KROMATOGRAFI KOLOM SEDERHANA

Any Guntarti

Kromatografi Kolom SederhanaBergerak / aliran karena gaya grafitasi

↓Pemilihan fase diam + fase gerak

↓Kepolaran

↓Pita-pita kromatogram

↓Terbentuk fraksi-fraksi

↓Dianalisis dengan KLT / KK↓

Pemisahan Secara Kromatografi

Mikhail Tswett↓

Pigmen tumbuhan↓

Pita-pita

Pengisian Kolom

Fase diam

Pasir

Kapas / glass wool

• fase diam homogen• fase diam ukuran sama• fase diam bentuk seragam• bebas gelembung udara

Tehnis : fase diam + pelarut → bubur (fase gerak)

Kolom kromatografi sederhana (learning kolom)

CHCl3 : MeOH : H2O = 6,5 :2,5:0,4

Profil KLT preparatif di bawah UV 254 nm fase diam silika danfase gerak = kloroform: metanol: air = 6,5: 2,5: 0,4

Isolat yang diambil

Isolasi hasil fraksi dengan KLT Preparatif

Identifikasi kemurnian isolat dengan KLTCHCl3:MeOH:H2O= 6,5:2,5:0,4

Gambar KLT hasil purifikasi pada lampu UV 254 nm.fase diam = silika GF 254 nm, fase gerak= kloroform: metanol: air = 6,5: 2,5: 0,4

A B

A: isolat hasil isolasi I

B: isolat hasil isolasi II

Hasil spektra Spektrofotometri UV

Hasil spektra Infra Red

408.

4042

8.60

454.

51

603.

3467

7.34

1125

.61

1548

.63

1636

.87

2298

.27

2349

.20

3469

.93

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

%T

500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

Wavenumbers (cm-1)

Gambar. berbagai metode pemisahan

• Contoh:

11

Klasifikasi Sistem Kromatografi

Umum Tehnik Spesifik

Fase diam Keseimbangan

1. K. Cair

(LC)

LLC LSC IEC

Cair pd padatan

Padatan

Resin

Partisi

Adsorbsi

Tukar ion

2. K. Gas

(GC)

GLC GSC Gas terikat

Cair pd padatan

Padatan

Padatan

Partisi

Adsorbsi

P / A

SKALA PRIORITAS / DERET ELUOTROPIK

n.PentanaIso oktanaSiklo hexanaCCl4XylenaToulenaBenzenaCHCl3AsetonEtil asetatAnilinAsetonitrilIso propanolEtanolMetanolAsam asetat

Pelarut Kekuatan / E0

00.010.040.180.260.290.320.400.560.580.620.650.820.880.95besar

Kromatografi

Fase diam fase gerak ↓ ↓ Statinary phase mobile phase

Pemisahan ↓ Perbedaan laju migrasi

Polaritas senyawa

Hukum Distribusi Kromatografi↓

perbedaan distribusi komponen di dalam FG & FD

↓koefisien distribusi / partisi (K)

↓K = CS /CM

CS : kons. Molar komponen dlm FDCM: kons. Molar komponen dlm FG

Secara ideal : CS & CM ↓

kurva linier

0

CS

CM

Macam-macam bentuk kesetimbangan CS & CM

DB

A

C

CM

CS

Kurva A : ideal → tidak saling campur → kromatografi Linier

B/C : ada asosiasi & desosiasi D : ada reaksi isoterm adsorpsi

↓Kromatografi → cenderung kurva A → konsentrasi relatif rendah

Elusi dalam kolom kromatografi

D

Sp Solvent

E

E

B + E

A + E

E

sign

alko

lom

tR

Elusi : proses terbawanya komponen dlm suatu camp, shg ada pemisahan komponen yg dibawa oleh FG dari ujung atas kolom → bawahtR : waktu yg diperlukan oleh komponen untuk bermigrasi sepanjang kolomVr : volume FG yg dibutuhkan untuk membawa komponen dari titik awal kolom → akhir kolom

F : laju alir FG yang menyatakan jumlah vol FG per satuan waktu ↓ F = VR / tR

tR = VR / F

Dalam kolom yang ideal ↓ Komp. yang tidak teretensi ↓ t = 0 ↓Komp. di atas memerlukan waktu untuk bermigrasi → tM : waktu FG melewati kolom VM : fraksi volum kolom yang dilalui komponen →

tR’ = tR – tM

VR’ = VR – VM terkoreksi

Untuk menerangkan proses pemisahan dlm kromatografi ada 2 macam teori :

1. Teori Lempeng (Plate Theory) ↓ Martin & Synge (1941) ↓ Efisiensi kolom ↓Apabila jumlah kesetimbangan makin besar→ efisiensi >> → menambah jumlah lempeng (N) → tebal lempeng teoritik → HN & H → menyatakan efisiensi ↓ Secara matematis : N = L / HKelemahan teori : tidak mampu mengidentifikasi variabel-variabel yangmempengaruhi pelebaran pita kromatogram

2. Teori Kinetik ( Kinetics Theory)

Dapat mengatasi kelemahan teori Plate.

