KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

1. Teori kromatografi cair kinerja tinggiKCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) atau HPLC (High Performance

Liquid Chromatography) merupakan teknik analisis yang paling cepat berkembang dalam ilmu kimia analitik. Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis di dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-zat menunjukkan perbedaan mobilitas yang disebabkan oleh adanya perbedaan dalam penyerapan (absorbs), atau kerapatan muatan ion. Teknik kromatografi umum membutuhkan zat terlarut terdistribusi diantara dua fase, satu diantaranya diam (fase diam) dan yang lainnya bergerak (fase gerak).

2. Prinsip kromatografi cair kinerja tinggiPrinsip kerja dari KCKT merupakan pemisahan senyawa dari campurannya

berdasarkan sifat kepolaran dari senyawa tersebut, yang terdiri dari fase gerak dan fase diam. Migrasi dari molekul komponen analit akan sebanding dengan koefisien distribusinya, maka komponen dengan distribusi tinggi pada fase diam akan bergerak lebih perlahan di dalam kolom sehingga dapat terpisah dari komponen yang distribusinya lebih rendah. Untuk analit yang lebih mudah berdistribusi di dalam fase gerak, maka akan bergerak lebih cepat.

3. Mekanisme kromatografi cair kinerja tinggiMekanisme kromatografi terdiri atas 4 tipe yaitu adsorpsi, partisi, penukar ion,

dan ekslusi ukuran. Kromatografi adsorpsi didasarkan pada kondisi anatara zat terlarut dan fase diam padat. Umumnya eluen yang digunakan untuk kromatografi adsorpsi kurang polar dari fase diam (fase normal). Kromatografi partisi melibatkan fase diam cair yang bercampur dengan eluen. System partisi dapat berupa fase normal (fase diam lebih diam lebih polar daripada eluen) atau kromatografi fase terbalik (fase diam kurang polar daripada eluen). Kromatografi penukar ion melibatkan fase diam padat dengan kelompok anionic atau kationik pada permukaan zat yang terlarut.

4. Bagian-bagian instrument kromatografi cair kinerja tinggiPada dasarnya alat kromatografi cair terdiri dari wadah fase gerak dan fase gerak,

sistem pompa, tempat penyuntikan analit, kolom kromatografi, detektor, penguat sinyal, dan perekam .

Gambar II.3 Diagram skematik alat KCKT

a. Wadah fase gerak dan fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan inert. Fase gerak atau eluen terdiri dari atas campuran pelarut yang dapat bercampur secara keseluruhan berperan dalam elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini dipengaruhi oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal, kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Untuk fase balik, kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil. Adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab gas akan berkumpul dengan komponen lain di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.

b. Pompa

Pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa yaitu bahan gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Fungsi utama pompa yaitu adalah untuk mengalirkam fase gerak ke dalam kolom. Pompa dalam sistem KCKT harus menghantarkan aliran pelarut ke kolom secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Pompa harus tahan terhadap segala jenis pelarut, dapat mencapai tekanan sampai 6000 psi, dan dapat menghantarkan aliran terukut 0,01-1,0 atau 0,1 mL/menit. Ada 2 jenis pompa dalam KCKT yaitu pompa dengan tekanan konstan dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan.

c. Injektor

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup telfon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.

d. Kolom

Kolom merupakan jantung kromatograf dimana merupakan bagian KCKT yang terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Pada KCKT, suhu kolom pada umumnya tidak begitu menentukan. Akan tetapi jika diperlukan pemanasan maka sudu harus dikendalikan. Peningkatan suhu barangkali sampai 40-50º C, biasanya mempertajam puncak. Pada kromatografi fase balik kolom yang sering digunakan adalah kolom hidrofob oktadesilsilan (C18) dimana fase diam dengan rantai alkil yang lebih panjang dan stabil dibandingkan dengan ikatan alkil yang lebih pendek. C18 merupakan fase diam yang sangat nonpolar sehingga kekuatan ikatan analit nonpolar pada kolom sangat lemah yang menyebabkan pemisahan yang baik.

