TINJAUAN PUSTAKA

Muara sungai

Muara sungai termasuk ke dalam ekosistem estuari, dimana air tawar dan air

laut bercampur. Bahan-bahan organik dan anorganik yang terdapat di muara

sungai sebagian diendapkan, terlarut dan terbawa oleh arus ke laut. Salah satu

proses yang mempengaruhi konsentrasi bahan-bahan organik dan anorganik pada

muara sungai adalah proses biologi (Chester 1990).

Menurut Dahuri et al. (1996) kualitas air suatu perairan pesisir seperti

muara dicirikan oleh karakteristik kimianya yang mudah dipengaruhi oleh

masukan air yang berasal dari daratan (melalui sungai) dan lautan sekitarnya.

Proses pembuangan limbah dari daratan melalui aliran sungai atau dari lautan

yang berlangsung secara terus menerus akan mengakibatkan turunnya kualitas air

muara sungai. Pencemaran muara sungai oleh senyawa nitrogen lebih dominan

berasal dari daratan.

Pada muara sungai terjadi daur biogeokimia nitrogen, yaitu terjadinya

perubahan-perubahan senyawa atau unsur nitrogen dalam medium dan peristiwa

yang berbeda. Beberapa proses transformasi senyawa nitrogen melibatkan

berbagai jenis bakteri yaitu bakteri yang berperan dalam amonifikasi, asimilasi,

fiksasi, nitrifikasi dan reduksi nitrat disimilatif.

Amonifikasi adalah proses pembentukan amonia dari materi organik

dilakukan oleh bakteri dan cendawan safrofit. Asimilasi adalah proses

pemanfaatan senyawa nitrogen anorganik untuk pembentukan asam amino dalam

protoplasma. Fiksasi nitrogen yaitu peristiwa pengikatan gas nitrogen (N2)

umumnya terjadi di daratan, simbiosis alga di perairan dan percampuran nitrogen

dari atmosfer. Nitrifikasi merupakan reaksi oksidasi pembentukan nitrat yang

berasal dari amonia. Reduksi nitrat disimilatif merupakan reaksi reduksi terhadap

nitrat dimana nitrat direduksi melalui tahap-tahap tertentu dengan hasil akhir

amonium atau gas nitrogen. Reduksi nitrat disimilatif yang dominan terjadi di

atas sedimen muara sungai adalah denitrifikasi (Dong et al. 2002). Denitrifikasi

yaitu reaksi reduksi yang mengubah nitrat menjadi nitrit, nitrit oksida, nitrous

oksida dan terakhir gas nitrogen. Reduksi nitrat disimilatif yang dominan pada

bagian sedimen muara sungai adalah nitrat amonifikasi disimilatif (Rusmana

2003a).

Madigan et al. (2006) menyatakan proses penghilangan senyawa nitrogen

di tanah dan perairan melalui proses denitrifikasi dan anaerob ammonia oxidation

(anammox). Kedua proses tersebut menghasilkan gas nitrogen dan nitrous oksida

(denitrifikasi) sebagai produk akhir. Proses ini jika terjadi di areal pertanian dapat

menurunkan produktivitas hasil pertanian.

Senyawa-senyawa nitrogen yang terdapat di muara sungai secara umum

terlibat dalam daur biogeokimia seperti yang dijelaskan oleh Kennish (1994)

seperti terlihat pada Gambar 1.

Gambar 1 Daur biogeokimia nitrogen di perairan

Muara Sungai Cimandiri dan Cisadane

Muara Sungai Cimandiri kabupaten Sukabumi Jawa Barat, merupakan

muara sungai yang telah tercemar. Berbagai sampah rumah tangga / pemukiman,

limbah areal pertanian (sawah, perkebunan) dan bahan-bahan lain sepanjang

Daerah Aliran Sungai (DAS) Sungai Cimandiri terakumulasi di muara. Kualitas

air pada muara sungai Cimandiri sudah mengalami penurunan (Marnis 2008).

