ISOLASI DNA

Oleh :

Nama : Putri Etty FerayantiNIM : B1J011060Kelompok : 2Rombongan : IIAsisten : Arthika Lovia Sari

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAANUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS BIOLOGIPURWOKERTO

2013

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

DNA adalah polimer nukleotida biasa. Satu gugusan fosfat dari setiap

trifosfat pelopor termasuk dalam polimer. Gugusan fosfat ini, yang terikat pada 5 ’-

karbon gula pentosa pada satu nukleotida, juga terikata secara kimiawi pada 3’-

karbon gula nukleotida kedua, sehingga suatu deret 5’-3’ pautan fosfat mengikat

nukleotida nukleotida itu menjadi satu sejauh panjangnya polimer. Ikatan ikatan

fosfat itu sangat kuat dan dikenal sebagai ikatan ikatan ester kovalen, atau ikatan

fosfodiester. Residu fosfat ( PO4- ) sepanjang rantai ini bersifat asam, sehingga

diberi nama asam nukleat ( Goodenough, 1988 ).

DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan

tumbuhan terdapat di dalam inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti

mitokondria dan kloroplast. Penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi

asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA genome) berasal dari inti sel, DNA

genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari mitokondria, DNA

genom kloroplast berasal dari kloroplast. Organisme tingkat rendah, DNA

penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri) atau

dibungkus oleh protein tertentu (pada virus). Kromosom eukariot berbentuk linear

sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga

mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular

dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom (Purnawarman et al.,

2012).

DNA merupakan dasar secara kimiawi dari hereditas dan merupakan

polimer dari nukleotida-nukleotida yang dihubungkan satu dengan yang lainnya

oleh ikatan fosfodiester, yaitu ikatan yang terjadi antara nukleotida yang terdiri

dari sebuah gula pentosa (deoksiribosa), satu buah fosfat dan satu basa nitrogen.

Basa nitrogen tersebut berikatan dengan karbon pertama dari gula deoksiribosa,

sedangkan fosfat berikatan dengan karbon kelima dari gula yang sama. Basa

nitrogen yang menyusun nukleotida dikelompokan menjadi 2 yaitu purin (adenin

dan guanin) dan pirimidin (sitosin dan timin) (Priyani, 2004).

B. Tujuan

Tujuan dari acara praktikum kali ini adalah mengetahui prinsip dan proses

isolasi DNA kromosom dan melakukan isolasi DNA kromosom bakteri

Escherichia coli.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi

Bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah isolat cair

Escherichia coli, buffer TAE 1x, aquades steril, 50 µl tenderizer 30%, etanol

absolut, alcohol 70% kloroform, akuades dan SDS 10%

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah tabung

eppendorf, sarung tangan, seperangkat mikropipet beserta tipnya, freezer, labu

Erlenmeyer, incubator dan kamera digital.

B. Metode

1. Sebanyak 1,5 ml kultur hasil inkubasi semalam diambil dan dimasukkan ke

dalam tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan

kecepatan 5000rpm selama 3 menit dalam suhu ruang.

2. Kemudian supernatant dibuang lalu ditambahkan 1 ml akuades,

disentrifugasi dengan kecepatan 5000rpm selama 3 menit.

3. Supernatant dibuang, ditambahkan tenderizer 30% sebanyak 50 µL

kemudian diinkubasi selama 1 jam dalam suhu 37ºC.

4. Setelah itu ditambahan 50 µL SDS 10% kemudian dihomogenkan dan

disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit.

5. Supernatan yang dihasilkan ditampung dalam tabung eppendorf baru lalu

ditambahkan kloroform dengan perbandingan 1:1 dari volume supernatant,

lalu dihomogenkan dengan disentrifugasi 10.000 rpm selama 10 menit.

6. DNA diambil dan dipindah ke tabung baru kemudian ditambahkan etanol

absolut dingin kemudian diendapkan selama 7x24 jam dalam lemari

pendingin (freezer).

7. Sentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm dilakukan selama 10 menit pada

suhu 4ºC. Supernatan yang terbentuk dibuang kemudian ditambahkan

alkohol 70% lalu disentrifugasi lagi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10

menit.

