uji aktivitas inhibisi fraksi-fraksi hasil kolom...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI AKTIVITAS INHIBISI FRAKSI-FRAKSI HASIL KOLOM KROMATOGRAFI DARI EKSTRAK KULIT

BUAH MANGGIS (Garcinia mangostana L.) TERHADAP ENZIM RNA HELIKASE VIRUS

HEPATITIS C

SKRIPSI

YUNITA SARI

NIM.109102000063

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

SEPTEMBER 2013

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI AKTIVITAS INHIBISI FRAKSI-FRAKSI HASIL KOLOM KROMATOGRAFI DARI EKSTRAK KULIT

BUAH MANGGIS (Garcinia mangostana L.) TERHADAP ENZIM RNA HELIKASE VIRUS

HEPATITIS C

SKRIPSI

Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Far)

YUNITA SARI

NIM.109102000063

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

SEPTEMBER 2013

iii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri, dan semua sumber baik yang

dikutip maupun dirujuk telah saya nyatakan dengan benar.

Nama : Yunita Sari

NIM : 109102000063

Tanda Tangan :

Tanggal : 27 September 2013

iv

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING

Nama : Yunita Sari

NIM : 109102000063

Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi : Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom

Kromatografi dari Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia

mangostana L.) Terhadap Enzim RNA Helikase Virus

Hepatitis C

Disetujui Oleh :

Pembimbing I Pembimbing II

Lina Elfita, M.Si.,Apt. A. Zaenal Mustopa, M.Si NIP. 197312122011012002 NIP. 197704122005021001

Mengetahui, Ketua Program Studi Farmasi

FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Drs. Umar Mansur, M.Sc.,Apt.

v UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PENGESAHAN

Skripsi ini diajukan oleh :

Nama : Yunita Sari

NIM : 109102000063


Judul Skripsi : Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom

Kromatografi dari Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia

mangostana L.) terhadap Enzim RNA Helikase Virus

Hepatitis C

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

DEWAN PENGUJI

Pembimbing I : Lina Elfita, M.Si.,Apt. ( )

Pembimbing II : A. Zaenal Mustopa, M.Si. ( )

Penguji I : Ofa Suzanti Betha, M.Si.,Apt. ( )

Penguji II : Ismiarni Komala, M.Sc.,Ph.D., Apt. ( )

Ditetapkan di : Jakarta

Tanggal : 27 September 2013

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK

Nama : Yunita Sari Program Studi : Farmasi Judul : Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom

Kromatografi dari Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) Terhadap Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

Virus hepatitis C termasuk anggota dalam genus hepacivirus dan famili flaviviridae yang merupakan penyebab penyakit hepatitis pada manusia di seluruh dunia. Penemuan senyawa-senyawa yang memiliki potensi sebagai inhibitor terhadap enzim yang essensial dalam proses replikasi pada virus HCV seperti enzim protease, RNA helikase, dan polimerase terus dilakukan. Manggis (Garcinia mangostana L.) merupakan pohon berbuah yang terdistribusi di Thailand, India, Srilanka, Myanmar, Indonesia, Malaysia, Philipina, dan China. Pada beberapa penelitian telah dilaporkan bahwa ekstrak kulit buah manggis dan senyawa aktifnya memiliki aktivitas antimikroba, antifungi, antioksidan, antiinflamasi, dan bahkan anti HIV. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas inhibisi hasil fraksi-fraksi kolom kromatografi dari ekstrak metanol kulit buah manggis terhadap RNA Helikase HCV. Eluen yang digunakan pada kolom kromatografi ini adalah kloroform-metanol dengan perbandingan (9:1, 8:2, 7:3, 6:4,5:5,4:6,3:7,2:8,1:9). Hasil fraksi kolom kromatografi ekstrak kulit buah manggis dibuat pada konsentrasi 2.500 ppm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas penghambatan tertinggi pada fraksi ke-sembilan dengan eluen kloroform-metanol perbandingan 7:3 yaitu sebesar 81,2 % dengan aktivitas enzim RNA helikase HCV sebesar 87,36 pmol fosfat/ml/menit/pmol protein. Hasil ini menunjukkan bahwa ekstrak kulit buah manggis berpotensi sebagai inhibitor RNA helikase virus hepatitis C.

Kata kunci : Ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.), Kolom kromatografi, RNA helikase HCV

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name : Yunita Sari Program Study : Pharmacy Title : Inhibition Activity Test of Fractions Result Column

Chromatography of Mangosteen (Garcinia mangostana L.) Pericarp Extract Against Hepatitis C Virus RNA Helicase

Hepatitis C virus including members of the Flaviviridae family, Hepacivirus genus and that is the cause of chronic hepatitis in humans worldwide. The discovery of compounds that have potential as inhibitor to essential enzyme in the process of replication HCV viral such as protease, RNA helicase and polymerase continues to be done. Mangosteen (Garcinia mangostana L.) is a fruit tree distributed in Thailand, India, Srilanka, Myanmar, Indonesia, Malaysia, Philippines and China. Recently research has reported that extracts of mangosteen pericarp and active compounds of pharmacological activities such as antimicrobial, antifungal, antioxidant, antiinflammatory, and anti-HIV. This study aims to determine inhibition activity of fractions result column chromatography from methanol pericarp extract of mangosteen of HCV RNA helicase. Eluent used in the column chromatography with the ratio of chloroform-methanol (9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9). Result of column chromatography fractions of pericarp extract of mangosteen was made with a concentration of 2.500 ppm. The results indicated that the highest inhibitory activity in fraction ninth with eluent chloroform-methanol 7:3 is 81.2% with the enzyme activity of HCV RNA helicase is 87.36 pmol phosphate/ml/min/pmol protein. These results indicate that pericarp extract of mangosteen has potential as inhibitor of HCV RNA helicase.

Keywords : Pericarp of mangosteen (Garcinia mangostana L.), Column chromatography, HCV RNA helicase

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah

SWT, yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat

menyelesaikan skripsi ini. Penulisan skripsi ini dilakukan dalam rangka

memenuhi salah satu syarat untuk menyelesaikan pendidikan guna memperoleh

gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas

Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

Penulis menyadari bahwa, tanpa bantuan dan dukungan dari berbagai

pihak, sangatlah sulit bagi penulis untuk menyelesaikan skripsi ini. Untuk itu,

penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :

(1) Ibu Lina Elfita, M.Si., Apt. selaku pembimbing I dan Bapak Apon Zaenal

Mustopa, M.Si. selaku pembimbing II, yang memiliki andil besar dalam

proses penelitian dan penyelesaian tugas akhir saya ini.

(2) Bapak Prof. Dr. dr.(hc). M. K. Tadjudin, Sp.And selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta.

(3) Bapak Drs. Umar Mansur, M,Sc., Apt selaku ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN)

Syarif Hidayatullah Jakarta.

(4) Bapak dan Ibu dosen dan karyawan yang telah memberikan bimbingan dan

bantuan selama saya menempuh pendidikan di Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN)


(5) Tim pengelola beasiswa santri jadi dokter Pemda Musi Banyuasin yang

telah mendukung saya sehingga saya dapat mengenyam pendidikan di UIN


(6) Kedua orang tua tercinta, Ayahanda Balakia dan Ibunda Faridah yang tak

pernah henti mendoakan dan memberikan dukungan kepada penulis, untuk

menyelesaikan tugas akhir ini.

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

(7) Teman seperjuangan selama kuliah dan penelitian Fakhrul Umam.

(8) Keluarga besar Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler LIPI, bu

Rifqiyah, om Ridwan, kak Linda, kak Putri, kak Yuni, kak Meita, kak Hana,

mas Aris, kak Ike, kak Aksar, kak Bugi, Uud, kak Kus, kang Ace yang telah

banyak membantu penulis dalam penelitian.

(9) Teman-teman Farmasi angkatan 2009 khususnya teman EDTA C, SJD

Muba angkatan 2009 dan sahabat-sahabat tercinta Butet, Puput, Dwi, Ika,

Ainul, dan Nurul yang berbagi suka, duka, keceriaan, dan semangat semasa

kuliah hingga penyelesaian tugas akhir ini.

Akhir kata, semoga Allah SWT membalas segala kebaikan semua pihak

yang telah membantu. Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh

dari kata sempurna, untuk itu saran dan kritik tetap penulis harapkan untuk

menjadikan tulisan ini lebih baik. Penulis berharap semoga skripsi ini

memberikan manfaat dan sumbangan bagi kemajuan dan perkembangan ilmu

pengetahuan di masa yang akan datang. Amiin Ya Robbal ‘Alamin.

Jakarta, September 2013

Penulis

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIK

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini :

Nama : Yunita Sari

NIM : 109102000063


Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis karya : Skripsi

Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah

saya, dengan judul :

UJI AKTIVITAS INHIBISI FRAKSI-FRAKSI HASIL KOLOM

KROMATOGRAFI DARI EKSTRAK KULIT BUAH MANGGIS (Garcinia

mangostana L.) TERHADAP ENZIM RNA HELIKASE VIRUS

HEPATITIS C

Untuk dipublikasikan atau ditampilkan diinternet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universita Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan pubikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

Di buat di : Jakarta

Pada Tanggal : 27 September 2013

Yang menyatakan

( Yunita Sari)

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ............................................................................................. ii HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS ................................................. iii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................ iv HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................ v ABSTRAK ............................................................................................................ iv ABSTRACT ............................................................................................................ v KATA PENGANTAR .......................................................................................... vi HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ....................... x DAFTAR ISI ......................................................................................................... xi DAFTAR TABEL .............................................................................................. xiii DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ xv DAFTAR ISTILAH ........................................................................................... xvi

BAB 1. PENDAHULUAN ..................................................................................... 1 1.1 LatarBelakang ............................................................................................. 1 1.2 Batasan dan Rumusan Masalah ................................................................... 3 1.3 Tujuan Penelitian ......................................................................................... 3 1.4 Manfaat Penelitian ....................................................................................... 3

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................ 4 2.1 Manggis (Garcinia mangostana L.) ............................................................ 4

2.1.1 Klasifikasi Tanaman .............................................................................. 4 2.1.2 Deskripsi Tanaman ................................................................................ 4 2.1.3 Kandungan Senyawa ............................................................................. 5 2.1.4 Khasiat Manggis (Garcinia mangostana L.) ......................................... 6

2.2 Ekstraksi ...................................................................................................... 7 2.3 Virus Hepatitis C ......................................................................................... 7 2.4 RNA Helikase Virus Hepatitis C ................................................................. 9 2.5 SDS PAGE ................................................................................................ 12 2.6 Kolorimetri ATPase .................................................................................. 13 2.7 Prinsip Kromatografi ................................................................................. 13 2.8 Kolom Kromatografi ................................................................................. 14

BAB 3. METODE PENELITIAN ....................................................................... 15 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ................................................................... 15 3.2 Alat dan Bahan .......................................................................................... 15 3.3 Metode Penelitian ...................................................................................... 16

3.3.1 Pengambilan Sampel ........................................................................... 16 3.3.2 Determinasi Sampel ............................................................................. 16 3.3.3 Persiapan Simplisia .............................................................................. 17 3.3.4 Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis

(Garcinia mangostana L.) ................................................................... 17 3.3.5 Rendemen Total Ekstrak Metanol Kulit Buah Manggis

(Garcinia mangostana L.) ................................................................... 17 3.3.6 Penapisan Fitokimia............................................................................. 18

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3.7 Parameter dan Metode Uji Ekstrak ...................................................... 19 3.3.7.1 Parameter Non Spesifik ........................................................... 19 3.3.7.2 Parameter Spesifik................................................................... 19

3.3.8 Produksi Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C .............................. 20 3.3.9 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan

SDS-PAGE .......................................................................................... 21 3.3.10 Uji Aktivitas Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C ...................... 22 3.3.11 Pemisahan Senyawa Inhibitor dengan Kolom kromatografi ............. 23 3.3.12 Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Manggis terhadap RNA

Helikase HCV ................................................................................... 24 3.3.13 Visualisasi Hasil Fraksi Kolom Kromatografi dengan

Menggunakan Kromatografi Lapis Tipis .......................................... 25 3.3.14 Perhitungan Aktivitas RNA Helikase Virus Hepatitis C ................... 25

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................ 27 4.1 Determinasi Sampel ................................................................................... 27 4.2 Rendemen Ekstrak ...................................................................................... 27 4.3 Penapisan Fitokimia ................................................................................... 28 4.4 Parameter dan Metode Uji Ekstrak ............................................................ 30 4.5 Produksi Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C ..................................... 31 4.6 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE .............. 33 4.7 Aktivitas Inhibisi Ekstrak Metanol Kulit Buah Manggis terhadap RNA Helikase HCV .................................................................... 35 4.8 Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom Kromatografi Ekstrak

Kulit Buah Manggis terhadap RNA Helikase HCV ................................... 37 4.9 Perhitungan Aktivitas RNA Helikase Virus Hepatitis C ............................ 40

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................ 43

5.1 Kesimpulan .................................................................................................. 43 5.2 Saran ............................................................................................................ 43

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 45 LAMPIRAN .......................................................................................................... 49

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1 Inhibitor RNA Helikase HCV .......................................................... 11 Tabel 4.1 Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak Kulit Buah Manggis................. 28 Tabel 4.2 Parameter dan Metode Uji Ekstrak .................................................. 30

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 2.1 Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) ................................... 4 Gambar 2.2 Virus Hepatitis C .......................................................................... 9 Gambar 2.3 Mekanisme Kerja Enzim RNA Helikase .................................... 10 Gambar 4.1 Hasil SDS-PAGE RNA Helikase HCV ....................................... 35 Gambar 4.2 Kurva Inhibisi Ekstrak Metanol Kulit Buah Manggis terhadap

RNA Helikase HCV .................................................................... 38 Gambar 4.3 Profil Aktivitas Inhibisi Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap Enzim RNA Helikase HCV ........ 39 Gambar 4.4 Visualisasi KLT pada Fraksi Hasil Kolom Kromatografi Ekstrak Metanol Kulit Buah manggis terhadap Enzim RNA

Helikase HCV ............................................................................. 40 Gambar 4.5 Grafik Aktivitas Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C ........... 41

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Hasil Determinasi (Garcinia mangostana L.) .......................... 49 Lampiran 2. Alur Penelitian .......................................................................... 50 Lampiran 3. Alur Kerja Persiapan Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia

mangostana L.) ......................................................................... 51 Lampiran 4. Alur Kerja Produksi Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C . 52 Lampiran 5. Alur Kerja Analisis Kemurnian Enzim RNA Helikase

HCV dengan SDS-PAGE ......................................................... 53 Lampiran 6. Alur Kerja Uji Aktivitas Enzin RNA Helikase HCV ............... 54 Lampiran 7. Alur Kerja Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah

Manggis terhadap RNA helikase HCV .................................... 55 Lampiran 8. Komposisi larutan-larutan yang digunakan dalam

SDS-PAGE ............................................................................... 56 Lampiran 9. Komposisi Reagen, Dapar, dan Medium yang digunakan ...... 57 Lampiran 10. Perhitungan Rendemen Ekstrak Kulit Buah Manggis .............. 58 Lampiran 11. Perhitungan Parameter Ekstrak Kulit Buah Manggis. .............. 59 Lampiran 12. Perhitungan Pengenceran Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak

Kulit Buah Manggis ................................................................. 60 Lampiran 13. Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Metanol Kulit Buah Manggis

(Garcinia mangostana L.) terhadap Enzim RNA Helikase HCV .................................................................................................. 61

Lampiran 14. Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) terhadap Enzim RNA Helikase HCV ................................................................. 62

Lampiran 15. Perhitungan Persen Inhibisi Hasil Fraksi Ekstak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) terhadap RNA Helikase HCV .................................................................................................. 64

Lampiran 16. Kurva Standar Fosfat (Uji ATPase) ......................................... 65 Lampiran 17. Contoh Perhitungan Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV ..... 66 Lampiran 18. Tabel Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV dengan Penambahan

Senyawa Inhibitor Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) ......................................................................... 67

Lampiran 19. Gambar Dokumentasi dan Alat Penelitian ............................... 69

xvi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISTILAH

APS : Ammonium Per Sulfat ATP : Adenosin Trifosfat IPTG : Isopropyl-β-D-Thiogalaktopiranosidase IV : Inner volum HCV : Hepatitis C Virus LB : Media Luria - Bertani MOPS : 4-asam morfolinopropana sulfonat OD : Optical Density SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis TEMED : N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamin W : Washing

1

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Penyakit menular yang disebabkan oleh virus bukan suatu masalah

baru di Indonesia dan juga merupakan masalah global yang perlu ditangani

secara serius. Hepatitis C, misalnya, adalah salah satu penyakit menular

yang disebabkan oleh infeksi virus hepatitis C yang merupakan golongan

flavivirus. Virus hepatitis C ini merupakan penyakit penyebab kematian ke

sepuluh didunia. Sekitar 12.000 orang meninggal pada tahun 2010 akibat

infeksi virus hepatitis C di Amerika Serikat menurut US Centers for

Disease Control And Prevention (CDC, 2012). Sedangkan berdasarkan data

World Health Organization (2012), diperkirakan sekitar sepertiga dari

populasi dunia atau sekitar 2 miliar orang saat ini terinfeksi oleh salah satu

dari virus yang menyebabkan hepatitis, dengan angka kematian 350.000

orang per tahun dan 150 juta orang menderita penyakit virus hepatitis C.

