NAMA : RIAN ERVAN NIM :

KELAS : Bio Dik C 2010

ENZIM RESTRIKSITabel 1. Beberapa enzim restriksi dan urutan pemotongannya

NO 1

Mikroorganisme Anabaena variabilitis Bacillus

Singkatan nama Ava1 enzim Bam HI BglII Eco RI Hae II Hga I Hha I Hind I

Rangkaian Pemotongan 5 G AGCCC G GATCC C CTAGG A GATCT T CTAGA G AATTC CTTAAG Pu G C G C Py Py C G C G Pu CGA C GC GCT GCG GCG C C G CG G T (T) (G) A C C A (A) (C) T G 3 G (T) CG (G)5 G 3

2 3 4 5 6 7 8

amyloliquifaciens H Bacillus globigii Escherichia coli RY 13 Haemophlius aegybtius Haemophlius gallinarum Haemophlius haemolyticus Haemophlius influenzae Rd Hind III

A AGCTT TTCGA A GTT AAC TTCGA A CAA TT G GGTAC C CCATG G

9 10

Haemophlius parainflunzae Klebsiella pnewmoniae

Hpa I Kpn III

11

Moraxella bovis

Mbo I

GATC CTAG

12 13 14 15 16 17

Providencia stuartii Serratia marcescens sb Streptomyces stanford Xanthomonas malvacearum Streptomyces albus G Xanthomonas oryzae

Pst I Sma I Sst I Xma SalI XorII BalI Eco RII Hae III Hpa II Hind II AlulI PvulI

CTGCA G GACGT C CCC GGG GGG CCC GAGCT C CTCGA G C CCGGG G GGCCC G TCGAC C AGCTG CGATC G G CTAGC TGG CCA ACC GGT CC TGG GGT A C C GG CC CC GG C CGG GGC C G T Py Pu A C C A Pu Py T G AGCT TCGA CAGCTG GTCGAC

18 Brevibacterium albidum 19 Escherichia coli R 245 20 Haemophilus aegyptius 21 Haemophilus aegyptius 22 Haemophilus influenzae Rd 23 Atrobacter luteus 24 Proteus vulgaris

Enzim Ligase Ligase merupakan proses memasukkan sekuens DNA yang mengandung gen yang diinginkan ke dalam DNA genom. Proses ligasi ini dapat dilihat ketika proses transformasi. Hasil transformasi terlihat bahwa koloni berwarna putih terbentuk pada cawan dengan penambahan X-gal dan IPTG serta pada kontrol positif tanpa perlakuan. Hasil ini sesuai dengan literatur yang mengatakan, terbentuknya koloni berwarna putih ini berarti sel bakteri mengandung DNA plasmid rekombinan dan proses ligasi dinyatakan berhasil (Brown 1995). Jika proses ligasi atau penyambungan fragmen DNA tidak berhasil ditandai dengan warna

koloni berwarna biru, sehingga dapat dikatakan percobaan meligasikan fragmen DNA berhasil dilakukan karena terdapat koloni putih. Proses ligasi yang tidak dapat terlihat itu dilakukan dalam tabung epedorf. Setelah campuran berbagai larutan dengan DNA vektor dan insertnya akan disuspensikan agar merata. Proses selanjutnya adalah inkubasi campuran larutan itu pada suhu 4 C selama satu malam. Namun, Suhu optimum aktivitas DNA ligase adalah pada suhu 37C, tetapi pada suhu tersebut ikatan hidrogen yang terbentuk di antara ujung lancip menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut dan mengakibatkan denaturasi. Maka, alternatif yag baik dilakukan dalam proses ini adalah inkubasi pada suhu yang diturunkan misalnya antara 4 dan 15C dengan waktu inkubasi yang diperpanjang. Proses ligasi yang dilakukan dengan bantuan enzim T4 DNA ligase. Fungsi dari T4 DNA ligase adalah untuk menyambungkan fragmen-fragmen DNA pendek menjadi DNA utuh yang disebut dengan DNA rekombinan. Enzim ini berasal dari T4 bakteriofage dan dapat meligasi fragmen DNA yang menggantung, memiliki ujung kohesif maupun ujung tumpul. Proses meligasi fragmen DNA yang memiliki ujung tumpul, diperlukan konsentrasi enzim yang lebih besar. Setiap kelas enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan kovalen menggunakan energi yang dilepaskan oleh pembelahan ATP. Ligase penting dalam sintesis dan perbaikan berbagai molekul biologis, termasuk DNA, dan digunakan dalam rekayasa genetik untuk memasukkan DNA asing ke vektor kloning. Dalam biokimia , ligase (dari bahasa Latin kata kerja ligre - "untuk mengikat" atau "untuk lem bersama-sama") adalah sebuah enzim yang dapat mengkatalisis bergabung dengan dua molekul besar dengan membentuk baru ikatan kimia , biasanya dengan disertai hidrolisis kelompok kimia kecil tergantung pada salah satu molekul yang lebih besar. Secara umum, ligase yang mengkatalisis reaksi berikut: Ab + C A-C + b atau kadang-kadang Ab + cd A-D + b + c dimana huruf kecil menandakan, kelompok-kelompok kecil tergantung.