Selain limbah yang masuk ke perairan sungai, aktivitas penambangan pasir

sepanjang DAS menyebabkan warna perairan di sekitar muara menjadi coklat

sampai jarak yang cukup jauh dari pantai (Marnis 2008). Pada kondisi kimia dan

fisik perairan seperti itu akan memicu pertumbuhan mikroorganisma-

mikroorganisma aerob fakultatif dan anaerob disamping bakteri aerob, termasuk

mikroorganisme yang memanfaatkan senyawa nitrogen baik organik (protein,

asam amino) atau senyawa anorganik (nitrat, nitrit, dan amonium).

Muara Sungai Cisadane merupakan muara sungai yang tingkat

pencemarannya lebih tinggi dari muara Sungai Cimandiri. Sungai Cisadane selain

sebagai sumber air yang dimanfaatkan penduduk untuk keperluan sehari-hari,

juga merupakan sumber perairan pertanian. Disamping itu berfungsi sebagai

tempat penampungan limbah yang berasal dari limbah rumah tangga, industri,

pertanian dan perternakan (Brahmana & Suriati 2001).

Beberapa parameter kualitas air yang menunjukkan muara Sungai Cisadane

tercemar adalah rendahnya kandungan oksigen terlarut, tingginya konsentrasi

nitrit dan amonia serta suhu perairan yang tinggi. Kandungan oksigen terlarut

berkisar antara 0,39-2,33 mg/l, dan suhu 32,0-32,60C. Kandungan senyawa nitrit

0,03-0,14 mg/l dan amonia 0,09-1,19 mg/l (Syahputra 2007). Tingkat pencemaran

muara Sungai Cisadane pada musim hujan akan lebih rendah karena faktor

pengenceran oleh air hujan, termasuk air hujan dari hulu melalui aliran sungai.

Muara sungai yang banyak mengandung limbah organik dan anorganik yang

mengandung senyawa nitrogen diduga menghasilkan emisi Nitrous Oksida (N2O)

yang lebih besar. Emisi N2O dari perairan dan muara kurang lebih 66%, produksi

gas ini berkorelasi positif dengan konsentrasi nitrat atau nitrit perairan (Seitzinger

& Kroezen 1998; Rusmana 2003c).

Pada kedua muara sungai diatas senyawa nitrogen umumnya berasal dari

limbah organik rumah tangga sepanjang daerah aliran sungai yang mengalami

dekomposisi, limbah pupuk nitrogen anorganik areal pertanian dan senyawa

nitrogen anorganik tanah yang mengalami erosi tepi sungai. Sumber senyawa

nitrogen lain berasal dari proses nitrifikasi, proses dekomposisi mikroorganisma

dan eksresi organisma di habitat muara sungai serta gas oksida nitrogen dari udara

yang terlarut melalui air hujan. Limbah industri merupakan faktor utama

pencemaran yang meningkatkan senyawa nitrogen pada muara Sungai Cisadane

disamping faktor-faktor di atas.

Bakteri Pereduksi Nitrat

Kelompok bakteri pereduksi nitrat merupakan mikroorganisma yang terlibat

dalam daur nitrogen di alam. Kelompok bakteri ini berperanan dalam pengubahan

senyawa nitrat menjadi produk akhir gas nitrogen atau senyawa amonium.

Rusmana (2003b) menyatakan bahwa terdapat tiga proses reduksi nitrat

disimilatif pada bakteri yaitu denitrifikasi, reduksi nitrat menjadi amonium

disimilatif dan oksidasi amonium disimilatif (anaerob ammonia oxidation,

anammox). Denitrifikasi adalah proses reduksi nitrat menjadi N2O atau N2. Pada

proses ini bakteri menggunakan nitrat sebagai penerima elektron terakhir untuk

memperoleh energi pada kondisi O2 terbatas atau anaerob (Zumft 1997; Ricardson

2000; Ricardson et al. 2001). Reduksi nitrat menjadi amonium disimilatif adalah

proses untuk menghilangkan kelebihan tenaga pereduksi dan menunjang

pertumbuhan bakteri pada kondisi anaerob (Cole 1996). Anamoks adalah oksidasi

amonia secara anaerobik dimana terjadi pengubahan amonium dan nitrat atau

nitrit menjadi gas nitrogen. Pada metabolisma ini membentuk senyawa antara

hidroksil amin dan hidrazin (Jetten et al. 2001).