Virus HCV ini dapat menyebar melalui penggunaan jarum suntik yang

berulang, transfusi darah, hubungan seksual, dan hemodialisis (Sy & Jamal,

2006). Hingga saat ini belum ada vaksin dan obat untuk mencegah dan

mengobati infeksi HCV. Terapi pengobatan saat ini untuk hepatitis C kronis

adalah pegylated interferon-α (IFN-α) dikombinasi dengan nukleosida

analog ribavirin. Akan tetapi terapi ini memiliki tingkat efektivitas sekitar

40% – 50% terhadap infeksi HCV. Kombinasi ini memiliki efek samping

seperti flu, anemia, dan depresi, yang sering menyebabkan penghentian

terapi. Dengan demikian, diperlukan penelitian untuk menemukan agen baru

dengan indeks terapi tinggi dan efek samping minimal untuk mengobati

infeksi HCV kronis (Lee et al, 2010, Ravikumar et al, 2011).

Upaya dalam rangka menemukan obat baru yang efektif dalam

pengobatan penyakit hepatitis C terus dilakukan dalam rangka menemukan

obat yang benar-benar efektif untuk menghambat kerja virus HCV ini dan

mengatasi masalah penyakit hepatitis C di Indonesia. Beberapa diantaranya

adalah penemuan senyawa-senyawa yang memiliki potensi sebagai inhibitor

2


terhadap enzim yang essensial dalam proses replikasi pada virus HCV

tersebut. Enzim-enzim essensial seperti enzim protease, RNA helikase, dan

polimerase menjadi target utama peneliti dalam memperoleh senyawa

inhibitor terhadap virus HCV ini.

Seperti pada enzim RNA helikase selain memiliki aktivitas RNA

helikase itu sendiri, juga memiliki aktivitas ikatan RNA (RNA binding) dan

ATPase (RNA-simulated ATPase), dan kedua aktivitas ini berpengaruh

terhadap aktivitas RNA helikase. Dengan adanya inhibitor yang

menghambat kerja RNA helikase, maka dapat menghambat proses replikasi

virus yang merupakan tahapan penting dalam proses pertumbuhan virus.

Oleh karena itu, enzim ini menjadi target yang potensial untuk penemuan

obat antivirus (Utama et al, 2005).

Dalam beberapa tahun terakhir ini konsep “back to nature” terus

menjadi pusat perhatian. Seperti pada penelitian yang telah dilakukan

sebelumnya oleh Syajarwati (2013) menemukan adanya aktivitas inhibisi

terhadap enzim RNA helikase virus hepatitis C dari ekstrak metanol kulit

buah manggis (Garcinia mangostana L.). Aktivitas ekstrak dalam beberapa

fraksi pelarut yang paling optimal dalam menginhibisi RNA helikase pada

virus HCV ini adalah pada fraksi ekstrak metanol sebesar 71,57% dengan

konsentrasi 3.125 ppm. Kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) telah

dilaporkan banyak memberikan aktivitas farmakologis seperti antimikroba,

antioksidan, antifungi, antitumor, antiinflamasi, antialergi, antimalaria dan

antiviral dan terus menaruh perhatian peneliti untuk melakukan isolasi

terhadap senyawa yang memberikan aktivitas (Chaverri et al, 2008).

Penelitian ini memberikan gambaran bahwa ekstrak kulit buah

manggis (Garcinia mangostana L.) mempunyai potensi sebagai kandidat

senyawa baru dalam menghambat kerja virus hepatitis C. Merujuk dari

penelitian tersebut maka peneliti bermaksud untuk melakukan uji aktivitas

inhibisi hasil fraksi-fraksi kolom kromatografi dari ekstrak kulit buah

manggis (Garcinia mangostana L.) terhadap enzim RNA helikase virus

hepatitis C.

3


1.2 Batasan dan Rumusan Masalah

1.2.1 Batasan penelitian

Batasan penelitian yang dilakukan meliputi uji aktivitas inhibisi pada

hasil fraksi-fraksi kolom kromatografi dari ekstrak metanol kulit buah

manggis (Garcinia mangostana L.) terhadap enzim RNA helikase virus

hepatitis C.

1.2.2 Rumusan masalah

Pemanfaatan bahan alam sebagai kandidat penemuan obat baru untuk

pengobatan penyakit hepatitis C masih terus diteliti sehingga diperoleh

suatu senyawa murni yang benar-benar efektif dalam menghambat enzim

RNA helikase virus hepatitis C. Untuk memperoleh suatu senyawa yang

murni dari senyawa kompleks yang terdapat pada ekstrak bahan alam cukup

sulit dan perlu dilakukan penelitian lebih lanjut. Yang menjadi

permasalahan dalam penelitian ini adalah : fraksi mana yang menghasilkan

aktivitas inhibisi tertinggi terhadap enzim RNA helikase virus hepatitis C

dari hasil kolom kromatografi ekstrak kulit buah manggis (Garcinia

mangostana L.)?

1.3 Tujuan Penelitian

Mengetahui aktivitas inhibisi hasil fraksi-fraksi kolom kromatografi

dari ekstrak metanol kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) terhadap

enzim RNA helikase virus hepatitis C.

1.4 Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan memiliki kontribusi dan manfaat

sebagai dasar upaya pemanfaatan bahan alam dalam pengobatan penyakit

hepatitis C.

4


BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Manggis (Garcinia mangostana L.)

2.1.1 Klasifikasi Tanaman

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta

Superdivision : Spermatophyta

Division : Magnoliophyta

Class : Magnoliopsida

Subclass : Dilleniidae

Order : Theales

Family : Clusiaceae

Genus : Garcinia L

Species : Garcinia mangostana L.

(United State Departement of Agriculture, 2012)

Gambar 2.1 Buah Manggis (Garcinia mangostana L.)

Sumber : dokumen pribadi

2.1.2 Deskripsi Tanaman

Garcinia mangostana Linn. adalah buah bersejarah yang dinamakan

sebagai “ratu buah” dan buah yang paling segar. Bagian yang dapat

dimakan berwarna putih, lembut dan manis, memberikan rasa yang sedikit

5


asam serta aroma yang menyenangkan. Tanaman ini terdistribusi di

Thailand, India, Srilanka, Myanmar, Indonesia, Malaysia, Philipina, dan

China (Yu et al, 2006). Tanaman ini berasal dari Indonesia. Dengan tinggi

pohon 7-8 m dengan dahan yang kuat dan besar, diketahui tumbuhan ini

ditanam di wilayah Asia tenggara dan kemudian di budidayakan di daerah-

daerah yang beriklim panas. Seringkali memerlukan iklim yang lembab

untuk pertumbuhannya. Daun-daunnya kasar. Pohonnya berwarna coklat

gelap, cukup keras dan padat. Warna kulit pohon bagian dalam kekuning-

kuningan. Tangkai daunnya pendek dan tebal. Diameter bunganya 5 cm,

dipisahkan menjadi 4 bagian. Bijinya lebar, gepeng dan melekat pada

buahnya yang putih dan kemerah-merahan (Anthony, 2002).

Batang manggis ini berkulit cokelat dan bergetah. Tanaman ini

berumah dua, bunga jantan dan betinanya dihasilkan oleh tanaman yang

berbeda. Akan tetapi, bunga jantannya tidak berfungsi sebab mengalami

rudimenter, yaitu mengecil dan mengering. Oleh karena itu, buah manggis

selalu dihasilkan dari bunga betina yang berwarna merah muda secara

apomiksis (tanpa proses penyerbukan). Bentuk daunnya merupakan daun

tunggal, duduk daun berhadapan atau bersilang berhadapan. Warnanya

mengkilat dipermukaan, permukaan atas hijau gelap permukaan bawah hijau

terang. Bentuk elips memanjang, 12-23 x 4,5-10 cm, tangkai 1,5-2 cm.

Bunga betina 1-3 di ujung batang, susunan menggarpu, garis tengah 5-6 cm.

Kelopak daun, dua daun kelopak yang terluar hijau kuning, dua yang

terdalam lebih kecil, bertepi merah, melengkung kuat, tumpul. Mahkota

terdiri dari 4 daun mahkota, bentuk telur terbalik, berdaging tebal, hijau

kuning, tepi merah atau hampir semua merah. Benang sari mandul biasanya

dalam kelompok (Astika, 2013).

2.1.3 Kandungan Senyawa

Telah dilaporkan bahwa kulit dari Garcinia mangostana L.

merupakan sumber dari senyawa mangostin, tannin, xanthon, isoflavon,

flavon, dan substansi bioaktif lainnya (Yu et al, 2006). Xanthon yang telah

diisolasi dari bagian pericarpium, buah, kulit kayu, dan daun buah manggis.

6


α-, β-, dan γ- mangostin, garcinon E, 8-deoxygartanin dan gartanin adalah

yang paling banyak diteliti (Chaverri et al, 2008). Secara fitokimia

pericarpium buah manggis kaya akan berbagai macam xanthon yang

teroksigenasi dan terprenilasi termasuk α- dan γ - mangostin, jenis xanthon

ini menunjukkan sifat-sifat biologis yang unik seperti antimikroba,

antifungi, antioksidan, antiinflamasi dan aktivitas sitotoksik (Watanapokasin

et al, 2009).

2.1.4 Khasiat Manggis (Garcinia mangostana L.)

Masyarakat di berbagai negara sering menggunakan manggis sebagai

pengobatan tradisional termasuk pengobatan nyeri perut, disentri, diare, luka

bernanah, infeksi luka, keputihan, bisul kronis dan gonorhoea (Yu et al,

2006). Buah manggis (Garcinia mangostana L.) yang merupakan famili

Clusiaceae telah digunakan di Asia Tenggara sebagai obat untuk infeksi

kulit, diare, bisul kronis, dan luka. Xanthon yang memiliki aktivitas seperti

antimikroba, antifungi, antioksidan, antiinflamasi, dan aktivitas sitotoksik

(Watanapokasin et al, 2009).

Akhir-akhir ini, beberapa produk yang diproduksi dari Garcinia

mangostana L. mulai digunakan sebagai suplemen diet alami di Amerika

Serikat, karena memiliki potensi sebagai antioksidan. Metabolit sekunder

utama dari manggis yang telah ditemukan adalah derivat xanthon yang

terprenilasi; beberapa golongan senyawa ini telah diisolasi dari tanaman dan

menunjukkan aktivitas antifungi, antimikroba, antioksidan, dan aktivitas

sitotoksik (Jung et al, 2006).

Dari beberapa spesies Garcinia dilaporkan memiliki aktivitas sebagai

inhibitor enzim protease HIV-1. Dan salah satunya adalah Garcinia

mangostana L. yang memiliki senyawa mangostin sebagai senyawa yang

signifikan menghambat enzim protease HIV-1 (Magadula et al, 2009).

Beberapa penelitian telah melakukan uji aktivitas anti kanker terhadap

xanthone yang diisolasi dari pericarpium buah manggis. Kemudian adanya

fakta tentang aktivitas antialergi dan antiinflamasi dari Garcinia

mangostana L. dengan menggunakan metode in vitro. Senyawa xanthon dan

7


ekstrak yang diperoleh dari Garcinia mangostana L. memiliki aktivitas

sebagai antibakteri, antifungi, antivirus serta antimalaria (Chaverri et al,

2006).

2.2 Ekstraksi

Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut

sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair.

Simplisia yang diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan

senyawa yang tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein dan lain-

lain. Senyawa aktif yang terdapat dalam berbagai simplisia dapat

digolongkan kedalam golongan minyak atsiri, alkaloid, flavonoid dan lain-

lain (Depkes, 2000).

Ekstraksi adalah pemisahan beberapa bagian dari senyawa aktif yang

berasal dari jaringan tumbuhan (dan hewan) dengan menggunakan pelarut

selektif berdasarkan prosedur standar. Produk-produk yang dihasilkan dari

tanaman meliputi senyawa metabolit kompleks, baik berupa cairan,

semisolid atau dalam bentuk serbuk kering yang dapat digunakan untuk

pemakaian oral maupun pemakaian luar (Tiwari et al, 2011).

2.3 Virus Hepatitis C

Virus hepatitis C adalah virus RNA yang memiliki untai nonsitopatik

positif dan menyebabkan hepatitis akut dan kronis serta karsinoma

hepatoseluler (Zhong et al, 2005). Virus hepatitis C termasuk anggota dalam

genus hepacivirus dan famili flaviviridae yang merupakan penyebab

penyakit hepatitis pada manusia di seluruh dunia (Baginski et al, 2000).

Virus famili flaviviridae ini memiliki ukuran kecil, berselubung (envelope),

partikel speris berdiameter 40-50 nm dengan untai tunggal, dan genom RNA

sense positif (Borowski et al 2008). Partikel virus hepatitis C terdiri atas inti

berupa RNA yang merupakan material genetik, kulit yang mengelilingi

material genetik yang terbentuk dari protein berbentuk ikosahedral, dan

terbungkus dalam selubung (envelope) asam lemak (Gambar 2.2 ). Dua

selubung (envelope) glikoprotein virus, E1 dan E2 tertanam di dalam

8


selubung lipid (Op de Beeck & Dubuisson, 2003). Target alami dari virus

hepatitis C adalah hepatosit dan limfosit B (Lauer & Walker, 2001). Virus

hepatitis C memiliki 3 reseptor yang telah diidentifikasi yaitu CD81

(Cormier et al, 2004), human scavenger class B1 (SR-BI) (Mailard et al,

2006), dan claudin-1 (Evans et al, 2001).

