Laporan Praktikum Hari/Tanggal : Senin/29 Maret 2010Struktur dan Fungsi Subseluler Waktu : 08.00-11.00 WIB

PJP : Ramdan Hidayat, M.Si Asisten : Akmal

Amelinda Irena Resti Siti M

Sapto Gontoro

FRAKSINASI SUBSELULER

Kelompok 4

Rizki Ayu Kartini (G84080061)Arena Yogi Pratiwi (G84080026)

Winahyu Hapsari (G84080021)

DEPARTEMEN BIOKIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR

2010

Pendahuluan

Fraksinasi merupakan proses pemisahan suatu larutan menjadi fraksi atau

bagian-bagian tertentu. Pembagian atau pemisahan ini didasarkan pada bobot dari

tiap fraksi, fraksi yang lebih berat akan berada paling dasar sedang fraksi yang

lebih ringan akan berada diatas. Salah satu contoh fraksinasi ialah fraksinasi

subseluler. Fraksinasi subseluler sendiri ialah memisahkan sel menjadi bagian-

bagian, memisahkan organel-organel utama sehingga fungsinya masing-masing

dapat dipelajari. Alat yang biasa digunkan untuk memfraksionasi sel ialah

sentrifugasi, sejenis komidi-putar untuk tabung reaksi yang mampu berputar pada

berbagai kecepatan. Fraksinasi biasanya dilakukan pada suhu rendah, perlakuan

ini berguna untuk mempertahankan struktur dan fungsi dari organel. Prinsipnya

untuk memperoleh organel yang besar maka diperlukan kecepatan sentrifugasi

yang rendah sedangkan apabila untuk memperoleh organel yang kecil, diperlukan

kecepatan sentrifugasi yang besar (Campbell 2002).

Sentrifus adalah suatu alat yang digunakan dalam pemisahan atau

memfraksinasi organel-organel yang ukurnnya berbeda yang dijalankan dengan

rotor. Sentrifugasi dilakukan dengan meletakkan sampel pada suatu gaya yang

memutar sampel pada kecepatan tinggi menyebabkan pengendapan partikel dan

organel sel atau makromolekul pada ukuran dan bobot jenisnya. Sentrifus yang

berulang-ulang dengan laju yang semakin tinggi menghasilkan ekstrak-ekstrak sel

yang terpilah menurut komponen-komponennya. Semakin kecil komponen

subseluler yang harus diendapkan, semakin besar pula gaya sentrifugal yang

dibutuhkan (Rickwood 1984).

Sentrifugasi sendiri diartikan sebagai proses pengendapan organel sel

dengan cara memberikan suatu gaya sentrifugal pada organel sel yang

disentrfugasi. Menurut Kimball (2005), alat sentrifugasi yang biasa disebut

sentrifus, bekerja dengan prinsip pemberian gaya sentrifugal yaitu dengan

memutar bahan dengan kecepatan tertentu dan selang waktu tertentu, sehingga

terjadi pemisahan berdasarkan bobot. Ada 2 macam prinsip sentrifugasi yang

didasarkan atas: 1) massa, ukuran atau panjang partikel dan 2) densitas partikel.

Sentrifugasi zonal merupakan contoh sentrifugasi didasarkan atas massa dan

ukuran partikel. Dalam sentrifugasi ini, partikel berbeda ukuran akan terpisah

pada lapisan-lapisan (zona) yang berbeda. Jenis kedua adalah sentrifugasi

berdasarkan pada keadaan yang setimbang, sentrifugasi keseimbangan gradien-

densitas. Sentrifugasi jenis ini bekerja berdasarkan prinsip partikel dan cairan

yang berada pada level keseimbangan densitas (disebut keadaan isopiknik).

Teknik sentrifugasi keseimbangan gradien-densitas dapat memisahkan molekul-

molekul dengan perbedaan densitas sampai 0,02 g/ml. Misal : DNA dan RNA

yang perbedaan densitasnya dalam larutan cesium klorida (CsCl) berturut-turut

adalah 1,3; 1,6-1,7 dan 1,75-1,8 gr/ml.