→ teori laju / rate theory

↓Partikel komponen bermigrasi diantara FG & FD

↓ Migrasi sangat tidak teratur

↓ Energi thermal ↓

Gerakan partikelnya random ↓

Ditribusi simetrik Gauss

H.E.T.P

H = 16 L x (Wb / tR)2

N = 16 x (tR / Wb)2 = (4tR/W)2

Simetrik Gauss → t (waktu) lama →puncak lebar

Menurut Van Deemter ↓

Ada 3 proses secara stimultan yg mempengaruhi variabilitas laju

migrasi komponen diantara FG & FD :

1. Difusi Eddy (Eddy diffusion)2. Difusi longitudinal (longitudinal diffusion)3. Proses transfer massa ↓Pada tebal lempeng teoritik (H) → merupakan fungsi linier variabilitas laju migrasi komponen ↓ Persamaan Van Deemter H = A + B /µ + C.µ

A = koefisien Difusi Eddy B = koefisien Difusi longitudinalC = (CS + CM) = koefisien total

Difussi longitudinal ↓ Pelebaran pita ↓Molekul komponen dlm FG → bermigrasi dari konsentrasi tinggi ke

konsentrasi rendah

↓ Kontribusi variabilitas laju migrasi yg menurun secara hiperbolik

terhadap kenaikan kecepatan linier FG (µ)

↓ Pada tebal lempeng teoritik

DM = koefisien difusi komponen FG Ψ = kualitas packing FD ↓ 0,6

HLD = 2ΨDM

µ=

B

µ

Pelebaran pita Transfer Massa ↓ Konstribusi H akan naik apabila kec. Linier FG naik ↓ Makin cepat kec. FG akan makin singkat proses transfer

massa → pemisahan rendah

• Pelebaran pita diffuse Eddy ↓ Akibat tidak homogen pori dalam packing kolom ↓ Ada yang jalannya pendek dan ada yang panjang

Composite curve

C standar

C mobile

A

B

H min

H. Opt

H

Proses migrasi

H = A + B / µ + C.µ → Persamaan Van Deemter

Kromatografi camp. 2 komp, yang mengalami retensi & tidakW

t (waktu)

Sin

yal a

nalit

ik

tM

tA

0

Profil konsentrasi komp. A & B dalam kolom pada jarak migrasi yang berbeda

A Bkon

sen

tra

si

Jarak migrasi

VARIABEL TERMODINAMIKA PADA PEMISAHAN

Mempengaruhi kualitas kolom

1. Waktu Retensi

2. Faktor-faktor kapasitas kolom (k’) Ratio jumlah molekul komponen dalam FD terhadap jumlah molekul komponen dalam FG

V =tR

tM

x µ Laju migrasi komponen

Lanjutan…

k’ =nS

nM

[ CS x VS ]

[ CM x VM ]=

k’ =VS

VMx k

k’ =( tR – tM)

tM

tR’

tM

=

Pengalaman : k’ < 1 ↓ Tidak memisah

Disarankan : k’ semakin besar ↓ Pemisahan ↑ ↓ k’ > 10 ↓ Tidak ekonomis

3. Faktor selektivitas (α) ↓ Ratio koef. Distribusi 2 komponen yang akan

dipisahkan ↓ Menggambarkan kemampuan pemisahan suatu kolom ↓ α = KB / KA

KB / KA = koef. Distribusi komp. B / A

Dimana : KB = koef. Distribusi komponen B yg teretensi kuat dalam kolom

KA = koef. Distribusi komponen A yg teretensi lemah dalam kolom

Ada hubungan dengan k’↓

α = KB’ / KA’

↓

α =(tR)B - tM

(tR)A - tM

4. Resolusi Kolom (Rs)

ΔZ = jarak puncak A & puncak BWA = lebar dasar kromatogram A

WB = lebar dasar kromatogram B

RS=ΔZ

0,5WA + 0,5WB

2 ΔZ

( WA + WB ) =

WA + WB

2 [ (tR)B – (tR)A ]RS=

Disarankan RS ≥ 1,5↓

Hubungan dengan faktor-faktor lain

RS =VN

4x

( α – 1)