Tiga lintasan proses reduksi nitrat oleh aktivitas bakteri dapat digambarkan

sebagai berikut (Rusmana 2003b).

(3)

Enzim-Enzim yang Berperan pada Reduksi Nitrat

Kelompok bakteri pereduksi nitrat baik denitrifikasi, bakteri DNRA maupun

anamoks memiliki enzim-enzim tertentu untuk mengkatalisasi reaksi-reaksi

reduksi nitrat. Enzim pada bakteri denitrifikasi adalah nitrat reduktase (Nar dan

Nap), Nitrit reduktase (Nir), Nitrit oksid reduktase (Nor), Nitrous oksid reduktase

(Nos) (Moreno - Vivian et al. 1999; Zumft 1997; Ricardson et al. 2001).

Bakteri DNRA memiliki enzim nitrat reduktase (Nap dan Nar) yang

mereduksi nitrat menjadi nitrit dan dua enzim yang mereduksi nitrat menjadi

amonium yaitu Nir B (Harbone et al. 1992) dan enzim formate dependent nitrite

reduction to amonium atau Nrf (Cole 1996). Pada spesies tertentu seperti

Wollinella succinogens dan Campylobacter fetus memiliki enzim nitrous oksida

reduktase (Nos). Enzim ini mereduksi gas N2O menjadi gas Nitrogen (Zumft

1997).

Enzim yang terdapat pada bakteri anamoks adalah nitrit reducing enzyme

(NR) yaitu enzim yang mereduksi nitrit menjadi hidroksil amin (NH2OH).

Hidrazin Hidrolase (HH) enzim yang mereduksi hidroksilamin menjadi hidrazin

(N2H4) dan Hydrazine – oxidising enzyme (HZO), enzim yang mengoksidasi

hidrazin menjadi gas nitrogen (Jetten et al. 2001).

NH4

NH3

N2N2H2NH2OH

NO3-

N2N2ONO

NO2-

N2O

(2)

(1)

(3)

NH4

NH3

N2N2H2NH2OH

NO3-

N2N2ONO

NO2-

N2O

(2)

(1)

(3)

NH4

NH3

N2N2H2NH2OH

NO3-

N2N2ONO

NO2-

N2O

(2)

(1)

(3)

Gambar 2 Lintasan reduksi nitrat oleh aktivitas bakteri (1) Denitrifikasi,(2).Reduksi nitrat amonifikasi disimilatif (3) Oksidasi amonia secaraanaerob.

Bakteri Nitrat Amonifikasi Disimilatif (DNRA)

Pada kondisi yang sesuai beberapa genus dapat mereduksi nitrit menjadi

amonia melalui proses reduksi nitrat disimilasif. Prosesnya berlangsung pada saat

kandungan senyawa nitrit tinggi (Kelso et al. 1997). Kelompok bakteri ini bersifat

fermentatif (Rusmana & Nedwell 2004), dapat memanfaatkan senyawa organik

untuk pembentukan energi melalui transfer elektron di sitoplasma (Purwoko

2007).

Purwoko (2007) mengemukakan bahwa sebagian besar prokariota

fermentatif menghasilkan semua ATP melalui fosforilasi tingkat subtrat,

kemudian ATP dihidrolisis oleh ATP sintetase, sehingga dapat menghasilkan

perbedaan potensial yang digunakan untuk aktivitas membran. Organisma

fermentatif memerlukan akseptor elektron untuk menerima elektron dari NADH.

Kelompok bakteri pereduksi nitrat dapat memanfaatkan senyawa nitrat sebagai

penerima elektron alternatif untuk mendapatkan energi dibawah kondisi oksigen

terbatas (Ricardson et al. 2001).