Replikasi virus bersifat kuat dan dapat diperkirakan lebih dari sepuluh

milyar partikel virion diproduksi perhari bahkan pada fase kronis dari

infeksi. Virus hepatitis C mengkode poliprotein tunggal yang terdiri atas

3011 asam amino dan memproses menjadi 10 protein struktural dan

regulator. Komponen struktural terdiri atas inti dan dua selubung protein.

Selain inti dari virus terdapat juga dua daerah dari protein envelope E2

didesain sebagai daerah hipervariabel 1 dan 2 yang memiliki laju yang

tinggi terhadap mutasi dan dipercaya sebagai hasil dari tekanan selektif oleh

antibodi spesifik terhadap virus (Lauer & Walker, 2001).

Virus hepatitis C juga mengkode gen helikase spesifik virus, protease,

dan polimerase. Protein-protein ini memiliki fungsi penting dalam siklus

hidup virus. Protein-protein ini dijadikan target yang menarik untuk terapi

antivirus.

Gambar 2.2 Virus Hepatitis C

Sumber: Moradpour et al, 2007.

9


2.4 RNA Helikase Virus Hepatitis C

Enzim helikase adalah enzim yang terlibat dalam hampir semua aspek

metabolisme DNA dan RNA. meskipun terdapat kemajuan terhadap

pengetahuan mekanisme aksi dari enzim-enzim ini, resolusi yang terbatas

menyebabkan mekanisme rinci seperti penataan ulang struktur asam nukleat

hingga pengikatan dan hidrolisis ATP yang dilakukan pasangan enzim

helikase ini tidak dapat diketahui (Dumont et al, 2006). Fungsi dasar enzim

helikase untuk membuka untai ganda DNA atau RNA melalui coupling

hidrolisis ATP dengan translokasi sepanjang satu untai DNA atau RNA

(Fan et al, 2008).

Seluruh helikase virus memiliki aktivitas NTP/ATPase. Aktivitas ini

tergantung pada adanya ATP dan kation divalen berupa Mg2+. Produk dari

hidrolisis NTP pada setiap pengkajian helikase adalah ADP dan Pi.

Aktivitas ATP dari helikase secara umum distimulasikan oleh keberadaan

asam nukleat untai tunggal. Hal ini memungkinkan enzim berikatan dengan

untai RNA dengan energi yang didapat dari hidrolisis ATP untuk

memisahkan ikatan hidrogen pasangan basa dari struktur dupleks (Kim et al,

1998).

Enzim helikase diperlukan untuk proses replikasi genom organisme

tersebut. Enzim helikase dapat dibagi menjadi DNA helikase dan RNA

helikase, sesuai dengan genom yang dimiliki organisme tersebut. HCV yang

merupakan virus RNA memiliki RNA helikase. Helikase bekerja secara

katalitik memisahkan untai ganda DNA atau RNA menggunakan energi

yang dihasilkan dari hidrolisis nukleosida trifosfat dan merupakan target

pencarian obat karena dibutuhkan dalam replikasi virus. (Utama et al,

2000).

10


Gambar 2.3 Mekanisme Kerja Enzim RNA Helikase

Sumber : Utama et al, 2000

Aktivitas ATP helikase secara umum distimulasikan oleh keberadaan

asam nukleat untai tunggal. Hal ini memungkinkan enzim berikatan dengan

untai RNA dengan energi yang dihasilkan dari hidrolisis ATP untuk

memisahkan ikatan hidrogen pasangan basa dari struktur dupleks (Utama et

al, 2000).

Ikatan asam nukleat dapat menginduksi konformasi protein yang

terkarakterisasi dengan pengembangan situs aktif dari domain ATPase dari

ATP. Aktivitas ATPase tidak dapat distimulasi pada kadar garam tinggi. Hal

ini disebabkan kondisi kekuatan ionik kuat asam nukleat tidak dapat terikat

dengan enzim dan enzim membentuk konformasi untuk pelepasan untaian.

Mekanisme kerja enzim RNA atau DNA helikase adalah pertama-tama

helikase akan mengikat untai RNA atau DNA untai ganda pada ujung 3’,

selanjutnya ATP akan berikatan pada suatu sisi aktif dari RNA atau DNA

helikase tersebut. Gugus ATP akan dihidrolisis oleh enzim RNA atau DNA

helikase menjadi ADP dan fosfat inorganik. Proses hidrolisis ini akan

terlepas energi yang kemudian digunakan oleh enzim RNA atau DNA

11


helikase untuk menguraikan untai ganda RNA atau DNA menjadi untai

tunggal RNA atau DNA (Utama et al, 2000).

Enzim helikase dapat menguraikan RNA atau DNA untai ganda

melalui pemutusan ikatan hidrogen yang mengikat kedua untai tersebut.

Reaksi ini berhubungan dengan hidrolisis ATP, di mana energi yang

dilepaskan selama hidrolisis ATP dibutuhkan dalam proses penguraian

RNA atau DNA (Shuman, 1992; Wagner et al, 1998).

Enzim helikase juga dapat berperan dalam fungsi selular lainnya

seperti membantu proses translasi, mengkoordinasi pembentukan

poliprotein, memutus interaksi RNA-protein, serta menyusun RNA di dalam

pembungkus viral (Lam & Frick, 2006). Enzim helikase juga memiliki

aktivitas ikatan RNA (RNA binding) dan ATPase (RNA-stimulated ATPase),

dan kedua aktivitas ini berpengaruh terhadap aktivitas RNA helikase. Enzim

ini menjadi target yang potensial untuk penemuan obat antivirus karena

penemuan inhibitor RNA helikase dapat dilakukan dengan penemuan

inhibitor terhadap aktivitas RNA binding atau ATPase (Utama et al, 2000).

Beberapa penelitian tentang mutasi dan penghambatan terhadap NS3

diperlukan untuk propagasi virus sehingga pengembangan inhibitor efektif

dari enzim helikase virus hepatitis C adalah bagian penting dalam strategi

antiviral. Pengembangan riset mengenai agen yang berperan sebagai

inhibitor RNA helikase terus ditegakkan, dalam rangka menemukan

kandidat obat untuk menangani infeksi virus hepatitis C. Berikut adalah

tabel riset beberapa agen yang berpotensi sebagai inhibitor RNA helikase

virus hepatitis C.

Tabel 2.1. Inhibitor RNA helikase HCV

No Inhibitor Persen

inhibisi

Pustaka

1 Protein kapang endofit CgKTm SF 89,45% Paturohman,

2011

2 Ekstrak metanol buah tanaman

mangrove Avicennia marina

76,705 % Kusumawati,

2011

12


(Forsk) Vierb.

3 Mikroalga BTM 11 81,205 % Putri, 2011a

4 Bakteriosin asam laktat S34 64,20 % Putri, 2011b.

5 Ekstrak rimpang temulawak

(Curcuma zanthorrhiza Roxb.)

73,60 % Setianingsih,

2011

6 Ekstrak metanol Kulit Buah

Manggis (Garcinia mangostana L.)

71,57 % Syajarwati,

2013

7 Ekstrak Biji Jinten Hitam (Nigella

sativa L.)

64,454 % A’yuni, 2013

2.5 SDS PAGE

Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) poliakrilamid gel elektroforesis

(PAGE) adalah metode pemisahan protein dalam sampel untuk dianalisa

dan ditentukan berat molekulnya. Protein-protein akan terdenaturasi dan

melepas monomernya karena pemanasan yang ditunjukkan dengan adanya

agen-agen pereduksi (2-merkaptoetanol atau ditiotheitol) dan surfaktan

bermuatan negatif (Sharma, 2009).

Elektroforesis gel Sodium Dodesil Silfat (SDS) poliakrilamid adalah

teknik yang sering digunakan dalam bidang biokimia, forensik, genetika,

dan biologi molekuler untuk memisahkan protein sesuai dengan mobilitas

elektroforesis (fungsi dari panjang rantai polipeptida atau molekul). Sampel

elektroforesis gel SDS dan sampel elektroforesis tersebut di pisahkan

berdasarkan ukuran berat molekul (Gam & Latiff, 2005).

Medan listrik yang digunakan menyebabkan protein bermuatan

negatif bermigrasi menuju anoda. Setiap protein akan bergerak melalui

matriks gel. Protein yang berbobot molekul kecil akan lebih mudah melalui

pori-pori pada gel, sedangkan protein yang berbobot molekul lebih besar

akan memiliki lebih banyak kesulitan untuk melewati pori-pori tersebut.

Setelah waktu yang telah ditentukan protein akan bermigrasi berdasarkan

ukuran; protein yang lebih kecil akan bermigrasi jauh di bawah gel,

13


sedangkan yang lebih besar akan tetap lebih dekat ke titik asal. Protein dapat

dipisahkan berdasarkan ukuran atau bobot molekul (Gam & Latiff, 2005).

Pewarna yang digunakan dalam teknik ini terdiri atas dua macam

yaitu Coomassie Brilliant Blue dan pewarna perak. Pewarna Coomassie

Brilliant Blue biasanya dapat mendeteksi sebuah band 50 ng protein.

Pewarnaan perak dapat meningkatkan sensitivitas pewarnaan biasanya 50

kali. Banyak variabel yang dapat mempengaruhi intensitas warna. Setiap

protein memiliki karakteristik pewarnaan sendiri (Jovanovic et al, 2007).

2.6 Kolorimetri ATPase

Uji kolorimetrik digunakan untuk menganalisis bahan yang umumnya

tidak berwarna, misalnya untuk mengukur konsentrasi protein dalam suatu

sampel yang tidak menyerap cahaya. Adapun pereaksi yang digunakan

adalah pereaksi yang bewarna seperti malakit hijau dan amonium molibdat.

Uji ATPase dilakukan dengan mengukur konsentrasi fosfat yang terurai dari

ATP menjadi ADP dan P, yang dihasilkan dari reaksi enzim ATPase.

Prinsip uji kolorimetrik adalah perubahan warna yang terjadi dari suatu zat

yang tidak bewarna dengan suatu pereaksi warna ( Utama et al, 2000).

2.7 Prinsip Kromatografi (Yazid, 2005)

Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas

perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantara dua fase,

yaitu fase diam (stationary) dan fase gerak (mobile). Fase diam dapat

berupa zat padat atau zat cair, sedangkan fase gerak dapat berupa zat cair

atau gas.

Dalam teknik kromatografi, sampel yang merupakan campuran dari

berbagai macam komponen ditempatkan dalam situasi dinamis dalam sistem

yang terdiri dari fase diam dan fase gerak. Semua pemisahan pada

kromatografi tergantung pada gerakan relatif dari masing-masing komponen

diantara kedua fase tersebut. Senyawa atau komponen yang tertahan

(terhambat) lebih lemah oleh fase diam akan bergerak lebih cepat daripada

14


komponen yang tertahan lebih kuat. Perbedaan gerakan (mobilitas) antara

komponen yang satu dengan lainnya disebabkan oleh perbedaan dalam

adsorpsi, partisi, kelarutan atau penguapan diantara kedua fase.

Jika perbedaan-perbedaan ini cukup besar, maka akan terjadi

pemisahan secara sempurna. Oleh karena itu dalam kromatografi, pemilihan

terhadap fase gerak maupun fase diam perlu dilakukan sedemikian rupa

sehingga semua komponen bisa bergerak dengan kecepatan yang berbeda-

beda agar dapat terjadi proses pemisahan.

2.8 Kolom Kromatografi (Gritter et al, 1991)

Kolom kromatografi merupakan cara yang paling lama dari

kromatografi yang ada. Fase diam, baik bahan penjerap atau film zat cair

pada penyangga, ditempatkan didalam tabung kaca berbentuk silinder, pada

bagian bawah tertutup dengan katup atau keran, dan fase gerak dibiarkan

mengalir ke bawah melaluinya karena gaya berat.

Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan

berupa pita pada bagian atas kolom penjerap yang berada dalam tabung

kaca, tabung logam, atau bahkan tabung plastik. Pelarut (fase gerak)

dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya

berat atau didorong dengan tekanan. Pita senyawa linarut bergerak melalui

kolom dengan laju yang berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi

yang keluar dari atas kolom.

Kolom kromatografi atau tabung untuk pengaliran biasanya terbuat

dari kaca yang dilengkapi keran jenis tertentu pada bagian bawahnya untuk

mengatur aliran pelarut.

15


BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan pada bulan Maret 2013 sampai bulan Agustus

2013. Pembuatan ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.)

dilakukan di laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia, dan laboratorium

Kimia Obat FKIK Jurusan Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Uji

aktivitas inhibisi enzim RNA helikase virus HCV dilakukan di

Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI

Cibinong, Bogor.

3.2 Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan untuk ekstraksi kulit buah manggis

(Garcinia mangostana L.) adalah pisau, kertas polos, maserator, batang

pengaduk, gelas ukur (Duran), kertas saring, kapas, lumpang alu, tabung

reaksi, corong buchner, cawan penguap, timbangan analitik, alat penggiling

simplisia, dan rotary evaporator (Eyela).

Alat-alat yang digunakan untuk ekspresi, pemurnian dan pengujian

aktivitas RNA helikase HCV adalah inkubator goyang (N-Biotek), vortex,

tabung sentrifus 50 ml dengan penutup (Falcon), tabung sentrifus 1,5 ml

(Eppendorf), erlenmeyer (Pyrex), 96-well microtiter plate (Polycarp), pipet

mikro (Gilson), neraca analitik (Acis), peralatan gelas, microplate reader

(Multiscan EX Thermo), vial, Laminar Air Flow (ESCO), lemari pendingin

(Sansio), sonikator (Labsonic), autoklaf tipe vertikal (mode TA-630),

sentrifus (HERMLE), hot plate magnetic stirer (Cimarec), SDS-PAGE

(ATTO).

Alat-alat yang digunakan untuk pemisahan tahap awal senyawa

inhibitor RNA helikase HCV adalah kolom kromatografi, erlenmeyer,

beaker gelas, lempeng KLT, chamber, vial, lampu UV.

Sampel yang digunakan adalah kulit buah manggis. Buah manggis

diperoleh dari daerah Kampung Cengal, Desa Karacak, Kec. Leuwiliang,

Kab. Bogor dan telah dideterminasi di Herbarium Bogoriense Litbang LIPI

Cibinong, Bogor.

16


Bahan-bahan yang digunakan untuk ekstraksi dan skrinning fitokimia

kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) adalah pelarut metanol

absolut 96%, aquadest, NaOH, dragendroff’s, mayer’s, asam hidroklorit,

ferri klorida, asam sulfat, dan kloroform.

