Cara:1. Persilangan seksual (perkawinan)2. Hibridisasi somatik3. Mutasi4. Teknologi DNA rekombinan (rekayasa

genetika)

Tujuannya sama: perbaikan genetik darisuatu sifat

DASAR REKAYASA GENETIKADASAR REKAYASA GENETIKARekayasa = manipulasi = modifikasi= perubahan bahan genetik (perubahan & pemindahan gen)

PERSILANGAN SEKSUAL•Kelemahan: Waktu lama, Kurang presisi•Keuntungan: Mudah, murah

HIBRIDISASI SOMATIK• Penggabungan sel somatik (protoplast)• Simetrik: kontribusi bahan genetik kedua tetuasama

• Asimetrik: kontribusi bahan genetik kedua tetuaberbeda

• Kelemahan: Regenerasi sulit (tanaman)• Keuntungan: Menggabungkan bahan genetikdari spesies berbeda

Pemuliaan Tanaman Konvensional(Persilangan seksual)

Pemuliaan Tanaman Konvensional(Persilangan seksual)

donor (spesies samaatau kerabat dekat)

varietas komersial

gen yang diinginkan

varietas baru

Dikawinkan(disilangkan)

gen yang tidak diinginkan

Dik

awin

kan

bebe

rapa

kali

(sila

ngba

lik)

Rantai gen, seperti untaianmutiara. Pemuliaankonvensional menggabungkanbanyak gen dalam sekalipenyilangan. Penyilangan balik(back-cross) harus dilakukanuntuk menghilangkan gen-genyang tidak diinginkan

Hibridisasi SomatikHibridisasi Somatik

donor (spesies sama atau lain) varietas komersial

gen yang diinginkan

varietas baru

Fusi sel

gen yang tidak diinginkan

Rantai gen, sepertiuntaian mutiara. Fusisel menggabungkanbanyak gen dari 2 individu atau lebih. Penapisan yang intensif harus dilakukanuntuk menghilangkangen-gen yang tidakdiinginkan danmempertahankanfertilitas

Penapisan dan seleksi intensif

MutasiMutasi

varietas baru

gen yang tidak diinginkan

Mutasi terhadap gen dapat mengubah struktur dan fungsi protein yang disandinya. Mutasi bersifat acak sehingga penapisan yang intensif terhadapmutan harus dilakukan untuk memilih individu mutan yang diinginkan

Penapisan dan seleksi intensif

•Fisik: radiasi UV, X, gamma, suhu•Kimia: kolkisin, EMS, 5-BrU

REKAYASA GENETIKA

•Teknologi DNA rekombinan GMO•Cara: penyisipan DNA asing (transgen) kedalam genom sehingga diekspresikan, dan diwariskan

•Transgenesis: proses perakitan organismetransgenik

•Keuntungan:Presisi, cepat, gen dari berbagai organisme

•Kelemahan:Teknologi, mahal

Teknologi DNA rekombinan(Bioteknologi)

Teknologi DNA rekombinan(Bioteknologi)

donor (berasal darispesies yang sama atau lain)

varietas komersial

gen yang diinginkan

varietas baru

pemindahan gen

gen yang tidak diinginkan

Dengan teknologi DNA rekombinan, hanya satugen saja yang dipindahkan.Pemindahan hanya terjadipada gen yang diinginkan

Ekspresi transgen•Elemen pengontrol: promoter dan terminator

•organisme: eukaryot/prokaryot•tujuan: kuantitas, tempat, waktu

•(+enhancer, intron)

•Promoter: tepat sasaran (waktu dan tempat)•konstitutif (ekspresi terus menerus): 35S CaMV•waktu dan tempat spesifik

Penanda seleksi• Tujuan: untuk menapis sehingga sasaran dapatdiindentifikasi dan diisolasi

• Reaksi biokimia sehingga terbentuk warna: X-gal (seleksi biru-putih)

• Reaksi resistensi terhadap antibiotika: ampisilin, kanamisin

Cara introduksi transgen kedalam sel inang• Transformasi (plasmid)• Transfeksi (fage, virus) sel hewan, serangga, bakteri

Metode transformasi•Agrobacterium tumefaciens•Biolistik•Mikroinjeksi•Elektroporasi•Transfer langsung dengan PEG•Liposom

Agrobacterium:•Khusus untuk tanaman•tumefaciens: tumor (pTi)•rhizogenes: akar berambut (hairy root) (pRi)

Plasmid pTi dari A. tumefaciens•Transfer: T-DNA (12-24 kb)•Gen-gen vir: pindah & integrasi•Ori: replikasi•Katabolisme opin

Biolistik•Banyak untuk tanaman tetapi tidak banyak untukhewan

•Jaringan, penggunaan luas•Khimera sehingga seleksi harus ketat•Tekanan udara: He•Partikel (<10 μm): emas atau tungsten•Pengaturan: jarak dan lama tembak

Elektroporasi•Kejutan listrik: membran protoplast•Bakteri, tanaman, hewan

Transfer langsung• Mg2+, Ca2+, PEG• Heat shock• Tanaman: regenerasi dari protoplast ke sel ke tanaman utuh

Mikroinjeksi• Banyak untuk hewan, jaranguntuk tanaman

• Injeksi di inti sel (kloroplastatau mitokondria)