Kelompok bakteri DNRA mereduksi senyawa nitrat sejalan dengan

penambahan senyawa nitrit, ketika konsentrasi nitrat rendah terjadi penambahan

senyawa amonium (Kelso et al. 1997). Pada beberapa pengamatan di lapangan

menunjukkan bahwa proses nitrat amonifikasi disimilatif banyak terjadi pada suhu

tinggi (Herbert & Nedwell 1990). Bakteri DNRA lebih dominan pada lingkungan

yang rasio C/N nya tinggi (Nedwell 1982). Bakteri DNRA lebih kompetitif dari

pada bakteri denitrifikasi pada konsentrasi bahan organik tinggi.

Bakteri-bakteri nitrat amonifikasi disimilatif diantaranya adalah Bacillus

pyocyanes, Clostridium pasteurianum, Desulfovibrio desulfuricans (Moat et al.

2002). Bacillus licheniformis, Wollinella succinogenes, Citrobacter freundii,

Klebsiella oxytoca, K. Pneumonia, Escherichia coli (Rusmana 2003a).

Rusmana (2003a) telah mengisolasi dan mengkarakterisasi Klebsiella

pneumonia yang mereduksi nitrat menjadi amonium dan menghasilkan N2O

sebagai produk sampingnya. Syahputra (2007) telah mengisolasi dan menyeleksi

bakteri nitrat amonifikasi disimilatif dari muara sungai Cisadane. Isolat terpilih

dikarakterisasi mempunyai kemiripan dengan Escherichia sp 21 CR dengan

tingkat kemiripan 97%. Sebagian besar famili Enterobacteriaceae mereduksi

nitrat dan bersifat fermentatif (Holt et al. 1994).

Proses pembentukan N2O pada kelompok bakteri nitrat amonifikasi

disimilatif bukan sebagai senyawa antara seperti pada kelompok bakteri

denitrifikasi, tetapi merupakan produk samping melalui reaksi kimia dalam

menghasilkan amonium (Rusmana 2003a). Bagan proses reaksi kimia reduksi

nitrat ke amonium dapat ditunjukkan pada Gambar 3.

Pada kelompok bakteri DNRA terjadi dua tahap reaksi enzimatik yaitu tahap

pertama oleh enzim Nap dan Nar seperti pada bakteri dinitrifikasi. Patereu et al.

(1994) menyatakan bahwa ada dua tipe enzim yang mereduksi nitrat menjadi nitrit

yaitu nitrat reduktase yang terdapat pada membran (Nar) dan nitrat reduktase yang

terdapat pada periplasmik (Nap). Enzim Nar aktivitasnya berhubungan langsung

dengan proses respirasi pembentukan ATP yang dapat dipengaruhi oleh

konsentrasi oksigen dimana oksigen menghambat sistem transpor nitrat. Enzim

Nap yang mereduksi nitrat dalam periplasma tidak sensitif terhadap oksigen.

Enzim Nar yang terdapat di membran plasma mempunyai transmembran proton

motive force (PMF) tempat terjadinya sintesis ATP (Moreno- Vivian et.al 1999).

Demikian pula menurut Carter et al. (1995) reduksi nitrat dalam periplasma

tidak sensitif terhadap hambatan oksigen. Oleh karena itu, nitrat reduktase

periplasmik berhubungan dengan kemampuan untuk respirasi nitrat dalam

ketersediaan oksigen pada spesies laboratorium. Oksidasi quinol oleh nitrat

reduktase periplasmik tidak terpusat untuk menghasilkan gradien proton

elektrokimia, tetapi cukup bertindak sebagai katup untuk membantu

keseimbangan regulasi reaksi redoks dan mempertahankan jalannya rantai

respirasi aerobik.

