengan eluen untuk dibuat bubur terlebih dahulu.

Setelah itu bubur adsorben dimasukkan ke dalam kolom yang telah berisi eluen ±1/3 panjang

kolom. Selama adsorben turun perlahan-lahan, kolom diketuk-ketuk pada semua sisi secara

perlahan dengan ballpipet karet atau bahan lain seperti gabus. Hal tersebut dimaksudkan agar

partikel-partikel adsorben dapat menyusun diri dengan kerapatan yang sama sehingga diperoleh

lapisan yang homogen. Jika besarnya partikel-partikel adsorben sama / monodisperse akan lebih

mudah untuk mendapatkan homogenitas pengepakan. Pengemasan cara basah dapat pula

dilakukan dengan memasukkan adsorben kering melalui corong dengan aliran teratur, ke dalam

kolom yang telah berisi eluen ±1/2 panjang kolom. Selama adsorben turun dilakukan hal yang

serupa dengan di atas. Jika adsorben dimasukkan sekaligus, akan diperoleh homogenitas yang

lebih baik. Kran dapat dibuka ataupun ditutup selama pengemasan, asalkan adsorben yang telah

dimasukkan ke dalam kolom tidak boleh ada bagian yang kering, atau harus selalu terendam oleh

eluen. Hal tersebut dapat tercapai dengan mempertahankan eluen ±1 cm di atas permukaan

adsorben. Setelah itu sepotong kertas saring diletakkan di atas adsorben serta ditambah selapis

pasir bersih untuk menutupi kertas saring. Hal tersebut dilakukan untuk menjaga kerataan

permukaan adorben jika sampel dimasukkan.

Partikel-partikel adsorben harus mengisi kolom dengan kerapatan yang sama / homogen,

sebab pengisisan kolom yang tidak teratur dapat merusak batas-batas pita kromatografi. Selain

itu pengisian yang tidak homogen dapat pula disebabkan oleh adanya gelembung-gelembung

udara saat pengisian. Oleh karena itu saat pembuatan bubur, adsorben harus diaduk-aduk dan

dicuci secara berulang dengan eluen untuk menghilangkan gelembung udara.

5. Penanganan Sampel

Sebelum larutan sampel dimasukkan, kran dibuka terlebih dulu untuk mengeluarkan

eluen yang ada di atas permukaan adsorben. Sampel dimasukkan ke dalam kolom pada saat eluen

di atas kolom hampir terserap seluruhnya. Sampel dimasukkan ke dalam kolom dengan

permukaan yang serata mungkin dan harus dicegah terjadinya pengguncangan kolom, karena hal

tersebut dapat memungkinkan rusaknya pita. Pemasukkan sampel ke dalam kolom dapat

34

menggunakan pipet kecil. Agar tidak merusak permukaan adsorben, maka ujung pipet jangan

sampai menyentuh permukaan adsorben. Oleh karena itu ujung pipet ditempelkan pada dinding

kolom dan terletak sedikit ke atas dari permukaan adsorben. Selama sampel dikeluarkan dari

pipet, ujung pipet digerakkan melingkar / berkeliling di dinding kolom namun jangan sampai ada

sampel yang tertinggal di dinding kolom. Setelah seluruh sampel terisikan ke dalam kolom, maka

kran dapat dibuka agar sampel terserap ke lapisan adsorben. Bila hampir seluruh sampel terserap

ke dalam adsorben, maka bagian atas kolom segera dialiri dengan eluen menggunakan corong

pisah.

6. Elusi

Proses terbawanya sampel dari puncak kolom sampai akhir kolom hingga memisah

menjadi komponen-komponennya disebut elusi. Untuk mempertahankan jumlah eluen selalu

dalam kondisi konstan yaitu ±1 cm di atas permukaan adsorben, maka kecepatan tetesan eluat

dari kolom harus sama dengan tetesan eluen dari corong pisah. Pemisahan terjadi karena

komponen sampel lebih banyak tertahan oleh adsorben atau dibawa oleh eluen tergantung dari

afinitas (Kd) komponen tersebut terhadap kedua fase. Pada umumnya lebih lambat jalannya

sampel dalam kolom maka akan diperoleh pita-pita kromatogram yang lebih tegas. Elusi

diteruskan hingga komponen yang dihendaki telah terpisah dan keluar dari kolom, yang

kemudian ditampung dalam beberapa fraksi pada interval waktu penampungan tertentu. Proses

ini dapat dilanjutkan dengan penetapan kadar masing-masing fraksi sehingga dapat diperoleh

kadar komponen dalam sampel campurannya.

Elusi dapat dilakukan secara isokratik ataupun secara gradien. Pada elusi isokratik, eluen

yang digunakan selama elusi selalu sama. Sedangkan pada gradien elusi / elusi landaan, eluen

yang digunakan tidak sama seperti yang digunakan pada awal elusi. Dengan kata lain, pada saat

proses elusi dapat dilakukan penggantian eluen. Jika komponen yang dikehendaki telah terpisah

dari campuran, maka eluen dapat diganti untuk mengeluarkan komponen lain yang masih ada di

dalam kolom.

C. POLA ELUSI (MEKANISME PEMISAHAN) PADA KROMATOGRAFI KOLOM

Setelah sampel dituang pada puncak kolom, dengan segera sampel akan terdistribusi di

antara kedua fase pada puncak kolom. Adanya aliran eluen maka eluen yang mengandung

sebagian sampel akan terdesak ke bagian kolom yang lebih bawah, sehingga akan terjadi

distribusi baru antara eluen dengan adsorben yang baru. Pada waktu yang bersamaan, distribusi

baru juga terjadi pada puncak kolom antara eluen yang baru dengan adsorben yang telah

mengandung sebagian sampel. Karena komponen-komponen sampel hanya dapat bergerak

bersama eluen, maka kecepatan bergerak dari suatu komponen tergantung pada lamanya

komponen berada dalam eluen, dimana hal tersebut tergantung pada seberapa besar komponen

tertambat pada adsorben. Apabila komponen mengalami retensi kuat pada adsorben maka

35

lamanya komponen tersebut berada dalam eluen lebih kecil

dibanding dengan komponen yang mengalami retensi lemah pada

adsorben. Pemisahan terjadi karena komponen sampel lebih

banyak tertahan oleh fase diam atau dibawa oleh fase gerak

tergantung pada afinitas komponen terhadap kedua fase. Dengan

demikian, apabila perbedaan dalam adsobsi cukup besar maka

akan terjadi perbedaan kecepatan migrasi dari masing-masing

komponen di dalam kolom sehingga akan diperoleh pita-pita

komponen di dalam kolom.

Jika pada bagian bawah kolom dihubungkan dengan

detektor maka akan diperoleh signal yang digambarkan sebagai

fungsi waktu, yang kemudian disebut sebagai kromatogram.

Koefisien distribusi menggambarkan kecepatan

rata-rata tiap solut (zona tengah) saat fase gerak bergerak ke

ujung akhir kolom. Harga K dapat dipresentasikan dengan

isoterm yang menggambarkan interaksi solut dengan fase

gerak dan fase diam pada temperatur tertentu. Pada kondisi

ideal, harga koefisien distribusi konstan dalam kisaran

konsentrasi yang luas, sehingga Cs proporsional terhadap

Cm dan korelasi antara keduanya membentuk kurva garis

lurus, seperti pada kurva C pada gambar di bawah. Apabila

pada equilibrium (kesetimbangan) distribusi solut di dalam kedua fase terjadi reaksi asosiasi atau

disosiasi pada salah satu fase, maka akan diperoleh isoterm B atau D. Sedangkan kurva A disebut

isoterm adsorpsi yang menunjukkan korelasi antara jumlah solut yang diadsorpsi pada

permukaan adsorben terhadap jumlah solut dalam fase gerak. Pada konsentrasi solut tinggi,

setelah seluruh tempat pada permukaan adsorben dipenuhi molekul-molekul solut maka tidak ada

perubahan perbandingan Cs dan Cm sehingga kurva tampak datar.

Hal tersebut menunjukkan bahwa pada kisaran konsentrasi yang luas, jarang didapat

korelasi linier antara Cs dan Cm, namun pada konsentrasi rendah korelasi Cs dan Cm merupakan

kurva garis lurus (K konstan).

Keseimbangan adsorbsi (adsorption equilibrium)

Jika cairan mengalir sepanjang permukaan aktif suatu padatan, maka akan terjadi

keseimbangan adsorpsi analit yang terserap pada permukaan zat padat tersebut. Bila dibuat grafik

hubungan antara konsentrasi sampel dalam adsorben (Cs) dan konsentrasi sampel dalam eluen

(Cm), maka dapat diperoleh kurva adsorption isotherms seperti berikut:

36

Linier. Konsentrasi sampel yang terserap sebanding dengan konsentrasi sampel dalam eluen,

sehingga kurva linier dan peak yang dihasilkan simetris. Slope dari kurva merupakan

koefisien distribusi sampel yang bersangkutan.

Konveks. Kurva ini terbentuk bila konsentrasi sampel dalam fase diam lebih kecil daripada

konsentrasi sampel dalam fase gerak, sehingga harga Kd menjadi lebih kecil dari harga

setimbangnya. Akibatnya puncak yang dihasilkan tidak simetris (tailing / pengekoran di

belakang).

Konkav. Kurva ini terbentuk bila konsentrasi sampel dalam fase diam lebih besar daripada

konsentrasi sampel dalam fase gerak, sehingga harga Kd menjadi lebih besar dari harga

setimbangnya. Akibatnya puncak yang dihasilkan tidak simetris (leading / pengekoran di

depan).

D. ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF

Kromatogram dapat menunjukkan waktu yang dibutuhkan untuk elusi suatu pita

komponen sampel. Waktu yang menunjukkan puncak kromatogram disebut sebagai waktu

retensi. Waktu retensi ini spesifik untuk tiap senyawa sehingga dapat digunakan sebagai dasar

analisis kulaitatif. Kromatogram juga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif, yaitu dengan

membandingkan AUC (Area Under Curve / luas daerah di bawah kurva) komponen sampel

dengan AUC senyawa baku yang telah diketahui konsentrasinya.

Setelah komponen memisah dan keluar dari kolom, eluat dipisahkan menjadi beberapa

fraksi. Penampungan eluat yang terbagi ke dalam fraksi-fraksi, dapat dilakukan secara manual

dengan tabung reaksi yang diganti pada interval waktu penampungan tertentu. Masing-masing

fraksi yang diperoleh kemudian dianalisis. Senyawa yang tidak berwarna dianalisis dengan spot

tes secara KK atau KLT.

Analisis kuantitatif dapat dilakukan dengan mengukur absorbansi masing-masing fraksi

secara spektrofotometri untuk menghitung kadarnya. Perhitungan kadar masing-masing dapat

dilakukan dengan memasukkan data absorbansi ke dalam persamaan kurva baku Y = BX + A.

Selain itu perhitungan kadar dapat pula dilakukan dengan membandingkan serapan larutan fraksi

dengan serapan larutan baku pada konsentrasi yang telah diketahui. Dengan mengukur volume

eluat yang tertampung pada masing-masing fraksi, maka dapat dihitung jumlah zat uji pada

masing-masing fraksi. Jumlah zat uji yang terdapat dalam seluruh fraksi merupakan jumlah zat

uji yang terdapat di dalam larutan sampel yang dimasukkan ke dalam kolom. Dengan demikian

konsentrasi zat uji di dalam sampel dapat dihitung.

37

HPLC

A. PENDAHULUAN

HPLC merupakan salah satu metode kromatografi cair yang fase geraknya dialirkan

secara cepat dengan bantuan tekanan, dan hasilnya dideteksi secara instrumen.

B. INSTRUMENTASI

C. FASE GERAK DAN FASE DIAM

Fase Gerak

Kemampuan HPLC untuk memisahkan banyak senyawa terutama tergantung pada

keanekaan fase gerak. Fase gerak pada HPLC sangat berpengaruh pada tambatan dan pemisahan

senyawa. Karena banyak pelarut dapat digunakan untuk HPLC, maka sifat utama fase gerak

harus dipertimbangkan. Fase gerak untuk analisis secara HPLC harus bersifat: murni, tanpa

cemaran, tidak bereaksi dengan kemasan dalam kolom, dapat melarutkan solut, viskositas

rendah, memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah (jika diperlukan), dan

harganya wajar. Fase gerak untuk HPLC juga harus bebas dari gas terlarut karena dapat

mempengaruhi respon detektor, sehingga menghasilkan sinyal palsu dan mempengaruhi kolom.

Kepolaran pelarut merupakan ukuran kekuatan pelarut untuk mengelusi suatu senyawa.

Kandungan utama fase gerak pada kromatografi fase terbalik adalah air. Kecenderungan air

untuk melarutkan sampel dapat diubah dengan menambahkan pelarut organik yang dapat

bercampur dengan air, garam untuk menimbulkan pengaruh penggaraman, asam, basa, dapar

untuk melarutkan atau mengendapkan asam basa, pereaksi pengompleks untuk menimbulkan

pengaruh pelarutan yang khas untuk gugus fungsi tertentu atau golongan senyawa tertentu.

Pemodifikasi organik yang banyak digunakan yaitu metanol, asetonitril, tetrahidrofuran.

38

Deret eluotropik ditetapkan untuk mengevaluasi polaritas pelarut, dengan parameter yang

sering digunakan yaitu P’ (indeks polaritas). Dasar yang digunakan untuk menentukan skala

polaritas ini adalah ukuran kelarutan dalam dioksan, nitrometan, dan etanol. Kekuatan mengelusi

suatu pelarut dinyatakan dengan elution strength. Secara umum, semakin besar nilai elution

strength, maka senyawa semakin cepat dielusi dari kolom. Harga indeks polaritas dan elution

strength untuk beberapa pelarut yang sering digunakan pada analisis secara HPLC, yaitu:

Pelarut IndeksPolaritas (P’)

ElutionStrength (SiO2)

UV transmission(nm)

n-HeksanToluen

Dietil eterTetrahidrofuran

KloroformEtanol

DioksanMetanol

AsetonitrilNitrometan

Air

0,12,42,84,04,14,34,85,15,86,010,2

0,010,220,380.350,260,680,490,730,500,49

Besar

195285215210235205215205190380170

Berdasarkan harga P’. Maka besarnya polaritas campuran pelarut dapat dihitung dengan

persamaan berikut:

dengan Φ adalah fraksi pelarut dalam campuran dan n adalah jenis pelarut yang digunakan.

Fase Diam

Mekanisme pemisahan yang banyak digunakan dalam metode HPLC adalah kromatografi

partisi fase terbalik, yaitu fase diam cair diikatkan pada penyangga padat dengan fase diam yang

relatif non polar dibanding fase gerak. Kolom yang biasa digunakan pada kromatografi partisi

fase terbalik adalah kolom dengan kemasan fase terikat. Kolom dengan kemasan fase terikat

memiliki sifat stabil karena fase diamnya terikat secara kimia pada penyangga, sehingga tidak

mudah terbawa oleh fase gerak. Penyangga pada kemasan fase terikat biasanya terbuat dari silika

yang sudah diseragamkan, berpori, dan umumnya partikel memiliki diameter 3,5 atau 10 μm.