e. Detektor

Detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadarnya (analisis kuantitatif). Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu detektor universal yang mampu mendeteksi secara umum, tidak spesifik, selektif dan golongan detektor yang spesifik yang hanya mendeteksi analit secara spesifik dan selektif seperti detektor uv-vis, detektor fluorosensi, detektor elektrokimia.Suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :

1) Respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel2) Sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang

sangat kecil. 3) Stabil dalam pengoperasiannya4) Mempunyai sel volume yang sangat kecil sehingga mampu meminimalkan

pelebaran pita.5) Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut.6) Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

f. Rekorder

Rekorder berfungsi untuk merekam hasil deteksi dari detektor yang biasanya dilengkapi dengan pencetak. Kromatogram yang dihasilkan dicatat sebagai puncak-puncak diagram atau peak.

5. Aplikasi kromatografi cair kinerja tinggiA. Analisis kualitatif

Data waktu retensi adalah karakteristik, tetapi tidak spesifik karena kemungkinan terdapat lebih dari 1 zat yang memiliki waktu retensi yang sama.

B. Analisis kuantitatifUmumnya metode kuantitatif yang digunakan adalah menggunakan baku

pembanding. Larutan pembanding dengan berbagai konsentrasi disuntikkan pada alat

kromatograf, lalu diukur luas puncak terhadap konsentrasi. Kadar zat yang diperoleh dengan cara memasukkan harga luas puncak pada persamaan kurva kalibrasi atau dengan perbandingan langsung.

6. Contoh senyawa analisis kromatografi cair kinerja tinggiIdentifikasi vitamin K secara KCKT

Penentuan vitamin K dapat menggunakan metode Kromatografi Cepat Kinerja Tinggi (KCKT). Metode ini digunakan karena spesifik untuk menentukan jenis-jenis dari vitamin K dan dapat memberikan spesifitas yang memuaskan. Menurut Jakob dan Elmadfa (2000), analisis KCKT untuk vitamin K menggunakan fase terbalik dengan menggunakan fase diam kolom C-18 dan deteksi fluoresensi. Fase diam yang digunakan diisi dengan bubuk seng. Sistem fase gerak yang tidak encer digunakan untuk penentuan vitamin K yaitu dengan menggunakanpelarut metanol dan diklorometana yang mengandung seng klorida, natrium asetat dan asam asetat.Ekstraksi pelarut yang digunakan sesuai dengan matriks dalam sampel. Sampel diekstraksi dengan menggunakan pelarut n-heksana yang dibutuhkan setelah penguapan menggunakan pelarut yang tidak mengandung n-heksana. Residu yang terbentuk dicuci dengan menggunakan campuran metanol dan air. Lapisan atas n-heksana dipisahkan dan diuapkan pada kondisi vakum. Residu yang dihasilkan dilarutkan dengan eluen dan diinjeksikan ke dalam KCKT untuk dilakukan analisis. Standar internal yang digunakan dalam analisis vitamin K yaitu 2,3-dihidrofilokuinon dalam pelarut etanol.

7. Uji kesesuaian systemBila memakai metode kromatografi seperti kromatografi cair kinerja tinggi, pada

umumnya harus dikehendaki adanya kepastian kesesuaian dan keefektifan sistem operasional. Penyesuaian kondisi operasional dan kromatogram yang baik. Untuk memastikan keefektifan sistem operasional akhir, perlu dilakukan uji kesesuaian sistem sebelum digunakan.

Data spesifik dikumpulkan dari penyuntikkan ulang larutan uji atau larutan baku. Suatu parameter yang berguna adalah keberulangan penyuntikkan ulang larutan baku yang paling baik dinyatakan dalam simpangan baku relatif.

Bila tidak dinyatakan lain, untuk perhitungan digunakan data kromatogram lima kali hasil penyuntikkan ulang, jika dinyatakan batas simpangan baku relatif 2,0% atau kurang, dan digunakan data kromatogram enam kali penyuntikkan ulang, jika dinyatakan batas simpangan baku relatif lebih dari 2,0%.