Percobaan kali ini menggunakan sentrifugasi perberbedaan kecepatan. Hal

ini dikarenakan metode ini cukup sederhana untuk pemisahan homogenat menjadi

fraksi-fraksi yang berbeda. Metode ini yang melibatkan sentrifugasi homogenat

dengan penambahan kecepatan untuk mendapatkan serangkaian pelet yang

mengandung komponen dari sel, yaitu fraksi inti, mitokondria, mikrosom, dan

lain-lain (Rickwood 1984).

Tujuan percobaan

Praktikum ini bertujuan memahami prinsip fraksinasi subseluler, dapat

menangani hewan uji dan terampil mengisolasi organ dari hewan uji tersebut,

serta dapat melakukan fraksinasi subseluler untuk mengisolasi salah satu organel

subseluler.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini, yaitu sentrifus Beckman J2-

21, homogienizer, labu erlenmeyer, gelas ukur, tabung Sorvall, tabung vial, dan

pipet tetes. Kemudian pinset, gunting, pisau bedah.

Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini,yaitu sel hati tikus dan

eter. Larutan sukrosa 0.25 M-EDTA, larutan sukrosa 0.34 M-EDTA I m M,

larutan sukrosa 0.25 mM-CaCl2, es batu, dan kain blacu.

Prosedur Percobaan

Praktikum ini diawali dengan pembiusan tikus yang telah disediakan oleh

laboran untuk dibedah dan diambil hatinya. Hati yang sudah didapat dibilas

dengan larutan sukrosa-EDTA 0,25 M sebanyak 3-4 kali hingga larutan tersebut

tidak berwarna. Setelah pembilasan selesai dilanjutkan dengan penimbangan berat

dari organ hati tikus tersebut. Kemudian hati yang telah ditimbang dimasukkan

kembali ke dalam gelas piala yang berisi larutan sukrosa-EDTA untuk dipotong-

potong. Hasil pemotongan hati tersebut di bilas sebanyak 3-4 kali dan dihaluskan

dengan homogenizer dan tambahkan 15 mL sukrosa-EDTA dingin.

Hati yang sudah dihaluskan itu sebagiannya dibagi menjadi tiga bagian dan

dimasukkan dalam vial (tabung plastik berukuran kecil), masing-masing bagian

berisi 2 ml larutan homogenat hati tikus. Sisa larutan homogenate sebanyak 13

mL ditambahakan 0.34 M-EDTA sebanyak 13 mL kemudian ditempatkan dalam

tabung sentrifus untuk disentrifugasi dengan 700 gravitasi selama 10 menit.

Setelah sentrifugasi selesai, supernatant dipindahkan ke tabung untuk isolasi

mitikondria dan pelet yang diperoleh digunakan untuk fraksi inti.

Pada praktikum selanjutnya, pelet fraksi inti disuspensi kembali dalam

tabung dengan 10 mL sukrosa 0.25 mM-CaCl2. Kemudian disentrifus pada 1500 g

selama 10 menit. Setelah disentrifugasi, supernatant dibuang, sedangkan pelet

yang diperoleh diresuspensi dengan 10 mL sukrosa-CaCl2. Suspensi diambil

sebagian saja sebanyak ukuran tabung vial dan diberi label “fraksi inti”.

Supernatan yang diperoleh dari praktikum sebelumnya disentrifugasi pada

5000 g selama 15 menit. Supernatan dituang ke wadah lain, kemudian pelet

dipindahkan secara kuantitatif dengan cara menambahakan larutan sukrosa 10 mL

0.34 mM-EDTA 1 mM, dimasukkan ke dalam tabung sentrifus 50 mL lalu pelet

dihaluskan dengan batang pengaduk. Kemudian ditambahkan larutan sukrosa-

EDTA hingga volumenya menjadi 20 mL, kemudian pelet disentrifugasi pada

24000 g selama 10 menit.