α xk’B

( 1 + k’B )

Sesungguhnya sedekah itu dapat menghilangkan

murka Alloh & dapat menghilangkan kematian

yang buruk(HR. at-Tirmidzi)

Sesungguhnya sedekah itu dapat menghilangkan

murka Alloh & dapat menghilangkan kematian

yang buruk(HR. at-Tirmidzi)

33

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

Any Guntarti

POMPA

DC18

Injektor

SKEMA HPLC

Integrator

Kolom analitik

Ke penampungan

Instrumen HPLC

1. Reservoir Fase Gerak↓

Bisa lebih dari 1↓

dari gelas / stainless steel↓

Daya tampung 1- 2 LDilengkapi degasser (menghilangkan gas terlarut) →

gas NO2 & O2 → membuat gelembung-gelembung di dalam kolom & detektor

↓ - Pelebaran pita analit - Respon detektor terganggu

• Degassing → pompa vakum dihubungkan reservoir &

diaduk / dipanaskan

Solven disaring dengan kertas Millipore

Pemisahan dengan 1 jenis FG dengan konsentrasi konstan

→ Elusi Isokratik

Bila dengan 1 atau lebih FG yang polaritasnya berbeda →

Elusi Gradien

Digunakan FG segar → mendapatkan hasil yang

reprodusibilitas optimum dalam pemisahan

2. Pompa

Tekanan ≥ 1000 psi (4000 – 6000psi)

Kec. Alir 1-3ml/menit

Bahan harus resisten secara kimiawi

Ex : dari teflon & stainless steel

Tidak ada pulsa getaran

Kontinyu

3. Peredam Pulsa Fase Gerak

Ada beberapa detektor sensitive terhadap

variasi kec. Alir FG → ex : index refraksi,

elektrokimia & konduktometer

Peredam aliran dengan gas yang ditekan

4. Sistem Injeksi Sampel

Menentukan presisi perhitungan → reprodusibilitas

sampel

Sampel dimasukkan dengan tekanan tinggi →

merupakan pita dengan sampel tipis → pelebaran

diperkecil

Konvensional atau automatik

Injektor Automatik

5. Kolom Kromatografi

Bentuk tabung, permukaan dalam rataDari gelas / stainless steelLapisan luar kadang dilapisi logam → menahan tekanan ad 6000 psi, rx kimia dari FGSambungan kolom → tidak menyebabkan FG stagnantPanjang kolom (10 – 30) cmAnalisis pemisahan cepat (3 – 8) cmInternal diameter (4 – 5)mmPartikel diameter (3 – 5) µmGuard kolom → sebelum kolom analitik

Kolom dari stainless steel

 

6. Detektor

Pemilihan didasarkan pada problem pemisahan↓

Harus sensitif (menghindari pelebaran)

Ada 2 macam :

1. Berdasarkan sifat umum larutanRefraktif indeks → control temperaturKurang sensitive

2. Berdasarkan sifat solut/analit/sampel

UV – VisFluorescenceElektrokimia

↓Sinyal analit yang berbeda dari FG

↓Lebih sensitif (µg – ng)

↓Dikembangkan dengan derivatisasi pre & post kolom

Derivatisasi/modivikasi Instrumen HPLC

50

Alur sampel ke Detektor

7.Interpretasi output dari Detektor/integrator

• Direkam berupa rangkaian puncak-puncak• Puncak untuk data kualitatif dan kuantitatif

Profil kromatogram

Dalam gambar, area di bawah puncak Y < dibanding dengan area dibawah puncak X. Hal ini mungkin disebabkan :a.Karena Y lebih sedikit dari Xb.Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X.

Rangkaian HPLC pada spektrometer massa

Pada saat detektor menunjukkan puncak, beberapa senyawa sementara melewati detektor dan pada waktu yang sama dapat dialihkan pada spektrometer massa. Pengalihan ini akan memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan pada data komputer dari senyawa yang polanya telah diketahui. Ini berarti bahwa identifikasi senyawa dalam jumlah besar dapat ditemukan tanpa harus mengetahui waktu retensinya.

Fase Normal HPLC• Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan

pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm panjang 150 sampai 250 mm.

Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

Fase Balik/Reverse Phase HPLCSilika dimodifikasi menjadi non polar berupa atomkarbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polardigunakan berupa campuran air dan alkoholseperti metanol.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan bereaksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.

Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC.

Hasil Analisis dengan menggunakan HPLC