Bahan-bahan yang digunakan untuk ekspresi, pemurnian, dan

pengujian inhibisi RNA helikase HCV adalah bakteri Escerichia coli BL21

(DE3) pLysS yang membawa gen NS3 RNA helikase HCV dalam plasmid

21b (koleksi Andi Utama, Puslit Bioteknologi LIPI), media Luria Bertani

(LB), aquades, ampisilin, IPTG (isopropil β-D-thiogalaktopiranoside), dapar

B (10 mM Tris HCl pH 8.5, 100 mM NaCl, dan 0,25% Tween 20), resin

Talon, dan dapar elusi (400 mM imidazole dalam buffer B), 0.1 mM ATP

(Adenosin trifosfat), 0.1 mM MOPS (asam 4-morfolinopropana sulfonat), 1

mM MgCl2, larutan hijau malakit, 2.3 % polivinil alkohol, amonium

molibdat, natrium sitrat, sukrosa, TEMED, akrilamid, amonium persulfat,

coomassie brilliant blue, dan marker protein 250 kDa untuk analisis bobot

molekul RNA helikase.

Bahan-bahan yang digunakan untuk pemisahan tahap awal senyawa

inhibitor RNA helikase HCV adalah ekstrak kental kulit buah manggis

(Garcinia mangostana L.), silika gel, kloroform, methanol, kapas,

alumunium foil, dan kertas saring.

3.3 Metode Penelitian

3.3.1 Pengambilan Sampel

Sampel buah manggis sebanyak 5 kg diperoleh dari kampung cengal,

desa karacak, kecamatan Leuwiliang, kabupaten Bogor pada bulan Februari.

Bagian yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit buah (pericarp)

manggis.

3.3.2 Determinasi Sampel

Determinasi buah manggis (Garcinia mangostana L.) dilakukan di

Herbarium Bogoriense Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, LIPI

Cibinong.

17


3.3.3 Persiapan Simplisia

Kulit buah manggis sebanyak 2,5 kg yang telah dipisahkan dari

daging buahnya dibersihkan dari kotoran dengan menggunakan air mengalir

(sortasi basah), kemudian dirajang dengan menggunakan pisau menjadi

ukuran yang lebih kecil ± 3 cm. Rajangan kulit buah manggis ini kemudian

dikeringkan dengan cara diangin-anginkan (pemanasan tidak langsung).

Kulit buah manggis kering kemudian digiling dengan menggunakan alat

penggiling dan diayak dengan ayakan 40 mesh sehingga didapat serbuk

kulit buah manggis kering sebanyak 800 g.

3.3.4 Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.)

Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 300 g dimasukkan kedalam

maserator kemudian dimaserasi dengan menggunakan pelarut metanol 96%

sebanyak 900 ml. Proses maserasi didiamkan selama 24 jam, sambil

sesekali dilakukan pengadukan. Setelah 24 jam maserat ditampung didalam

erlenmeyer dengan cara disaring menggunakan corong buchner dan kertas

saring. Kemudian ampas dimasukkan ke dalam maserator, untuk dimaserasi

kembali. Proses maserasi ini dilakukan selama 3 x 24 jam. Seluruh hasil

penampungan pelarut dicampur untuk kemudian dilakukan proses

pemekatan ekstrak dengan menggunakan rotary evaporator suhu 45⁰C. Dan

selanjutnya diperoleh ekstrak kental kulit buah manggis (Garcinia

mangostana L.) sebanyak 70,2984 g.

3.3.5 Rendemen Total Ekstrak Metanol Kulit Buah Manggis (Garcinia

mangostana L.)

Rendemen ektrak kulit buah manggis total dihitung dengan

membandingkan berat awal serbuk simplisia dengan berat akhir ekstrak

kulit buah manggis total yang diperoleh.

% Rendemen =

18


3.3.6 Penapisan Fitokimia

Penapisan fitokimia ini dilakukan untuk melihat kandungan golongan

senyawa yang terdapat didalam ekstrak kulit buah manggis (Garcinia

mangostana L.).

a. Alkaloid

Ekstrak dilarutkan dalam pelarut asam hidroklorit dan kemudian

disaring. Dilakukan uji pada beberapa pereaksi.

1. Test Mayer’s: filtrat ditambahkan dengan pereaksi Mayer’s

(kalium merkuri iodida). Maka akan terbentuk endapan berwarna

kuning yang menunjukkan adanya senyawa alkaloid.

2. Test Dragendroff’s: filtrat ditambahkan pereaksi dragendroff’s

(larutan potassium iodida). Maka akan membentuk endapan merah

yang menunjukkan adanya senyawa alkaloid (Tiwari, P et al,

2011).

b. Saponin

Test busa: 0,5 mg ekstrak dikocok dalam 2 ml aquades. Jika terbentuk

busa yang cukup lama ± 10 menit menunjukkan adanya senyawa

saponin (Tiwari, P et al, 2011).

c. Fenol

Test ferric chlorida: ekstrak ditambahkan 3-4 tetes larutan ferri

klorida. Terbentuk warna hitam kebiru-biruan menunjukkan adanya

senyawa fenol (Tiwari, P et al, 2011).

d. Tannin

Ekstrak sebanyak 0,5 gram dididihkan dalam 10 ml aquadest dalam

tabung reaksi, lalu disaring. Kemudian kedalam filtrat ditambahkan

beberapa tetes ferri klorida 0,1 %. Terbentuk warna hijau kecoklatan

atau biru kehitaman menunjukkan keberadaan tannin (Ayoola, G.A. et

al., 2008).

e. Flavonoid

Larutan ammonia sebanyak 5 ml ditambahkan kedalam filtrat air dari

ekstrak, lalu ditambahkan 1 ml asam sulfat. Terbentuk warna kuning

menunjukkan adanya flavonoid (Ayoola, G.A. et al, 2008).

19


f. Terpenoid (Uji Salkowski)

Sebanyak 0,5 gram ekstrak ditambahkan 2 ml kloroform, kemudian

ditambahkan 3 ml asam sulfat (H2SO4) untuk membentuk lapisan.

Adanya warna merah kecoklatan diantara lapisan menunjukkan

adanya senyawa terpenoid (Ayoola, G.A. et al, 2008).

3.3.7 Parameter dan Metode Uji Ekstrak

3.3.7.1 Parameter Non Spesifik

a. Susut Pengeringan

Ekstrak ditimbang sebanyak 1,673 g dan dimasukkan kedalam botol

timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu

105⁰C selama 30 menit dan ditara. Sebelum ditimbang ekstrak diratakan

dalam botol timbang, dengan cara menggoyangkan botol, hingga

membentuk lapisan setebal lebih kurang 5 mm sampai 10 mm. Jika berupa

ekstrak kental diratakan dengan batang pengaduk. Kemudian dimasukkan

kedalam ruang pengering, buka tutupnya, keringkan pada suhu 105⁰C

hingga bobot tetap. Sebelum setiap pengeringan, biarkan botol dalam

keadaan tertutup mendingin dalam eksikator hingga suhu kamar (Depkes,

2000).

b. Kadar Abu

Untuk penentuan kadar abu, ekstrak sebanyak 1,008 g dipanaskan

pada temperatur 625⁰C di mana senyawa organik dan turunannya

terdestruksi dan menguap sehingga hanya tersisa unsur mineral dan

anorganik. Tujuannya adalah untuk memberikan gambaran tentang

kandungan mineral internal dan eksternal yang berasal dari proses awal

sampai terbentuknya ekstrak. Nilai untuk kadar abu sesuai dengan yang

tertera dalam monografi (Depkes RI, 2000).

3.3.7.2 Parameter Spesifik

a. Parameter Identitas Ekstrak

Memberikan identitas obyektif dari nama dan spesifik dari senyawa

identitas. Meliputi :

20


I. Deskripsi tata nama :

1. Nama Ekstrak (generik, dagang, paten)

2. Nama lain tumbuhan (sistematika botani)

3. Bagian tumbuhan yang digunakan

4. Nama indonesia tumbuhan

II . Ekstrak dapat mempunyai senyawa identitas, artinya senyawa tertentu

yang menjadi petunjuk spesifik dengan metode tertentu (Depkes, 2000).

b. Parameter Organoleptik Ekstrak

1. Bentuk : padat, serbuk-kering, kental, cair.

2. Warna : kuning, coklat, dll.

3. Bau : aromatik, tidak berbau, dll.

4. Rasa : pahit, manis, kelat, dll.

3.3.8 Produksi Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C (Utama et al, 2000)

Produksi enzim RNA helikase virus hepatitis C dilakukan berdasarkan

metode Utama et al, (2000). Sebelum melakukan ekspresi dilakukan

pembuatan media LB (Luria Bertani) cair untuk Escherichia coli BL21

(DE3)pLysS. Media LB dibuat sebanyak 10 ml untuk prekultur dan 400 ml

untuk kultur. Pembuatan media LB 410 ml dengan cara mencampurkan

tryptone 4.1 g, NaCl 4.1 g, yeast ekstrak 2.05 g dalam 410 ml aquades.

Kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121⁰C selama 15

menit.

Langkah pertama ekspresi dan purifikasi RNA helikase virus hepatitis

C adalah prekultur, media LB 10 ml diberi ampisilin 10 µl/ml dan

dimasukkan bakteri E.coli BL21 (DE3) pLysS yang membawa gen RNA

helikase dihomogenkan dan diinkubasi dengan inkubasi goyang suhu 37⁰C

dengan kecepatan 150 rpm dibiarkan selama satu malam.

Langkah kedua adalah kultur, hasil prekultur diinolukasikan kedalam

media LB 400 ml yang telah diberi ampisilin 410 µl Dan diinkubasi dengan

inkubator goyang suhu 37⁰C, 150 rpm selama satu jam. Kemudian

ditambahkan IPTG (isopropil β-D-tiogalaktopiranoside) 0,3 mM 205 µl.

21


Dan diinkubasi kembali dengan inkubator goyang selama 3 jam pada suhu

37⁰C 150 rpm.

Selanjutnya hasil kultur dipindahkan dalam tube 50 ml vortex terlebih

dahulu kemudian di sentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit.

Endapan dicuci dengan media LB dan disentrifus kembali dengan kecepatan

5000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan diperoleh pelet simpan

pada suhu -20⁰C selama satu malam.

Proses selanjutnya adalah purifikasi, pelet yang diperoleh dilakukan

freeze thawing atau pengeringbekuan sebanyak tiga kali. Setelah itu

dilakukan sonikasi (pemecahan sel dengan menggunakan sonikator)

amplitudo 40 cycle 0,5 selama 15 detik, dilakukan tiga kali dengan interval

1 menit. Selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 7000 rpm selama 20

menit. Supernatan dipindahkan dalam tube 50 ml dan pelet disimpan pada

suhu -20⁰C. Sedangkan supernatan ditambahkan resin TALON 200 µl

kemudian diletakkan pada rotary cold room selama 3 jam. Supernatan

disentrifus selama 7 menit kecepatan 3500 rpm.

Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 10 ml dapar B diaduk secara

perlahan dan disentrifus kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3500

rpm. Supernatan dibuang kembali, pelet ditambahkan 10 ml dapar B dan

disentrifus kembali selama 3 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan

dibuang kembali, pelet diaduk perlahan dipindahkan dalam tube 1,5 ml,

kemudian ditambahkan 100 µl dapar elusi dan diletakkan pada rotary cold

room selama satu malam. Kemudian disentrifus kembali selama 1 menit,

3500 rpm. Endapan dicuci dengan 100 µl larutan dapar elusi dan diletakkan

pada rotary cold room selama satu jam. Kemudian disentrifus kembali

selama 1 menit, 3500 rpm. Setelah itu larutan (enzim) dan resin dipisahkan

dan disimpan pada suhu 4⁰C.

3.3.9 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE

Semua alat disiapkan, plat kaca yang digunakan terdiri atas short plate

dan spacer plate dibersihkan terlebih dahulu dengan alkohol 70%. Short

plate ditempatkan pada bagian depan kaca spacer yang sebelumnya diberi

casting frame pada bagian tengah dan dikunci dengan menggunakan

22


casting stand. Selanjutnya dibuat larutan separating gel 8% (lampiran 8a).

Larutan tersebut dimasukkan diantara celah short plate dan spacer plate

sampai terisi dua pertiga bagian, kemudian sepertiganya diisi dengan

aquades hingga penuh. Ditunggu hingga terbentuk gel selama ± 30 menit.

Setelah terbentuk gel dibuat larutan gel stacking 8% (lampiran 8b).

Aquades pada separating dibuang dan dimasukkan larutan stacking pada

sepertiga bagian celah. Dan dipasangkan comb, tunggu hingga terbentuk gel

selama ± 30 menit. Gel dipindahkan dari casting frame, gel cassette

sandwich ditempatkan pada electrode assembly dengan posisi short plate

menghadap kedalam, lalu ditempatkan ke dalam clamping frame, dan

ditutup kedua camp levers pada clamping frame. Lower inner chamber

dimasukkan ke dalam tank elektroforesis lalu diisi dengan larutan dapar

elektroforesis SDS 1x pH 8,3.

Sampel yang diperoleh pada produksi RNA helikase HCV ditampung

dalam tube 1,5 ml meliputi pelet, supernatan, inner volum, washing, elusi

enzim dan resin. Masing-masing sampel yang diambil 20 µl dan

ditambahkan 10 µl loading dye (lampiran 8c) kemudian dilakukan

denaturasi yaitu dipanaskan didalam waterbath pada suhu 90⁰C selama 15

menit.

Masing-masing sampel tersebut dimasukkan kedalam well sebanyak

15 µl. Marker protein (BIORAD®) sebanyak 4 µl/gel dimasukan ke dalam

well. Kemudian gel di elektroforesis pada 40 mA selama 90 menit.

Kemudian gel diangkat dan direndam dalam larutan staining comassie blue

G-250 (lampiran 8d) selama 1 jam sambil digoyang diatas rocker.

Kemudian gel dibilas dengan larutan Commassie Blue G-250 Destaining

(lampiran 8e) ± 30 menit, dan dibilas dengan aquades hingga bau asam

hilang, diletakkan didalam kertas mika kemudian di scan.

3.3.10 Uji Aktivitas Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C (Utama et al,

2000)

Uji aktivitas enzim helikase berdasarkan metode ATPase kolorimetri.

Langkah pertama dibuat pengenceran enzim 5x, 10x, 20x, 40x, dan 80x,

23


Pengenceran yang dilakukan menggunakan MOPS 10 mM. Kemudian

pembuatan larutan master mix yang terdiri dari ddH2O, MOPS 0.1 M,

MgCl2 0.1 mM, dan ATP 0.1 mM. Selanjutnya dilakukan pengujian dengan

cara mengisi tiap microtiter plate 96-well dengan 5 µl pengenceran enzim

dan 45 µl master mix. Untuk blanko, diisi 5 µl aquades dan 45 µl master

mix. Semua pengujian dilakukan secara triplo.

Campuran reaksi tersebut diinkubasi selama 45 menit pada suhu

ruang. Setelah pada menit ke-35 dibuat larutan pewarna yang terdiri dari

0.081 % malakit hijau, H2O, 5.7 % amonium molibdat dalam HCl 6 M dan

2.3 % polivinil alkohol dengan perbandingan (2:2:1:1). Setelah masa

inkubasi selesai larutan pewarna dimasukkan dalam tiap well sebanyak 100

µl, dan kemudian dilakukan inkubasi selama 5 menit pada suhu ruang.