Gambar 3 Bagan pembentukan N2O pada reduksi nitrat oleh bakteri DNRA(Darjamurni 2003)

NH4+NH2OHNOHN2O2H2NONO3

-NO2

-

N2O

Sitoplasma

Periplasma

NO2-NO3

-

NarI

NarH

NarG

NapC NrfC

NrfB

NH4+

NO2-

NrfA

NO3- NO2

-

NO3- NO2

-

Membran plasma

NirD

NirB

NH4+NO2

-

NO3-

NO2-

NapBNapA

NrfD

NrfB

NrfC

Enzim Nap merupakan komplek dari dua sub unit protein. Sub unit Nap A

mengikat kofaktor Molibdenum (Mo) sebagai sisi aktif dari enzim. Sub unit Nap

B mempunyai dua situs ikatan heme C yang memiliki perbedaan potensial. Nap C

merupakan sitokrom tipe tetraheme C, berperan dalam transfer elektron antara

Quinol dan Nap AB (Richardson 2000).

Reaksi enzimatik tahap kedua yaitu perubahan nitrit menjadi amonium oleh

enzim Nir B yang aktivitasnya bergantung pada NADH sitoplasma sebagai donor

elektron (Harbone et al. 1992) dan enzim Nrf yang aktivitasnya bergantung pada

format sebagai donor elektron (Cole 1996). Dalam Richardson (2000) kinerja

enzim pereduksi nitrat menjadi amonium disimilatif digambarkan sebagai berikut

(Gambar 4).

Ketersediaan oksigen di lingkungan pada bakteri nitrat amonifikasi

disimilatif diantaranya berkaitan erat dengan sistem sensor regulator sebagai

mikroorganisme anaerob fakultatif. Kelompok bakteri DNRA memiliki

kemampuan adaptasi dari aerob ke anaerob atau sebaliknya. Oksigen merepresi

sintesis reduktase anaerob, sebaliknya pada kondisi oksigen terbatas akan

merepresi sintesis ketoglutarat dehidrogenase. Hal ini mengakibatkan perubahan

Gambar 4 Enzim pereduksi nitrat bakteri nitrat amonifikasi disimilatif

kondisi jalur asam sitrat dari siklus TCA oksidatif menjadi non siklus/ reduktif

(White 1995).

Pada White (1995) dijelaskan bahwa pergantian respirasi oksidatif dan

reduktif Escherichia coli sebagai salah satu bakteri DNRA diatur oleh tiga

sistem, yaitu sistem Arc (Aerobic respiration control), sistem Nar (Nitrat

anaerobic respiration) dan sistem Fnr. Sistem Arc merupakan sistem dua

komponen. Sistem ini merepresi gen-gen aerob berupa enzim-enzim siklus asam

sitrat, piruvat dehidrogenase, asam lemak oksidase, dan sitokrom oksidase. Selain

itu sistem Arc menginduksi gen-gen mikroaerob (sitokrom d oksidase dan sintesis

kobal alamin).

Sistem Nar terdiri dari 3 protein yaitu Nar X, Nar L dan Nar Q. Sistem ini

juga merupakan sistem dua komponen, Nar X berperan sebagai histidin kinase,

sedangkan Nar L sebagai protein regulator respons. Sistem ini menginduksi

sintesis transkripsi gen nitrat reduktase dan menghambat gen fumarat reduktase

serta gen aerobik lainnya. Penelitian selanjutnya diketahui bahwa Nar Q juga

berperan sebagai penerima sensor (White 1995 ; Purwoko 2007).

Sistem Fnr merupakan sistem tunggal yang berperanan pada kondisi

anaerob. Protein Fnr berperan sebagai regulator positif untuk transkripsi gen-gen

dalam pertumbuhan anaerob dan regulator negatif untuk transkripsi gen-gen

pertumbuhan aerob (White 1995 ; Purwoko 2007).

METODE PENELITIAN

Waktu dan Tempat penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2008 sampai Maret 2009.

Tempat penelitian di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Bahan Penelitian

Isolat yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri nitrat amonifikasi

disimilatif (DNRA) koleksi Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi,

FMIPA IPB Bogor. Isolat merupakan bakteri terpilih dari penelitian sebelumnya

hasil isolasi dari muara Sungai Cimandiri Pelabuhan Ratu Sukabumi Jawa Barat

dan muara Sungai Cisadane Tangerang Banten. Kode isolat dari muara Sungai

Cimandiri adalah FR1 dan FR2 (Marnis 2008). Kode isolat dari muara Sungai

Cisadane HF7 dan LF6 (Syahputra 2007).