Penyangga silika gel (SiO2) merupakan rantai -O-

Si-O- dimana pada bagian permukaan silika berupa

gugus-gugus hidroksil (-OH), oleh karena itu silika gel

relatif bersifat polar. Pada reversed phase HPLC,

modifikasi silika gel dilakukan dengan menutup gugus

silanol (-SiOH) untuk menghilangkan gugus hidroksil

melalui reaksi silanisasi. Pada reaksi silanisasi kolom

39

partisi fase terikat, bagian organik akan diikatkan secara kimia dengan gugus silanol pada

permukaan silika. Bagian organik tersebut umumnya hidrokarbon rantai panjang. Semakin

panjang rantai karbon yang diikatkan pada silika maka akan semakin hidrofobik, sehingga fase

gerak umumnya polar. Reaksi silanisasi akan menghasilkan fase diam terikat dengan tipe ikatan

siloksan yang bersifat sangat stabil. Kemasan fase terikat dengan tipe ikatan siloksan (Si-O-Si-C)

dibuat dengan mereaksikan organoklorosilan dengan gugus silanol pada permukaan silika gel

yang terhidrolisis sebagai berikut:

Reaksi Silanisasi

Jika organoklorosilan yang digunakan adalah dichlorodimethylsilane (Si(CH3)2Cl2) maka akan

diperoleh fase diam dimetilsilan menurut reaksi berikut:

Jika organoklorosilan yang digunakan adalah trimetilklorolsilan (Si(CH3)3Cl) maka akan

diperoleh fase diam trimetilsilan menurut reaksi berikut:

Pada kromatografi partisi fase terbalik dengan kemasan fase terikat, R pada siloksan biasanya

berupa gugus C18 (oktadesil) atau C8 (oktil). Reaksi silanisasi untuk membuat isian kolom

oktadesilsilan (ODS atau C18) dibuat dari gugus silanol dan oktadesilklorosilan sebagai berikut:

Reaksi Pembuatan Kolom ODS

40

Tabel di bawah menunjukkan berbagai macam gugus yang diikatkan secara kimia pada

penyangga silika, sehingga terbentuk berbagai macam fase diam terikat yang diinginkan, baik

fase diam terikat yang bersifat polar ataupun nonpolar :

Berbagai macam hasil modifikasi fase diam terikat juga dapat digambarkan sebagai berikut:

41

Panjang pendeknya rantai karbon mempengaruhi tertambatnya senyawa pada fase diam. Kolom

dengan karbon rantai panjang bersifat retensif, sehingga senyawa yang memiliki sifat mirip

dengan kolom akan tertambat lebih lama.

C. POLA ELUSI (MEKANISME PEMISAHAN) PADA HPLC

Pada HPLC pemisahan terjadi di dalam kolom, sehingga mekanisme pemisahan atau pola

elusinya seperti pada kromatografi kolom. Gambar di bawah menunjukkan profil konsentrasi

komponen A dan B pada awal dan akhir elusi. Koefisien partisi A > B, oleh karena itu pada

proses migrasi komponen A berada di belakang komponen B. Bersamaan dengan proses migrasi,

terjadi pula efek pelebaran pada kedua pita yang mengurangi efisiensi pemisahan. Pelebaran pita

tidak dapat dihilangkan secara total, namun dapat dikurangi sehingga pelebaran pita terjadi jauh

lebih lambat daripada pemisahan pita. Dengan demikian pemisahan kedua komponen dapat

terjadi secara sempurna pada panjang kolom yang sesuai.

Profil Konsentrasi Solut A dan B pada Jarak Migrasi yang Berbeda

Padatan pendukung pada kromatografi partisi disalut dengan fase diam cair, dan

pemisahan senyawa campuran ditentukan oleh koefisien partisi masing-msing senyawa di antara

kedua fase cair. Pada kedua fase yaitu fase gerak dan fase diam, salah satu diantaranya harus

lebih polar dibanding yang lain. Bila fase diam lebih polar, disebut kromatografi partisi fase

normal. Bila sebaliknya, disebut kromatografi partisi fase terbalik. Pada fase normal, senyawa

polar lebih terbagi ke fase diam dan tertambat lebih lama dibanding senyawa nonpolar. Pada

kromatografi partisi fase terbalik, terjadi hal yang sebaliknya.

D. TEORI KOLOM, TEORI LEMPENG, TEORI LAJU

Teori Kolom

Kolom merupakan jantung kromatografi. Keberhasilan atau kegagalan analisis tergantung

pada pemilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Tujuan utama kromatografi adalah

memisahkan senyawa campuran dalam waktu yang relatif cepat dan wajar, menjadi puncak atau

pita, ketika senyawa bergerak melalui kolom. Ukuran kinerja kolom dapat dilihat dari

kemampuan kolom dalam memisahkan senyawa. Kolom yang efisien mencegah pelebaran

puncak atau menghasilkan puncak yang sangat sempit. Parameter yang paling banyak digunakan

untuk mengukur keefisienan kolom adalah faktor resolusi (R), bilangan lempeng teoritik (N) dan

HETP (High Equivalent to Theoretical Plate).

42

Faktor resolusi adalah ukuran pemisahan dari 2 puncak.

Daya pisah , Rs, antara 2 puncak dapat diukur secara kuantitatif

dengan persamaan di samping. Harga tR1 dan tR2 adalah

waktu retensi senyawa, sedangkan harga w1 dan w2 adalah

lebar alas puncak.

Berikut adalah contoh pemisahan 2 puncak pada

harga Rs yang berbeda, dengan perbandingan ukuran 2

puncak masing-masing adalah 1/1. ¼. 1/16. Pada gambar

tersebut tampak bahwa pada harga Rs yang semakin kecil,

pemisahan semakin buruk. Bahkan terdapat suatu kemungkinan bahwa 1 puncak yang muncul

tidak mencerminkan satu senyawa, melainkan 2 senyawa atau lebih yang belum memisah,

terlebih apabila kedua puncak memiliki perbandingan ukuran yang relative tinggi, seperti pada 2

puncak dengan perbandingan ukuran 1/16. Daya pisah 2 puncak dikatakan baik apabila memiliki

harga Rs minimal 1,5.

Teori Lempeng

Pada teori lempeng, kolom kromatografi digambarkan sebagai suatu seri lapisan tipis

horisontal yang disebut lempeng teoritik (theoritical plates), dimana pada setiap lempeng akan

terjadi keseimbangan solut antara fase diam dan fase gerak. Gerakan solut dan fase gerak

digambarkan sebagai transfer berurutan dari lempeng satu ke lempeng berikutnya. Pemisahan

akan terjadi lebih baik jika terjadi keseimbangan berkali-kali dalam jumlah yang tinggi. Hal

tersebut dapat tercapai jika bilangan lempeng teoritik juga tinggi. Oleh karena itu, bilangan

lempeng teoritik (N) dapat digunakan sebagai ukuran efisiensi kolom. Persamaan tersebut

menyatakan hubungan waktu retensi senyawa (tR) dan lebar alas

puncak (w) atau lebar puncak pada setengah tinggi puncak (wh)

dengan bilangan lempeng teoritik (N).

43

Bilangan lempeng teoritik berbanding lurus dengan panjang kolom (L). Karena panjang

kolom bermacam-macam, maka diperlukan ukuran keefisienan kolom yang tidak tergantung

pada panjang kolom. HETP atau H merupakan ukuran keefisienan kolom yang lebih disukai

karena memungkinkan perbandingan antara kolom yang panjangnya berlainan, yang dapat

diukur dengan persamaan berikut:

Terlihat bahwa apabila H kecil maka N besar, sehingga jumlah terjadinya kesetimbangan di

dalam kolom akan semakin banyak. Dengan demikian pemisahan di dalam kolom akan lebih

efisien.

Plate teori mampu menggambarkan laju migrasi secara kuantitatif, namun tidak dapat

menggambarkan pengaruh dari variabel-variabel yang menyebabkan terjadinya pelebaran pita,

seperti ukuran partikel, difusi, flow rate, suhu, viskositas pelarut terhadap kinerja kolom. Selain

itu, teori lempeng mengabaikan kinetika transfer massa, oleh karena itu teori lempeng tidak

menjelaskan tentang perubahan konsentrasi yang berhubungan dengan terjadinya satu

keseimbangan pada sebuah kolom dengan tinggi H, sehingga tidak dapat digunakan untuk

memprediksi penampakan kolom dalam hal pemisahan komponen sampel. Oleh karena itu, perlu

diketahui pula tentang teori laju.

Teori Laju

Pada saat migrasi, solut mengalami transfer / distribusi antara fase diam atau fase gerak

berkali-kali. Karena solut hanya dapat bergerak bila berada dalam fase gerak, maka migrasi

dalam kolom juga tidak teratur, sehingga mengakibatkan laju rata-rata solut relatif terhadap fase

gerak juga sangat bervariasi, akibatnya terjadi pelebaran pita solut.

Teori laju didasarkan pada parameter-parameter transfer massa antara fase diam dan fase

gerak, laju difusi solut sepanjang kolom, laju alir fase gerak, dan dinamika fase gerak.

Berdasarkan teori laju, pelebaran pita disebabkan oleh 3 faktor:

1. Difusi eddy (efek perbedaan jarak)

Difusi eddy merupakan aliran tidak teratur yang menyebabkan terjadinya

pencampuran konvektif. Hal ini disebabkan oleh banyaknya kemungkinan diantara

partikel packing yang dapat dilalui oleh solut, sehingga terjadi perbedaan jarak yang

harus dilalui oleh molekul yang satu dengan yang lain. Perbedaan jarak yang dilalui oleh

molekul yang satu dengan yang lain disebabkan oleh perbedaan bentuk, ukuran partikel

pengisi kolom, cara pengisian kolom, dan diameter kolom. Perbedaan tersebut

mengakibatkan perbedaan waktu keluarnya molekul-molekul dari kolom. Suatu molekul

solut dapat bergerak melalui kolom dekat dinding kolom, suatu daerah dengan kerapatan

packing yang rendah, sehingga molekul tersebut dengan cepat akan mencapai akhir

kolom. Sedangkan molekul solut yang melalui bagian tengah kolom, suatu daerah dengan

kerapatan packing yang tinggi, akan mencapai akhir kolom dengan kecepatan yang lebih

44

rendah. Hal tersebut menyebabkan pelebaran pita untuk tiap solut. Efek tersebut dapat

digambarkan sebagai berikut:

Difusi Eddy

Untuk memperkecil efek tersebut maka digunakan partikel dengan diameter kecil

dan seragam, diameter kolom kecil, pengepakan yang mampat dan homogen. Hal yang

perlu diperhatikan yaitu apabila partikel semakin kecil, maka akan terjadi penurunan

tekanan dalam kolom sehingga diperlukan tekanan yang lebih tinggi agar fase gerak

dapat melalui kolom. Selain itu, dalam hal packing semakin kecil ukuran partikel maka

akan lebih sulit untuk mendapatkan keseragaman kerapatan. Oleh karena itu, pengecilan

ukuran partikel dilakukan dengan memperhitungkan penurunan tekanan kolom yang tidak

terlalu tinggi, disertai dengan penyesuaian panjang kolom.

2. Difusi longitudinal (difusi molekul sepanjang kolom)

Difusi longitudinal merupakan efek dari gerakan random molekul solut dalam

fase gerak karena adanya perbedaan konsentrasi. Molekul-molekul cenderung berdifusi

dari daerah berkonsentrasi tinggi ke daerah berkonsentrasi rendah. Dengan demikian pada

saat melintasi kolom, molekul-molekul akan

menyebar untuk berdifusi baik ke belakang ataupun

ke depan. Oleh karena itu difusi ini disebut juga difusi

memanjang, karena dapat terjadi di sepanjang kolom,

baik pada fase gerak maupun fase diam. Akibatnya

solut yang semula membentuk pita yang sempit, akan

berdifusi ke dalam fase gerak di sekelilingnya dan melebarkan profil pita.

Efek ini dapat diperkecil dengan menggunakan fase gerak yang bobot jenisnya lebih

tinggi dengan kecepatan linier aliran ditingkatkan.

3. Transfer massa non equilibrium (efek ketidakseimbangan)

45

Aliran yang terus-menerus dari fase gerak dapat menyebabkan penyimpangan

kesetimbangan. Transfer massa non equilibrium terjadi karena pada umumnya aliran fase

gerak terlalu cepat untuk mendapatkan equilibrium (kesetimbangan) solut di antara dua

fase, dimana pada ujung belakang Cs/Cm lebih kecil dari Kd dan pada ujung depan lebih

besar dari K. Hal ini dapat digambarkan sebagai berikut: fase gerak yang berada di front

terdepan akan bertemu dengan fase diam yang masih baru. Namun molekul solut tidak

bergerak dengan cepat karena adanya resistensi antar fase pada fase diam, sehingga

equilibrium tidak terjadi dengan cepat. Akibatnya, solut sudah akan terbawa oleh fase

gerak lebih jauh ke dalam kolom sebelum kesetimbangan antar fase terjadi. Semakin

cepat aliran fase gerak, transfer massa yang terjadi akan semakin terlambat, sehingga pita

solut akan lebih melebar. Demikian pula yang terjadi di inlet kolom, yaitu solut dalam

fase diam akan bertemu dengan fase gerak yang masih baru. Namun karena transfer

massa solut tidak terjadi dengan segera maka masih ada solut yang tertinggal pada fase

diam. Efek netto dari kedua keadaan ini adalah pelebaran pita pada kedua ujungnya.

Penggunaan partikel packing yang lebih kecil akan mengurangi konsentrasi solut

di fase gerak. Pada gambar di samping terlihat

bahwa (a) konsentrasi sampel saat melintasi

kolom ideal, (b) terjadi pelebaran pita karena

difusi molekul, (c) terjadi pelebaran karena

keseimbangan antara kedua fase belum tercapai.

Pengekoran puncak kromatogram (tailing dan leading)

Pada analisis secara HPLC, kondisi percobaan yang menghasilkan puncak yang simetri

selalu lebih disukai, karena puncak yang asimetri dapat menghsailkan pengukuran bilangan

lempeng teoritik dan faktor resolusi yang tidak akurat, perhitungan yang tidak teliti, penurunan

derajat resolusi dan puncak-pincak minor yang tidak terdeteksi pada ekor puncak, serta waktu

retensi yang tidak reprodusibel. Parameter yang digunakan untuk menilai bentuk puncak adalah

peak asimmetry factor (As), yang diukur pada 10% tinggi puncak. Puncak yang simetri memiliki

nilai As sama dengan 1, sedangkan puncak dengan nilai As pada rentang 0,95 – 1,1 masih dapat

dikatakan bai. Parameter lain yang dapat digunakan yaitu peak tailing factor, yang diukur pada

5% tinggi puncak.

46

Gugus silanol yang tidak bereaksi karena adanya halangan sterik dapat memberikan

kepolaran yang tidak dikehendaki dan menyebabkan pengekoran pada puncak kromatogram.

Untuk mengurangi jumlah gugus silanol yang masih bebas, reaksi dilanjutkan dengan

penambahan trimetilklorosilan yang dapat mencapai gugus silanol karena ukurannya yang lebih

kecil dibanding organoklorosilan lain. Penambahan trimetilklorosilan dapat menutupi banyak

gugus silanol yang masih bebas, namun tidak semua gugus tersebut dapat tertutupi.

Puncak kromatogram yang tidak simetri (tailing dan leading) sering dijumpai bila

konsentrasi solut dalam fase gerak terlalu besar. Senyawa-senyawa polar juga berpotensi

menimbulkan tailing apabila masih terdapat residu gugus silanol pada permukaan fase diam.

Penyebab tailing yang lain yaitu ketidaksesuaian antara solut dan kolom, pengemasan kolom

yang tidak seragam, dan faktor yang terjadi diluar kolom seperti pada injektor.