Setelah masa inkubasi selesai ditambahkan 25 µl Na sitrat untuk

menghentikan reaksi pewarnaan. Selanjutnya hasil reaksi diukur dengan

menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 405 nm dan 620

nm.

3.3.11 Pemisahan Senyawa Inhibitor dengan Kolom Kromatografi

Pemisahan tahap awal ekstrak kental kulit buah manggis (Garcinia

mangostana L.) menggunakan kolom kromatografi dengan diameter 2,54

cm dan panjang kolom 65 cm. Kolom kromatografi yang telah dibersihkan,

disiapkan dengan memberi kapas pada ujung kolom untuk menahan silika

gel agar tidak keluar, dipasang tegak lurus pada statif. Selanjutnya silika gel

ditimbang sebanyak 100 g, dilarutkan dengan pelarut organik nonpolar

(kloroform) hingga diperoleh silika dengan konsentrasi seperti bubur,

diaduk hingga terbentuk suspensi.

Bubur silika dimasukkan kedalam kolom sambil diketuk-ketuk agar

silika memadat didalam kolom serta dialiri pelarut kloroform didalam

kolom, pelarut ditampung dan dimasukkan kembali. Dilakukan secara

berulang-ulang sehingga silika gel menjadi padat didalam kolom. Ekstrak

metanol kulit buah manggis sebanyak 4 g dilarutkan dengan pelarut metanol

24


sebanyak 4 ml. Selanjutnya dimasukkan secara hati-hati kedalam kolom

pada bagian atas dengan cara dialirkan melalui dinding kolom.

Pemisahan ekstrak metanol kulit buah manggis dengan menggunakan

pelarut gradien kloroform-metanol dengan perbandingan (9:1, 8:2, 7:3, 6:4,

5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9). Sebanyak 4 ml eluat ditampung didalam masing-

masing vial. Masing-masing fraksi diuapkan dari eluennya untuk kemudian

diuji aktivitas inhibisi RNA helikase virus hepatitis C dengan menggunakan

uji ATPase kolorimetri (Mustopa et al, 2012).

3.3.12 Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap RNA

Helikase HCV (Utama et al, 2000)

Uji aktivitas inhibisi ekstrak kulit buah manggis (Garcinia

mangostana L.) terhadap enzim RNA Helikase virus HCV dilakukan

berdasarkan metode ATPase kolorimetri. Fraksi-fraksi yang diperoleh dari

hasil pemisahan dengan kolom kromatografi yang telah diuapkan, dibuat

dalam larutan stok ditimbang sebanyak 0,025 g dilarutkan dengan metanol

sebanyak 1 ml. Untuk uji aktivitas diambil sebanyak 5 µl dan dilarutkan

dengan larutan master mix sebanyak 45 µl sehingga konsentrasi sampel

yang diuji sebesar 2.500 ppm.

Pada pengukuran absorbansi enzim RNA Helikase dilakukan dengan

menambahkan 5 µl ekstrak kulit buah manggis hasil pemisahan pada setiap

well dan 45 µl campuran larutan master mix dan pengenceran enzim. Untuk

blanko dimasukkan 5 µl aquades dan 45 µl larutan master mix. Untuk

kontrol positif berupa campuran larutan master mix dan pengenceran enzim

50 µl, sedangkan kontrol negatif berupa campuran 5 µl metanol dan 45 µl

campuran master mix dan pengenceran enzim. Semua pengujian dilakukan

secara triplo.

Campuran reaksi tersebut diinkubasi selama 45 menit pada suhu

ruang. Setelah pada menit ke-35 dibuat larutan pewarna yang terdiri dari

0.081 % malakit hijau, H2O, 5.7 % amonium molibdat dalam HCl 6 M dan

2.3 % polivinil alkohol dengan perbandingan 2:2:1:1. Setelah masa inkubasi

selesai larutan pewarna dimasukkan dalam tiap well sebanyak 100 µl, dan

25


kemudian dilakukan inkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Setelah masa

inkubasi selesai ditambahkan 25 µl Na sitrat untuk menghentikan reaksi

pewarnaan. Selanjutnya hasil reaksi diukur absorbansinya menggunakan

microplate reader pada panjang gelombang 405 nm dan 620 nm.

Nilai absorbansi yang diperoleh digunakan untuk menghitung

persentase penghambatan ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana

L.) terhadap RNA Helikase HCV. Perhitungan persen penghambatan

sampel ekstrak kulit buah manggis terhadap RNA helikase berdasarkan

perhitungan :

% inhibisi =

Di mana :

A = serapan enzim RNA helikase tanpa adanya senyawa inhibitor.

I = serapan enzim RNA helikase dengan adanya senyawa inhibitor.

3.3.13 Visualisasi Hasil Fraksi Kolom Kromatografi dengan Menggunakan

Kromatografi Lapis Tipis

Fraksi hasil pemisahan kolom kromatografi dilihat pola

kromatogramnya dengan menggunakan kromatografi lapis tipis fase diam

silika gel GF254. Eluen yang digunakan adalah kloroform 100 %

dimasukkan kedalam chamber, masing-masing fraksi dototolkan pada plat

silika kemudian di elusi pada eluennya. Hasil pemisahan dengan KLT

dilihat dbawah UV pada panjang gelombang 254 nm.

3.3.14 Perhitungan Aktivitas RNA Helikase Virus Hepatitis C

Fraksi dari hasil kolom kromatografi yang memberikan aktivitas

inhibisi terhadap RNA helikase virus hepatitis C selanjutnya dihitung

aktivitas RNA helikase dengan menentukan kadar fosfat yang dilepaskan.

Fosfat bebas yang dilepaskan berasal dari hasil reaksi antara enzim RNA

helikase dan ATP (Utama et al, 2000). Kadar fosfat yang dilepaskan

berbanding lurus dengan aktivitas enzim RNA helikase, namun berbanding

terbalik dengan aktivitas penghambatan senyawa inhibitor enzim RNA

helikase.

26


Perhitungan kadar fosfat dilakukan dengan menggunakan kurva

kalibrasi dari K2HPO4. Di mana K2HPO4 dibuat dalam larutan dengan

konsentrasi 0,1 mM, 0,2 mM, 0,4 mM, 0,6 mM, 0,8 mM dan 1 mM

(Lampiran 16). Hasil pembacaan absorbansi selisih panjang gelombang 620

nm dan 450 nm dengan menggunakan microplate reader, dimasukkan

kedalam persamaan kurva kalibrasi K2HPO4.

27


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Determinasi sampel

Sampel buah manggis yang diperoleh dari kampung cengal, desa

karacak, kecamatan leuwiliang, kabupaten Bogor dideterminasi di

Herbarium Bogoriense Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, LIPI

Cibinong. Hasil determinasi menyatakan bahwa sampel merupakan jenis

Garcinia mangostana L. suku Clusiaceae (Lampiran 1).

4.2 Rendemen Ekstrak

Metode ekstraksi yang dilakukan adalah dengan cara maserasi.

Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan

pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur

ruang (Depkes, 2000). Ekstraksi dengan cara maserasi ini biasanya

digunakan untuk senyawa-senyawa yang tidak tahan pemanasan (Tiwari, P

et al, 2011).

Maserasi yang dilakukan terhadap kulit buah manggis menggunakan

pelarut metanol 96%. Hal ini bertujuan untuk menarik senyawa-senyawa

polar yang terkandung dalam simplisia kulit buah manggis (Garcinia

mangostana L.). Merujuk dari penelitian sebelumnya yang telah dilakukan

oleh Syajarwati (2013) bahwa aktivitas inhibisi tertinggi terhadap enzim

RNA helikase HCV dari ekstrak kulit buah manggis pada ekstrak metanol

dengan aktivitas penghambatan tertinggi sebesar 71,57 %.

Dari hasil maserasi diperoleh rendemen ekstrak sebesar 23,4348%.

Nilai tersebut menyatakan bahwa ekstrak yang diperoleh cukup banyak, hal

ini disebabkan karena pelarut metanol adalah pelarut universal yang mampu

menarik banyak senyawa polar (Tiwari, 2011). Prinsip pelarutan yang

dipakai pada metode ini adalah like dissolve like, di mana senyawa yang

bersifat polar akan terlarut dalam pelarut polar dan senyawa yang bersifat

kurang polar akan terlarut dalam pelarut kurang polar (Mutaqin et al, 2013).

28


4.3 Penapisan Fitokimia

Penapisan fitokimia yang lakukan terhadap ekstrak kulit buah manggis

(Garcinia mangostana L.) bertujuan untuk mengetahui kandungan metabolit

sekunder yang terdapat didalam ekstrak kulit buah manggis pada pelarut

metanol. Pada kulit buah manggis kaya akan metabolit sekunder seperti

tannin, terpenoid, alkaloid dan flavonoid yang dilaporkan memiliki aktivitas

antibakteri (Geetha R.V et al, 2011). Skrining fitokimia pada simplisia kulit

buah manggis dan ekstrak etanol kulit buah manggis mengandung senyawa

kimia golongan alkaloid, flavonoid, glikosida, saponin, tanin dan

steroid/triterpenoid (Pasaribu et al, 2012)

Tabel 4.1 Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak Kulit Buah Manggis

Ekstrak Metanol Keterangan

Alkaloid +

Flavonoid +

Saponin +

Tannin +

Fenol +

Terpenoid +

Dari identifikasi senyawa alkaloid ekstrak metanol kulit buah manggis

memberikan hasil yang positif hal ini dikarenakan adanya endapan merah

bata pada ekstrak dengan penambahan pereaksi Dragendorff, begitu pula

dengan penambahan pereaksi Mayer menghasilkan endapan kuning.

Alkaloid merupakan bahan alam heterosiklik yang mengandung nitrogen.

Sebagai suatu golongan, alkaloid menunjukkan aktivitas biologis yang

sangat luas dan juga tersebar luas, yang terdapat di tanaman, fungi, bakteri,

amfibi, serangga, hewan laut dan manusia (Heinrich, 2009).

Pada identifikasi senyawa flavonoid memberikan hasil yang positif

ditandai dengan terbentuknya warna kuning pada ekstrak dengan

penambahan larutan ammonia dan asam sulfat. Flavonoid merupakan

golongan senyawa terbesar dari senyawa fenol, flavonoid umumnya terdapat

dalam tumbuhan, terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon flavonoid

29


yang mana pun mungkin saja terdapat dalam satu tumbuhan dalam beberapa

bentuk kombinasi glikosida (Harborne, 1987).

Senyawa glikosida triterpen tersebar luas dalam tanaman dan kadang

disebut saponin karena sifatnya mirip sabun dan mudah membentuk busa

(Heinrich, 2009). Saponin merupakan senyawa yang bersifat seperti sabun,

serta dapat dideteksi berdasarkan kemampuannya membentuk busa dan

menghemolisis sel darah (Harborne, 1987). Pada identifikasi senyawa

saponin memberikan hasil yang positif ditandai dengan terbentuknya busa

yang stabil setelah dikocok selama ± 10 menit dengan penambahan aquades.

Pembentukan busa yang mantap sewaktu mengekstraksi tumbuhan atau

waktu memekatkan ekstrak tumbuhan merupakan bukti terpercaya akan

adanya saponin (Harborne, 1987).

Pada identifikasi senyawa tanin memberikan hasil yang positif

ditandai dengan terbentuknya warna biru kehitaman dengan penambahan

ferri klorida pada ekstrak yang dilarutkan dengan aquades. Senyawa tanin

adalah golongan bahan alam yang memberikan rasa kesat dan pahit dalam

tanaman dan makanan. Golongan ini terdiri atas senyawa polifenol larut air

yang dapat memiliki bobot molekul tinggi. Sifat utama tanin adalah

kemampuannya berikatan dengan protein (Heinrich, 2009).

Selanjutnya identifikasi senyawa fenol memberikan hasil yang positif

ditandai dengan terbentuknya warna hitam kebiru-biruan pada ekstrak

dengan penambahan ferri klorida. Senyawa fenol yaitu cincin aromatik yang

mengandung satu atau dua penyulih hidroksil. Senyawa fenol cenderung

mudah larut dalam air karena umumnya mereka sering kali berikatan dengan

gula sebagai glikosida. Cara klasik untuk mendeteksi senyawa fenol

sederhana ialah dengan menambahkan larutan besi (III) klorida 1% dalam

air atau etanol kepada larutan cuplikan, yang menimbulkan warna hijau,

merah, ungu, biru atau hitam yang kuat (Harborne, 1987).

Senyawa terpen tersebar luas di alam dan terdapat dalam banyak

spesies, termasuk pada manusia. Senyawa ini kadang-kadang disebut

isoprena karena motif berulang yang banyak dijumpai dalam strukturnya

(unit C5 berulang bercabang, rangka isopentana) mirip dengan isoprena

30


(Heinrich, 2009). Pada identifikasi senyawa terpenoid memberikan hasil

yang positif ditandai dengan adanya warna merah kecoklatan diantara

lapisan kloroform dan asam sulfat yang ditambahkan kedalam ekstrak.

4.4 Parameter dan Metode Uji Ekstrak

Parameter dan metode uji ekstrak yang dilakukan terhadap ekstrak

kulit buah manggis dapat dilihat dari tabel 4.2.

Tabel 4.2 Parameter dan Metode Uji Ekstrak

Parameter Uji Ekstrak Ekstrak Metanol Menurut Literatur

Parameter Non spesifik :

a. Susut pengeringan

b. Kadar abu

Parameter Spesifik :

a. Parameter Identitas Ekstrak

- Nama lain Tumbuhan

- Bagian yang digunakan

- Nama Indonesia

tumbuhan

b. Organoleptik

- Bentuk

- Warna

18,41 %

1,388 %

Mangi, manggi,

manggus, manggista

Kulit Buah (pericarp)

Manggis

Ekstrak kental

Coklat

< 4 % (MMI

jilid V, 1989)

Parameter uji ekstrak meliputi dua aspek: 1) aspek parameter spesifik

yang berfokus pada senyawa atau golongan senyawa yang bertanggung

jawab terhadap aktivitas farmakologis. 2) aspek parameter non spesifik yang

berfokus pada aspek kimia, mikrobiologi dan fisis yang akan mempengaruhi

keamanan konsumen dan stabilitas misal kadar logam, aflatoksin, kadar air,

dan lain-lain (Saifudin, 2011).

Pada pengujian kadar abu dimaksudkan untuk menentukan

karakteristik sisa kadar abu nonorganik setelah pengabuan. Pada prinsipnya

dengan memanaskan ekstrak pada temperatur di mana senyawa organik dan

31


turunannya terdestruksi dan menguap, sehingga hanya ada sisa kadar abu

nonorganik. Nilai kadar abu yang diperoleh adalah 1,388 %, persyaratan

batas kadar abu untuk ekstrak buah manggis pada buku Materia Medika jilid

V adalah tidak lebih dari 4 %. Hal ini menandakan bahwa ekstrak

memenuhi persyaratan kadar abu yang dianjurkan.

Pada uji parameter susut pengeringan untuk memberikan batasan

maksimal (rentang) tentang besarnya senyawa yang hilang pada proses

pengeringan. Nilai susut pengeringan yang diperoleh adalah 18,41 %. Hal

ini menandakan tingginya kadar senyawa yang hilang selama proses

pengeringan baik berupa air, sisa pelarut dan senyawa yang mudah menguap

lainnya.