Konfirmasi dan Peremajaan Isolat.

Peremajaan isolat murni dimulai dengan konfirmasi kemurnian isolat

menggunakan media padat, dilanjutkan dengan peremajaan isolat murni pada

media cair. Komposisi media cair adalah: 10 g Natrium asetat, 4,2 g NaNO3,

3,0 g yeast ekstrak, 0,5 g (NH4)2SO4, 0,9 g K2HPO4.3 H2O, 0,5 g MgSO4.7H2O,

0,2 g KH2PO4, 0,1 g CaCl2.2H2O dengan salinitas 2% dan pH 7 (Rodina 1972).

Media padat dibuat sama dengan media cair ditambah agar bacto 20 g per liter.

Media disterilisasi pada suhu 1210 C tekanan udara 1 atmosfer selama 15 menit.

Konfirmasi kemurnian isolat dilakukan dengan cara diinokulasikan masing-

masing isolat murni bakteri nitrat amonifikasi disimilatif dengan metoda cawan

gores pada medium agar, kemudian diinkubasikan selama 7 hari. Karakterisasi

dan morfologi sel tiap isolat dilakukan dengan teknik pewarnaan gram

(Hadioetomo 1993).

Konfirmasi kemurnian isolat secara fisiologi dilakukan dengan uji

fermentatif. Keempat isolat ditumbuhkan pada medium glukosa dengan indikator

brom cressol purple. Isolat diletakkan pada tabung bertutup untuk membatasi

masukan oksigen. Uji ini dilakukan untuk melihat kemampuan fermentasi dari

tiap isolat. Perubahan warna ungu menjadi kuning menunjukkan isolat tersebut

melakukan fermentasi, jika tidak terjadi perubahan warna bukan kelompok

bakteri fermentatif. Peremajaan bakteri pada medium cair dilakukan dengan cara

diinokulasikan 1 lup tiap isolat pada medium cair masing-masing sebanyak 20

ml kedalam botol yang berukuran 100 ml. Inkubasi dilakukan selama 24 jam

Tahap selanjutnya masing-masing isolat diambil 1 ml dimasukkan ke medium 50

ml untuk perbanyakan inokulan dan diinkubasikan selama 24 jam.

Seleksi Aktivitas Reduksi Nitrat pada KonsentrasiOksigen (O2) yang Berbeda

Pengukuran aktivitas reduksi nitrat pada konsentrasi oksigen berbeda

dilakukan pada botol serum steril 75 ml yang ditutup dengan butyl rubber

septum. Pengkondisian konsentrasi oksigen dengan pengaturan volume saturasi

udara pada head space botol serum.

Botol serum steril volume 75 ml diisi dengan 23 ml medium cair. Botol

dibuat kondisi an aerobik dengan cara menghilangkan oksigen yang terdapat di

dalam botol. Gas nitrogen bebas oksigen dialirkan ke dalam botol reaksi dengan

menggunakan jarum/syringe steril selama 15 menit. Sebelum gas dimasukkan,

gas terlebih dahulu disaring dengan filter steril diameter 47 mm dengan ukuran

0,45 mikro meter.

Langkah berikutnya, saturasi udara pada masing-masing botol dikondisikan

menjadi 0%, 1%, 10%, 30%, 50%, 80%, dan 100%. Saturasi udara dimasukkan

pada masing-masing botol serum yang telah diberi perlakuan pembebasan oksigen

sebanyak 0,5 ml, 5 ml, 15 ml, 25 ml, dan 40 ml. Pada waktu proses pemasukan

saturasi udara, gas nitrogen akan terdorong keluar melalui jarum yang dipasang

pada tutup botol disamping syringe, sehingga volume saturasi udara pada masing-

masing botol menjadi 1%, 10%, 30%, 50%, 80%. Pengkondisian saturasi udara

100% dilakukan dengan tanpa memasukkan gas nitrogen murni pada botol serum.

