Intracellular and Extracellular Redox Status and Free Radical Generation in Primary Immune Cells from Children with Autism

1. Pendahuluan Autisme adalah gangguan perkembangan saraf perilaku yang biasanya tampak pada anak usia dini dan ditandai oleh gangguan yang signifikan dalam interaksi sosial, komunikasi, dan perilaku abnormal berulang yang selalu terfokus. Prevalensi gangguan autisme telah meningkat lebih dari 10 kali lipat dalam dua dekade terakhir, mempengaruhi satu dari 110 anak-anak di AS, namun etiologi dari gangguan ini masih sulit dipahami [1]. Deplesi glutathione dan stres oksidatif telah terlibat dalam patologi berbagai gangguan neurobehavioral termasuk skizofrenia [2], gangguan bipolar [3], dan penyakit Alzheimer [4]. Bukti-bukti yang ada menunjukkan bahwa ketidakseimbangan redoks dan stres oksidatif juga dapat berperan dalam patofisiologi autisme. Beberapa biomarker stres oksidatif telah diidentifikasi pada sampel darah dari anak autis [5-12]. Kelompok kami telah melaporkan penurunan konsentrasi glutation (GSH) dan beberapa prekursor metabolik, peningkatan glutation disulfida teroksidasi (GSSG), dan penurunan rasio glutation redoks (GSH / GSSG) dalam evaluasi plasma pada penelitian case-control dan jalur sel lymfoblastoid yang berasal dari anak autis [13-16]. Baru-baru ini, beberapa polimorfisme interaktif enzim yang mengatur sintesis glutation ditemukan menjadi lebih banyak pada anak dengan autisme menunjukkan bahwa defisit glutation dan kecenderungan untuk mengalami stres oksidatif mungkin didapatkan secara genetik pada beberapa anak [17]. Stres oksidatif terjadi ketika mekanisme pertahanan antioksidan seluler gagal untuk mempertahankan keseimbangan produksi ROS endogen dan / atau eksposur prooksidan eksogen lingkungan. Glutation (-L-glutamil-L-cysteinylglycine) merupakan tripeptida yang berfungsi sebagai antioksidan intraseluler utama dan buffer redoks terhadap kerusakan oksidatif makromolekul. Pasangan glutation tiol / disulfida redoks (GSH / GSSG) adalah mekanisme utama untuk menjaga lingkungan mikro intraseluler dalam keadaan yang sangat minim yang penting bagi kapasitas antioksidan / detoksifikasi, pengaturan enzim redoks, progresi siklus sel, dan transkripsi elemen respon antioksidan (ADALAH) [18-23]. Variasi halus dalam konsentrasi relatif dari glutation berkurang dan teroksidasi menyediakan mekanisme sinyal dinamis redoks yang mengatur proses-proses vital selular [24-27]. Misalnya, dalam prekursor sel SSP dan sel imun yang naive, keadaan glutathione intraseluler redoks adalah penentu utama pengaturan sel untuk menjalani penahanan siklus sel, diferensiasi, atau proliferasi [27]. Sebuah lingkungan intraseluler yang berkurang diperlukan