4.5 Produksi Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

Pada penelitian ini produksi enzim RNA helikase dilakukan untuk

mendapatkan enzim RNA helikase virus hepatitis C yang dihasilkan oleh

bakteri Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. Dan kemudian akan digunakan

untuk menguji aktivitas inhibisi ekstrak kulit buah manggis terhadap enzim

RNA helikase virus hepatitis C.

Ekspresi RNA helikase virus hepatitis C dimulai dengan tahapan pre

kultur yang dilakukan dalam media cair Luria Bertani (LB) yang merupakan

media kompleks yang terdiri dari tripton, ekstrak khamir, dan natrium

klorida dan merupakan media yang cocok untuk pertumbuhan bakteri.

Ampisilin yang ditambahkan pada media LB berfungsi sebagai penghambat

bagi pertumbuhan bakteri lain sehingga hanya bakteri Escherichia coli yang

membawa gen RNA helikase virus hepatitis C yang dapat tumbuh pada

media tersebut.

Prekultur diinkubasi dalam inkubator goyang pada suhu 37⁰C dengan

kecepatan 150 rpm selama semalam, kondisi ini merupakan kondisi

optimum untuk pertumbuhan bakteri (Pelzar & Chan, 1986). Selanjutnya

hasil prekultur dipindahkan ke medium LB 400 ml yang sebelumnya telah

ditambahkan ampisilin dan diinkubasi kembali pada suhu 37⁰C dengan

kecepatan 150 rpm hingga diperoleh nilai OD600 (Optical Density) mencapai

32


0,3 atau pada saat bakteri mencapai fase logaritmik, karena fase ini

merupakan fase awal di mana bakteri Escherichia coli tumbuh. Kultur

ditambahkan IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalaktopiranosidase) yang

bertujuan untuk menginduksi gen RNA helikase virus hepatitis C agar

terjadi ekspresi berlebih. Sehingga dihasilkan jumlah enzim RNA helikase

yang lebih besar hingga fase awal stasioner di mana nilai OD600 mencapai 1

(Utama et al, 2000).

Pengumpulan pelet bakteri E. coli dengan cara disentrifugasi pada

suhu 4⁰C dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit untuk memisahkan

sel E. coli dengan media LB. Pelet yang telah terkumpul disimpan pada

suhu -20⁰C untuk menjaga stabilitas RNA helikase HCV. Proses selanjutnya

adalah purifikasi enzim RNA helikase virus hepatitis C yang bertujuan

untuk memurnikan hasil ekspresi protein RNA HCV yang telah disisipkan

dalam bakteri E. coli BL 21 (DE3) pLysS.

Proses purifikasi diawali dengan pemecahan sel yang terdiri atas dua

metode yaitu pengeringbekuan dan sonikasi. Proses pengeringbekuan dan

sonikasi dalam purifikasi RNA helikase bertujuan untuk memecah sel

bakteri rekombinan karena RNA helikase bersifat intraseluler.

Pengeringbekuan dilakukan dengan menempatkan sel secara bergantian

pada suhu -20⁰C dan suhu ruang, masing-masing selama 30 menit sebanyak

tiga kali pengulangan. Proses pengeringbekuan ini menyebabkan

melunaknya dinding sel bakteri sehingga mempermudah proses pemecahan

sel.

Metode berikutnya adalah sonikasi dengan menggunakan sonikator,

enzim RNA helikase HCV disuspensikan terlebih dahulu dengan dapar B

(10 mM Tris HCl pH 8,5, 100 mM NaCl dan 0,25% Tween 20). Tris HCl

berfungsi sebagai dapar untuk mempertahankan pH enzim RNA helikase

sehingga stabilitasnya terjaga, natrium klorida berperan untuk

menghilangkan kontaminan dan asam nukleat yang berikatan tidak spesifik

dengan RNA helikase (Vanz et al, 2008). Sedangkan tween 20 merupakan

detergen non-ionik yang dapat menghancurkan lipid bipolar pada membran

33


sel. Metode sonikasi ini akan merusak organel dalam sel namun tidak

merusak integritas (kemampuan) fungsionalnya.

Hasil sonikasi selanjutnya di sentrifugasi untuk memisahkan metabolit

intraseluler dan ekstraseluler. Supernatan berupa metabolit intraseluler

dimurnikan kembali dengan resin TALON dan dibiarkan selama 3 jam

didalam cold rotary room, resin TALON akan mengikat RNA helikase,

pengikatan dilakukan oleh logam Co2+ yang terdapat dalam resin TALON.

RNA helikase yang telah diikat oleh resin TALON dipisahkan dengan

metabolit intraseluler lainnya melalui sentrifugasi pada temperatur 4°C

kecepatan 3500 rpm selama 7 menit.

Proses terakhir dari purifikasi adalah pencucian dengan menggunakan

dapar B dan disentrifugasi kembali pada temperatur 4°C kecepatan 3500

rpm selama 7 menit. Sentrifugasi ini menghasilkan pelet yang mengandung

RNA helikase dan supernatan yang mengandung metabolit intraselular.

Pelet ditambahkan dapar elusi (imidazol dalam dapar B) untuk

menghilangkan protein selain enzim RNA helikase. Imidazol yang terdapat

dalam dapar elusi ini akan memutus ikatan antara RNA helikase dengan

resin TALON dan selanjutnya disentrifugasi kembali. Sentrifugasi pada

temperatur 4°C kecepatan 3500 rpm selama 7 menit digunakan untuk

memisahkan imidazol dengan enzim yang telah murni. Penggunaan

kecepatan tersebut untuk menghindari kerusakan enzim dan mencegah

penurunan aktivitasnya (Sambrook & Russel, 2001).

4.6 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE

Uji kemurnian enzim RNA helikase HCV dengan menggunakan SDS

PAGE dengan konsentrasi 8%. SDS PAGE merupakan teknik yang

digunakan untuk menganalisis bobot molekul suatu protein. Adapun prinsip

kerjanya adalah pemisahan berdasarkan migrasi protein pada media

penyangga. Komposisi SDS PAGE adalah akrilamid, tris asam klorida, air

suling, tetramethylethylendiamine dan amonium persulfat. Akrilamid

berguna sebagai pembentuk gel, tris asam klorida berguna sebagai dapar

atau pengatur keseimbangan pH. Amonium persulfat sebagai inisiator dalam

34


proses polimerasi akrilamid menjadi poliakrilamid, sedangkan

tetramethylethylendiamine berguna sebagai katalisator reaksi polimerasi

akrilamid menjadi akrilamid. Dan air suling sebagai pencuci pada proses

pembuatan gel akrilamid.

Berdasarkan hasil SDS PAGE pada gambar 4.1 menunjukkan pita

protein tunggal dengan bobot molekul 54 kDa. Sehingga dapat dikatakan

enzim RNA helikase yang dipurifikasi telah murni sesuai dengan yang telah

dilaporkan sebelumnya oleh Utama et al, 2000 yang menyatakan bahwa

bobot molekul RNA helikase adalah sebesar 54 kDa. Pada lajur pelet tidak

menunjukkan adanya pita protein dikarenakan metabolit intraseluler telah

berada pada supenatan (S). Pada lajur inner volume (IV) dan supernatan (S)

terdapat penumpukan pita protein dikarenakan masih banyak metabolit

intraseluler yang belum termurnikan melalui tahap purifikasi. Lajur washing

(W) yang merupakan hasil tahapan pencucian binding resin TALON dan

tidak menunjukkan adanya pita protein yang berarti pada proses pencucian

ini tidak terbawa protein RNA helikase. Adapun marker yang digunakan

adalah marker BIORAD®.

Hasil SDS PAGE yang diperoleh belum terlalu bagus dikarenakan

waktu pencelupan gel SDS PAGE didalam larutan destaining commassie

blue terlalu cepat sehingga larutan commassie blue yang memberikan warna

biru masih terlihat pada gel SDS PAGE.

35


Gambar 4.1. Hasil SDS PAGE RNA Helikase HCV Keterangan : S= Supernatan, W1= Washing 1, IV= Inner Volume, M= Marker,

E1= Elusi 1

4.7 Aktivitas Inhibisi Ekstrak Metanol Kulit Buah Manggis terhadap RNA

Helikase HCV

Setelah diperoleh enzim RNA helikase murni selanjutnya dilakukan

uji aktivitas inhibisi ekstrak metanol kulit buah manggis terhadap RNA

helikase HCV dengan menggunakan metode kolorimetri ATPase. Uji

kolorimetri ATPase digunakan untuk menguji aktivitas enzim yang

bergantung pada keberadaan ATP sebagai sumber energi dan melibatkan

pengukuran serapan senyawa organik yang dilepaskan ATP oleh enzim RNA

helikase. Prinsip ujinya adalah pengukuran fosfat bebas yang terbentuk dari

hasil reaksi antara RNA helikase dengan ATP yang menghasilkan ADP dan

Pi (fosfat anorganik).

Tahap awal dilakukan dengan mengencerkan ekstrak metanol kulit

buah manggis dengan methanol absolut. Kemudian sampel ditambahkan pada

setiap well sebanyak 5 µl yang sebelumnya telah terisi larutan master mix

sebanyak 45 µl yang terdiri dari air suling, MOPS, MgCl2, dan ATP serta

enzim RNA helikase yang telah diencerkan dengan aquades. ATP (adenosin

36


trifosfat) merupakan substrat pada pengujian ATPase kolorimetri, MOPS

(asam 4-morfolinopropana sulfonat) berperan sebagai dapar dalam larutan

master mix. MgCl2 berfungsi sebagai kofaktor RNA helikase, dan air suling

sebagai pelarut (Utama et al, 2000).

Larutan pewarna yang ditambahkan pada reaksi ini merupakan

indikator pada reaksi pengujian. Larutan pewarna malachite green terdiri dari

ammonium molibdat yang berikatan dengan fosfat anorganik yang

terhidrolisis menghasilkan kompleks fosfomolibdat dan malachite green.

Semakin banyak jumlah kompleks fosfomolibdat dan malachite green, maka

semakin pekat warna yang dihasilkan (hijau tua), begitu pula sebaliknya,

Semakin sedikit jumlah kompleks fosfomolibdat dan malachite green, maka

semakin encer warna yang dihasilkan (hijau muda).

Pada reaksi ini juga dibuat larutan blanko yaitu larutan master mix

tanpa penambahan enzim RNA helikase sehingga tidak dihasilkan fosfat

bebas yang menyebabkan tidak terbentuknya kompleks fosfomolibdat dan

malachite green sehingga warna yang dihasilkan lebih muda. Uji aktivitas

inhibisi secara kolorimetri dilakukan dengan mengukur panjang gelombang

pada reaksi antara enzim RNA helikase dan ekstrak kulit buah manggis

menggunakan microplate reader.

Absorbansi diukur pada dua panjang gelombang, yaitu panjang

gelombang 620 nm dan 405 nm. Panjang gelombang 620 optimum untuk

penyerapan warna kebiruan, sedangkan panjang gelombang 405 nm optimum

untuk penyerapan warna kekuningan. Kedua panjang gelombang ini

digunakan agar perhitungan reaksi antara RNA helikase dengan ATP lebih

akurat. Perhitungan konsentrasi fosfat anorganik yang terinhibisi oleh sampel

menggunakan perbandingan kedua panjang gelombang tersebut (Chan et al,

1986).

Reaksi warna di hentikan dengan penambahan natrium sitrat pada

campuran reaksi. Natrium sitrat berfungsi mencegah terbentuknya reaksi

enzimatis yang berlebihan.

37


Gambar 4.2. Kurva Inhibisi Ekstrak Metanol Kulit Buah Manggis terhadap RNA Helikase HCV

Dari gambar diatas, menyatakan bahwa ekstrak metanol kulit buah

manggis memiliki aktivitas yang masih rendah dalam menghambat enzim

RNA helikase virus hepatitis C secara invitro menggunakan uji kolorimetri

ATPase dengan persentase 66,28 % pada konsentrasi yang masih tinggi

5.000 ppm. Sedangkan pada konsentrasi 10.000 ppm tidak dapat dibaca

pada uji kolorimetri ATPase dikarenakan masih menggumpal sehingga

perlu dilakukan pengenceran.

Pelarut yang digunakan pada uji kolorimetri ATPase adalah metanol.

Metanol secara kimia merupakan zat denaturan pada enzim, namun selama

dalam konsentrasi kecil maka metanol tidak mengganggu kerja enzim

helikase dalam menginhibisi virus. Metanol dikontrol dengan cara

menjadikannya sebagai kontrol negatif, sehingga hasil akhir dari persen

penghambatan dikurangi dengan kontrol negatif agar diperoleh nilai persen

yang sesungguhnya dari senyawa inhibitor ekstrak kulit buah manggis

(Garcinia mangostana L.).

4.8 Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom Kromatografi Ekstrak

Kulit Buah Manggis terhadap RNA Helikase HCV

Pemisahan dengan menggunakan kolom kromatografi merupakan

pemisahan tahap awal terhadap senyawa yang terkandung pada ekstrak kulit

buah manggis (Garcinia mangostana L.). Prinsip kerja pemisahan kolom

38


kromatografi berdasarkan tingkat kepolarannya, molekul senyawa yang non

polar akan bergerak terlebih dahulu diikuti senyawa semi polar dan senyawa

polar.

Adapun fase diam yang digunakan pada pemisahan ini adalah silika

gel 60 (Merck), dengan fase geraknya kloroform-metanol dengan berbagai

perbandingan (9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9). Eluen yang

digunakan ini merupakan eluen terbaik yang mampu memisahkan senyawa

pada ekstrak metanol kulit buah manggis berdasarkan hasil optimasi KLT.

Secara umum fase gerak kloroform-metanol dengan berbagai komposisi

kadar dapat memisahkan berbagai senyawa, ekstrak dan fraksi dengan

kemampuan yang cukup luas. Dengan demikian jika belum ada acuan fase

gerak apa yang akan dipilih maka dipilih kombinasi kloroform-metanol

(Saifudin et al, 2011)

Fraksi senyawa yang ditampung sebanyak 4 ml untuk setiap fraksi,

seluruh fraksi senyawa hasil kolom yang diperoleh, diuapkan dan

dilarutkan kembali dengan metanol untuk selanjutnya diuji aktivitas

inhibisinya terhadap enzim RNA helikase virus hepatitis C dengan uji

kolorimetri ATPase. Adapun konsentrasi fraksi senyawa inhibitor yang

digunakan dalam pengujian ini adalah 2.500 ppm.

Dasar pengambilan konsentrasi 2.500 ppm ini berdasarkan uji

aktivitas yang telah dilakukan, dimana pada konsentrasi dibawah 2.500 ppm

persen aktivitas inhibisi menjadi rendah dibawah 50%, untuk itu di ambil

konsentrasi optimal yaitu 2.500 ppm untuk uji aktivitas inhibisi RNA

helikase HCV.