• Sel hewan: injeksi di sel telurterbuahi

Transfeksi

Tahapan Pengklonan GenDASAR PENGKLONAN GEN

1. Isolasi DNA (gen)2. Penyisipan DNA kedalam vektor3. Introduksi vektor (rekombinan) kedalam sel

inang (bakteri)

ENZIM YANG TERLIBAT1. Enzim restriksi endonuklease•Memotong DNA pada situs spesifik•Tipe II: situs pengenalan dan pemotongan spesifik•Situs pengenalan: palindrom (simetri)

5’-N-N-G-G-C-C-N-N-3’3’-N-N-C-C-G-G-N-N-5’

HaeIII

EcoRI

5’-N-N-G-G C-C-N-N-3’3’-N-N-C-C G-G-N-N-5’

5’-N-N-G A-A-T-T-C-N-N-3’3’-N-N-C-T-T-A-A G-N-N-3’

•Hasil pemotongan•Ditentukan oleh situs pemotongan•Pusat simetri: ujung rata (blunt end)•Di luar pusat simetri: ujung tidak rata/kohesif(sticky end)

5’-N-N-G-A-A-T-T-C-N-N-3’3’-N-N-C-T-T-A-A-G-N-N-3’

Contoh Enzim Restriksi Endonuklease

Enzimrestriksi

Organisme asal Situs pengenalan(arah 5’-3’)

Ujung potonganyang dihasilkan

EcoRI Escherichia coli G AATTC kohesifBamHI Bacillus amyloliquefaciens G GATCC kohesifBglII B. globigii A GATCT kohesifPvuI Proteus vulgaris CGATCG kohesifPvuII P. vulgaris CAGCTG rataHindIII Haemophilus influenzae Rd A AGCTT kohesif

HinfI H. influenzae Rf GANTC kohesifSau3A Staphylococcus aureus GATC kohesifAluI Arthrobacter luteus AG CT rataTaqI Thermus aquaticua TCGA kohesifHaeIII H. aegyptius GG CC rataHpaII H.parainfluenzae C CGG kohesifNotI Nocardia otitidis-caviarum GCGGCCGC kohesif

2. Enzim Ligase•Untuk menyambung potongan DNA•5P dari nukleotida 1 dengan 3OH nukleotida 2•2 tipe:DNA ligase dari E.coli

DNA ligase dari fage T4

ISOLASI GEN1. Pemotongan DNA dengan enzim restriksi

endonuklease

Pemotongan DNA Pustaka Genom

Construction of genomic library

DNA total

Partial digestion

Ligation

Packaging

Transvection

λBlueSTAR7-20 kb DNA fragment

2. Isolasi cDNA•cDNA: DNA yang disintesis berdasarkan mRNA•RNA total = mRNA + rRNA + tRNA•RNA total + Oligo (dT) → (Oligo (dT)+ mRNA) + (rRNA+tRNA)

Pengklonan gen melalui RT-PCR

RT

PCR

Ligasi

mRNA

Tran

sform

asi

cDNA

3. Transposon•Dapat berpindah tempat di kromosom•Bila menyisip ke gen, gennya mengalami mutasi•Mutan dapat dilacak dengan transposon sebagaipelacaknya•Perlu: konstruksi pustaka genom

VEKTOR PENGKLONAN• Pembawa molekul DNA

1. PlasmidKarakteristik:•Replikasi (autonom)•Ekstra kromosom•Stabil•Ukuran 1-300 kb

Jenis:•F (fertilitas → konjugasi)•R (resistensi → antibiotika)•Toksin (ColE1 dari E.coli)•Degradatif (TOL dari Pseudomonas putida)•Patogenesitas (pTi dari A. tumefaciens)

Cloning vector & host

Cloning gene by RT-PCR: pGEM-T Easy (Promega)Host: E. coli DH5α

Keadaan plasmid di dalambakteri:

• Non-integratif (tidakmenyisip di kromosominang)

• Episom (menyisip dikromosom inang)

Syarat menjadi vektor:•Ukuran kecil•Punya situs penyisipan•Gen penanda seleksi

2. Fage•Virus yang menyerang bakteri

Fage λ•Bentuk: kepala dan ekor•Siklus hidup: (1) lisis, (2) lisogeni•Ukuran genom: 49 kb, utas ganda•Kedua ujung: situs cos → (1) sirkuler, (2) situspemotongan

Fage M13•Bentuk: batang/filamen•Ukuran genom: 6,407 kb, linier•Perbanyakan: tanpa lisis sel inang

Cloning vector & host

E. coli strain ER1647 Host:, BM25.8, DH5α

3. Cosmid•DNA hibrid: λ dan plasmid•Ukuran: 5 kb sehinggadapat membawa 40 kb DNA•Dapat digunakan sebagaivektor dengan karakteristik:•Mempunyai titik asalreplikasi

•Mempunyai situs cos•Mempunyai genpenanda seleksi

• Dapat membawa sisipanDNA berukuran besar•Konstruksi pustaka genom

• Karakteristik sebagai vektor:•Mempunyai sentromer•Mempunyai telomer(menghindari ligasi dengankromosom lainnya)

•Mempunyai titik asalreplikasi

4. Kromosom buatan dari khamir (Yeast Artificial Chromosome = YAC)

5. Kromosom buatan dari bakteri (Bacterial Artificial Chromosome = BAC)

• Dapat membawa sisipan DNA berukuran besar•Konstruksi pustaka genom