E. ANALISIS KUALITATIF

Proses terbawanya solut dari puncak kolom sampai akhir kolom disebut elusi. Apabila

detektor ditempatkan pada ujung akhir kolom, maka akan diperoleh sinyal yang digambarkan

sebagai fungsi waktu, yang disebut kromatogram. Kromatogram akan memperlihatkan bahwa

setiap senyawa meninggalkan kolom sebagai puncak simetri, sehingga sinyal detektor yang

tercatat berbentuk kurva Gauss pada waktu yang khas untuk setiap senyawa. Oleh karena itu,

kromatogram dapat menunjukkan waktu yang diperlukan untuk elusi. Waktu yang menunjukkan

puncak signal disebut waktu retensi (tR), yang tidak lain adalah waktu yang dibutuhkan analit

mulai saat diinjeksikan hingga terelusi dan keluar dari kolom pada konsentrasi maksimumnya.

Tiap senyawa memiliki waktu retensi yang spesifik pada kondisi tertentu, antara lain kondisi

kolom, tekanan, suhu, laju aliran fase gerak, dll, sehingga dapat digunakan sebagai salah satu

dasar untuk analisis kualitatif. Beberapa senyawa memiliki waktu retensi yang berdekatan,

namun tiap senyawa hanya memiliki satu waktu retensi saja. Dengan membandingkan waktu

retensi analit dengan waktu retensi senyawa baku maka analit dapat diidentifikasi.

F. ANALISIS KUANTITATIF

Analisis Kuantitatif Berdasarkan Tinggi Puncak

Tinggi puncak diperoleh dengan membuiat garis antara kedua dasar sisi puncak, dan

mengukur tegak lurus dari garis tersebut hingga puncak kromatogram. Apabila variasi pada

keadaan kolom tidak menyebabkan pelebaran puncak, dimana kromatogram yang diperoleh

berupa pita yang sempit dan tajam, maka analisis kuantitatif lebih baik didasarkan pada tinggi

puncak. Pengukuran ini dapat dilakukan dengan ketelitian tinggi, sehingga data yang diperoleh

akan lebih akurat. Variabel yang perlu dikendalikan pada analisis ini adalah suhu dalam kolom,

laju alir fase gerak, tekanan dalam kolom, dan kecepatan injeksi. Kesalahan relatif yang

disebabkan oleh penginjeksian berkisar antara 5 – 10%.

47

Analisis Kuantitatif Berdasarkan Luas Puncak

Pengukuran dengan cara ini tidak dipengaruhi oleh pelebaran pita, oleh karena itu cara ini

lebih disukai daripada pengukuran tinggi puncak. Pada umumnya, instrumen kromatografi

dilengkapi dengan integrator yang memungkinkan pengukuran luas puncak secara lebih teliti.

Bila tidak ada integrator maka pengukuran harus dilakukan secara manual.

Analisis Kuantitatif secara Kalibrasi dengan Standar

Metode untuk memperkirakan komposisi suatu campuran yang tidak diketahui adalah

dengan membandingkan terhadap suatu seri larutan baku dengan berbagai konsentrasi. Setelah

pembuatan kromatogram dari masing-masing larutan standar, kemudian dibuat kurva baku

dengan tinggi puncak atau luas puncak sebagai fungsi konsentrasi. Sumber kesalahan utama pada

metode ini terletak pada volume larutan yang diinjeksikan yang tidak reprodusibel.

Analisis Kuantitatif dengan Standar Internal

Pada metode ini dapat diperoleh ketelitian tertinggi pada analisis kuantitatif, karena

variasi volume larutan yang diinjeksikan dapat dieliminasi. Pada metode ini sejumlah standar

internal dimasukkan ke dalam tiap larutan standar dan larutan sampel. Analisis kuantitatif

dilakukan dengan rasio luas atau tinggi puncak analit terhadap standar internal. Senyawa yang

digunakan sebagai standar internal harus terpisah dari analit namun dekat dengan puncak analit.

DASAR – DASAR SPEKTROFOTOMETRI

48

A. RADIASI ELEKTROMAGNETIS

Radiasi elektromagnetis merupakan suatu bentuk energi cahaya yang memiliki sifat

dualitik antara sifat gelombang dan sifat partikel. Sifat gelombang radiasi elektromagnetis

diperlihatkan dalam fenomena seperti pembiasan, pemantulan, dan transmisi cahaya. Parameter

sifat gelombang dari radiasi elektromagnetik dijelaskan melalui teori gelombang, meliputi:

kecepatan, frekuensi, panjang gelombang, amplitude, jumlah gelombang, dll. Teori gelombang

tidak dapat menjelaskan tentang fenomena yang berkaitan dengan serapan ataupun emisi dari

tenaga radiasi. Namun hal tersebut dapat dijelaskan melalui teori korpuskuler yang menyatakan

bahwa radiasi elektromagnetis terdiri dari partikel – partikel yang disebut foton. Foton memiliki

energi tertentu dan bergerak dengan kecepatan konstan yaitu sebesar kecepatan cahaya.

Sifat-sifat Gelombang

Radiasi elektromagnetis merupakan gelombang yang tersusun dari komponen

elektrik/listrik dan komponen magnetik, yang keduanya bergetar pada bidang yang tegak lurus

satu sama lain dan tegak lurus terhadap arah rambatnya. Komponen yang aktif bila terjadi

perpindahan energi ketika terjadi interaksi dengan suatu benda adalah komponen elektrik saja.

Gelombang Elektromagnetis

Panjang gelombang (λ) merupakan jarak 2 titik yang menyatakan 1 gelombang penuh atau 1

lingkaran (nm, μm, Å). Jumlah gelombang / bilangan gelombang (υ) merupakan banyaknya

gelombang per cm (cm-1), sedangkan frekuensi (υ) merupakan banyaknya gelombang per detik

(putaran per detik atau Hz). Hubungan antara panjang gelombang, frekuensi dan kecepatan

cahaya yaitu: c/n = υ λ

c = kecepatan cahaya (3 x 1010 cm/detik)

υ = frekuensi

λ = panjang gelombang

n = indeks bias (perbandingan kecepatan cahaya dalam hampa dan kecepatan

cahaya dalam suatu medium)

49

Frekuensi radiasi dalam setiap medium adalah sama, namun kecepatan dan panjang gelombang

radiasi berbeda dari medium satu ke medium yang lain.

Sifat-sifat Partikel

Seberkas sinar dibayangkan sebagai sederetan foton. Energi masing-masing foton

sebanding dengan frekuensi dari radiasi yang bersangkutan:

E = h υ E = energi (erg)

E = h c h = tetapan Plank (6,62 x 10-27 erg.sec) n λ

Foton yang memiliki panjang gelombang pendek memiliki tenaga yang lebih besar daripada

foton dengan panjang gelombang yang lebih panjang. Intensitas berkas sinar sebanding dengan

jumlah foton, dan tidak tergantung pada tenaga setiap foton.

B. SPEKTRUM ELEKTROMAGNETIS

Spektrum cahaya dari matahari dapat dilihat secara alamiah dalam bentuk pelangi.

Dengan menggunakan serangkaian lensa dan prisma, maka sinar matahari dapat terpecah

menjadi beberapa komponen berwarna dengan urutan sebagai berikut:

Ultra violet – violet – nila – biru – hijau – kuning – jingga – merah – infra merah

Batas sensitivitas mata manusia adalah antara cahaya violet / ungu (λ = 400 nm = 4 x 10-4 mm)

hingga cahaya merah (λ = 800 nm). Ada pula cahaya yang memiliki λ kurang dari 400 nm dan

lebih dari 800 nm, namun tidak dapat dilihat oleh mata manusia.

Radiasi elektromagnetis yang berguna untuk analisa dapat dibagi menjadi beberapa

daerah mulai dari daerah yang energinya paling tinggi hingga daerah yang energinya paling

rendah, yaitu dari sinar gama sampai gelombang radio. Masing-masing daerah dengan panjang

gelombang, transisi energi yang terjadi, beserta penggunaannya dalam analisis dapat dilihat sbb:

50

51

Cahaya yang dapat dilihat oleh mata manusia disebut cahaya tampak, yang umumnya

merupakan campuran dari cahaya yang memiliki panjang gelombang 400 – 800 nm. Hubungan

antara warna pada cahaya dan panjang gelombang dapat terlihat pada gambar berikut:

Hubungan Warna dengan Panjang Gelombang

Dalam tabel berikut tercantum warna beserta warna komplementernya yang tidak lain merupakan

pasangan dari setiap 2 warna dari spektrum yang akan menghasilkan warna putih bila dicampur.

Warna dan Warna Komplementer

C. ABSORPSI DAN EMISI

52

Tiap atom memiliki tingkat energi yang tertentu besarnya (discrete energy states).

Transisi dari satu level energi ke level energi yang lebih tinggi dapat disebabkan radiasi, panas,

atau penembakan dengan partikel-partikel yang energinya relatif sama dengan perbedaan dari

kedua level energi tersebut. Oleh karena setiap level memiliki energi yang tertentu besarnya,

maka setiap sistem hanya dapat menyerap energi yang besarnya tertentu pula, yang disebut

dengan kuanta.

Proses penyerapan energi dari level energi yang paling rendah (ground state) ke level

energi yang lebih tinggi (exited state) disebut absorpsi, sedangkan proses dimana energi yang

diserap dilepaskan kembali disebut emisi. Bila cahaya jatuh pada senyawa, maka sebagian dari

cahaya diserap oleh molekul-molekul. Setiap senyawa memiliki tingkatan energi yang spesifik.

Bila cahaya yang memiliki energi yang sama dengan perbedaan energi antara ground state dan

exited state jatuh pada senyawa, maka energi akan diserap dan elektron-elektron pada ground

state akan dieksitasikan. Elektron yang teksitasi melepaskan energi dan kembali ke tingkat dasar.

absorpsiX + h X*

emisi

X = reseptor (atom, ion, molekul) pada level energi rendah / ground state

X* = reseptor pada level energi yang lebih tinggi / exited state

Pelepasan energi dapat berupa radiasi atau panas. Cahaya yang diemisikan dengan energi yang

sama dengan energi yang diserap disebut radiasi resonan, dan hanya terjadi pada atom. Hal

tersebut merupakan dasar dari teknik analisa yang disebut atomic fluorescence. Pada kebanyakan

molekul, energi yang diserap akan dilepaskan kembali berupa panas. Namun ada pula yang

hanya sebagian yang berupa panas (akibat adanya benturan antara molekul satu dengan yang lain

/ collisions) dan sisanya berupa cahaya, dimana proses tersebut disebut dengan luminesensi

(fluoresensi dan fosforesensi), seperi terlihat pada diagram berikut:

Diagram Absorpsi dan Emisi Energi

53

Pada atom, transisi energi terjadi karena perpindahan elektron dari orbit satu ke orbit

yang lain, sehingga disebut sebagai transisi elektronik. Sedangkan pada molekul, transisi energi

merupakan kombinasi dari transisi energi elektronik, energi vibrasi, dan energi rotasi. Dalam

urutan tersebut yang terbesar adalah energi elektronik dan yang terkecil adalah energi rotasi.

Etotal = Eelek + Evib + Erot

Gambar berikut memperlihatkan beberapa kemungkinan transisi energi pada sebuah molekul

diatomik. Dari masing-masing level energi elektronik (E0 dan E1) ada beberapa kemungkinan

level energi vibrasi (V1, V2, …) dan dari masing-masing level energi vibrasi terdapat beberapa

level energi rotasi (J1, J2, ...).

Skema Level Energi pada Sebuah Molekul

Suatu molekul memiliki energi elektronik, vibrasi, dan rotasi (internal energy) yang tertentu

besarnya (quantized energy), sehingga transisi energi hanya terjadi apabila suatu molekul

dirangsang dengan energi yang sesuai dan besarnya tergantung dari struktur molekul yang

bersangkutan. Grafik hubungan antara peresapan cahaya dan panjang gelombang (atau frekuensi)

disebut spektrum peresapan.

Radiasi inframerah hanya mampu menstimulir transisi vibrasi dan rotasi dari suatu

molekul. Oleh karena trasisi vibrasi selalu disertai dengan transisi rotasi, maka spektrum

peresapan inframerah tidak merupakan puncak yang tajam / sempit melainkan sedikit melebar

54

karena transisi rotasi berhimpit dengan transisi vibrasi. Oleh karena itu spektrum peresapan

inframerah disebut sebagai spektrum rotasi-vibrasi.

Cahaya tampak dan ultraviolet memiliki energi yang cukup untuk melakukan transisi

elektronik pada suatu molekul. Oleh karena transisi elektronik disertai oleh transisi-transisi

vibrasi dan rotasi, maka spektrum peresapan cahaya tampak dan ultraviolet merupakan puncak

yang lebih lebar (broad absorption bands) daripada spektrum peresapan inframerah. Spektrum

peresapan cahaya tampak dan ultraviolet disebut spektrum elektronik.

Molekul dengan struktur yang berbeda memiliki tingkat energi yang berbeda sehingga

spektrum peresapannya pun tidak sama. Hal inilah yang menjadi dasar analisa kualitatif suatu

senyawa (identifikasi senyawa). Banyaknya cahaya yang diserap pada panjang gelombang

tertentu sesuai dengan jumlah molekul yang ada. Hal inilah yang menentukan intensitas resapan

(banyak sedikitnya resapan) sehingga menjadi dasar analisa kuantitatif suatu senyawa.

D. HUKUM-HUKUM PERESAPAN CAHAYA

Penurunan intensitas cahaya setelah melalui zat peresap terutama disebabkan oleh

resapan dari zat tersebut. Selain itu, dapat pula disebabkan oleh pemantulan cahaya (reflektion)

pada permukaan sel yang digunakan, atau penghamburan cahaya (scattering) oleh partikel /

kotoran / serat – serat yang mungkin ada dalam larutan yang diperiksa. Sehubungan dengan hal

tersebut, maka pemantulan cahaya dapat dikoreksi dengan menggunakan blangko / referen yang

berisi pelarut yang digunakan, sedangkan penghamburan cahaya dicegah dengan menggunakan

larutan yang jernih. Bila tidak dicegah maka intensitas total dari sinar yang masuk terdiri dari:

Io = Iabsorpbed + Itransmitted + Ireflekted + Iscattered

Pada kondisi percobaan yang ideal, maka dua hal terakhir dapat diabaikan sehingga:

Io = Iabsorpbed + Itransmitted

Pada analisa kuantitatif, banyaknya cahaya yang diserap sesuai dengan jumlah zat

peresap. Hukum yang berkaitan dengan hal tersebut antara lain:

1. Hukum Lambert

Intensitas sinar keluar menurun secara eksponensial sesuai dengan kenaikan tebal

zat peresap.

2. Hukum Beer

Intensitas sinar keluar menurun secara eksponensial sesuai dengan kenaikan

konsentrasi zat peresap.

3. Hukum Lambert – Beer

Hukum ini merupakan kombinasi dari kedua hukum di atas yang menyatakan

hubungan antara intensitas sinar masuk dan intensitas sinar keluar sebagai fungsi

dari tebal dan konsentrasi zat peresap: A = abc

A = resapan (absorbance)

a = daya resap (absorptivity)

b = tebal larutan (cm)

c = konsentrasi (g/L)

55

SPEKTROFOTOMETRI UV – VISIBEL

A. PENDAHULUAN

Pada bidang farmasi, analisa spektrofotometri UV-cahaya tampak telah dikenal sebagai

metode utama baik untuk identifikasi, pemeriksaan kemurnian, ataupun penetapan kadar obat.

Selain dapat digunakan untuk analisa senyawa dalam kadar kecil, metode ini juga cepat,

sederhana, spesifik, sensitif, dan non-destruktif. Disamping untuk analisa kualitatif dan

kuantitatif, data resapan maksimum dari spektrum resapan yang diperoleh juga dapat membantu

dalam penetapan rumus bangun suatu senyawa.