8. Supernatan kembali dibuang, tabung dikeringkan, ditambahkan 50 µL TE

1x dan diresuspensi dengan cara membolak-balik. Suspense yang diperoleh

adalah suspensi DNA kromosom bakteri

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Gambar. Hasil Isolasi DNA Kromosom Bakteri Escherichia coli

B. Pembahasan

DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan

terdapat di dalam inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti

mitokondria dan kloroplast. Penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi

asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA genome) berasal dari inti sel, DNA

genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari mitokondria, DNA

genom kloroplast berasal dari kloroplast. Organisme tingkat rendah, DNA

penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri) atau

dibungkus oleh protein tertentu (pada virus). Kromosom eukariot berbentuk linear

sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Prokariot memiliki materi

genetik berupa DNA yang tidak dibungkus membrane inti DNA prokariotik

berbentuk sirkuler atau disebut nukleoid. Di luar nukleoid terdapat juga DNA

sirkuler lain yang lebih kecil disebut plasmid. Selain itu prokariot juga

mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular

dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom (Kimbal, 2005).

Pengecekan keberadaan E. colidi bagian usus karena, untuk megetahui jenis-jenis

E. coli apa saja yang hidup di usus dan tingkat resistensi terhadap antibiotik

(Medina et al., 2011).

Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba

tertentu dari lingkungan, sehingga diperoleh kultur murni atau biakkan murni.

Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari

satu sel tunggal. Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu Isolasi sel, lisis

dinding dan membran sel, Ekstraksi dalam larutan, purifikasi dan presipitasi.

Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan

presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan

berat jenis molekul. Menjalankan prosedur dengan benar akan diperoleh DNA

kromosom dan plasmid dengan kemurniannya cukup tinggi, dapat dilihat dari

penampakan hasil elektroforesis yang baik. Ketelitian dan kecermatan dalam

pelaksanaan penelitian, sangat menentukan hasil kemurnian DNA kromosom dan

plasmid (Faatih, 2009).

Tahap-tahap isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan

dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi,

tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian

lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak

dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium buffer non osmotik,

sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang

kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot

langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel

mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang, biasanya pembuangan

remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi

menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian

disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang

telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA

sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA.

Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan

penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan

menggunakan CsCl (Zubaidah, 2004).

Prinsisp isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi dan presipitasi.

Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat

molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan

berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas

tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah,

yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Tahap presipitasi

dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian

divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi

protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein

mengakibatkan terbentuknya senyawa baru yang memiliki kelarutan yang lebih

rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap (Jamilah, 2005).

Ekstraksi DNA dari organisme eukaryote (manusia, hewan dan tumbuhan)

dilakukan melalui proses penghancuran dinding sel (lysis of cell walls),

penghilangan protein dan RNA (cell digestion) dan pengendapan DNA

(precipitation of DNA) dan pemanenan. Berbagai teknik ekstraksi DNA telah

dikembangkan dari prinsip dasar tersebut, sehingga saat ini muncul berbagai

teknik ekstraksi dan purifikasi DNA. Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah

serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen sel

lainnya. Hasil ekstraksi tersebut merupakan tahapan penting untuk langkah

berikutnya. Oleh sebab itu dalam pelaksanaannya harus dilakukan dengan baik

dan bebas kontaminasi (Lewis, 2003).

Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan

senyawa kimia seperti EDTA (ethyllenediamine tetraacetic), dan SDS (Sodium

Dodecyl Sulfate). EDTA berfungsi sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion

magnesium (ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun

mempertahankan aktivitas enzim nuclease yang merusak asam nukleat). SDS

merupakan sejenis deterjen yang berfungsi merusak membrane sel. Enzim

proteinase K dapat digunakan untuk menghancurkan protein. Kotoran akibat lisis

sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Kemudian molekul nucleotida (DNA dan

RNA) yang telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan

menggunakan phenol. Proses ini sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan.

Sedangkan choloform digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan

polisakarida dari larutan. Enzim RNAase digunakan untuk menghancurkan RNA

sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh. Pemurnian atau purifikasi DNA dapat

dilakukan dengan mencampur larutan DNA tersebut dengan NaCl yang berfungsi

memekatkan, memisahkan DNA dari larutan, dan mengendapkan DNA sewaktu

dicampur dengan ethanol. Proses sentrifugasi dengan kecepatan tinggi akan

mengendapkan tepung berwarna putih (DNA) dan menempel di dasar tabung

ependorf (Harisha, 2007).

