ANALISIS OBATMULTIKOMPONENDENGANKROMATOGRAFI GAS(KG)

PENDAHULUAN• Kromatografi gas (KG) merupakan teknik

instrumental yang dikenalkan pertama kali padatahun 1950-an.

• GC merupakan metode yang dinamis untukpemisahan dan deteksi senyawa-senyawa organikyang mudah menguap dan senyawa-senyawa gasanorganik dalam suatu campuran.

• Perkembangan teknologi yang signifikan dalambidang elektronik, komputer, dan kolom telahmenghasilkan batas deteksi yang lebih rendah sertaidentifikasi senyawa menjadi lebih akurat melaluiteknik analisis dengan resolusi yang meningkat.

•GC menggunakan gas sebagai gaspembawa/fase geraknya.

•Ada 2 jenis kromatografi gas, yaitu

1. Kromatografi gas–cair (KGC) yang fasediamnya berupa cairan yang diikatkan padasuatu pendukung sehingga solut akanterlarut dalam fase diam;

2.Kromatografi gas-padat (KGP), yang fasediamnya berupa padatan dan kadang-kadang berupa polimerik.

DERIVATISASI

•Derivatisasi merupakan proses kimiawi untukmengubah suatu senyawa menjadi senyawalain yang mempunyai sifat-sifat yang sesuaiuntuk dilakukan analisis menggunakankromatografi gas (menjadi lebih mudahmenguap).

Alasan dilakukan derivatisasi:• Senyawa-senyawa tersebut tidak memungkinkan

dilakukan analisis dengan GC terkait denganvolatilitas dan stabilitasnya.

• Untuk meningkatkan batas deteksi dan bentukkromatogram. Beberapa senyawa tidak menghasilkanbentuk kromatogram yang bagus (misal puncakkromatogram saling tumpang tindih) atau sampelyang dituju tidak terdeteksi, karenanya diperlukanderivatisasi sebelum dilakukan analisis dengan GC.

• Meningkatkan batas deteksi pada penggunaandetektor tangkap elektron (ECD).

• Meningkatkan volatilitas, misal senyawa gula.

• Tujuan utama derivatisasi adalah untuk meningkatkanvolatilitas senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap(non-volatil).

• Senyawa-senyawa dengan berat molekul rendah biasanyatidak mudah menguap karena adanya gaya tarik-menarikinter molekuler antara gugus-gusug polar karenanya jikagugus-gugus polar ini ditutup dengan cara derivatisasiakan mampu meningkatkan volatilitas senyawa tersebutsecara dramatis.

• Meningkatkan deteksi, misal untuk kolesterol dansenyawa-senyawa steroid.

• Meningkatkan stabilitas. Beberapa senyawa volatilmengalami dekomposisi parsial karena panas sehinggadiperlukan derivatisasi untuk meningkatkan stabilitasnya.

Contoh Derivatisasi Yang Digunakan UntukMemperbaiki Bentuk Puncak Pseudoefedrin :

Prosedur

• Sirup dekongestan dibasakan dengan amonia dan diekstraksike dalam etil asetat sehingga akan menjamin bahwa semuakomponen yang terekstraksi berada dalam bentuk basabebasnya daripada bentuk garamnya.

• Bentuk basa inilah yang bertanggungjawab pada bagusnyabentuk puncak kromatografi.

• Garam-garam atau basa-basa akan terurai karena adanyapanas pada lubang suntik GC, sehingga dengan adanya prosesini akan dapat menyebabkan terjadinya peruraian.

• Jika ekstrak pada sirup dekongestan di lakukan kromatografi gassecara langsung maka kromatogram yang dihasilkan seperti gambardibawah.

Basa bebas triprolidin dandekstrometorfan menunjukkanbentuk puncak yang bagus, akantetapi pesudoefedrin yangmerupakan basa yang lebih kuatkarena adanya gugus hidroksil dangugus amin memberikan bentukpuncak yang kurang bagus. Hal inidapat diatasi dengan menutup guguspolar (gugus hidroksi dan amin) padapseudoefedrin dengan caramereaksikannya menggunakantrifluoroasetat anhidrida (TFA).

Perlakuan dengan TFA initidak menghasilkan senyawaderivatif terhadap senyawa-senyawa basa tersier dalamekstrak (sirup dekongestan)ini. Reagen TFA ini sangatbermanfaat karena reagenini sangat reaktif dan bertitikdidih rendah (400C)sehingga kelebihan reagenTFA ini mudah dihilangkandengan cara evaporasisebelum dilakukankromatografi gas.

Contoh analisis obat dengan Kromatografi Gas

• Asam benzoat bersama-sama dengan asam sorbatdapat ditentukan kadarnya dengan kromatografi gas.

• Asam benzoat dan asam sorbat diisolasi dari sampeldengan mengekstraknya menggunakan eter dandipartisi dengan larutan NaOH dan diklorometan.

• Asam-asam ini diubah dengan cara derivatisasimenjadi ester trimetilsilil (TMS) lalu ditetapkankadarnya dengan kromatografi gas.