Telah dinyatakan bahwa suatu molekul akan menyerap energi dari luar apabila energi

tersebut besarnya sama dengan energi yang dibutuhkan molekul tersebut untuk melakukan

transisi pada level energi yang lebih tinggi. Karena tiap molekul memiliki level energi yang

berbeda, maka energi yang dibutuhkan oleh senyawa yang berbeda juga tidak sama, yakni

tertentu jumlahnya (quantized energy) untuk molekul tertentu, menurut persamaan:

E = h c / λ

Jadi suatu molekul akan meresap cahaya dengan panjang gelombang tertentu dimana energi pada

panjang gelombang tersebut besarnya sama dengan energi yang dibutuhkan untuk melakukan

transisi elektronik, vibrasi, ataupun rotasi. Karena transisi elektronik ditentukan oleh konfigurasi

elektron dari molekul yang bersangkutan, dan transisi vibrasi rotasi ditentukan oleh gugus-gugus

fungsional dari suatu molekul, maka dapat diperoleh hubungan antara struktur molekul dengan

panjang gelombang. Molekul dengan struktur yang berbeda memiliki tingkat energi yang

berbeda, sehingga akan menyerap cahaya pada panjang gelombang yang berbeda, dengan

demikian spektrum peresapannya pun tidak sama. Hal inilah yang menjadi dasar analisa

kualitatif suatu senyawa (identifikasi senyawa). Transisi elektronik terjadi pada daerah ultraviolet

(200 – 400 nm) dan daerah cahaya tampak (400 – 800 nm). Karena transisi elektronik suatu

molekul diikuti oleh transisi energi vibrasi dan rotasi yang juga menyerap cahaya, maka

spektrum peresapan pada daerah uv dan visibel tidak menunjukkan puncak yang tajam/sempit

melainkan puncak yang melebar.

Intensitas cahaya yang diserap pada panjang gelombang tertentu tergantung pada jumlah

molekul atau kadar larutan zat peresap, sehingga menjadi dasar analisa kuantitatif suatu senyawa,

yang dapat dinyatakan melalui persamaan:

A = abc

B. PENYIMPANGAN HUKUM LAMBERT-BEER

Pada konsentrasi ideal (umumnya konsentrasi rendah), grafik hubungan antara resapan

dengan konsentrasi umumnya merupakan garis lurus / linier. Pada konsentrasi yang lebih tinggi,

kurva dapat membelok ke arah absis ataupun ordinat. Penyimpangan tersebut dapat disebabkan

oleh kondisi percobaan yang tidak ideal lagi, antara lain:

56

1. Cahaya tidak cukup monokromatis

2. Terdapat cahaya sampingan yang mengenai detektor

3. Kepekaan / sensitifitas detektor menurun

4. Intensitas sumber cahaya dan amplifier dari detektor berubah-ubah karena

tegangan yang tidak stabil

5. Disosiasi-asosiasi kesetimbangan kimia berubah, misalnya pada perubahan pH

larutan

6. Larutan berfluoresensi

7. Suhu larutan berubah selama pengukuran

Hukum Lambert-Beer hanya berlaku untuk cahaya monokromatis, yaitu cahaya yang memiliki

panjang gelombang tunggal. Dalam praktek, hal ini sulit untuk dipenuhi karena derajat

kemonokromatisan ditentukan oleh lebar celah yang digunakan. Makin kecil lebar celah maka

cahaya yang diperoleh makin monokromatis, namun intensitas cahaya yang mengenai detektor

juga makin kecil sehingga kepekaan berkurang. Oleh karena itu selalu dicari jalan tengah untuk

mendapatkan keakuratan dan kepekaan detektor.

Analisa kuantitatif sebaiknya dilakukan pada panjang gelombang maksimum yaitu panjang

gelombang saat terjadi serapan maksimum, karena:

1. Pada resapan maksimum, perubahan resapan karena konsentrasi juga pada kondisi yang

maksimum sehingga memiliki kepekaan dan keakuratan yang tinggi.

2. Pada pita panjang gelombang ini, daya serap juga relatif konstan sehingga diperoleh

kurva kalibrasi yang linier (kurva b).

Jika panjang gelombang dipilih pada lereng puncak, misalnya λ2, maka daya resap akan berubah

sepanjang pita panjang gelombang tersebut. Pada panjang gelombang ini, hukum Lambert-Beer

tidak dipenuhi lagi sehingga kurva yang diperoleh tidak linier (kurva c).

a. Spektrum Resapan suatu Senyawa pada 2 Konsentrasi (C dan ½ C)

b. Kurva Kalibrasi Linier pada λ1 (λ maksimum)

c. Kurva Kalibrasi non Linier pada λ2

Penyimpangan karena disosiasi-asosiasi dapat dijelaskan sebagai berikut: Jika konsentrasi

suatu asam lemah hendak ditetapkan secara spektrofotometri, maka kesetimbangan asam dapat

ditulis sbb: HB H+ + B-

57

Pada panjang gelombang maksimum, misalnya hanya anion B- yang melakukan resapan. Jika

pengukuran dilakukan pada medium alkali kuat maka asam lemah akan terdisosiasi sempurna

sehingga HB praktis tidak ada dalam larutan. Dengan demikian [HB] ~ [B-] dan kurva kalibrasi

merupakan kurva yang lurus. Apabila pengukuran dilakukan pada medium yang kurang alkalis,

maka disosiasi asam tidak berjalan sempurna, misalnya hanya 50% berdisosiasi, sehingga

kesetaraan [HB] dan [B-] praktis tidak dapat dipertahankan. Akibatnya hubungan antara resapan

dan konsentrasi menjadi non linier.

Perubahan suhu dapat menyebabkan pemuaian ataupun penyusutan larutan sehingga

merubah konsentrasi. Meningkatnya temperatur akan mengakibatkan penguapan terutama bila

digunakan pelarut yang mudah menguap. Pemanasan juga memicu terbentuknya gelembung gas

dari gas-gas yang diserap oleh larutan (umumnya dari udara). Gelembung gas yang menempel

pada dinding sel / kuvet, dapat menyebabkan kesalahan pada pengukuran.

Kesalahan fotometrik pada metode ini disebabkan oleh keakuratan metode fotometri yang

berkurang karena resapan yang terjadi terlalu tinggi atupun terlalu rendah. Pada resapan yang

terlalu rendah (konsentrasi larutan terlalu encer), maka intensitas sinar masuk dan sinar keluar

hampir sama sehingga tingkat kesalahan pengukuran akan menjadi besar karena yang dideteksi

adalah perbedaan dari kedua intensitas sinar tersebut. Pada resapan yang terlalu tinggi, energi

yang diteruskan terlalu kecil sehingga sulit untuk diukur secara akurat. Oleh karena itu, untuk

memperkecil kesalahan, larutan yang diperiksa sebaiknya memiliki harga transmitan antara 15

%T atau A = 0,8 hingga 65 %T atau A = 0,2. Bila resapan terletak di luar daerah tersebut, maka

dapat diatasi dengan:

larutan yang diukur diencerkan / dipekatkan

gunakan sel dengan ketebalan yang sesuai

pilih panjang gelombang pengukuran yang sesuai

Dengan demikian larutan yang diukur dapat menghasilkan resapan dengan harga A antara 0,2 –

0,8 atau harga transmitan antara 15 %T – 65 %T. Namun hal tersebut tidak selalu berlaku untuk

setiap spektrofotometer. Umumnya pabrik mencantumkan pula kondisi %T atau A optimum

untuk spektrofotometer yang bersangkutan. Transmitan merupakan hasil bagi intensitas sinar

keluar dengan intensitas sinar yang masuk. Dengan demikian harga absorbance (A) merupakan

harga negatif logaritma dari transmitan A = - log T

= log (1/T)

= log (100/T)

C. INSTRUMENTASI

Instrumen yang digunakan untuk mengukur resapan ataupun emisi radiasi

elektromagnetik sebagai fungsi panjang gelombang disebut spektrometer. Apabila detektor yang

digunakan berupa lempeng fotografik atau filamen, maka alat ini disebut spektrograf. Bila

detektor yang digunakan berupa sel fotoelektris / fotolistrik maka disebut spektrofotometer.

58

Spektrometer yang dibuat hanya untuk pengukuran pada daerah cahaya tampak disebut

kolorimeter. Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi:

1. Sumber tenaga radiasi

2. Monokromator

3. Sel peresap

4. Detektor

5. Rekorder atau pencatat

59

1. Sumber Cahaya / Radiasi

Sumber tenaga radiasi terdiri dari benda yang bila diberi tenaga listrik bertegangan tinggi

dapat memicu terjadinya eksitasi elektron ke level energi yang lebih tinggi (excited state). Ketika

elektron kembali ke level energi dasar (ground state) akan memancarkan radiasi. Sumber radiasi

yang ideal dapat menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada seluruh

rentang panjang gelombang yang digunakan yaitu 200 – 400 nm untuk spektrofotometer UV dan

400 – 800 nm untuk spektrofotometer visibel.

Sumber radiasi ultraviolet yang banyak digunakan adalah lampu hidrogen dan lampu

deuterium. Lampu tersebut terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam tabung gelas

dan berisi gas gidrogen atau deuterium pada tekanan rendah. Bila tegangan tinggi dikenakan

pada elektroda tersebut, maka akan terjadi pelepasan elektron yang kemudian elektron-elektron

tersebut merangsang eksitasi elektron lain dalam molekul gas ke tingkat energi yang lebih tinggi.

Bila elektron kembali ke tingkat dasar, mereka akan memancarkan radiasi secara kontinyu pada

daerah 180 – 350 nm. Sumber radiasi ultraviolet yang lain adalah lampu xenon namun tidak se-

stabil lampu hidrogen.

Sumber radiasi cahaya tampak sekaligus inframerah dekat adalah lampu wolfram atau

lampu filamen tungsten. Lampu ini menghasilkan radiasi kontinyu pada daerah 350 – 2500 nm.

2. Monokromator

Sumber radiasi yang umum digunakan berupa radiasi kontinyu pada daerah panjang

gelombang yang lebar. Pada spektrofotometer, radiasi yang polikromatis harus diubah menjadi

monokromatis, dengan alasan:

1. Resolusi dapat terjadi lebih sempurna

2. Sensitifitas / kepekaan meningkat karena pengukuran dapat dilakukan pada resapan

maksimum

3. Penyimpangan terhadap hukum Lambert-Beer dapat dicegah / diperkecil

Ada 2 alat yang dapat digunakan untuk mengurangi radiasi polikromatik menjadi monokromatik,

yaitu filter dan monokromator. Filter dibuat dari bahan khusus yang hanya meneruskan radiasi

pada daerah panjang gelombang tertentu dengan rentang 20 – 50 nm dan menyerap radiasi dari

panjang gelombang lain. Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang dapat

menguraikan radiasi polikromatik menjadi panjang gelombang tunggalnya, dan memisahkan

panjang gelombang tersebut menjadi jalur yang sangat sempit, yaitu 35 – 0,1 nm.

3. Sel Peresap

Sampel yang diperiksa pada daerah UV dan visibel biasanya berupa gas atau larutan yang

dimasukkan ke dalam sel atau kuvet yang terbuat dari bahan transparan pada daerah pengukuran,

yaitu untuk daerah UV dari bahan quartz atau dari silika yang dilebur, sedangkan untuk daerah

visibel dari gelas biasa atau quartz. Kuvet untuk sampel gas memiliki panjang lintasan 0,1 – 100

60

nm, sedangkan untuk larutan memiliki panjang lintasan 1 – 10 cm. Sebelum digunakan, kuvet

harus dibersihkan dengan air kemudian dibilas dengan pelarut yang digunakan.

Kuvet harus diletakkan sedemikian rupa sehingga sinar masuk tegak lurus pada

permukaan kuvet. Bila sel miring maka terjadi kesalahan karena sebagian sinar dipantulkan atau

dibiaskan. Permukaan kuvet harus selalu pada posisi yang sama pada setiap pengukuran. Oleh

karena itu, kuvet persegi lebih menguntungkan daripada berbentuk silinder. Bila digunakan kuvet

berbentuk silinder, hendaknya ditandai agar permukaan yang sama selalu pada posisi yang sama

pula.

4. Detektor

Detektor yang digunakan dalam spektrofotometer UV-visibel disebut detektor fotolistrik /

fotoelektris, yaitu detektor yang dapat menyerap tenaga foton yang mengenainya, kemudian

mengubah tenaga tersebut menjadi arus listrik atau panas yang dapat diukur secara kuantitatif

(arus listrik yang dihasilkan sebanding dengan jumlah foton yang diserap). Kebanyakan detektor

menghasilkan sinyal listrik yang dapat mengaktifkan pencatat, sehingga menghasilkan sinyal

yang secara kuantitatif sesuai dengan tenaga cahaya yang mengenainya. Persyaratan yang harus

dipenuhi detektor antara lain: sensitivitas tinggi sehingga dapat mendeteksi tenaga cahaya yang

memiliki tingkatan rendah sekalipun, waktu respon yang singkat, stabilitas yang lama untuk

menjamin respon secara kuantitiatif, sinyal elektronik mudah diperjelas.

5. Pencatat / recorder

Sinyal yang dihasilkan detektor harus diubah ke bentuk yang dapat diinterpertasikan. Hal

tersebut dapat dilakukan menggunakan amplifier, ammeter, atau potensiometer. Agar dapat

diukur, pada umumnya sinyal detektor diperbesar menggunakan amplifier.

D. ANALISA KUALITATIF

Karakteristik resapan suatu senyawa di dalam pelarut tertentu yang berupa panjang

gelombang pada resapan maksimum dapat digunakan untuk identifikasi suatu senyawa. Panjang

gelombang pada resapan maksimum dapat diperoleh dari spektrum peresapan yang dihasilkan

oleh larutan zat yang diperiksa sepanjang daerah panjang gelombang tertentu, yang dihasilkan

oleh recorder. Apabila tidak terdapat recorder, maka resapan pada interval panjang gelombang

tertentu dicatat kemudian titik-titik yang merupakan hubungan antara resapan dan panjang

gelombang dihubungkan sehingga diperoleh spektrum peresapan. Spektrum peresapan yang

dibuat akan semakin akurat bila interval panjang gelombang setiap pencatatan dibuat semakin

kecil. Senyawa yang sama akan menghasilkan spektrum peresapan yang berbeda pada pelarut

yang berbeda.

Berdasarkan spektrum peresapan yang diperoleh, maka identifikasi senyawa dapat

dilakukan sebagai berikut:

61

1. Membandingkan λ maksimum. Panjang gelombang maksimum suatu senyawa dalam

pelarut tertentu dibandingkan dengan panjang gelombang maksimum senyawa baku

pembanding pada pelarut yang sama atau dengan data literatur.

2. Membandingkan resapan. Resapan yang dinyatakan dengan daya resap (a), daya resap

molar (ε), atau resapan jenis E (1%, 1 cm) dari larutan zat yang diperiksa dibandingkan

dengan data literatur atau senyawa baku pembanding.

3. Membandingkan harga resapan relatif, yaitu perbandingan resapan dari 2 panjang

gelombang resapan maksimum. Cara ini sangat berguna untuk mengetahui adanya

pengotor / impurities.

4. Membandingkan spektrum peresapan. Spektrum peresapan suatu senyawa dibandingkan

dengan senyawa baku pembanding.

Keempat hal tersebut di atas dilakukan pada waktu, cara dan kondisi percobaan yang sama,

yaitu: jenis pelarut, kadar larutan, tebal larutan dan pengaturan instrumen yang sama.

Faktor-faktor yang mempengaruhi spektrum peresapan:

1. Pelarut

Pengaruh pelarut terhadap spektrum peresapan tidak sama untuk setiap zat.