untuk proliferasi, sementara lingkungan mikro yang lebih teroksidasi membantu penahanan siklus sel dan diferensiasi sel. Defisit kronis dalam rasio GSH / GSSG redoks dianggap sebagai indikator yang dapat diandalkan dari stres oksidatif dan meningkatkan kerentanan terhadap kerusakan oksidatif dari paparan prooksidan lingkungan [28, 29]. Dalam kompartemen plasma ekstraseluler, pasangan redoks sistein / sistin (tiol / disulfida) pasangan redoks secara independen memberikan lingkungan redoks ambient untuk sel imun di dalam sirkulasi. Sistein ekstrasel / sistin redoks potensial ekstraseluler telah terbukti lebih teroksidasi daripada GSH intrasel / GSSG potensial redoks dan secara independen diatur [30]. Pergeseran dinamis dalam plasma sistein / sistin potensial redoks mengubah status redoks dari gugus sistein dalam protein permukaan sel untuk menginduksi perubahan struktur protein yang secara reversibel dapat mengubah fungsi [31, 32]. Sebagai contoh, di bawah kondisi ekstraseluler teroksidasi, residu sistein sensitif-redoks dalam inti katalitik dari tirosin protein fosfatase menjadi teroksidasi dan secara reversibel menonaktifkan aktivitas enzim tergantung pada sistein ambien / sistin potensial redoks [31, 33, 34]. Sistein ekstraseluler / status sistin redoks muncul sebagai transduksi penting sinyal baru mekanisme yang dapat menginduksi perubahan posttranslational pada aliran protein sensitif redoks termasuk berbagai enzim, faktor transkripsi, reseptor, adesi molekul, dan protein penanda membran yang berpengaruh pada pengaturan kedinamisan aktivitas dan fungsi mereka [32, 35, 36]. Penelitian terbaru telah mengungkapkan kelainan imunologi di antara anak autis termasuk perubahan dalam proporsi sel imun [37-40] dan pergeseran populasi sel T-helper setelah stimulasi mitogenik [41, 42]. Sel mononuklear darah perifer (PBMC) dari individu dengan autisme telah terbukti menghasilkan sitokin proinflamasi lebih tinggi dan terdapat level abnormal sitokin yang beredar dibandingkan dengan kontrol PBMC pada awal dan pada stimulasi mitogenik [43-46]. Secara keseluruhan, studi imunologi menunjukkan peran untuk sistem kekebalan yang tidak teregulasi dalam autisme yang berpotensi terkait dengan defisit antioksidan dimediasi-glutation dan sel imun mikro teroksidasi dalam lingkungan mikro. Untuk menyelidiki kemungkinan ini, kami memeriksa apakah sel-sel imun primer (PBMC) dari anak-anak dengan autisme menunjukkan penurunan kapasitas glutathione intraseluler redoks dibandingkan dengan PBMC dari anak-anak dengan usia-kontrol dan apakah lingkungan mikro intraseluler dan ekstraseluler lebih teroksidasi dikaitkan dengan peningkatan produksi radikal bebas intraseluler yang beroksidasi. Karena sel-sel imun dari anak autis telah terbukti memiliki respon abnormal terhadap stimulasi, kami juga memilih untuk menantang PBMC dengan aktivator sel imun yang dikenal untuk memberikan stres

oksidatif dan mengukur status glutation redoks intraseluler dalam monosit terisolasi yang diaktifkan dan sel T.

2. Subjek dan Metode 2.1. Peserta. Penelitian ini dilakukan pada anak-anak autis IMAGE (Integrated Metabolic and Genomic Endeavor) di Arkansas Childrens Hospital Research Institute (ACHRI) yang telah merekrut lebih dari 162 kasus dan kontrol keluarga sampai saat ini. Kohort IMAGE untuk penelitian ini terdiri dari 43 anak didiagnosis dengan gangguan autis dan 41 anak-anak kontrol yang tidak terpengaruh (16 di antaranya adalah saudara kandung terpengaruh). Keluarga autisme ini direkrut secara lokal setelah dirujuk ke University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS), Dennis Developmental Center dan didiagnosa oleh dokter anak terlatih. Anak-anak berusia 3 sampai 10 tahun dengan diagnosis gangguan autistik seperti yang didefinisikan oleh DSM-IV 299.0, Autism Diagnostic Observation Schedule (ADOS), dan / atau Childhood Autism Rating Scales (CARS > 30) yang terdaftar. Anak yang didiagnosis dengan kondisi lain pada spektrum autisme atau penyakit genetik yang langka dikaitkan dengan gejala autisme tidak dimasukkan dalam penelitian. Anak-anak dengan gangguan kejang kronis, infeksi baru, dan dengan suplemen vitamin atau mineral dosis tinggi melebihi RDA juga dikeluarkan karena kondisi ini merupakan pembaur potensial yang dapat mempengaruhi status redoks. Saudara tidak terpengaruh dan tidak terkait, anakanak neurotypical berusia 3 sampai 10 tahun yang tidak memiliki riwayat medis kelainan perilaku atau neurologis berdasarkan laporan orang tua menjadi kelompok pembanding. Protokol ini telah disetujui oleh Institutional Review Board di UAMS, dan semua orangtua menandatangani informed consent. 2.2. Bahan. Termos, piring, dan pipet setempat diperoleh dari Corning Life Sciences (Lowell, Mass, USA). RPMI 1640, penisilin / streptomisin, garam phosphatebuffered Dulbecco (PBS), serum janin sapi (FBS), dan glutamin yang dibeli dari Life Technologies (Carlsbad, California, USA). Karboksi-H2DCFDA (6-karboksi-2_, 7_-

dichlorodihydrofluorescein diasetat, ester diacetoxymethyl) diperoleh dari Molecular Probes (Carlsbad, California, USA). Human Monocyte Isolation Kit II dan Human CD4 T Cell Isolation Kit II yang dibeli dari Miltenyi Biotec (Bergisch-Gladbach, Jerman). Histopaque1077 dan semua bahan kimia lainnya diperoleh dari Sigma-Aldrich (St Louis, Mo, USA).

