KOLOM CHROMATOGRAF

Adalah pemisahan suatu solute dari campurannya dalam solven tertentu (fasa mobile) yang didasarkan pada mudah-sulitnya suatu solute melewati unggun (bed) padatan (fasa stationer) yang berfungsi sebagai media separator sehingga masing-masing solute akan mempunyai kecepatan melewati bed yang berbeda-beda dan keluar bed dengan waktu yang berbeda-beda pula. Hal ini yang mendasari pemisahan secara chromatography. Larutan feed yang mengandung berbagai macam solute diumpankan ke kolom chromatograf yang berisi unggun bead kemudian dituangkan cairan eluant ( biasanya air ). Unggun bead separator akan secara selektif memperlambat laju masing-masing solute sehingga semakin panjang unggun bead akan semakin tinggi tingkat separasinya dan saat keluar dari bawah kolom solute akan terpisah-pisah dengan selang waktu tertentu.

Walaupun metoda separasi-purifikasi ini baru mulai berkembang diakhir perang dunia II, saat ini semakin banyak industri khususnya bioproses yang menggunakannya. Hal ini didukung oleh kemajuan pembuatan resin bead yang lebih selektif dan sistem kontrol otomatis yang memungkinkan pemisahan bisa dilakukan secara akurat.(penggunaan on line measurement & automation system)

Berdasarkan pada sifat retentif fasa stasioner terhadap solute, ada 4 metoda pemisahan secara chromatograf ini :

Adsorption chromatografi Ion exchange chromatografi Gel filtration atau Gel permeation chromatografi Affinity chromatografi

Dalam adsorption chromatografi, physicals surface force yang akan menahan solute yang bersifat nonpolar dan non volatile. Sebagai adsorbennya banyak digunakan silika, alumina, karbon aktif dan makroporous nonionik polimer dan sebagai eluant-nya banyak digunakan solven organik ber-BM rendah.

Dalam ion exchanger chromatografi, terjadi ikatan kimiawi heteropolar akan terjadi diantara ion-ion dalam fasa stationer dan fasa mobile. Bead ion exchanger baik yang hidrophobik maupun yang hidrophilik yang telah diberi gugus fungsional. Sebagai cairan eluant untuk produk-produk bioproses biasanya air ataupun larutan buffer.

Selain itu phasa stationer juga berfungsi sebagai filter solute berdasarkan pada ukuran molekulnya. Mekanisme ini dikenal sebagai gel filtration chromatografi, atau gel permeation chromatografi. Metoda ini didasarkan pada gel yang akan mengembang didalam air sehingga bersifat seperti filter untuk molekul-molekul solute. Dow Chemical menggunakan gel yang dibuat dari polystyrene gel yang mengembang dalam solven organik untuk memfilter senyawa polimer synthetis berdasarkan ukurannya.

Affinity chromatografi didasarkan pada sifat unit produk bioproses yaitu mempunyai kecenderungan berinteraksi secara selektif dan bersifat reversible dengan molekul-molekul tertentu. Sifat inilah yang dikembangkan untuk metoda affinity chromatografi.

Berdasarkan pada type solute yang bisa dipisahkan, pemisahan chromatografi dapat diklasifikasikan menjadi 3 type :

Affinity differences Ion exclusion Size exclusion

Affinity chromatografi baru dikembangkan pada tahun 1968 untuk pemurnian protein (enzym), dimana metoda separasi ini didasarkan pada biospecific recoqnition (pengenalan gugus spesifik suatu senyawa) diantara suatu solute tertentu oleh gugus senyawa spesifik (=ligand) yang diimobilisasi kesuatu material supportnya (menjadi fasa stationer-nya).

Karena selektivitas separasinya lebih tinggi dari metoda yang lain, maka pemurnian dengan metoda affinitas ini dapat mempersingkat proses sekaligus menurunkan biaya pemurnian. Hal inilah yang membuat metoda ini sangat cepat berkembang dan digunakan dalam industri bioproses secara luas.

Peranan resin sangat dominan dalam affinity separasi ini, sehingga banyak dikembangkan berbagai resin untuk keperluan purifikasi solute tertentu pula. Secara skematik dapat digambarkan sebagai berikut.

Perbedaan affinitas solute pada fasa stasioner dan fasa mobile didasarkan pada koeffisien distribusi solute Kd yaitu perbandingan konsentrasi solute dalam resin dan dalam larutan atau

Kd = Cr / Cl

Sedangkan faktor separasi α adalah perbandingan antara koeff distribusi solute satu dengan solute yang lain atau

α = Kd1 /Kd2

harga α ini dapat dipakai untuk mengetahui urutan separasi yang terjadi dalam kolom chromatograf untuk suatu jenis resin tertentu yang digunakan sebagai fasa stasionernya.

Contoh rasio koeffisien distribusi individu formaldehyde : aceton sering disebut faktor separasibilitas dalam resin Dowex 50WX8(H+) adalah 2,03 dan dalam resin Dowex 1X8 (Cl-) adalah 1,02 . Maka berdasarkan definisi tersebut diatas akan lebih baik digunakan resin Dowex 50WX8(H+) karena lebih besar affinitasnya terhadap solute. Sedangkan yang akan keluar duluan dari kolom adalah aseton, sesuai rule of thumb : yang keluar duluan adalah yang berfungsi sebagai penyebut bila nilai rasionya lebih besar dari 1, atau akan terjadi sebaliknya bila kurang dari 1.

Type pemisahan seperti ini sudah digunakan secara luas di industri untuk pemisahan fructose dari glucose untuk membuat fructose syrup dari 55 hingga 90 %. Penggunaan lain affinity separation ini antara lain untuk pemurnian enzyme, protein, antibody,asam-asam nukleat.

Ion exclusion merupakan pemisahan suatu senyawa berbentuk ion dari senyawa-senyawa lain non ionik. Senyawa ionik akan tertahan diluar resin bead oleh adanya gaya repulsi ionik resin, sedangkan senyawa non ionik akan larut dalam solven yang terserap masuk dalam bead. Karena senyawa ionik bergerak diluar bead maka akan dapat keluar terlebih dulu dari resin bed dibanding solute yang tertahan dalam resin bead. Aplikasi type ini dalam industri contohnya pemisahan sukrose yang non ionik dari komponen komponen ionik dalam molasses.

Penggunaan lain ion exclusion dalam industri adalah pemisahan MSG dari asam-asam amino lainnya yang juga telah ternetralkan oleh penambahan NaOH. Larutan asam amino mula-mula dinetralkan dengan NaOH hingga pH 7.2 maka akan membentuk garam sodium dari asam amino, kemudian dilewatkan resin kation asam kuat dari asam sulfonat. MSG akan terelusi pertama kali, baru kemudian garam sodium dari asam-asam amino lainnya.

Dalam size exclusion chromatografi, bead resin berfungsi sebagai filter molekuler (moleculer sieves) dimana molekul yang kecil bisa masuk ke dalam bead resin sedangkan yang besar lolos dan tetap mengalir diluar resin bead, sehingga lebih cepat keluar dari kolom. Contoh pemakaian tipe ini adalah pemisahan dextrose dari senyawa disacharida dan poly sacharida