Umumnya pelarut non polar tidak terlalu berpengaruh terhadap spektrum peresapan,

sehingga spektrum peresapannya akan relatif sama. Sedangkan pelarut polar akan

mempengaruhi bentuk, intensitas, dan letak resapan maksimum, dimana pengaruh akan

makin besar bila polaritasnya makin tinggi. Pergeseran resapan ke arah panjang

gelombang yang lebih panjang disebut pergeseran batokromik / pergeseran merah.

Pergeseran resapan ke arah panjang gelombang yang lebih pendek disebut pergeseran

hipsokromik / pergeseran biru. Kenaikan dalam intensitas serapan disebut efek

hiperkromik, sedangkan penurunan dalam intensitas serapan disebut efek hipokromik.

Hal lain yang perlu diperhatikan yaitu adanya absorpsi pelarut yang digunakan di daerah

UV-Vis yang dikenal dengan istilah penggal UV atau UV cut off.

Pelarut yang digunakan pada spektrofotometri harus:

1. Mampu melarutkan cuplikan

2. Tidak berwarna dan mampu meneruskan radiasi pada daerah panjang gelombang

pemeriksaan

3. Tidak mengandung sistem ikatan rangkap terkonjugasi pada struktur molekulnya

4. Tidak terjadi interaksi dengan molekul senyawa yang dianalisis

5. Kemurnian tinggi dengan derajat untuk analisis

2. Kadar larutan

Makin tinggi kadar larutan maka intensitas resapan akan meningkat sehingga puncak

spektrum peresapan akan semakin tinggi. Namun kadang dengan kadar yang berbeda,

spektrum peresapan akan lain sama sekali karena pada kadar tertentu zat mengadakan

polimerisasi, dimana bentuk monomer dan polimer memiliki daerah resapan yang beda.

62

3. Tebal larutan

Larutan dengan kadar yang sama akan memberikan spektrum peresapan dengan intensitas

serapan yang berbeda bila diukur menggunakan sel yang berbeda. Makin tebal sel maka

intensitas serapan makin tinggi.

4. Lebar celah

Makin lebar celah maka sumber radiasi semakin mengarah ke polikromatis sehingga

intensitas serapan menurun dan resolusi dari puncak-puncak kurva tidak sempurna,

akibatnya pita spektrum peresapan akan makin melebar.

Spektrum Peresapan Metilparaben (Nipagin) dalam metanolx = 0,15 mg%y = 0,2 mg%

D. ANALISA KUANTITATIF

Analisa kuantitatif umumnya didasarkan pada hukum Lambert-Beer. Jika kondisi

percobaan memenuhi hukum tersebut, maka kurva kalibrasi yang menyatakan hubungan antara

absorbansi dan konsentrasi akan linier. Suatu senyawa memenuhi Hukum Lambert-Beer pada

batas-batas kadar tertentu pada panjang gelombang tertentu.

Prosedur analisa kuantitatif meliputi:

1. Penyiapan Sampel

Sampel umumnya berupa larutan zat dalam pelarut yang sesuai dan dapat sebagai hasil

ekstraksi atau eluat kromatografi. Penambahan sensitifitas dapat dilakukan melalui pembentukan

senyawa kompleks warna yang intensif ataupun pembentukan senyawa derivat (derivatisasi)

63

yang memiliki serapan pada daerah panjang gelombang tertentu. Pada pembentukan derivat atau

komplek yang berwarna perlu diperhatikan bahwa warna yang terjadi harus stabil, dan

pengukuran dilakukan pada rentang waktu tertentu dimana warna masih dalam kondisi stabil.

Hal yang harus diperhatikan pada penyiapan sampel adalah jenis pelarut dan kadar larutan.

Beberapa pelarut yang biasa digunakan pada spektrofotometri UV – visibel antara lain: air,

metanol, etanol, etil eter, kloroform, aseton, karbontetraklorida, benzena, dioksan, diklorometan.

Kadar larutan menentukan bentuk spektrum peresapan. Dalam monografi farmakope telah

ditentukan kadar larutan yang dapat menghasilkan serapan yang ideal. Namun bila belum

diketahui maka kadar larutan harus dibuat sedemikian rupa sehingga terletak pada daerah

optimum dimana kesalahan fotometrik dalam keadaan minimum, yaitu antara 15 %T atau A =

0,8 sampai 65 %T atau A = 0,2.

2. Pemilihan Panjang Gelombang Pengukuran

Pengukuran serapan dilakukan pada rentang panjang gelombang tertentu, dimana panjang

gelombang maksimum berada pada interval tersebut.

3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Panjang gelombang maksimum ditentukan dengan membaca spektrum peresapan yang

dihasilkan dalam langkah kedua. Setelah panjang gelombang maksimum didapatkan, maka

pengukuran resapan untuk perhitungan kadar harus dilakukan pada panjang gelombang

maksimum.

3. Pengukuran Resapan

Pengukuran resapan dilakukan pada panjang gelombang maksimum. Pada setiap

pengukuran, resapan sampel harus selalu dibandingkan dengan serapan blangko, yaitu larutan

yang berisi pelarut dan pereaksi yang sama, dengan susunan dan jumlah yang sama seperti yang

digunakan untuk melarutkan atau mereaksikan senyawa uji. Blangko digunakan sebagai kontrol

atau koreksi resapan yang disebabkan oleh pelarut ataupun pereaksi yang digunakan, sehingga

data resapan yang diperoleh merupakan resapan senyawa sampel saja. Pada spektrofotometer

cahaya ganda (double beem), resapan yang terbaca langsung merupakan selisih resapan sampel

dengan resapan blangko. Pada spektrofotometer cahaya tunggal, harus dilakukan dua kali

pengukuran, yaitu pengukuran larutan sampel dan larutan blangko, kemudian harga resapan

dihitung dengan mengurangi resapan sampel dengan resapan blangko.

4. Perhitungan

a. Bila daya serap atau turunannya diketahui maka kadar senyawa uji dapat dihitung dengan

rumus : A = abc

c = A / a gram / liter

c = A / ε grol / liter

64

c = A / E (1%, 1 cm) gram / 100 ml

Daya resap (a) merupakan ukuran kemampuan suatu zat untuk menyerap cahaya. Daya

resap molar (ε) merupakan resapan larutan zat 1 molar setebal 1 cm, sedangkan resapan

jenis (E) merupakan resapan larutan zat 1% seetebal 1 cm.

b. Bila digunakan zat pembanding yang kadar larutannya diketahui, maka kadar sampel

dapat dihitung dengan rumus: AsCs = x Cp Ap

Cs adalah kadar larutan sampel, Cp adalah kadar larutan pembanding, As adalah resapan

sampel, dan Ap adalah resapan larutan pembanding. Guna memperkecil penyimpangan

hukum Lambert-Beer, maka larutan pembanding dibuat dengan kadar sedemikian hingga

As mendekati atau bahkan relatif sama dengan Ap.

c. Kurva kalibrasi / Kurva baku

Kurva kalibrasi dibuat dari satu seri larutan pembanding / baku / standar, yang dibuat

dengan cara yang sama dengan larutan sampel. Seri kadar larutan baku hendaknya

memiliki resapan antara 0,2 – 0,8 dan larutan sampel juga memiliki resapan pada rentang

seri kadar larutan baku. Kurva kalibrasi atau kurva baku ini merupakan hubungan antara

konsentrasi dengan resapan / aborbance. Bila hukum Lambert-Beer dipenuhi maka kurva

kalibrasi berbentuk garis lurus atau linier. Dengan memasukkan harga masing-masing

konsentrasi dan resapan yang dihasilkan oleh tiap seri konsentrasi tersebut ke program

regresi linier (LR), maka dapat diperoleh harga A, B, dan r sehingga dapat disususn

persamaan regresi linier kurva baku sebagai berikut:

Y = B.X + A

Dengan demikian konsentrasi larutan sampel (X) dapat dicari dengan memasukkan harga

resapan yang dihasilkan sebagai Y. Nilai koefisien korelasi (r) merupakan parameter

linieritas / linearity kurva, dimana linieritas persamaan kurva baku semakin baik jika r

semakin mendekati ± 1. B (tangen α) merupakan harga kemiringan / slope kurva baku

sehingga menjadi parameter sensitivitas metode pengukuran. Apabila sudut (α) yang

dihasilkan slope kurva baku semakin mendekati 45o, maka metode pengukuran akan

semakin sensitif. Sedangkan A merupakan harga intersep kurva yaitu titik potong kurva

pada sumbu y. Semakin kecil harga A maka penyimpangan juga semakin kecil, sehingga

kurva ideal memiliki harga A = 0, dengan demikian apabila kurva diperpanjang maka

akan melalui titik (0,0).

65

E. TRANSISI ELEKTRONIK PADA SPEKTROFOTOMETRI UV – VIS

Setiap molekul memiliki sejumlah elektron yang menempati berbagai orbital molekul

secara berpasangan. Menurut Pauli, kedua elektron yang menempati orbital molekul dengan

berpasangan tersebut harus memiliki spin dengan arah berlawanan. Tingkat energi elektron yang

berpasangan dalam suatu molekul disebut tingkat energi elektron singlet. Tingkat energi elektron

singlet yang berada dalam keadaan dasar (singlet ground state) bila dikenai radiasi

elektromagnetik akan mengalami eksitasi (singlet exited state) ke tingkat energi yang lebih

tinggi. Setelah satu elektron tereksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi, maka akan mengalami

perubahan spin yang tidak lagi berpasangan terhadap satu elektron pasangannya yang masih

berada dalam keadaan dasar. Hal tersebut terjadi karena adanya konversi internal dan eksternal

(intersistem). Tingkat energi elektron yang spinnya sama (tidak berpasangan) dalam suatu

molekul disebut tingkat energi elektron triplet (triplet exited state). Notasi pasangan elektron

singlet dan pasangan elektron triplet dinyatakan sebagai berikut:

Diagram Energi Eksitasi Elektron

Life time adalah selang waktu tertentu suatu molekul mengalami eksitasi setelah

berinteraksi dengan radiasi elektromagnetik atau dapat dikatakan pula sebagai waktu yang

dibutuhkan untuk berada dalam keadaan tereksitasi. Setiap molekul memiliki life time yang

berbeda sehingga bentuk spektrum yang diberikan pada spektrofotometri UV-Vis,

spektrofluorometri, dan fosforimetri juga berbeda. Life time pada spektrofotometri UV-Vis (S0 –

S2 absorpsi), yaitu 10-14 – 10-10 detik. Life time pada fluoresensi (S0 – S1) 10-8 – 10-6 detik,

66

sedangkan fosforesensi (S0 – T1) berlangsung lebih dari 10-4 detik. Life time fluoresensi dan

fosforesensi lebih lama karena terjadinya konversi internal dan relaksasi vibrasi pada

spektrofluorometri, serta terjadinya konversi internal dan eksternal pada fosforimetri.

Interaksi Elektron π, σ, dan n dengan Radiasi Elektromagnetik

Ada 3 macam distribusi elektron dalam suatu senyawa organik secara umum, yaitu orbital

lektron pi (π), sigma (σ) dan elektron tidak berpasangan (n). Contoh: ketiga orbital tersebut ada

pada senyawa organik formaldehide orbital elektron σ

x orbital elektron π

* orbital elektron n

Bila molekul dikenai radiasi elektromagnetik maka pertama hanya satu elektron dipromosikan ke

ke tingkat energi yang lebih tinggi, dimana orbitalnya disebut sebagai orbital anti ikatan / anti

bonding (*), dan elektron lain tidak terpengaruh. Selama elektron dalam keadaan tereksitasi

maka atom-atom dalam molekul tidak bergerak / diam dan hanya terjadi pergeseran elektron

saja. Elektron-elektron yang mengalami transisi energi elektronik pada saat terjadi resapan dapat

dibagi menjadi:

Eksitasi elektron σ→σ*

Eksitasi ini merupakan transisi energi terbesar yaitu pada daerah ultraviolet jauh / vakum

di bawah 210 nm, dan terjadi pada ikatan tunggal pada senyawa jenuh, contoh alkana.

Eksitasi elektron π→π*

Elektron-elektron ini membentuk ikatan rangkap dua dan tiga (alkena dan alkuna) yang

merupakan pertautan / overlap orbital p yang sejajar dari 2 atom. Posisi resapan adalah

sekitar 180 – 200 nm yang ditandai dengan intensitas resapan yang kuat.

Eksitasi elektron n→π*

Transisi ini merupakan transisi energi terendah yaitu pada daerah sekitar 280 nm yang

ditandai dengan intensitas resapan yang rendah. Bila elektron valensi pada atom O, N, S,

atau halogen berupa pasangan elektron bebas (lone pairs electron) yang tidak membentuk

ikatan (nonbonding electron), maka transisi elektronik yang terjadi yaitu transisi n→π*.

Pada senyawa organik dikenal pula gugus auksokrom, yaitu gugus fungsional yang

memiliki pasangan elektron bebas yang melekat pada kromofor, seperti –OH, O-NH2, -

OCH3 yang memberikan transisi n→σ*.

Peresapan radiasi ultraviolet dan visibel, memungkinkan terjadinya transisi n→π*, π→π*, n→σ*,

σ→σ*, dimana dalam urutan tersebut energi yang diserap semakin besar seperti terlihat pada

diagram di bawah. Kebolehjadian transisi ΔE yang paling mungkin akan terjadi yaitu pada

transisi satu elektron dari orbital molekul terisi yang paling tinggi ke orbital tak terisi yang

terendah. Namun tidak semua transisi dari orbital terisi ke orbital tak terisi dapat terjadi. Transisi

yang forbidden kebolehjadian transisinya rendah sehingga intensitas jalur serapannya pun

rendah, ini terjadi pada transisi n→π*.

67

Spektra Ultraviolet danVisibel

Suatu molekul sederhana apabila dikenai radiasi elektromagnetik akan menyerap radiasi

elektromagnetik yang energinya sesuai. Bila pada molekul tersebut hanya terjadi transisi

elektronik satu macam gugus, maka spektrum yang terbentuk berupa garis. Namun pada

kenyataannya, spektrum UV-Vis tidak berupa garis spektrum melainkan pita spektrum.

Terbentuknya pita spectrum tersebut disebabkan transsi energi yang tak sejenis akibat terjadinya

transisi elektronik lebih dari satu macam pada gugus molekul yang kompleks. Terjadinya dua

atau lebih pita spektrum UV-Vis diberikan oleh molekul dengan struktur yang lebih kompleks

karena terjadi beberapa macam transisi. Terbentuknya pita spektrum UV-Vis, selain disebabkan

karena tumpang tindih transisi energi elektronik dengan energi yang lain (rotasi dan vibrasi),

juga disebabkan adanya faktor lain seperti pelarut, dimana pelarut dapat mengurangi kebebasan

transisi elektronik pada molekul yang dikenai radiasi elektromagnetik.

Diagram Orbital Molekul dan Level Energi Elektronik

Dalam alkena sederhana, sejumlah transisi terjadi, namun transisi tenaga yang paling

rendah adalah yang paling penting, yaitu transisi π→π*, yang mengakibatkan serapan sekitar 170

– 190 nm dalam alkena tak terkonjugasi. Dalam keton alifatik jenuh, transisi tenaga paling

rendah melibatkan elektron-elektron bebas pada oksigen, dimana satu dari antaranya

dipromosikan ke orbital π* sehingga terjadi transisi n→π* (forbidden) dengan intensitas rendah.

Dua transisi lain yaitu n→σ*dan π→π* dimana keduanya memiliki intensitas yang kuat. Karena

elektron dalam molekul memiliki tenaga yang tidak sama, maka besarnya tenaga yang diserap

dalam proses eksitasi dapat mengakibatkan terjadinya satu atau lebih transisi.