Kondisi saturasi udara 0% dengan pengisian gas nitrogen murni tanpa

memasukkan saturasi udara.

Seluruh botol serum yang telah dikondisikan saturasi udaranya dikocok

untuk melarutkan gas perlakuan. Masing-masing botol serum diinokulasi dengan

1 ml isolat. Isolat diletakan pada inkubator berpenggoyang pada kecepatan 80 rpm

suhu ruang (28-31)oC selama 96 jam (Su et al. 2001).

Setelah diinkubasi pada kadar oksigen yang berbeda, dilakukan pengukuran

densitas sel dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm. Kultur

biakan bakteri diambil sebanyak 1ml pada tabung efendorf dan disentrifugasi

dengan kecepatan 4000 rpm selama 15 menit untuk mendapatkan supernatan.

Supernatan dari kultur biakan dianalisis kandungan nitrit, nitrat dan amonium.

Analisis nitrit.

Analisis Nitrit menggunakan metode Sulfanilamide (Cleseri et al 1989).

Nitrit dengan amina aromatik pada sulfalinamide akan membentuk diazonium.

Senyawa tersebut dengan NED (N-I-Naphtyl Ethylene Diamine Dyhidrochloride)

membentuk gugus kromofor yang berwarna merah muda (Lampiran 1) dan dapat

diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Kadar nitrit

ditentukan dengan cara memasukkan 5 ml sampel yang telah diencerkan kedalam

tabung reaksi, ditambahkan 0,1 sulfanilamid (C6H8N2O2S) dan 0,1 NED.

Kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang

gelombang 540 nm. Kurva standar natrium nitrit (NaNO2) dengan konsentrasi

sebesar : 0 ; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 , dan 1,0 mg/l kemudian dikonversi ke mM

digunakan untuk menentukan kadar nitrit pada sampel (Lampiran 2).

Analisis nitrat

Analisis senyawa nitrat dengan menggunakan metode Greenberg et al

(1992). Kadar nitrat ditentukan dengan cara memasukkan 20 ml sampel yang

telah diencerkan ke dalam kolom reduksi yang berisi cadmium. Pada saat sampel

melewati kolom reduksi, cadmium akan mereduksi nitrat menjadi nitrit. Sampel

sebanyak 5 ml direaksikan dengan reagen pada analisis nitrit. Sampel akan

menunjukkan perubahan warna merah muda (Lampiran 1), diukur pada panjang

gelombang 540 nm. Kurva standar natrium nitrit (NaNO2) dengan konsentrasi

sebesar : 0 ; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1,0 mg/l, kemudian dikonversi ke mM

digunakan untuk menentukan kadar nitrit pada sampel. Nilai konsentrasi nitrat

adalah hasil pengurangan antara konsentrasi nitrit yang dilewatkan pada kolom

reduksi dengan konsentrasi nitrit yang tidak dilewatkan.

Analisis amonium

Pengukuran konsentrasi amonium menggunakan metode phenate (Cleseri et

al. 1989). Kadar amonium ditentukan dengan cara 5 ml sampel yang diencerkan ,

dimasukkan kedalam tabung reaksi, ditambahkan 0,2 ml larutan fenol alkohol

(C6H5OH) lalu dihomogenkan, diamkan selama 1 menit lalu tambahkan 0,2 ml

Na-Dihidro Nitroprusid (Na2[Fe(CN)NO]2.H2O), kemudian ditambahkan 0,5 ml

larutan oksidan yang terdiri dari Natrium Sitrat (C6H5Na3O7.2H2O) dan Natrium

hipoklorit (NaOCl2) dan dibiarkan selama satu jam pada suhu ruang (28-31)o C.