2.3 Isolasi PBMC dan Stimulasi Monosit dan Sel T CD4

Sampel darah puasa diambil sebelum jam 09.00 dan dimasukkan ke tabung EDTAVacutainer dan segera didinginkan di dalam es sebelum disentrifugasi pada 1300xg selama 10 menit pada suhu 40C. Alikuot plasma disimpan pada suhu -800C di dalam tabung cryostat sampai ekstraksi dan kuantifikasi HPLC. PBMC diisolasi dengan sentrifugasi pada Histopaque-1077. Sel darah merah dilisis menggunakan inkubasi singkat (15 detik) dengan 1 mL air es. Sekitar 30x106 PBMC diresuspensi dalam medium RPMI 1640 (ditambah dengan 10% FBS, 1% penisillin/streptomysin, dan 2mM glutamin) dengan kepadatan 106 sel/mL. Mengingat bahwa sulit untuk memperoleh 20mL volume darah dari setiap anak, maka isolasi dan analisa monosit dan sel-T CD4 tidak mungkin dilakukan pada semua peserta. Untuk stimulasi monosit, PBMC ditambahkan dengan 0.1 g/mL lipopolisakarida (LPS); untuk stimulasi sel-T, PBMC ditambahkan dengan 10 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) dan 1 g/mL ionomysin. Sel ditempatkan di dalam inkubator 5% CO2 pada suhu 370C selama 4 jam. Monosit yang sudah distimulasi dan sel-T CD4 kemudian diisolasi oleh seleksi negatif menggunakan pelabelan sel magnetik seperti yang dijelaskan oleh pabrik (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany). Dengan menggunakan flowsitometri, dapat ditentukan bahwa 75% monosit isolasi positif untuk CD14 dan 87% sel-T CD4 positif untuk CD4. Untuk kuantifikasi HPLC dari GSH and GSSG, sekitar 2x106 PBMC yang belum distimulasi, monosit stimulasi, atau sel-T CD4 stimulasi digabung, dibekukan di es kering, dan disimpan pada suhu -800C.

2.4. Ekstraksi Sel dan Kuantifikasi HPLC Glutathione Intraseluler dan Plasma Sistein Redox Status. Interval penyimpanan pada -800C sebelum ekstraksi secara konsisten antara 1-

2 minggu setelah pengambilan darah dan isolasi sel untuk meminimalisir potensi interkonversi metabolit. Rincian metodologis untuk intraseluler dan ekstraseluler ekstraksi GSH dan elusi HPLC dan deteksi elektrokemikal sudah dijelaskan sebelumnya [15, 16], dan deteksi metabolit tidak memerlukan derivatisasi. Meskipun kebanyakan GSSG merupakan disulfida campuran dengan thiol termasuk cysteine, pengukuran kami hanya mendeteksi GSSG bebas dalam plasma. Konsentrasi glutathione dan cysteine dikalkulasi dari daerah puncak kurva standar kalibrasi menggunakan software HPLC. Hasil intraseluler dinyatakan sebagai nanomoles per milligram protein menggunakan BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, Ill, USA), dan hasil plasma dinyatakan sebagai micromoles per liter.

2.5. Pengukuran Radikal Bebas Intraseluler.

Carboxy-H2DCFDA (DCF) adalah sebuah membran permeabel ROS/RNS-sensitif probe yang tetap nonfluoresen sampai dioksidasi oleh intraseluler radikal bebas. Intensitas fluoresen DCF berbanding lurus dengan tingkat oksidasi radikal bebas. Sekitar 106 PBMC diresuspensi dalam 1 mL RPMI 1640 medium ditambahkan dengan 10% FBS, 1% penisilin/streptomysin, and 2mM glutamin dan diwarnai di tempat gelap selama 20 menit dengan 1 M DCF pada suhu 370C. Sel yang diwarnai, dicuci dan diresuspensi dalam PBS segera dianalisa dengan flowsitometer Partec CyFlow (Gorlitz, Germany) menggunakan panjang gelombang eksitasi 488 nm dan dengan emisi penyaring (FL1) 530/30 nm. Untuk setiap analisa, fluoresensi dari 10000 sel dikumpulkan, dan data dianalisa menggunakan software FCS Express (De Novo Software, Los Angeles, Calif, USA). Radikal bebas intraseluler dinyatakan sebagai median fluorescence intensity (MFI) dari sampel subjek fluoresensi DCF normalisasi untuk fluoresensi DCF dari standar persiapan PBMC. Sebagai kontrol internal, standar persiapan PBMC diisolasi dari 100 mL sampel darah dari sukarelawan dewasa sehat yang tidak terpengaruh, dialikuosi dan dibekukan pada -1800C dalam 90% FBS/10% DMSO. Alikuot dari standar persiapan PBMC diwarnai dan dianalisa dengan setiap sampel subjek. Evaluasi oksidasi produksi radikal bebas hanya mungkin dilakukan pada kasus tersebut dan diperoleh sampel kontrol yang tidak berhubungan pada (~20 mL) volume darah.Tabel 1: Demografi Populasi Penelitian.