Kromofor merupakan gugus tak jenuh kovalen yang dapat menyerap radiasi ultraviolet

dan visibel. Dengan demikian kromofor inilah yang bertanggung jawab terhadap terjadinya

resapan radiasi ultraviolet dan visibel, dan dianggap sebagai pembentuk warna. Resapan dari dua

atau lebih kromofor bila dipisahkan oleh lebih dari satu ikatan tunggal (tak terkonjugasi)

68

biasanya aditif, namun bila kromofor terkonjugasi (dipisahkan oleh satu ikatan tunggal) akan

terjadi perubahan yang nyata yaitu pergeseran batokromik yang disertai efek hiperkromik.

Kromofor-kromofor tak terkonjugasi sederhana yang banyak dijumpai dapat dilihat dalam daftar

berikut:

Auksokrom merupakan gugus fungsional yang memiliki pasangan elektron bebas yang

bila terikat pada kromofor mengubah panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum. Ciri

khas dari auksokrom yaitu heteroatom (contoh: -OCH3, -Cl, -OH, NH2) yang langsung terikat

pada kromofor. Substitusi auksokrom pada sisitem kromofor akan mengakibatkan pergeseran

batokromik yang disertai efek hiperkromik.

ATOM DAN MOLEKUL

69

A. STRUKTUR ELEKTRON DARI ATOM

Setiap kulit berhubungan dengan sejumlah energi tertentu. Semakin dekat elektron ke inti

maka semakin rendah energinya karena akan semakin tertarik oleh proton dalam inti, sehingga

dalam reaksi kimia semakin sukar berpindah. Kulit elektron yang terdekat ke inti adalah kulit

yang terendah energinya, dan elektron dalam kulit ini dikatakan berada pada tingkat energi

pertama, sedangkan elektron dalam kulit kedua, yaitu pada tingkat energi kedua memiliki energi

yang lebih tinggi.

Dalam tingkatan energi utama (kulit elektron) terdapat sub tingkat energi yang diberi

nama sesuai dengan penampilan garis-garis spectra dari elektron yang dieksitasikan yaitu s

(sharp, tajam), p (principal, utama), d (diffuse, kabur), f (fundamental, dasar). Elektron dalam

sub tingkat s lebih dekat ke inti daripada sub tingkat p, elektron dalam sub tingkat p lebih dekat

ke inti daripada sub tingkat d, elektron dalam sub tingkat d lebih dekat ke inti daripada sub

tingkat f. Banyaknya elektron yang dapat menghuni sub tingkat energi tidak sama, yaitu s : 2, p :

6, d : 10, f :14. Sub tingkat energi dibagi menjadi ruangan-ruangan yang disebut orbital atom.

Orbital atom adalah bagian dari ruang dimana kebolehjadian ditemukannya elektron adalah

tinggi (90 – 95%). Tiap orbital dapat dihuni maksimum oleh 2 elektron. Sub tingkat s terdiri dari

1 orbital s, subtingkat p terdiri dari 3 orbital p, subtingkat d terdiri dari 5 orbital d, sub tingkat f

terdiri dari 7 orbital f. Elektron mengisi orbital dari tingkat energi rendah ke tingkat energi yang

lebih tinggi (asas Aufbau), seperti terlihat dalam gambar berikut:

Berdasarkan nomor atom, maka dapat disusun konfigurasi elektron seperti contoh berikut:

B. IKATAN ANTAR ATOM

Ikatan Ion dan Kovalen

70

Karena struktur elektron berbeda-beda maka, atom dapat terikat menjadi molekul dengan

berbagai cara, seperti:

1. Ikatan ion, yaitu ikatan yang terbentuk dari perpindahan elektron dari satu atom ke atom

lain karena adanya tarikan elektrostatika antara ion-ion yang berlawanan muatan. Satu

atom akan memberikan satu atau lebih elektron terluarnya ke atom lain. Atom yang

kehilangan elektron menjadi ion positif (kation) dan atom yang mendapat elektron

menjadi ion negatif (anion).

2. Ikatan kovalen, yaitu ikatan yang terbentuk dari pemakaian bersama sepasang elektron

oleh 2 atom. Elektron yang digunakan dihasilkan dari penggabungan orbital atom

menjadi orbital yang saling digunakan yang kemudian disebut sebagai orbital molekul.

Atom membuat pasangan elektron untuk mencapai konfigurasi elektron gas mulia (aturan

oktet) yaitu 2 elektron valensi (konfigurasi helium) untuk hydrogen dan 8 elektron

valensi untuk atom lain. Penggunaan bersama sepasang elektron antara 2 atom disebut

ikatan tunggal. Dua atom dapat membagi 2 atau 3 pasang elektron sehingga disebut

ikatan rangkap dan ikatan ganda tiga.

Bilamana atom membentuk ikatan ion atau ikatan kovalen? Ikatan ion terbentuk bila

perbedaan kelektronegatifan antara 2 atom adalah besar (±1,7). Keelektronegatifan adalah

ukuran kemampuan atom untuk menarik elektron valensi (elektron pada kulit terluar yang

digunakan untuk ikatan). Kelektronegatifan dipengaruhi oleh jumlah proton dalam inti dan

jumlah kulit yang mengandung elektron. Makin besar jumlah proton maka makin besar muatan

inti positif sehingga tarikannya terhadap elektron valensi meningkat. Oleh karena itu dari kiri ke

kanan keelektronegatifan dalam satu periode susunan berkala semakin meningkat. Tarikan antar

partikel yang berlawanan muatan semakin meningkat dengan berkurangnya jarak antar partikel,

sehingga keelektronegatifan semakin meningkat dari bawah ke atas dalam satu golongan susunan

berkala karena elektron valensi makin dekat ke inti. Misalnya atom Natrium (keelektronegatifan

0,9) dengan mudah akan melepaskan elektron valensi kepada atom klor (keelektronegatifan 3,0)

Beda kelektronegatifan antara 2 atom karbon adalah nol, antara karbon dan hydrogen

hanya 0,4, antara karbon dan klor 0,5. Karbon memiliki keelektronegatifan 2,5, yaitu tengah-

tengah antara keelektronegatifan yang luar biasa tinggi dan keelektronegatifan yang luar biasa

rendah, sehingga karbon hampir tak membentuk ikatan ion dengan unsur lain. Karbon

membentuk ikatan ion dengan atom karbon lain atau dengan atom dari unsur lain.

Ikatan Kovalen Polar dan Nonpolar

71

Atom dengan keelektronegatifan yang sama atau hampir sama akan membentuk ikatan

kovalen yang memiliki tarikan yang sama atau hampir sama terhadap elektron ikatannya. Jenis

ikatan kovalen ini disebut sebagai ikatan kovalen nonpolar, contoh ikatan karbon-karbon, ikatan

karbon hydrogen.

Pada senyawa kovalen H2O, HCl, CH3OH, satu atom memiliki keelektronegatifan yang lebih

besar daripada yang lain. Semakin elektronegatif suatu atom, maka semakin besar tarikannya

terhadap elektron valensinya. Meskipun tarikannya tidak cukup untuk memecah atom menjadi

ion, namun cukup untuk membuat atom memiliki bagian rapat elektron yang lebih besar.

Hasilnya adalah ikatan kovalen polar, suatu ikatan kovalen dengan distribusi rapat elektron yang

tidak merata. Distribusi elektron dalam molekul polar dapat dilambangkan oleh muatan parsial:

δ+ (parsial positif) dan δ- (parsial negatif)

Momen Ikatan

Bila ikatan polar seperti pada ikatan O-H dibiarkan dalam medan listrik, maka ikatan

akan mengalami sejumlah gaya balik tertentu yang akan membebaskan ikatan dalam medan.

Ikatan yang lebih polar mengalami gaya yang lebih besar daripada ikatan yang kurang polar.

Momen ikatan, suatu ukuran kepolaran ikatan, dapat dihitung dari nilai gaya yang dialami.

momen ikatan bervariasi, mulai dari 0 Debye untuk ikatan non polar seperti H-H sampai 3-4

Debye untuk ikatan yang sangat polar.

Momen Dipol

Momen dipol μ adalah jumlah vektor dari momen ikatan dalam molekul. Karena adisi

vektor menyangkut besarnya momen ikatan sekaligus arah, maka momen dipol merupakan

ukuran kepolaran molekul secara keseluruhan, contoh momen dipol CCl4 adalah 0 meskipun tiap

ikatan C-Cl memiliki momen ikatan 1,46 D. Hal tersebut terjadi karena molekul CCl4 sekeliling

atom pusat, sehingga momen ikatannya saling meniadakan (jumlah vektror nol). Momen ikatan

molekul air tidak saling meniadakan karena molekul air tidak simetrik sekeliling oksigen.

72

Antaraksi Dipol-dipol

Adanya antaraksi dipol-dipol maka molekul saling tarik-menarik dan tolak-menolak:

tarik-menarik antara muatan yang berlainan tanda dan tolak-menolak antara muatan yang sama

tanda. Molekul nonpolar saling ditarik oleh antaraksi dipol-dipol yang lemah yang disebut gaya

London. Gaya London timbul dari dipol yang diinduksi dalam satu molekul oleh molekul lain.

Dalam hal ini. elektron dari satu molekul ditarik ke inti dari molekul kedua secara lemah, maka

elektron dari molekul kedua ditolak oleh elektron dari molekul pertama. Hasilnya adalah

distribusi elektron yang tidak merata dan suatu dipol terinduksi.

Antaraksi berbagai dipol (tarikan dan tolakan) secara kolektif disebut gaya Van der Waals. Jarak

antar atom ataupun molekul dimana gaya memiliki kekuatan terbesar disebut sebgai jari-jari Van

der Waals. Bila 2 atom saling mendekat lebih dekat dari jari-jari Van der Waals, maka timbul

tolakan. Bila jarak kedua molekul lebih besar dari jari-jari Van der Waals maka gaya tarik

berkurang.

Molekul rantai kontinu seperti CH3CH2CH2CH2CH3 dapat meluruskan molekul-

molekulnya menurut rantai yang berliku-liku (zig-zag), sehingga memungkinkan atom dari

berbagai molekul menempati kedudukan yang sesuai dengan jari-jari Van der Waals. Sedangkan

molekul bercabang tidak dapat saling mendekati cukup dekat bagi semua atomnya untuk

mencapai jari – jari Van der Waals secara optimal. Oleh karena itu, senyawa rantai kontinu

memiliki titik didih yang lebih tinggi daripada senyawa rantai bercabang meskipun memiliki

struktur dan berat molekul yang sama, karena senyawa rantai kontinu memerlukan energi yang

lebih besar untuk mengatasi tarikan Van der Waals.

Ikatan Hidrogen

73

Jenis antaraksi dipol-dipol yang teristimewa kuat terjadi antara molekul yang

mengandung atom hidrogen yang terikat pada nitrogen, oksigen, atau fluor yang masing-masing

adalah elektronegatif dan memiliki pasangan elektron bebas. Atom hidrogen yang parsial positif

dari satu molekul ditarik oleh pasangan elektron bebas dari atom molekul lain yang

elektronegatif. Tarikan tersebut disebut ikatan hidrogen.

Senyawa ataupun gugus yang mengandung karbon dan hidrogen tidak dapat mengalami ikatan

hidrogen, contoh CH4 (metana) tidak dapat mengalami ikatan hidrogen karena atom karbon

dalam CH4 tidak memiliki pasangan elektron bebas untuk menarik atom hidrogen sehingga tidak

memiliki H yang parsial positif.

Kekuatan ikatan hidrogen tidak sama, contoh ikatan hidrogen O – – HO lebih kuat dari

N – – HN karena oksigen lebih elektronegatif daripada nitrogen sehingga gugus O–H lebih polar

dan memiliki H yang lebih positif. H yang lebih positif akan lebih kuat tertarik pada pusat

negatif.

Ikatan hidrogen juga dapat terbentuk antara 2 senyawa yang berbeda, contoh antara CH3OH dan

H2O. Dalam hal ini sering terdapat lebih dari satu kemungkinan terjadinya ikatan hidrogen.

Dalam campuran senyawa tersebut, ikatan hidrogen dapat pula terbentuk antara 2 molekul H2O

dan antara 2 molekul CH3OH.

ORBITAL DAN PERANANNYA DALAM IKATAN KOVALEN

A. ORBITAL IKATAN DAN ORBITAL ANTI IKATAN

Bila 2 gelombang yang sefase saling tumpang tindih, maka akan saling memperkuat. Bila

sepasang gelombang yang tumpang tindih keluar fase maka akan saling mengganggu atau

berinterferensi. Satu orbital atom dapat bertumpang tindih dengan orbital atom lain. Bila yang

74

bertumpang tindih sefase, maka akan terjadi perkuatan dan terbentuk orbital molekul ikatan.

Tumpang tindih orbital yang keluar fase menghasilkan interferensi menuju ke orbital anti ikatan.

Pada 2 atom hidrogen yang terisolir, masing-masing memiliki satu elektron dalam orbital

atom 1s. Bila kedua atom mulai membentuk ikatan, orbital atom akan melebur dan bertumpang

tindih untuk saling memperkuat dan membentuk orbital molekul ikatan. Orbital molekul ini

mencakup kedua inti hidrogen dan mengandung sepasang elektron (masing-masing dari satu

atom H), dimana kedua elektron tersebut tertarik sama kuat ke kedua inti. Karena rapat elektron

antara inti yang berikatan adalah tinggi, maka tolak menolak antara inti dikurangi dan terbentuk

ikatan kovalen dalam molekul H2.

Bila 2 gelombang berlawanan fase, maka akan saling berinterferensi. Interferensi dari 2

orbital atom yang keluar fase dari 2 atom H akan menghasilkan orbital molekul dengan simpul

antara inti yang disebut orbital anti ikatan (* artinya anti ikatan). Dalam orbital molekul ini,

kebolehjadian menemukan elektron antara inti sangat rendah. Oleh karena itu, orbital molekul ini

menimbulkan sistem dimana kedua inti tak dilindungi oleh sepasang elektron dan intinya saling

tolak-menolak. Karena adanya tolakan inti, maka sistem ini energinya lebih tinggi daripada

sistem 2 atom H yang terisolir / mandiri.

75

Demikian pula dengan pembentukan orbital molekul dari molekul F2, yang masing-masing

memiliki konfigurasi 1s2 2s2 2px2 2py

2 2pz1. Masing-masing atom F memiliki 1 orbital p setengah

terisi yaitu 2pz. Orbital 2pz dari masing-masing atom F akan bertumpang tindih pada sumbu x

dengan arah adu kepala sehingga masing-masing orbital dapat terisi 2 elektron dengan spin

berlawanan. Dengan demikian terbentuklah satu orbital molekul yang mencakup 2 elektron

orbital 2pz dan kedua inti.

Pada molekul HF, tumpang tindihnya terdiri dari satu orbital 1s setengah terisi dari atom

H dan satu orbital 2p setengah terisi dari atom F.

B. IKATAN SIGMA (σ)

Dalam H2, F2, dan HF, orbital molekul yang dibentuk disebut orbital sigma, yaitu orbital

molekul yang simetris di sekitar garis yang menghubungkan kedua inti, sehingga rapat elektron

berada di daerah bonding antara kedua inti. Ikatan yang terjadi disebut sebagai ikatan sigma (σ).

C. IKATAN PI (π)

Selain adu kepala, orbital p yang setengah terisi memiliki cara lain dalam bertumpang

tindih untuk membentuk orbital ikatan. Jika kedua orbital p terletak tegak lurus pada garis yang

menghubungkan kedua inti, maka orbital p akan bertumpang tindih secara adu sisi.sehingga

terbentuk awan elektron yang terletak di atas dan di bawah kedua inti. Orbital molekul yang

terbentuk ini disebut orbital pi, dan ikatan kovalen ini disebut ikatan pi (π).