Cara kerja isolasi DNA kromosom bakteri E.coli dan fungsinya adalah isolat

cair 1,5 ml kultur E. coli disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm, selama 3

menit. Supernatan dibuang, tambahkan 1 ml akuades steril disenrifugasi 5000 rpm

selama 3 menit, suhu 25 0C. Supernatan dibuang dan disuspensikan tenderizer

30% sabanyak 50 µl . Diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 0C. kemudian

ditambahakan SDS 10% brfungsi melisiskan sel dan sentrifugasi 10000 rpm

selama 10 menit suhu 25 0C. Supernatan dipindahkan ketabung baru dengan

penambahan kloroform berfungsi merusak protein 1:1 dan dikocok 20 kali.

Kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm selama 10

menit suhu 25 0C. Supernatan dibuang dan ditambahakan etanol absolute

berfungsi menggumpalkan DNA 1:1 dan diinkubasi dalam freezer 7 X 24 jam.

Disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm dengan suhu 4 0C.

Supernatan dibuang kemudian ditambahakan alkohol 70% untuk membersihkan

dari etanol absolut dan disentrifugasi 10000 rpm 10 menit suhu 4 0C. Supernatan

dibuang kembali kemudian ditambahkan TAE 1x sebanyak 50 µl untuk

melarutkan DNA kembali dan EDTA menjaga struktur DNA kemudian

disuspensikan secara bolak-balik.

Berdasarkan pengamatan dan pembahasan isolasi DNA kromosom bakteri

E.coli menunjukan hasil yang positif artinya berhasil mengisolasi DNA

kromosom bakteri tersebut. Isolat bakteri E.coli sebagai sumber DNA, DNA yang

berhasil diisolasi menunjukan seperti kabut putih. Menurut Kimball 2005), DNA

juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun pada tumbuhan.

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan sebelumnya dapat diambil kesimpulan

bahwa :

1. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan

presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi

berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal

sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi

yang lebih ringan akan terletak di atas.

2. Proses pengisolasian DNA bakteri adalah isolasi isolat, perusakan dan

pembuangan dinding sel, pelisisan sel, pembuangan sisa remukan dengan

sentrifugasi, pembersihan protein sehingga didapatkan DNA murni.

B. Saran

Saran untuk praktikum isolasi DNA kromosom bakteri selanjutnya agar lebih

memperhatikan dalam penambahan – penambahan larutan serta dalam proses

sentrifugasi.

DAFTAR REFERENSI

Epplen, J.E. dan T. Lubjuhn. 1999. DNA Profiling and DNA Fingerprinting. Birhkhauser Verlag, Berlin.

Faatih, M. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurnal Penelitian Sains & Teknologi, 10 (1): 61 – 67.

Goodenough, Ursula. 1988. Genetics. Erlangga, Jakarta.

Harisha, S. 2007. Biotechnology Procedures and Experiments Handbook (An Introduction To Biotechnology).Infinity Science Press LLC, Canada.

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Penambahan Enzim Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang : Unoversitas Negeri Malang.

Kimball, J.W. 2005. Biologi. Erlangga, Jakarta.

Lewis, R. 2003. Human genetics: Concepts and Applications. The McGraw-Hills Company, Inc.

Medina, M.M et al. 2009. Molecular Diversity of Escherichia coli in the Human Gut: New Ecological Evidence Supporting the Role of Adherent-Invasive E. coli (AIEC) in Crohn’s Disease. Inflamm Bowel Dis 2009;15:872– 882.

Purnawarman, T., Wibawan, I., Pasaribu, F. H., Setiyono, A. dan Saepulloh, M. 2012. Sensitivitas dan Spesifisits Nested Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Mendeteksi DNA Coxiella burnetii. Jurnal Veteriner. 13(1).

Priyani, N. 2004. Sifat Fisik dan Kimia DNA. Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara, Medan.

Zubaidah, siti. 2004. Identifikasi, variasi genetik, distribusi dan upaya eliminasi bakteri penyebab CVPD (Citrus Vein Phloem Degeneration). Desertasi tidakl diterbitkan. Program pasca sarjana Universitas Brawijaya, Malang.