• Asam fenil asetat dan asam kaproat digunakansebagai baku internal

• Larutan baku internal disiapkan dengan melarutkan 250mg asam fenil asetat dan 250 mg asam kaproat ke dalam100 ml larutan KOH 3%. Sebagai agen penderivat adalahN-metil-N-trimetilsilil-trifluoroasetamid (MSTFA).

• Larutan baku dibuat dengan cara mencampur asambenzoat ,asam sorbat, asam fenil asetat, dan asamkaproat dengan konsentrasi akhir masing-masing sebesar

• 200, 200, 750 dan 750 μg/ml

• 400, 400, 750 dan 750 μg/ml

• 600, 600, 750 dan 750 μg/ml

• 800, 800, 750 dan 750 μg/ml

• 1000, 1000, 750 dan 750 μg/ml

Kondisi kromatografi yang digunakan

•Kolom 1,8 m x 2 mm i.d yang dilapisi denganOV-1 3% (100-120 mesh). Suhu operasional,oven:80-2100C dengan kenaikan 80C/menit;lubang injector 2000C, detector ionisasi nyala(FID) 2800C. gas pembawa : nitrogen dengankecepatan alir 20 ml/menit. Waktu retensiasam kaproat, asam sorbat, asam benzoat, danasam fenilasetat masing-masing kurang lebih2,5;4;5; dan 6 menit.

Penyiapan sampel

•Sampel dihomogenkan dengan pengadukan.Jika sampel sulit dihomogenkan makadigunakan teknik apapun sehingga sampelhomogen.

Ekstraksi Sampel• Sebanyak kurang lebih 5 g sampel yang telah homogen ditimbang secara

seksama lalu dimaukkan ke dalam tabung sentrifugasi 30 ml.

• sampel selanjutnya ditambah 3,0 ml larutan baku internal; 1,5 ml asamsulfat (1 bagian H2SO4 pekat dalam 5 bagian air); 5 gram pasir dan 15 mleter. Tabung sentrifuse ditutup rapat lalu digojog secara mekanik selama 5menit dan disentrifus dengan kecepatan 1500 x selama 10 menit.

• Lapisan eter dikumpulkan dan diekstraksi 2 kali masing-masing dengan 15ml eter. Lapisan eter dikumpulkan dan diekstraksi 2 kali masing-masingdengan 15 ml NaOH 0,1 N dan 10 ml larutan NaCl jenuh. Lapisan airdikumpulkan dan dimasukkan corong pisah 250 ml lalu ditambah dengan 2tetes indikator metal jingga dan selanjutnya diasamkan dengan HCl (1bagian HCl pekat dalam 1 bagian air) hingga pH-nya 1.

• Larutan selanjutnya diekstraksi dengan diklorometan 3 kali masing-masingdengan 75, 50 dan 50 ml. Jika terbentuk emulsi, sebanyak 10 ml larutanNaCl jenuh ditambahkan kedalam larutan.

• Larutan diklorometan yang telah terkumpul selanjutnya ditambah dengan15 g natrium sulfat anhidrat lalu diuapan dengan rotavapor pada suhu400C.

Derivatisasi Sampel

• Residu diklorometan ditambah dengan 10 ml kloroform,dimasukkan dalam labu, dan digojog secara manualselama 2 menit.

• Sebanyak 1 ml larutan kloroform ini dipindahkan kedalam5 tabung uji 8 ml lalu ditambah 0,2 ml agen penderivat(sililasi) dan dipanaskan dalam penangas air shu 600Cselama 15 menit.

• Sebanyak 1 μL sampel diinjeksikan sebanyak 2 kali.

• Dihitung tinggi puncak sampel lalu dihitung rasio tinggipuncak asam benzoate/asam fenilasetat dan rasio tinggipuncak asam sorbet/asam kaproat. Perbedaan rasiotinggi puncak untuk 2 kali injeksi ≤ 5%.

Penyiapan kurva baku

• Sebanyak 1,0 ml larutan baku dipindahkan ke dalam 5 tabung uji 8ml lalu ditambah 0,2 ml agen penderivat (silisasi) dan dipanaskandalam penangas air suhu 600C selama 15 menit.

• Sebanyak 1 ml sampel diinjeksikan sebanyak 2 kali.

• Dihitung rasio tinggi puncak asam benzoat/asam fenilasetat danrasio tinggi puncak asam sorbet/asam kaproat. Perbedaan rasiotinggi puncak untuk 2 kali injeksi ≤ 5% . kurva baku dibuat dengan menghubungkan antara rasio berat (x) dan rata-rata rasio tinggipuncak untuk masing-masing pengawet (asam benzoat dan asamsorbat), lalu dihitung slope (b), intersep (a), dan koefisien korelasi(r).

Perhitungan

Kadar pengawet (mg/kg) = x x 1000

•b = slope (kemiringan) kurva baku

•a = intersep kurva baku

•y = rata-rata rasio pengawet/baku internal

•W= berat sampel (dalam g)

•W’=berat baku internal (dalam mg)

Perhatikan jika ada faktor pengenceran.

SEKIAN