Umur; rata-rata (SD) Laki-laki; n (%) Putih; n (%) Asia; n (%) Afrika Amerika; n (%) Hispanic; n (%) Penggunaan multivitamin OTC; n (%)

Anak Kasus n = 43 5.42 (1.98) 36 (84) 38 (88.4) 2 (4.65) 2 (4.65) 1 (2.3) 17 (39.5)

Anak Kontrol n = 41 6.16 (2.29) 20 (49) 31 (75.6) 0 (0) 8 (19.5) 2 (4.9) 8 (19.5)

2.6. Analisa Statistik. Dalam kelompok kontrol, 16 dari 41 anak-anak tidak terpengaruh

kontrol adalah saudara kandung kelompok kasus. Ada 27 orang tambahan anak kelompok kasus tanpa saudara dan 25 orang tambahan anak yang tidak berhubungan dengan anak kelompok kontrol sehingga total 84 orang anak kohort kontrol kasus. Untuk menurunkan dampak asing, tiga observasi metabolit dibatasi pada ekstrim dari distribusi PBMC GSH, PBMC GSSG, and Monocytes GSH/GSSG (lihat Tabel 2). Data saudara berkorelasi sehingga

menghasilkan kombinasi sampel data berkorelasi dan data tidak berkorelasi.; dengan demikian, asumsi semua data independen tidak memuaskan untuk standar dua sampel tes-t. Untuk memanfaatkan semua data dari observasi dependen dan independen, kami menggunakan koreksi tes-Z oleh Looney and Jones [47]. Pendekatan statistik ini memberikan kontrol yang memadai dari kesalahan Tipe 1 dan memiliki kekuatan lebih dari standar Students t-test. Karena data DCF dibandingkan kasus dan control yang tidak berhubungan (tanpa saudara kandung) standar Students t-test digunakan dengan set signifikansi pada 0.05. Interkorelasi nonparametrik (Spearman correlation coefficients) antara umur dan gender dan 7 variabel hasil, GSH, GSSG, GSH/GSSG, % glutathione oksidasi, cysteine, cystine, and cysteine/cystine ditentukan dengan set tingkat signifikansi di 0.05. Data dianalisa menggunakan software SAS 9.2 (SAS Institute Inc, Cary, NC, USA).

3.1. Demografi Populasi Penelitian Table 1 menunjukkan demografi populasi penelitian. Satu-satunya perbedaan utama antara kasus dan kontrol adalah bahwa kelompok kontrol terdiri dari proporsi perempuan dan Afrika-Amerika yang lebih besar, sedangkan kelompok kasus mempunyai proporsi Asia yang lebih besar. Penggunaan suplemen multivitamin lebih tinggi pada kalompok kasus (39.5%) dibandingkan kelompok kontrol (19.5%); namun, status redoks glutathione secara statistik tidak terpengaruh oleh penggunaan vitamin (data tidak ditampilkan).

3.2 Penurunan Status Intraselular Glutathione Redoks dalam Autisme Tabel 2 menyajikan konsentrasi intraseluler relatif dari GSH, GSSG, rasio redoks glutathione, dan persentase dari glutation teroksidasi seimbang dalam keadaan istirahat (tidak distimulasi) PBMC dan stimulasi monosit terisolasi dan sel T CD4 dari anak autis dan anak usia kontrol yang cocok. Persentase glutathione teroksidasi dinyatakan dalam absolut glutathione ekuivalen sebagai 2GSSG / (GSH +2 GSSG). Sehubungan dengan kontrol, konsentrasi intraselular GSSG dan persen glutation teroksidasi meningkat secara signifikan (~ 40%), dan rasio GSH / GSSG menurun (~ 21%) di PBMC dari anak autis (P