Data dan Hasil Percobaan

Tabel 1 Hasil fraksinasi subseluler

Meja Bobot hati (gram) Volume Homogenat (mL)

1 8.5713 g 19 mL

2 5.8890 g 15 mL

3 8.9600 g 28.8 mL

Lanjutan

Meja Bobot hati (gram) Volume Homogenat (mL)

4 8.6300 g 20.21 mL

Contoh perhitungan:

RCF = 24000 g

r = 108 mm

RPM?

RCF = 1.12 × r ×(RPM1000 )

2

24000 = 1.12 × 108 mm×(RPM1000 )

2

RPM = 14086 rpm

Pembahasan

Fraksinasi merupakan proses pemisahan suatu larutan menjadi fraksi atau

bagian-bagian tertentu. Prinsip fraksinasi adalah pembagian atau pemisahan yang

didasarkan pada bobot tiap fraksi, fraksi yang lebih berat akan berada paling dasar

sedangkan fraksi yang lebih ringan akan berada di atas. Fraksinasi umumnya

dibantu dengan sentrifugasi (Anonim 2008).

Praktikum kali ini menggunakan organel hati tikus dengan fraksi subseluler

untuk mengambil fraksi homogenat, fraksi inti, fraksi mitokondria, dan fraksi

mikrosom di dapat hasil dari percobaan, yaitu dari meja 1 diperoleh bobot hati

8.5713 gram dan volume homogenat 19 mL, meja 2 diperoleh bobot hati 5.880

gram dan volume homogenat 15 mL, meja 3 diperoleh bobot hati 8.9600 gram

dan volume homogenat 28.8 mL, dan meja 4 diperoleh 8.6300 gram dan volume

homogenat 20.21 mL.

Sentrifugasi adalah suatu metode yang digunakan untuk pemisahan sel atau

organel subseluler serta komponennya. Prinsip dasar sentrifugasi adalah partikel

yang terusupensi akan mengendap ke dasar karena pengaruh gravitasi. Ada dua

macam prinsip sentrifugasi yang didasarkan pada perbedaan kecepatan dan

sentrifugasi bobot jenis bertingkat. Sentrifugasi perbedaan kecepatan

pemisahannya dilakukan berdasarkan ukuran organel sel, sentrifugasi dilakukan

dari kecepatan rendah dan waktu yang singkat kemudian ditingkatkan kecepatan

dan waktunya. Hasil isolasi tidak sepenuhnya murni dari komponen yang lain,

sehingga perlu pemurnian lebih lanjut (Rickwood 1984).

Sentrifugasi bobot jenis bertingkat menggunakan suatu metode gradien dari

larutan yang pekat untuk memisahkan organel seluler berdasarkan bobot jenis

yang digunakan untuk tahap pemurnian. Sentrifugasi ini ada dua jenis, yaitu

sentrifugasi zonal dan sentrifugasi isopiknik (Rickwood 1984).

Sentrifugasi perbedaan kecepatan adalah yang digunakan dalam percobaan

kali ini. Hal ini disebabakan dalam sentrifugasi ini dapat diperoleh pecahan-

pecahan subseluler dari komponen sel berdasarkan ukuran organel selnya.

Pemisahan ini dilakukan dari kecepatan rendah dan waktu yang singkat, kemudian

ditingkatkan kecepatan dan waktunya, sebab organel memiliki ukuran yang

berbeda-beda sehingga diperlukan kecepatan yang berbeda-beda pula untuk

mengisolasi organel-organel tersebut. Selain itu, pada praktikum ini digunakan

sentrifugasi berdasarkan kecepatan karena teknik penggunaannya mudah dan

cepat (Rickwood 1984).

Isolat yang dihasilkan tidak murni karena dari percobaan tidak dapat dilihat

aktvitas enzim rendah atau tinggi dan fraksi-fraksi seperti inti, mitokondria,

mikrosom, lisosom, dan sitoplasma tidak dilakukan dalam praktikum kali ini.

Praktikum kali ini tikus yang digunakan adalah tikus berjenis kelamin jantan.