39


Gambar 4.3. Profil Aktivitas Inhibisi Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap Enzim RNA Helikase HCV

Dari gambar diatas terlihat bahwa aktivitas ATPase dari enzim RNA

helikase terhambat oleh senyawa yang terkandung pada fraksi kelima, tujuh

dan sembilan ekstrak metanol kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.)

yang dipisahkan menggunakan kolom kromatografi silika gel 60, dengan

aktivitas penghambatan masing-masing 78,39%, 75,76%, dan 81,2%.

Dari gambar diatas dapat dilihat aktivitas inhibisi tertinggi terdapat

pada fraksi kesembilan kolom kromatografi dengan pengenceran 2.500 ppm

yaitu sebesar 81,2 %. Aktivitas inhibisi pada fraksi kolom kromatografi ini

lebih besar dibandingkan pada ekstrak metanol kulit buah manggis yang

hanya memiliki aktivitas 66,28 % pada konsentrasi 5.000 ppm.

Adapun fraksi kesembilan hasil kolom kromatografi ini menggunakan

eluen kloroform-metanol dengan perbandingan 7:3, pada eluen ini mampu

memberikan aktivitas tertinggi sebagai senyawa inhibitor enzim RNA

helikase virus hepatitis C.

Seharusnya untuk pengujian aktivitas inhibisi enzim RNA helikase

tidak perlu dilakukan pada semua fraksi karena berdasarkan pola

kromatogram yang dapat dilihat pada gambar 4.4 senyawa dari fraksi kelima

hingga kesebelas adalah sama. Untuk lebih mengefektifkan kerja, fraksi

yang memiliki spot yang sama digabung untuk kemudian dilakukan uji

aktivitas inhibisi enzim RNA helikase.

40


Gambar 4.4. Visualisasi KLT pada Fraksi Hasil Kolom Kromatografi Ekstrak Metanol Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.)

Pada penelitian sebelumnya oleh Syajarwati (2013) yang menemukan

adanya aktivitas ekstrak metanol kulit buah manggis (Garcinia mangostana

L.) dengan aktivitas penghambatan tertinggi pada konsentrasi 3.125 ppm

sebesar 71,57%. Hasil fraksi kolom kromatografi ini memberikan aktivitas

penghambatan yang cukup tinggi, dikarenakan senyawa yang memberikan

aktivitas pada ekstrak kulit buah manggis sudah dipisahkan dari senyawa-

senyawa lain yang dapat menghambat kerja senyawa tersebut dalam

menginhibisi enzim RNA helikase virus hepatitis C.

4.9 Perhitungan Aktivitas RNA Helikase Virus Hepatitis C

Perhitungan aktivitas RNA helikase virus hepatitis C ini dapat

dihitung dari banyaknya kadar fosfat yang dilepaskan dari hasil reaksi antara

RNA helikase dengan ATP yang menghasilkan ADP dan Pi (fosfat organik).

Aktivitas enzim RNA helikase dapat dilihat pada grafik (Gambar 4.5).

Aktivitas enzim RNA helikase HCV yang tidak ditambahkan senyawa

inhibitor adalah 519,76 pmol fosfat/ml/menit/pmol protein dan setelah

ditambahkan senyawa inhibitor fraksi kesembilan hasil kolom kromatografi

ekstrak kulit buah manggis, aktivitas enzim RNA helikase HCV menjadi

berkurang yaitu 87,36 pmol fosfat/ml/menit/pmol protein.

Hal ini menunjukkan adanya penurunan aktivitas enzim RNA helikase

setelah ditambahkan senyawa inhibitor sehingga kadar fosfat yang

dilepaskan dari hasil reaksi enzim RNA helikase dengan ATP menjadi

rendah. Nilai aktivitas enzim RNA helikase ini berbanding terbalik dengan

nilai persentase penghambatan, semakin tinggi persen penghambatan oleh

41


senyawa inhibitor maka semakin rendah aktivitas enzim RNA helikase dan

sebaliknya semakin rendah persen penghambatan oleh senyawa inhibitor

maka semakin tinggi aktivitas enzim RNA helikase.

Gambar 4.5. Grafik Aktivitas Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

Penelitian Magadula et al, 2009 telah melaporkan bahwa dari

beberapa ekstrak etanol spesies garcinia memiliki aktivitas inhibitor enzim

protease HIV tipe 1 dengan menggunakan HPLC. Dari beberapa uji ekstrak,

kulit buah dari Garcinia semseii menunjukkan aktivitas inhibitor paling

tinggi dalam menghambat protease HIV type 1 dengan nilai IC50 5,7 µg/ml

diikuti dengan ekstrak kulit batang dari Garcinia edulis dan Garcinia

kingaensis dengan nilai IC50 9,2 µg/ml dan 15,2 µg/ml. Merujuk dari

penelitian tersebut maka konsentrasi fraksi hasil kolom kromatografi yang

digunakan pada uji aktivitas masih sangat tinggi yaitu sebesar 2.500 ppm,

sehingga perlu dilakukan uji aktivitas lebih lanjut dengan konsentrasi rendah

dan aktivitas yang optimal, walaupun belum ada literatur yang menyatakan

pada konsentrasi berapa senyawa inhibitor dikatakan potensial dalam

menghambat RNA helikase HCV.

Pada penelitian Farnsworth dan Bunyapraphatsara (1992) dalam

Moongkarndi et al, 2004 melaporkan bahwa kulit buah manggis merupakan

sumber senyawa mangostin, tannin, xanthone, chrysanthemin, garcinone,

gartanin, Vitamin B1, B2 dan substansi bioaktif lainnya. Dari beberapa

spesies Garcinia dilaporkan dalam literatur memiliki aktivitas sebagai

42


senyawa inhibitor enzim protease HIV type 1, termasuk Garcinia

mangostana L. yang memiliki senyawa mangostin, senyawa tersebut

diindikasikan mampu menghambat protease HIV type 1 secara signifikan

(Chen et al, 1996).

Selain sebagai antivirus, Garcinia mangostana L. juga memiliki

aktivitas sebagai antioksidan, antitumor, antiinflamasi, antialergi,

antibakteri, antifungi dan antimalaria (Chaverri et al, 2008). Dalam

mekanismenya sebagai inhibitor RNA helikase, terdapat dua kemungkinan

yang terjadi : (1) inhibitor menempel pada RNA helikase tidak pada sisi

aktifnya, namun terjadi perubahan konformasi bentuk enzim yang

mengakibatkan berkurangnya interaksi enzim dengan substrat

(Borowski et al, 2008). (2) inhibitor berikatan pada sisi aktif enzim (RNA

binding-site) sehingga ATP tidak dapat berikatan dengan enzim yang

menyebabkan enzim tidak memiliki cukup energi untuk membuka untai

ganda RNA (Yamashita et al, 2012).

43


BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Fraksi kesembilan hasil kolom kromatografi dengan eluen kloroform-

metanol perbandingan 7:3 memiliki aktivitas penghambatan tertinggi

terhadap enzim RNA helikase HCV sebesar 81,2 % pada konsentrasi

2.500 ppm dengan aktivitas enzim RNA helikase sebesar 87,36 pmol

fosfat/ml/menit/pmol protein.

5.2 Saran

1. Pada pengujian aktivitas inhibisi enzim RNA helikase tidak perlu

dilakukan pada semua fraksi. Fraksi yang memiliki spot yang sama

cukup digabung untuk lebih mengefektifkan kerja.

2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai isolasi senyawa

bioaktif dari ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.)

sehingga diperoleh senyawa murni sebagai kandidat obat untuk

penyakit yang disebabkan oleh virus hepatitis C.

3. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai uji toksisitas dan uji

aktivitas inhibisi RNA helikase virus hepatitis C dari ekstrak kulit

buah manggis (Garcinia mangostana L.) secara in vivo.

44


DAFTAR PUSTAKA

Anthony, C.. (2002). A review of Mangosteen (Garcinia mangostana) Linn.

Dalam Dweck Data. Dweck FLS FRSH FRSC.

Astika, ayu. 2013. Khasiat Selangit Manggis dan Sirsak Tumpas Beragam

Penyakit. Yogyakarta: Araska.

Ayoola, G.A et al.2008. Phytochemical Screening and Antioxidant Activities of

Some Selected Medicinal Plants Used for Malaria Therapy in Southwestern

Nigeria. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, September 2008; 7 (3):

1019-1024.

Baginski SG et al. 2000. Mechanism of action of Pest virus antiviral compound.

PNAS 97:14.

Borowski P et al. 2008. Viral NS3 helicase activity is inhibited by peptides

reproducing the Arg-rich conserved motif of the enzyme (motif VI). Biochemical

Pharmacology 76:28-38.

Center for Disease Control and Prevention. 2012. Disease Burden from Viral

Hepatitis A, B, and C in the United States.

http://www.cdc.gov/hepatitis/Statistics/index.htm. Diakses tanggal 24 Juni 2012.

Chaverri et al. 2008. Medicinal properties of mangosteen (Garcinia mangostana).

Food and Chemical Toxicology 46 (2008) 3227-3239.

Departemen Kesehatan RI. (1989). Materia Medika Indonesia jilid V. Direktorat

Jendral Pengawasan Obat dan Makanan : Jakarta

Departemen Kesehatan RI. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan

Obat. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

Dumont S et al. 2006. RNA translocation and unwinding mechanism of HCV NS3

helicase and its coordination by ATP. Nature 439: 105-108.

Evans MJ et al. 2007. Claudin-1 is a hepatitis C virus co-receptor required for a

late step in entry. Nature 446:801.

http://www.cdc.gov/hepatitis/Statistics/index.htm

45


Fan L et al.. 2008. XPD helicase structures and activities: insight into the cancer

and aging phenotypes from XPD mutations. Cell 133: 789-800.

Gam LH and Latiff A. 2005. SDS-PAGE electrophoretic property of human

chorionic gonadotropin (hCG) and its β-subunit. Int.J.Biol.Sci 1(3): 103-109.

Gritter RJ, Bobbitt JM, and Schw AE. 1991. Pengantar Kromatografi, Edisi II.

Diterjemahkan oleh Padmawinata K. Bandung : ITB Bandung.

Hairany, Ainun. 2010. Pemurnian dan Karakterisasi Protein Inhibitor RNA

Helikase Virus Hepatitis C dari Streptomyces chartreusis 5-095 [Tesis]. Bogor:

Institut Pertanian Bogor.

Heinrich et al. 2009. Farmakognosi dan Fitoterapi. Jakarta: EGC.

Jovanovic S, Barac M, Macej O, Vucic T, and Lacnjevac C. 2007. SDS-PAGE

analysis of soluble proteins in reconstituted milk expose to different heat

treatments. Sensors 7: 371-383.

Jung et al. 2006. Antioxidant Xanthones from the Pericarp of Garcinia

mangostana (Mangosteen). J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 2077-2082.

Kim et al. 1988. Hepatitis C virus NS3 RNA helicase domain with a bound

oligonucleotide: the crystal structure provides insights into the mode of

unwinding. Structure 6:89-100.

Lauer GM, Walker BD. 2001. Hepatitis C virus infection. N.Eng.J. Med 345:41-

51.

Maillard P et al. 2006. The interaction of natural hepatitis C virus with human

scavenger receptor SR-BI/Cla1 is mediated by ApoB-containing lipoproteins.

FASEB J. , 20:735-737.

McHutchison JG, Patel K. 2002. Future therapy of hepatitis C. Hepatology :245-

252.

46


Mustopa, A.Z et al. 2012. Isolasi dan Identifikasi Awal Senyawa Inhibitor RNA

Helikase Virus Hepatitis C dari Ekstrak Buah Mangrove Avicennia marina

(Forsk.) Vierh. JPHPI 2012, Volume 15 Nomor 2.

Mutaqin et al. 2013. Identifikasi Hasil Reaksi Adisi Nukleofilik Sianida pada

Gugus Karbonil Sitronelal Menggunakan Pereaksi Kalium Sianida. JKK, tahun

2013, volume 2 (1), halaman 38-41.

Op De Beeck A, Dubuisson J. 2003. Topology of hepatitis C virus envelope

glycoproteins. Rev. Med. Virol. 13:233–41.

Peg-Intron. 2012. Penyakit Hepatitis C.

http://medicastore.com/hepatitis_c/infeksi_hepatitis.htm. diakses tanggal 25 Juli

2012.

Putra, I nengah kencana. 2010. Aktivitas antibakteri ekstrak kulit manggis

(Garcinia mangostana L) serta kandungan senyawa aktifnya. J.teknol dan Industri

Pangan, Vol. XXI No. 1 Th.2010.

Saifudin et al, 2011. Standarisasi Bahan Obat Alam. Yogyakarta: Graha Ilmu.

Sharma, R.K & S.P.S Sangha. 2009. Basic Techniques in Biochemistry and

Molecular Biology. India: I.K. International.

Shuman S. 1992. Vaccinia virus RNA helicase: an essential enzyme related to the

DE-H family of RNA dependent NTPase. Proc. Natl. Acad. 89:10935-10939.

Sy T, Jamal MM. 2006. Epidemiology of hepatitis C virus (HCV) infection.

Int.J.Med.Sci 3:41-4.

Syajarwati, Putri. 2013. Uji Aktivitas Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia

mangostana L.) sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C [skripsi].

Jakarta: UIN Syarif Hidayatullah.

Tiwari P et al. 2011. Phytochemical Screening and Extraction: A Review.

Internationale Pharmaceutica Sciencia Jan-March 2011 Vol.1 Issue 1.

http://medicastore.com/hepatitis_c/infeksi_hepatitis.htm

47


United State Departement of Agriculture. 2012. Plants Profile Garcinia

mangostana L. http://plants.usda.gov/java/name search diakses tanggal 23 juli

2012.

Utama, A et al. 2000. Identification and characterization of the RNA helicase

activity of Japaneese encephalitis virus NS3 protein. FEBS Lett 465: 74-78.

Utama, A et al. 2005. Skrining Inhibitor RNA Helikase terhadap Virus Japanese

Encephalitis. Poster Program Kompetitif LIPI.

Wagner J, Jankowski E, Company M, Pyle A, and Abelson J. 1998. The

DEAHbox protein PRP22 is an ATPase that mediates ATP dependent mRNA

relase from the spliceosome and unwinds RNA duplexes.

EMBO Journal. 17:2926-2937.

Watanapokasin et al. 2009. Potential of Xanthones from Tropical Fruit

Mangoseen as Anti-cancer Agents: Caspase-Dependent Apoptosis Induction In

Vitro and in Mice. Appl Biochem Biotechnol (2010) 162:1080-1094.

World Health Organization. 2012. Hepatitis C.

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs164/en/index.html. di akses Juli

2012.

Yazid, Estien. 2005. Kimia Fisika untuk Paramedis. Yogyakarta: penerbit ANDI.

Yu et al. 2006. Phenolic from hull of Garcinia mangostana fruit and their

antioxidant activities. Food Chemistry 104 (2007) 176-181.

Zhong J et al. 2005. Robust hepatitis C virus infection in vitro. PNAS 102: 26.

http://plants.usda.gov/java/name

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs164/en/index.html.%20di%20akses%20Juli%202012

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs164/en/index.html.%20di%20akses%20Juli%202012

48


LAMPIRAN

49


Lampiran 1. Hasil Determinasi Garcinia mangostana L.

50


Lampiran 2. Alur Penelitian

Kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.)