Ikatan pi terdapat dalam molekul yang memiliki 2 atom yang dihubungkan oleh ikatan

rangkap atau ganda tiga, dimana ikatan tersebut juga sekaligus mengandung ikatan sigma. Ikatan

sigma memiliki tumpang tindih yang lebih besar dan ikatannya lebih kuat, sedangkan ikatan pi

tumpang tindihnya lebih kecil sehingga ikatannya lebih lemah.

Ikatan Sigma Ikatan Pi

D. ORBITAL HIBRIDA KARBON

Karbon memiliki 2 elektron dalam orbital 1s, sehingga orbital 1s merupakan orbital terisi

yang tidak digunakan untuk membentuk ikatan. Keempat elektron pada tingkat energi kedua

(kulit kedua) merupakan elektron valensinya, yaitu elektron pada kulit terluar yang digunakan

untuk membentuk ikatan yang terdiri dari satu orbital 2s dan tiga orbital 2p. Namun karbon tidak

76

menggunakan keempat orbital dalam keadaan murninya untuk ikatan, melainkan bercampur atau

berhibridisasi. Terdapat 3 cara hibridisasi atom karbon untuk membentuk ikatan, yaitu:

1. Hibridisasi sp3

Digunakan bila karbon membentuk 4 ikatan tunggal, contoh:

Dalam CH4 karbon memiliki ikatan kovalen terhadap hidrogen yang ekuivalen. Hal ini

membuktikan bahwa karbon tidak membentuk ikatan dari satu orbital s dan tiga orbital p, karena

jika demikian keempat ikikatan C – H tidak akan ekuivalen. Keempat ikatan karbon tersebut

terjadi dari hibridisasi lengkap keempat orbital atomnya (satu orbital 2s dan tiga orbital 2p)

sehingga terbentuk orbital sp3 yang akuivalen. Agar hal tersebut terjadi maka satu dari elektron

2s harus dieksitasikan ke orbital 2p yang kosong sehingga terbentuk empat orbital sp3 yang

masing-masing mengandung satu elektron untuk ikatan. Keempat orbital sp3 yang terbentuk

memiliki energi yang sama, agak lebih tinggi dari energi orbital 2s namun agak lebih rendah dari

orbital 2p.

Orbital sp3 berupa pencampuran orbital 2s dan 2p sehingga ada cuping besar dan cuping kecil

dengan simpul pada inti. Ikatan atom karbon sp3 terjadi dari tumpang tindih masing-masing

orbital sp3 dengan empat orbital atom lain. Dalam metana masing-masing orbital sp3 dari karbon

bertumpang tindih dengan orbital 1s dari hidrogen dan ikatan yang terbentuk berupa ikatan

sigma.

Demikian pula dalam etana (CH3–CH3), tiga orbital sp3 dari masing-masing atom C

bertumpang tindih dengan orbital 1s atom H dan satu orbital sp3 sisanya bertumpang tindih

dengan orbital sp3 atom karbon yang lain.

77

2. Hibridisasi sp2

Digunakan bila karbon membentuk ikatan rangkap, contoh:

Untuk membentuk orbital sp2, karbon menghibridisasikan orbital 2s nya hanya dengan dua

orbital 2p, dan satu orbital p pada atom karbon tetap tidak terhibridisasi, sehingga terbentuk 3

orbital sp2 dan satu orbital 2p yang tak terhibridisasi.

Dalam etilena (CH2=CH2), dua orbital sp3 dari masing-masing atom C bertumpang tindih dengan

orbital 1s atom H dan satu orbital sp3 sisanya bertumpang tindih dengan orbital sp3 atom karbon

yang lain, dimana ketiganya membentuk ikatan sigma. Sedangkan satu orbital 2p yang tak

terhibridisasi dari atom C akan bertumpang tindih secara adu sisi dengan orbital 2p tak

terhibridisasi atom C lain dan membentuk ikatan pi.

3. Hibridisasi sp

Digunakan bila karbon membentuk ikatan ganda tiga atau ikatan rangkap terakumulasi

(dua ikatan rangkap terhadap satu karbon tunggal), contoh:

78

Untuk membentuk orbital sp, karbon menghibridisasikan orbital 2s nya hanya dengan satu orbital

2p, dan dua orbital p pada atom karbon tetap tidak terhibridisasi, sehingga terbentuk 2 orbital

hibrida sp dan dua orbital 2p yang tak terhibridisasi.

Dalam asetilena, kedua atom C dihubungkan oleh ikatan sigma sp–sp dan masing-masing karbon

juga terikat terhadap atom H oleh ikatan sigma sp–s. Sedangkan kedua orbital 2p yang tak

terhibridisasi dari satu karbon akan bertumpang tindih dengan dua orbital 2p atom karbon yang

lain, sehingga terbentuk 2 ikatan pi. Dengan demikian ikatan rangkap tiga terdiri dari satu ikatan

sigma dan dua ikatan pi.

POTENSIOMETRI

A. PENDAHULUAN

Reaksi-reaksi kimia yang melibatkan transfer elektron (pelepasan atau penangkapan

elektron) dari satu spesies ke spesies lain merupakan dasar dari kimia elektroanalitik /

elektrokimia. Hal tersebut umumnya berlangsung dalam suatu sistem yang terdiri dari elektrolit

79

dan sepasang elektroda (electrochemical cell). Berdasarkan unit listrik yang dipelajari untuk

menyatakan konsentrasi, maka dalam elektrokimia dikenal beberapa macam teknik seperti:

Unit Listrik yang Diamati Teknik

Volt / pH vs ml titran Potensiometri

Ampere vs ml titran Amperometri

Tahanan Konduktimetri

Coulomb Coulometri

Amper vs volt Polarografi

Pertambahan berat elektroda Elektrogravimetri

Volt vs waktu Chronopotensiometri

Hilang timbulnya arus Dead stop end point

Pada bidang farmasi, teknik yang sering digunakan yaitu: potensiometri, polarografi, dan dead

stop end point. Metode elektrometrik bersifat sensitif, selektif, dan akurat. Kesensitifan metode

ini dapat sampai di bawah 10-10 molar. Karena selektif maka pemisahan sampel atau sample

pretreatment dapat dikurangi sehingga waktu analisis bisa lebih singkat. Selain itu, remote

control, in-line instalation dan automation dapat dilakukan dengan cara ini.

Potensiometri merupakan cabang dari elektrokimia yang mempelajari atau mengukur

potensial elektroda untuk menyatakan konsentrasi. Titrasi potensiometri dapat digunakan untuk

penetapan kadar larutan dimana indikator visual tidak dapat digunakan, misalnya larutan yang

sangat encer dan untuk larutan berwarna.

B. POTENSIAL ELEKTRODA

Pada sistem redoks (reduksi oksidasi) terjadi transfer elektron, baik berupa pelepasan

elektron (oksidasi) ataupun penangkapan elektron (reduksi) yang terjadi secara bersamaan.

Oksidator dipahami sebagai senyawa yang mampu mengoksidasi senyawa lain, sedangkan

dirinya sendiri mengalami reduksi sehingga terjadi penurunan bilangan oksidasi (biloks).

Reduktor dipahami sebagai senyawa yang mampu mereduksi senyawa lain, sedangkan dirinya

sendiri mengalami oksidasi sehingga terjadi kenaikan biloks. Bilangan oksidasi merupakan

bilangan yang menyatakan banyaknya muatan listrik suatu unsur di dalam persenyawaan,

misalnya:

Unsur bebas biloks = 0

H dalam persenyawaan biloks = +1

O dalam persenyawaan biloks = -2

Logam alkali (gol A) biloks = +1

Alkali tanah (gol B) biloks = +2

Jumlah biloks unsur-unsur dalam persenyawaan = 0

80

Pada sistem redoks selalu terjadi kesetimbangan antara oksidator dan reduktor, seperti

digambarkan reaksi berikut:

red oks + ne

Berdasarkan pemahaman tersebut, maka reaksi di atas dapat dituliskan dalam 2 reaksi paro:

Oksidasi : red → oks + ne

Reduksi : oks + ne → red

Bila sebuah elektroda dicelupkan ke dalam sistem tersebut, maka dapat terjadi 2 kemungkinan:

1. Bila sistem merupakan oksidator maka elektroda akan teroksidasi (melepaskan elektron)

sehingga bermuatan positif.

2. Bila sistem merupakan reduktor maka elektroda akan tereduksi (menangkap elektron)

sehingga bermuatan negatif.

Besarnya potensial yang terjadi merupakan ukuran kemampuan atau potensi sifat oksidator

reduktor dari sistem tersebut, yang dinyatakan dalam harga potensial reduksi / potensial

elektroda (E).

Permasalahannya, harga E yang sesungguhnya dari suatu reaksi reduksi tidak dapat

dihitung, sebab tidak ada reaksi reduksi yang berlangsung tanpa disertai reaksi oksidasi sehingga

reaksi reduksi hanya merupakan setengah reaksi dari pasangan reaksi oksidasi. Oleh sebab itu

harga E yang digunakan adalah harga E relatif yang dibandingkan terhadap elektroda standar,

sehingga harga E lebih tepat disebut harga Eo yaitu potensial reduksi standar atau potensial

elektroda standar.

Standar yang digunakan dalam menentukan harga Eo adalah elektroda hidrogen. Gas

hidrogen murni dialirkan pada elektroda platina yang tercelup dalam larutan asam (H+), maka

pada permukaan platina akan terjadi kesetimbangan :

2H+ + 2e === H2

Harga Eo dari reaksi tersebut adalah nol volt, sehingga harga Eo dari semua reaksi reduksi adalah

harga E relatif yang dibandingkan terhadap Eo hidrogen.

Semakin besar harga potensial reduksi standar (Eo) maka potensi atau kemampuan suatu

unsur untuk mengalami reduksi semakin besar, yang artinya sifat oksidatornya semakin kuat.

Demikian pula sebaliknya. Sistem yang harga Eonya lebih besar dapat mengoksidasi sistem yang

Eonya lebih kecil.

C. ELEKTRODA

Elektroda dapat dibagi menjadi 2 golongan, yaitu reference elektrode atau elektroda

standar dan indicator elektrode. Elektroda standar memiliki harga potensial yang konstan tidak

dipengaruhi oleh kondisi larutan, sedangkan elektroda indikator harga potensialnya berubah-

ubah sesuai dengan konsentrasi larutan. Masing-masing elektroda tersebut merupakan sistem

setengah sel sehingga tidak dapat digunakan sendiri-sendiri.

81

Potensial suatu larutan ditentukan oleh: Ecell = Eind + Eref + Ej

dimana Ecell, Eind, Eref, Ej masing-masing adalah harga potensial sel, elektroda indikator, elektroda

standar, dan liquid junktion potential yaitu potensial pada bidang batas dua larutan. Pada sistem

yang baik harga Eref konstan dan harga Ej juga konstan bahkan sangat kecil sehingga harga Ej

seringkali diabaikan. Oleh karena itu, potensial yang ditunjukkan oleh elektroda indikator dapat

memberikan informasi tentang konsentrasi zat uji tertentu dalam suatu larutan.

Elektroda standar / rujukan

1. Elektroda hidrogen. Semua potensial elektroda merupakan harga relatif terhadap

potensial elektroda hidogen standar, sehingga elektroda hidrogen merupakan elektroda

rujukan primer. Meskipun elektroda hidrogen merupakan elektroda rujukan primer,

namun dalam praktek banyak digunakan elektroda standar lain untuk kebanyakan

maksud, elektroda yang dapat dipasang permanen sehingga tersedia untuk penggunaan

yang mendadak. Dengan demikian pemasangan seksama termasuk pemurnian gas yag

diperlukan dalam menyusun elektroda hidrogen dapat dihindari. Bila digunakan sebagai

elektroda standar, elektroda hidrogen bekerja dalam larutan yang mengandung ion

hidrogen pada aktivitas yang konstan yang biasanya didasarkan pada asam klorida. Selain

itu gas hidrogen harus bertekanan 1 atm.

Elektoda Hidrogen Elektroda Kalomel

2. Elektroda kalomel. Elektroda standar yang paling banyak digunakan adalah elektroda

kalomel karena mudah dibuat dan harga potensial yang konstan. Potensial elektroda

tergantung pada konsentrasi KCl yang ada di dalamnya, yaitu 0,1 N; 1 N; atau jenuh,

namun yang banyak dipilih untuk suatu pekerjaan rutin adalah yang jenuh. Larutan

kalium klorida harus dijenuhi oleh kalomel (merkurium (I) klorida). Potensial elektroda

kalomel pada 25 oC relatif terhadap elektroda hidogen normal (standar) untuk 0,1 N; 1 N;

dan jenuh masing-masing adalah 0,3371; 0,2846; dan 0,2458 volt.

3. Elektroda perak-perak klorida . Elektroda ini barangkali nomor dua pentingnya setelah

elektroda kalomel. Silver-silver chlorida elektrode terdiri dari kawat perak atau kawat

platinum yang dilapis perak, kemudian disalut secara elektrolisis dengan lapisan tipis

perak klorida. Kawat tersebut tercelup di dalam larutan KCl yang telah diketahui

82

konsentrasinya. Potensial elektroda perak-perak klorida pada 25 oC relatif terhadap

elektroda hidogen normal (satandar) masing-masing adalah 0,29 dan 0,199 volt untuk

konsentrasi larutan KCl 0,1 M dan jenuh.

4. Elektroda merkuri sulfat. Susunannya hampir sama dengan elektroda kalomel namun

menggunakan larutan raksa (I) sulfat jenuh dalam asam sulfat 0,1N. Elektroda ini dapat

digunakan untuk larutan yang mengandung ion-ion perak dan timbal.

Elektroda indikator

1. Elektroda hidrogen. Selain fungsinya sebagai elektroda standar, elektroda hidrogen dapat

digunakan sebagai elektroda indikator untuk mengukur konsentrasi ion hidrogen ataupun

pH larutan sehingga dapat digunakan untuk titrasi potensiometri asam-basa. Elektroda

hidrogen tidak dapat digunakan dalam larutan yang mengandung oksidator, seperti ion

permanganat, nitrat, serium (IV), dan besi (II), ataupun reduktor seperti senyawa organik

tak jenuh, sulfida, sulfit, arsen. Elektroda hidrogen juga tak memuaskan apabila terdapat

garam logam mulia seperti tembaga, perak, emas, dan dalam larutan yang mengandung

garam timbel, kadmium, dan talium. Elektroda hirogen juga memiliki beberapa

keunggulan antara lain, merupakan elektroda mendasar dimana semua pengukuran pH

pada akhirnya akan dibandingkan, dapat digunakan pada semua rentang pH, tidak

menunjukkan sesatan garam. Namun dalam praktek penggunaan elektroda lain sebagai

elektroda indikator lebih disukai. Elektroda alternatif yang peka akan ion hidrogen antara

lain elektroda kuinhidron, elektroda stibium, elektroda gelas.

2. Elektroda stibium. Elektroda stibium sebenarnya merupakan elektroda stibium-stibium

trioksida. Elektroda ini tidak mudah terkontaminasi / teracuni, sederhana penggunaannya

dan kuat sehingga digunakan untuk merekam atau mengawasi pH secara

berkesinambungan. Namun elektroda ini tidak dapat digunakan jika terdapat oksidator

kuat dan zat pengompleks, di dalam larutan dengan pH di bawah 3, ataupun adanya

logam yang lebih mulia dari stibium. Pada bidang analisis penggunaannya terbatas, tetapi

penting dalam industri karena memiliki sifat dasar sederhana dan tahan terhadap

kekasaran.