Tikus jantan yang digunakan karena tidak mengalami masa periode seperti yang

terjadi pada tikus betina, yaitu masa perubahan secara hormonal yang dapat

mempengaruhi aktivitas enzimatik. Tikus percobaan terdiri atas beberapa galur,

anatara lain: Wistar, Sprague Dawley, Long-evans, Zucker, Hairless, dan RCS.

Organ tubuh yang digunakan adalah hati, karena hati merupakan organel terbesar

dalam tubuh dan mengandung banyak organel seperti mitokondria yang berfungsi

sebagai penghasil ATP pada proses respirasi dan enzim-enzim yang dibutuhkan

oleh tubuh. Pemecahan sel hati tikus ini harus dilakukan pada suhu rendah dan

untuk menjaga agar tidak timbul panas yang dapat mengakibatkan organel sel

tidak aktif (Evenhius 1978).

Pemecahan sel hati dilakukan dengan menggunkan homogenizer yang

berfungsi untuk menghaluskan organ hati dan memecah membran plasma. Pada

fraksinasi subseluler ini digunakan larutan sukrosa-EDTA 0.34 mM yang

berfungsi melisis membran sel, meningkatkan stabilitas biokimia mitokondria dan

aktivitas degradasi mitokondria, serta meningkatkan fosforilasi endogenus. Selain

itu, dilakukan juga proses dekantasi sukrosa-EDTA atau larutan isotonis untuk

memecah-mecahkan selubung sel yang belum pecah. Dekantasi adalah pemisahan

komponen-komponen dalam campuran dengan cara dituang secara langsung

(Abynoel 2008).

Setelah proses penuangan berbagai macam larutan dilakukan proses

sentrifugasi. Hasil yang diperoleh adalah nukleus (inti sel) memerlukan gaya

sentrifus sebesar 1500 g atau setelah dikonversi menjadi 3522 rpm (rotations per

minute), sedangkan mitokondria memerlukan gaya yang lebih besar, yaitu 5000 g

setelah dikonversi menjadi 6429 rpm dan 24000 g setelah dikonversi menjadi

14086 rpm. Hal tersebut menunjukkan semakin kecil ukuran suatu komponen sel

maka akan semakin sulit untuk mendapatkan fraksinya dan juga semakin besar

kecepatan sentrifugasi yang diperlukan untuk mengisolasi komponen tersebut.

Dibawah ini dapat dilihat bagan fraksinasi subseluler.

Gambar 1 Skema isolasi komponen sel dengan cara sentrifugasi diferensial

(Campbell 2002)

Simpulan

Didapat hasil fraksinasi subseluler, yaitu dari meja 1 diperoleh bobot hati

8.5713 gram dan volume homogenat 19 mL, meja 2 diperoleh bobot hati 5.880

gram dan volume homogenat 15 mL, meja 3 diperoleh bobot hati 8.9600 gram

dan volume homogenat 28.8 mL, dan meja 4 diperoleh 8.6300 gram dan volume

homogenat 20.21 mL. Nilai RPM yang dipakai dalam sentrifus dengan gaya 700 g

adalah 2406 rpm. Untuk memperoleh fraksi inti pada gaya 1500 g nilai RPM yang

digunakan adalah 3522 rpm, sedangkan untuk isolasi mitokondria digunakan gaya

5000 g dengan nilai RPM-nya adalah 6429 rpm, dan gaya 24000 g dengan nilai

RPM 14086 rpm.

Daftar Pustaka

Abynoel. 2008. Pemisahan Dalam Campuran [terhubung berkala].

http://abynoel.com/modul-kimia [8 maret 2010]

[Anonim]. 2008. Dasar-dasar Isolasi Protein. [terhubung berkala].

http://inherent.brawijaya.ac.id/biomol/materi/Lectutre13.pdf.htm [9 maret

2010]

Campbell NA, Jane BR, Lawrence GM. 2002. Biologi. Lestari R et al,

penerjemah; Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Biology

Evenhius ES. 1978. Methods of Folair Analysis. Amsterdam: Institut Koninklikj

Voor de Amsterdam

Rickwood D. 1984. Centrifugation 2nd: a practical approach. Washington DC:

IRL pr