Simplisia serbuk kering

Maserasi dengan metanol absolut 96 %

Ekstrak metanol dipekatkan dengan rotary

evaporator

Pemisahan senyawa dengan kolom kromatografi

Uji ATPase kolorimetri

Uji aktivitas inhibitor RNA helikase pada setiap

fraksi

Perhitungan aktivitas enzim RNA helikase virus

hepatitis C

Skrining fitokimia dan parameter uji

ekstrak

Uji kemurnian enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE

Determinasi buah manggis (Garcinia mangostana L.)

Ekspresi dan purifikasi enzim RNA helikase

HCV

51


Lampiran 3. Alur Kerja Persiapan Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.)

52


Lampiran 4. Alur Kerja Produksi Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

0,3 M IPTG, shaker 150 rpm, 37⁰C, 3 jam

10 ml E. coli rekombinan diinokulasi

pada media LB yang ditambahkan ampisilin

Shaker 150 rpm, 37⁰C, 1 jam

Sentrifus 3500 rpm, 10 menit, koleksi

pelet

Sentrifus 7000 rpm, 20 menit, 4⁰C

Sonikasi (amplitudo 0.5, waktu 3x15 detik,

interval 1 menit)

Freeze thaw 3x, ditambah 10 ml

buffer B

Sentrifus 5000 rpm, 10 menit, 4⁰C, pelet

disimpan pada -20⁰C

Pelet + Resin TALON, binding selama 3 jam di cold

rotary room

Sentrifus 3500 rpm, 5 menit. Pelet + buffer elusi. Binding

semalaman di cold rotary room

Sentrifus 3500 rpm, 7 menit, 4⁰C. Pelet + 10 ml buffer B

Konfirmasi kemurnian dgn SDS PAGE 8 %

RNA helikase HCV

53


Lampiran 5. Alur Kerja Analisis Kemurnian Enzim RNA helikase HCV dengan SDS - PAGE

Commasie blue staining

Hasil SDS PAGE di scan

Destain for commasie blue

Denaturasi pada suhu 95⁰C, 15 menit

Preparasi gel ( stacking dan separating) 8 %

Running SDS PAGE

Sample + loading dye

54


Lampiran 6. Alur Kerja Uji Aktivitas Enzin RNA Helikase HCV

Inkubasi selama 45 menit dalam suhu ruang

Tambahkan larutan pewarna

(0,081% malachite green, H2O, 5,7% amonium molibdat dalam 6 M HCl, dan 2,3% polivinil alkohol dengan perbandingan 2:1:1:2)

Inkubasi selama 5 menit pada suhu ruang

Pengukuran absorbansi menggunakan microplate

reader panjang gelombang 620 nm dan 405 nm

Tambahkan 25 µL Na Sitrat

Campuran master mix

(5 µL MOPS 10 mM (pH 6,6), 1 µL ATP 0,1 M, 0,5 µL MgCl2 1 mM, 38,5 µL H2O, dan 5 µL RNA helikase HCV)

55


Lampiran 7. Skema Kerja Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap RNA helikase HCV

Campuran master mix

(5 µL MOPS 10 mM (pH 6,6), 1 µL ATP 0,1 M, 0,5 µL MgCl2 1 mM, 38,5 µL H2O, dan 5 µL RNA helikase HCV)

Blanko: master mix + ddH2O Enzim: master mix + enzim

Kontrol negatif: master mix + enzim + metanol

Sampel : master mix + enzim + fraksi kolom kromatografi ekstrak kulit buah manggis

Fraksi kolom kromatografi diuapkan, dilarutkan dengan metanol 96 % dibuat dalam larutan stock 25.000 ppm

Inkubasi selama 45 menit pada suhu ruang

Tambahkan larutan pewarna

(0,081% malachite green, H2O, 5,7% amonium molibdat dalam 6 M HCl, dan 2,3% polivinil alkohol dengan

perbandingan 2:1:1:2)

Inkubasi selama 5 menit dalam suhu ruang

Pengukuran absorbansi menggunakan microplate reader pd panjang gelombang 620

nm dan 405 nm

Tambahkan 25 µL Na Sitrat

56


Lampiran 8. Komposisi Larutan-Larutan yang Digunakan dalam SDS-PAGE

Larutan-larutan Komposisi

A Larutan separating

8%

H2O 7,25 mL

1,5 M Tris-Cl pH 8,8 containing 0.4% SDS 3,75

mL

30% Akrilamid 4 mL

10% Amonium Persulfat 0,05 mL

TEMED 0,015 mL

B Larutan stacking

3,9%

H2O 3,05 mL

0,5 M Tris-Cl pH 6,8 containing 0.4% SDS 1,25

mL

30% Akrilamid 0,65 mL

10% Amonium Persulfat 0,025 mL

TEMED 0,005 mL

C Dapar sampel SDS

2X (Loading Dye)

4x Tris Cl/SDS pH 6,8 25 mL

Gliserol 20 mL

SDS 4 g

β- mercaptoethanol (2-ME) 2 mL

Bromphenol blue 1 mg

H2O sampai 100 mL

D Commasie Blue G-

250 Staining

Solution (500 mL)

45% H2O 225 mL

45% Metanol 225 mL

10% Asam asetat glacial 50 mL

0,05% Commasie brilliant blue 250 mg

E Commasie Blue G-

250 Destaining

Solution (1000 mL)

50% H2O 500 mL

10% Asam asetat glacial 100 mL

40% Metanol 400 mL

57


Lampiran 9. Komposisi Reagen, Dapar, dan Medium yang digunakan

Larutan, dapar, medium

Komposisi dan Cara Pembuatan

A Media LB (Luria-Bertani) cair

Media LB dibuat sebanyak 10 mL untuk prekultur dan 400 mL untuk kultur. Media LB dibuat dengan cara melarutkan sejumlah 0,25 g dan 10 g masing-masing ke dalam 10 mL dan 400 mL akuades. Semua disterilisasi pada suhu 121o C selama 15 menit.

B Dapar B Dapar dibuat dengan komposisi Tris-HCl 10 mM, NaCl 100 mM, dan Tween 20 0,25%. Dicampur menjadi satu dan diaduk hingga homogen.

C Dapar Elusi Sebanyak 0,2724 g imidazol dilarutkan dalam 10 mL dapar B kemudian dihomogenkan

D Adenosin 5’ trifosfat (ATP) 0,1 M

Sebanyak 0,3 g adenosine 5’ triphosphate disodium salt dilarutkan dalam nuclease free water sambil diukur pH 7,0. Sebanyak 500 µL dialikuot ke dalam 1,5 mL tabung

mikrosentrifus. Disimpan pada -20°C.

E Ampisilin 100 mg/mL

Amphicillin sodium salt sebanyak 2 gram dilarutkan dalam 2 mL akuades kemudian dihomogenkan. Larutan disaring dengan filter 0,2 µm. Alikuot 1 mL ke dalam tabung 1,5 mL. Disimpan pada -20°C

F Malachite green 0,081%

Sebanyak 0,081 malachite green oxalate salt dilarutkan dalam akuades hingga mencapai volume 100 mL dan dihomogenkan. Selanjutnya larutan disaring dengan kertas saring

G Polivinil alkohol 2,3%

Sebanyak 2,3 g polivinil alkohol dilarutkan dalam akuades hingga mencapai volume 100 mL kemudian dihomogenkan dengan pemanasan

H Ammonium molibdat 5,7% dalam HCl 6 N

Sebanyak 5,7 g ammonium molibdat tetrahidrat dilarutkan dalam HCl 6 N hingga mencapai volume 100 mL kemudian dihomogenkan

I Natrium Sitrat 30%

Sebanyak 3 g citric acid trisodium salt dihydrate dilarutkan dalam akuades hingga mencapai 100 mL kemudian dihomogenkan

58


Lampiran 10. Perhitungan Rendemen Ekstrak Kulit Buah Manggis

Rendemen

Ekstrak metanol kulit buah Manggis (Garcinia mangostana L.)

Rendemen

59


Lampiran 11. Perhitungan Parameter Ekstrak Kulit Buah Manggis

1. Susut pengeringan x 100%

Ekstrak Berat sampel awal Berat sampel akhir

Metanol 1,673 g 1,365 g

Ekstrak metanol kulit buah Manggis

Susut pengeringan

2. Kadar abu x 100%

Ekstrak Berat sampel awal Berat sampel akhir

Metanol 1,008 g 0,014 g

Ekstrak metanol kulit buah Manggis

Kadar abu = 1,388%

60


Lampiran 12. Perhitungan Pengenceran Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.)

Fraksi hasil kolom kromatografi diuapkan, kemudian ditimbang bobotnya untuk

dilarutkan kembali dengan metanol dibuat larutan stock dengan konsentrasi

100.000 ppm.

Konsentrasi = 0,1 g/ 1 ml = 100.000 ppm

Selanjutnya dilakukan pengenceran hingga 35.000 ppm dengan menggunakan

rumus pengenceran :

V1 x N1 = V2 x N2

Di mana, V1= volume yang diambil dari larutan stock

N1 = konsentrasi larutan stock

V2 = volume larutan yang akan dibuat

N2 = konsentrasi larutan yang akan dibuat

Pengenceran 35.000 ppm

V1 x N1 = V2 x N2

V1 x 100.000 ppm = 1 mL x 25.000 ppm

V1 = 0,25 mL

Artinya 0,25 mL sampel dari larutan stock + 0,75 mL metanol

61


Lampiran 13. Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Metanol Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) terhadap Enzim RNA Helikase HCV

Ekstrak Konsentrasi

(ppm)

Absorbansi

tanpa

inhibitor

(enzim)

Absorbansi

dengan

inhibitor

(enzim +

inhibitor)

% Inhibisi Ket

Kontrol (-) 1,102 1,178 6,423

Metanol 10.000 ppm 0,031 97,34 gumpal

Metanol 5.000 ppm 0,322 72,708

Metanol 2.000 ppm 1,089 7,555

62


Lampiran 14. Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) terhadap Enzim RNA Helikase HCV

Fraksi Konsentrasi

(ppm) Absorbansi tanpa inhibitor (enzim)

Absorbansi dengan inhibitor (enzim +

inhibitor)

% Inhibisi

Kontrol (-) 1,103 1,089 1,239 1 2500 ppm 0,466 57,721

2 2500 ppm 0,512 53,581

3 2500 ppm 0,648 41,221

4 2500 ppm 0,921 16,485

5 2500 ppm 0,225 79,631

6 2500 ppm 0,492 55,364

7 2500 ppm 0,254 77,002

8 2500 ppm 0,458 58,447

9 2500 ppm 0,194 82,442

10 2500 ppm 0,835 24,267

11 2500 ppm 0,444 59,716

12 2500 ppm 1,021 7,404

13 2500 ppm 0,986 10,638

14 2500 ppm 0,949 13,962

15 2500 ppm 0,978 11,363

16 2500 ppm 0,873 20,852

17 2500 ppm 0,769 30,281

18 2500 ppm 0,662 39,982

19 2500 ppm 0,484 56,089

20 2500 ppm 0,650 41,070

63


21 2500 ppm 0,747 32,276

22 2500 ppm 0,675 38,803

23 2500 ppm 0,652 40,858

24 2500 ppm 0,593 46,238

25 2500 ppm 0,641 41,886

26 2500 ppm 0,693 37,171

27 2500 ppm 0,750 31,973

28 2500 ppm 0,686 37,836

29 2500 ppm 0,779 29,374

64


Lampiran 15. Perhitungan Persen Inhibisi Hasil Fraksi Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) terhadap RNA helikase HCV

Rumus Perhitungan :

% inhibisi = x 100

A = absorban enzim tanpa adanya senyawa inhibitor

I = absorban enzim dengan adanya senyawa inhibitor

Contoh perhitungan pada fraksi ke-9 kolom kromatografi ekstrak kulit buah

manggis dengan konsentrasi 2.500 ppm :

Absorbansi aktivitas inhibisi – kontrol negatif

= 82,442 % - 1,239 %

= 81,203 %

65


Lampiran 16. Kurva Standar Fosfat (Uji ATPase)

Data :

Grafik :

Konsentrasi K2HPO4 (mM)

Absorbasi 620 nm dengan referensi

405 nm

0.0

0.1

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.000

0.102

0.239

0.417

0.622

0.834

1.022

y = 1.020x + 0.010

R2 = 0.9989

66


Lampiran 17. Contoh Perhitungan Aktivitas RNA Helikase HCV

Diketahui : y = 1,020x + 0,010 (kurva standar dilihat di lampiran 14)

Sampel didilusi 40x

OD pada 620 nm = 1,103

Masa inkubasi 45 menit

1 well terdapat 5 µL enzim RNA helikase

Konsentrasi enzim RNA helikase = 18,32 µg/ µL

1 pmol = 0,05

Ditanya : Aktivitas enzim RNA helikase

Jawab : y = 1,020x + 0,010

1,103 = (1,020x) + 0,010

x = 1,0712 mM fosfat

Banyaknya fosfat yang dilepaskan dari sampel = 1,0712 mM fosfat x 40

= 4,28 x 10-5 mol fosfat/mL

Fosfat yang dilepaskan dalam 45 menit =

= 9,52 x 10-7 mol fosfat/mL/menit

Banyaknya enzim dalam 1 well = 18,32 µg/µL x 5 µL

= 91,6 µg = 1832 pmol protein

Aktivitas enzim RNA helikase =

= 519,76 pmol fosfat/mL/menit/pmol protein

67


Lampiran 18. Tabel Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV dengan Penambahan Senyawa Inhibitor Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.)

Ket % inhibisi Aktivitas RNA helikase

enzim pengenceran 15x

0 519,768

kontrol (-) 1,239 513,4255

fraksi 1 57,721 217,0721

fraksi 2 53,581 238,7952

fraksi 3 41,221 303,6473

fraksi 4 16,485 433,4307

fraksi 5 79,631 102,1143

fraksi 6 55,364 229,44

fraksi 7 77,002 115,9092

fraksi 8 58,447 213,2666

fraksi 9 82,442 87,36796

fraksi 10 24,267 392,6008

fraksi 11 59,716 206,607

fraksi 12 7,404 481,0787

fraksi 13 10,638 464,1125

fraksi 14 13,962 446,6707

fraksi 15 11,363 460,307

fraksi 16 20,852 410,5184

fraksi 17 30,281 361,0469

fraksi 18 39,982 310,1483

fraksi 19 56,089 225,6345

fraksi 20 41,070 304,4401

68


fraksi 21 32,276 350,5818

fraksi 22 38,803 316,3323

fraksi 23 40,858 305,55

fraksi 24 46,238 277,3259

fraksi 25 41,886 300,1589

fraksi 26 37,171 324,8946

fraksi 27 31,973 352,1674

fraksi 28 37,836 321,4063

fraksi 29 29,374 365,8038

69


Lampiran 19. Gambar Dokumentasi dan Alat Penelitian

Alkaloid Flavonoid Saponin

Tanin Fenol Terpenoid

Susut Pengeringan Kadar Abu Kolom

Kromatografi

70


Microplate reader Rotary evaporator Inkubator goyang

Laminar Air Flow Sentrifus Hot Plate

Sonikator SDS-PAGE 96-well microtiter

plate

uji aktivitas inhibisi fraksi-fraksi hasil kolom...

Documents