Sampel yang telah diberi larutan indikator menunjukkan perubahan warna hijau

sampai biru (Lampiran 1), diukur dengan spektrofotometer pada panjang

gelombang 640 nm. Kurva standar amonium klorida (NH4Cl) sebesar: 0 ; 0,2;

0,4; 0,6; 0,8 ; 1,0; 2,0; 4,0; dan 8,0 mg/l kemudian dikonversi ke mM digunakan

untuk menghitung konsentrasi amonia pada sampel (Lampiran 2).

Perhitungan Pembentukan Gas.

Setelah konsentrasi nitrat (NO3-), nitrit (NO2

-), dan amonium (NH4+)

diketahui dari masing-masing sampel, dihitung jumlah nitrat yang tereduksi

dengan rumus :

[NO3-] tereduksi = [NO3

-] kontrol – [NO3-]inokulasi

% [NO3-] tereduksi = [NO3

-] red x 100

[NO3-] kontrol

Jumlah senyawa nitrit yang terbentuk dihitung dengan rumus sebagai berikut:

[NO2-] terbentuk = [NO2

-] perlakuan – [NO2-] kontrol

%[NO2-] terbentuk = [NO2

-] perlakuan – [NO2-] kontrol x 100

[NO3-]tereduksi

Jumlah senyawa amonium yang terbentuk dihitung dengan rumus sebagai berikut:

[NH4+] terbentuk = [NH4

+] perlakuan – [NH4+] kontrol

% [NH4+] terbentuk = [NH4

+] perlakuan – [NH4+] kontrol x 100

[NO3-]tereduksi

Estimasi produk akhir gas yang terbentuk dihitung dengan rumus

[Gas ] = [NO3-]reduksi – [NO2

-] terbentuk – [NH4+] terbentuk

% [ Gas] = [Gas] X 100%

[NO3-] tereduksi

Keterangan : Konsentrasi nitrat kontrol didapatkan dari sediaan medium steriltanpa bakteri .

Kinetika Aktivitas Reduksi Nitrat Isolat Terpilih

Dua isolat terbaik dalam mereduksi nitrat dan responsif terhadap oksigen

dipilih untuk diamati kinetikanya. Botol serum steril volume 125 ml diisi dengan

50 ml medium cair. Sebanyak 1 ml isolat diinokulasikan pada tiap botol yang

telah dikondisikan saturasi udaranya secara berurutan masing-masing 1 %, 10%,

100%. Kultur biakan diinkubasikan pada suhu ruang (28-31)oC selama 96 jam

(Su et al 2001). Kultur biakan diamati pola pertumbuhannya dan dianalisis

konsentrasi nitrat, nitrat, dan amonium dengan metoda yang telah diuraikan

sebelumnya. Analisis dilakukan setiap selang waktu 12 jam selama 96 jam (4

hari).

Hasil pertumbuhan digambarkan pada suatu grafik pertumbuhan pada

kondisi oksigen berbeda. Korelasi antara konsentrasi sel dengan kerapatan optis

(OD) isolat, dilakukan metoda hitungan cawan (Lampiran 3) pada konsentrasi

pengenceran 10-6, 10-7, 10-8, dan 10-9. Kultur biakan yang sama diencerkan dan

OD dari beberapa pengenceran diukur. Kurva standar pertumbuhan dibuat dari

nilai-nilai OD pengenceran dan konsentrasi sel sehingga didapatkan nilai regresi

dan persamaan garis (Lampiran 4) untuk menentukan jumlah sel. Laju

pertumbuhan spesifik maksimum didapatkan dengan mencari nilai regresi dan

persamaan garis dari korelasi waktu inkubasi dengan nilai ln jumlah sel. Laju

pertumbuhan maksimum merupakan koefisien variabel x pada persamaan garis

Y= ax + c (Maier et al. 2000).

Hasil uji kimia digambarkan dalam suatu grafik yang menunjukkan

hubungan lama inkubasi dengan nitrat tereduksi, nitrit, dan amonium serta

estimasi gas N2O yang terbentuk pada setiap konsentrasi oksigen yang berbeda.

Kecepatan reduksi setiap sel masing-masing isolat dihitung pada kondisi saturasi

udara 1 %, 10% dan 100%.