3. Elektroda kuinhidron. Elektroda kuinhidron sensitive terhadap hydrogen, dan relatif

paling murah. Elektroda ini terdiri dari sama banyak molar kuinon dan hidrokinon, serta

kawat platina. Elektroda kuinhidron tidak dapat digunakan untuk pengukuran pH di atas 8

ataupun larutan yang mengandung oksidator reduktor kuat.

4. Elektroda gelas / kaca. Elektroda kaca merupakan elektroda peka ion hidrogen yang

paling luas penggunaannya. Penggunaannya didasarkan pada suatu fakta bahwa bila suatu

selaput kaca dibenamkan dalam suatu larutan, maka akan terjadi suatu potensial yang

merupakan fungsi linier dari konsentrasi ion hidrogen larutan tersebut. Bagian ujungnya

83

terbuat dari gelembung gelas yang sangat tipis dan sensitif terhadap perubahan pH larutan

dengan penataan dasar seperti pada gambar berikut:

Elektroda Gelas

Bola B dibenamkan dalam larutan yang konsentrasi ion hidrogennya akan diukur. Kontak

listrik akan terjadi dengan mengisi bola tersebut dengan larutan asam klorida (0,1 M)

kemudian membenamkan elektroda perak-perak klorida. Apabila konsentrasi larutan HCl

konstan maka potensial elektroda perak-perak klorida juga konstan. Demikian pula

dengan potensial elektroda antara larutan HCl dan permukaan dalam bola kaca. Satu-

satunya potensial yang dapat berubah adalah potensial antara permukaan luar bola kaca

dan larutan uji yang dicelupi elektroda tersebut, sehingga potensial keseluruhan elektroda

tergantung pada konsentrasi ion hidrogen dalam larutan uji. Oleh karena itu, untuk

memastikan bahwa konsentrasi asam klorida di dalam bola tetap konstan maka ujung atas

elektroda harus dikedapkan dengan melelehkan kaca seperti dilukiskan pada gambar b.

Elektroda kaca memiliki respon yang cepat, tidak dipengaruhi oleh oksidator kuat

ataupun reduktor kuat, gas terlarut, warna larutan, koloid, media kental, larutan garam

kecuali garam natrium, dan dengan adanya protein ataupun senyawa serupa yang dapat

mengganggu elektroda lain. Elektroda kaca dapat pula disesuaikan untuk pengukuran

larutan yang volumenya kecil. Sifat dasar dari bahan kaca / gelas yang digunakan untuk

membuat elektroda ini sangatlah penting. Hardglass seperti Pyrex tidak sesuai, sehingga

harus digunakan jenis yang lunak (softglass) yang responsif terhadap pH. Elektroda gelas

dari soda-kapur (Corning glass 015) memiliki respon linier pada rentang pH 1 – 9, namun

dalam larutan berbasa tinggi mudah mengalami sesatan basa dan cenderung memberikan

harga pH yang lebih rendah. Sesatan meningkat dengan bertambahnya konsentrasi ion

logam alkali dalam larutan, namun sesatan berkurang dalam larutan yang mengandung

ion litium, kalium, barium, atau kalsium. Oleh karena itu, sesatan basa diatasi dengan

mengganti kandungan natrium kaca dengan litium elektroda gelas dari litium-silika dapat

84

digunakan pada hampir seluruh rentang pH. Elektroda gelas mudah pecah dan goresan

pada gelembungnya dapat mempengaruhi kerjanya. Sebelum melakukan pengukuran,

elektroda gelas hendaknya dicuci baik-baik dengan akuades setiap setelah pengukuran,

kemudian dibilas dengan larutan uji. Elektroda kaca tidak boleh dibiarkan kering, kecuali

selama penyimpanan dalam waktu panjang dan akan kembali ke kondisi responnya bila

dicelup dalam akuades minimal 12 jam sebelum digunakan. Pada 25 oC, bila dicelupkan

dalam suatu larutan maka potensial elektroda kaca dinyatakan dengan persamaan:

E = k + 0,0592 pH

K merupakan suatu tetapan yang dikenal dengan potensial asimetri, yang harganya

tergantung pada sifat dasar kaca (kualitas, tebal kaca), komposisi larutan dalam elektroda,

ataupun usia elektroda. Dengan demikian tidak dapat diberikan nilai konstan pada k,

sehingga elektroda gelas harus seringkali distandarisasi dengan membenamnya dalam

larutan yang aktivitas ion hidrogennya telah diketahui (larutan buffer). Elektroda standar

yang paling lazim digunakan sebagai kombinasinya dalam mengukur konsentrasi ion

hidrogen adalah elektroda kalomel, sehingga akan dihasilkan sel:

Ag, AgCl(s) | HCl (0,1 M) | kaca | larutan uji | KCl (jenuh), Hg2Cl2(s) | Hg

Pada elektroda kombinasi, elektroda kaca dan elektroda kalomel jenuh digabung menjadi

satu satuan tuggal, sehingga diperoleh instrumen yang lebih kokoh dan terhindar dari

kerepotan membenamkan kedua komponen secara terpisah.

D. INSTRUMENTASI

Potensiometer (konvensional)

Alat ini digunakan untuk penetapan potensial suatu sel. Sebelum digunakan sel kerja

harus dirangkai pada instrumen tersebut selama 20-30 menit, dimana selama waktu ini

kumparan-kumparan tahanan pada instrumen akan menghangat dan diperlukan waktu

secukupnya untuk mencapai kesetimbangan termal. Kemudian sel standar dimasukkan pada

rangkaian dan ditetapkan titik ke titik keberimbangan pada kawat geser potensiometer.

Potensiometer Tinsley pembacaan langsung dalam volt, sehingga hlangkah tersebut dilakukan

dengan cara memutar saklar selektor ke posisi calibrate dan reostat penyetimbang disesuaikan

hingga galvanometer tidak lagi menunjukkan simpangan. Saat mulai operasi standarisasi, saklar

kepekaan galvanometer diatur pada tingkat kepekaan terendah kemudian bertahap dinaikkan

hingga makin mendekati titik keberimbangan. Langkah tersebut dilakukan dengan cara memutar

saklar selektor dari posisi 1 ke posisi 2 tergantung pada pasangan ujung mana sel itu

dihubungkan. Saat mendekati titik berimbang, kepekaan galvanometer ditingkatkan hingga

tercapai kepekaan maksimum. Kemudian sel standar diganti dengan sel uji.

Pada banyak kerja analitik, pengukuran potensial sel disederhanakan menggunakan mili

voltmeter zat padat, seperti pH meter, sehingga potensial diperoleh dengan segera melalui suatu

85

pembacaan tunggal tanpa proses penyetimbangan yang memakan waktu seperti yang dilakukan

pada potensiometer konvensional.

pH Meter

Mengingat tingginya tahanan elektroda gelas, maka potensiometer biasa tidak dapat

digunakan untuk mengukur potensial sel dengan elektroda gelas. Kemudian dirancang suatu

voltmeter elektronis yang dirancang untuk sistem elektroda gelas. Elektroda gelas digunakan

untuk mengukur pH suatu larutan, sehingga instrumen tersebut dikenal sebagai pH meter. Ada 2

tipe pH meter, yaitu:

1. Potentiometric pH meter (pH meter bertipe potensiometer)

Tipe ini menggunakan potensiometer sirkuit konvensional dimana galvanometer

diganti dengan tahanan tinggi. Ketidakseimbangan antara potensiometer dan sel sirkuit

akan menghasilkan penurunan potensial sepanjang tahanan tersebut. Hal tersebut

diperbesar dengan suatu elektronik sirkuit sehingga terbaca pada skala. Bila potensial dari

potensiometer dan sel tepat sama, maka tidak ada arus ataupun penurunan potensial

sepanjang tahanan sehingga skala menunjukkan angka nol. Dalam hal ini, amplifier

circuit hanya berfungsi untuk mendeteksi titik keseimbangan dari potensiometer.

Potensiometer

2. Direct reading pH meter (pembacaan langsung)

Tipe ini tidak menggunakan potensiometer sirkuit melainkan sebuah vacuum tube

voltmeter atau suatu transistor analog. Potensial dari sel diteruskan melalui tahanan yang

tinggi ke dalam input dari instrumen dan pH ataupun potensial larutan langsung dibaca

pada sebuah skala setelah signal diperbesar oleh amplifier. Persyaratan elektronis tipe ini

lebih komplek karena hubungan antar input voltage dengan penyimpangan jarum skala

harus benar-benar linier. Keuntungan penggunaan tipe ini yaitu bahwa grafik hubungan

antara pH dan waktu dapat dilukiskan pada kertas grafik dengan recorder. Bila tipe ini

dikombinasi dengan recorder maka dapat digunakan untuk membuat kurva netralisasi

86

selama titrasi atau dengan menggunakan servemecanism dapat digunakan untuk

mengontrol proses industri.

Persamaan dasar suatu pH meter menyatakan bahwa 1 unit pH setara dengan 59 mV pada suhu

25oC. Oleh karena itu, meter yang sama dapat digunakan untuk dua skala yaitu mV dan pH.

Diagram skematis basic circuit dari pH meter adalah sebagai berikut:

pH meter tipe pembacaan langsung sekarang telah menjadi standar, bahkan tipe termodernnya

menggunakan voltmeter digital, yang skalanya diubah sehingga langsung menunjukkan nilai pH,

seperti pada gambar berikut:

Elektroda gelas memiliki potensial asimetri yang tidak memungkinkan menghubungkan

langsung potensial elektroda terukur dengan pH larutan. Oleh karena itu, elektroda perlu

dikalibrasi terlebih dahulu. Kalibrasi dilakukan dengan mengoperasikan 2 tombol, yaitu tombol

kalibrasi nol dan tombol pengontrol suhu. Tombol kalibrasi nol digunakan untuk mengubah pH

yang ditunjukkan pH meter sehingga sesuai dengan pH buffer standar yang digunakan.

Persamaan Nernst menunjukkan bahwa potensial elektroda gelas untuk suatu nilai pH tertentu

tergantung pada suhu larutan. Tombol pengontrol suhu digunakan untuk mengubah faktor 0,0592

sehingga skala pengukur dapat disesuaikan agar berpadanan dengan suhu larutan yang sedang

diuji. Kalibrasi dilakukan dengan langkah sebagai berikut:

87

1. Mula-mula alat dikalibrasi dengan buffer pH 7, yaitu dengan mengatur jarum skala pada

pH meter menjadi sedemikian rupa sehingga skala pada pH 7 sama dengan 0 mV dan

tidak tergantung pada suhu, menggunakan tombol kalibrasi nol sehingga jarum

menunjukkan angka 7 pada skala pH dan 0 pada skala mV. Pada pH meter digital seperti

di atas, setelah elektroda dibenamkan dalam larutan buffer pH 7 maka tombol kalibrasi

nol dioperasikan agar angka yang muncul sesuai dengan nilai pH dari buffer standar yang

digunakan yaitu 7.

2. Kalibrasi dilanjutkan dengan buffer pH 4 atau 10 dengan mengoperasikan tombol

pengontrol suhu. Setelah elektroda dibenamkan dalam larutan buffer pH 4 atau 10 maka

tombol pengontrol suhu dioperasikan agar angka yang muncul pada alat sesuai dengan

nilai pH dari buffer standar yang digunakan yaitu 4 atau 10. Langkah ini bertujuan untuk

mengatur kemiringan / slope kurva sehingga diperoleh hubungan linier yang tepat antara

pH dan mV. Oleh karena itu tombol pengontrol suhu disebut juga tombol slope kontrol /

pengendali lereng. Apabila kurva mampu menunjukkan hubungan yang linier antara pH

dan mV maka persamaan dasar pH meter dapat dicapai yaitu 1 unit pH setara dengan 59

mV pada suhu 25oC. Dengan demikian apabila ditarik suatu garis lurus yang memotong

kurva maka pada pH 4 kurva akan merujuk pada +177 mV dan pada pH 10 kurva akan

merujuk pada -177 mV, karena dari pH 7 ke pH 4 dan 10 terdapat selisih 3 unit pH.

Setelah dikalibrasi, pH meter akan memberikan pembacaan yang tepat untuk semua nilai pH

yang terletak pada rentang pH larutan buffer yang digunakan. Kurva yang diperoleh setelah

dilakukan kalibrasi adalah sebagai berikut:

Tombol Kalibrasi Nol Tombol Pengontrol Suhu

E. PENENTUAN TITIK EKIVALEN DAN PERHITUNGAN KADAR

Titrasi potensiometri umumnya lebih disukai menggunakan direct reading pH meter

karena dapat membaca pH atau mV terus menerus selama titrasi. Pada titrasi potensiometri,

elektroda indikator yang digunakan harus sesuai dengan jenis titrasi yang dilakukan, misalnya

elektroda gelas untuk titrasi asam basa, elektroda platina untuk titrasi redoks, dll. Harga potensial

yang sesungguhnya dari elektroda standar tidak perlu diketahui asal harganya konstan selama

titrasi, karena yang diukur adalah perbedaan potensialnya dengan potensial elektroda indikator

yang senantiasa berubah sesuai dengan perubahan konsentrasi ion / potensial larutan.

88

Titrasi dilakukan dengan mencelupkan pasangan elektroda ke dalam titrat, kemudian

perbedaan potensial antara kedua elektroda atau pH larutan pada awal titrasi diukur. Titran

kemudian ditambahkan ke dalam titrat yang terus diaduk dengan stirer magnetig, dan pada setiap

penambahan sejumlah volume titran (misalnya setiap 1,0 ml titran), harga pH atau mV dicatat.

Pendekatan titik ekivalen terjadi saat perubahan harga pH atau mV relatif cepat, oleh karena itu

saat mendekati titik ekivalen maka penambahan titran harus sekecil mungkin dan konstan,

misalnya tiap 0,05 – 0,10 ml. Setelah tiap penambahan titran, maka perlu didiamkan beberapa

saat untuk memberikan kesempatan pada elektroda indikator untuk mencapai potensial yang

stabil yang ditandai dengan perubahan harga pH atau mV yang hanya berkisar 1 – 2 unit. Titik

ekivalen akan tercapai saat terjadi perubahan potensial atau pH yang mendadak yang kemudian

dihubungkan dengan volume titran yang digunakan. Titik ekivalen dapat ditentukan dengan

kurva ataupun perhitungan.

Penentuan titik ekivalen dapat dilakukan dengan membuat kuva hubungan antara pH atau

mV sebagai ordinat dan ml titran sebagai absis, sehingga akan diperoleh kurva sebagai berikut:

Cara tersebut disebut cara analisis penempatan titik ekivalen. Namun penentuan tersebut kurang

teliti dan banyak kesalahannya. Hasil yang lebih baik dapat diperoleh dengan cara derivatif.

Derivatif pertama dilakukan dengan membuat kurva ΔpH / ΔV atau ΔmV / ΔV terhadap ml

titran, sehingga akan diperoleh kurva sebagai berikut:

Derivatif kedua dilakukan dengan membuat kurva Δ2pH / ΔV2 atau Δ2mV / ΔV2 terhadap ml

titran, sehingga akan diperoleh kurva sebagai berikut:

Penentuan titik ekivalen secara perhitungan dapat digambarkan dengan cara berikut:

89

→X

→Y

atau

Volume ekivalen = ml

Volume ekivalen merupakan volume titran yang dibutuhkan untuk mencapai titik

ekivalen, dimana jumlah ekivalen titran = jumlah ekivalen titrat.

V pH ΔV ΔpH ΔpH / ΔV Δ2pH / ΔV2

A KA’ K’ A*

atauB L

B’ L’ B*C M atau

C’ M’ C*

D N atau

D’ N’ D*

E O atau

E’ O’ E*F P

atau

F’ P’ F*G Q dst...

90