Isolasi DNA DNA merupakan asam nukleat pembawa pesan genetik dalam kehidupan terletak di dalam sel dan tersusun rapi dalam kromosom. Pola DNA penyusun kromosom inilah yang

menentukan jenis rambut, warna kulit dan sifat-sifat khusus yang berbeda antara satu individu dengan lainnya. Karena perbedaan DNA yang dimiliki oleh seseorang inilah metode sidik DNA menjadi salah satu alat pembuktian yang cukup handal. Namun karena letaknya yang ada didalam sel maka untuk mendapatkan DNA diperlukan tahap-tahap khusus yang biasanya dilakukan di laboratorium tertentu. DNA ditemukan pertama kali pada tahun 1869, kemudian dengan menggunakan teknologi X-ray diketahui bahwa DNA memiliki struktur yang tertata secara rapi. Adanya publikasi model rantai ganda DNA oleh Watson dan Crick di jurnal Nature pada tahun 1953, teknik pemurnaian DNA mengalami perkembangan yang pesat dan menjadi prosedur rutin dilakukan dalam penelitian bioteknologi. DNA dapat diisolasi dari semua bagian tubuh misalnya dari daging, darah, sperma, ginjal, jantung, hati, dan lain-lain. Begitu pun untuk tanaman, DNA dapat diambil dari semua bagian. DNA juga bisa diperoleh dari spesimen yang berumur ratusan tahun atau fosil. Untuk mengeluarkan DNA dari sel maka teknik pemurnian DNA secara biokimia dilakukan dengan merusak dinding sel yang telah dilarutkan dalam larutan penyangga tertentu dengan menggunakan berbagai jenis deterjen. Dengan terbukanya lapisan sel maka DNA dapat dikeluarkan dan diendapkan dengan penambahan alkohol.

Gambar Tahapan isolasi DNA

Multiplikasi Gen Perbanyakan DNA dengan PCR PCR (Polymerase Chain Reaction ) : suatu reaksi enzimatis untuk melipatgandakan suatu urutan nukleotida tertentu secara in vitro. Metode ini dikembangkan pertama kali oleh Kary B. Mulis pada tahun 1985. Dengan menggunakan metode PCR, akan diperoleh pelipatgandaan suatu fragmen DNA sebesar 200.000 kali melalui 20 siklus reaksi selama 220 menit. Pembelahan molekul DNA sangat penting dalam proses amplifikasi DNA melalui teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) atau reaksi berantai polimerase. Seperti telah diketahui bahwa molekul DNA selalu dalam keadaan berpasangan (double stranded DNA),dan untuk membelah molekul DNA digunakan gergaji yang bisa berupa pemanasan (suhu 90oC) atau dengan larutan NaOH (konsentrasi 0,4 M). Empat komponen utama dalam proses PCR adalah : DNA cetakan yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan Oligonukleotida primer, yaitu suatu urutan nukleotida pendek ( 15-25 basa nukleotida), digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dan dCTP Enzim DNA polimerase, yaitu enzim yang mengkatalisis reaksi sintesis DNA

Keuntungan : memerlukan waktu yang relative lebih singkat bila dibandingkan dengan memperbanyak dengan menggunakan vector dan hanya memerlukan sejumlah kecil targer DNA. Kerugian : kita harus mengetahui urutan nukleotida dari segmen DNA yang diinginkan (untuk mensintesis primer), dan hanya dapat diaplikasikan pada fragmen DNA yang pendek, berukuran kurang dari 5 kb.