isolasi dna

Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. (Mukhlissul Faatih) 61

ISOLASI DAN DIGESTI DNA KROMOSOM

ISOLATION AND DIGESTION OF CHROMOSOMAL DNA

Mukhlissul Faatih

Jurusan Pendidikan Biologi FKIPUniversitas Muhammadiyah Surakarta

Jl. A. Yani Tromol Pos I Pabelan Kartasura SurakartaTelp. (0271) 717417 ext 171

ABSTRAK

Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam proses rekayasagenetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA

dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akanterbentuk ekstrak sel yang terdiri DNA, RNA dan substansi dasar lainnya. Ekstrak sel kemudiandipurifikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA/RNA total. Isolasi DNAmemiliki beberapa tahapan, yaitu: (1)Isolasi sel; (2)Lisis dinding dan membran sel; (3)Ekstraksidalam larutan; (4)Purifikasi; dan (5)Presipitasi. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNAada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansiberdasarkan berat jenis molekul. Dengan menjalankan prosedur dengan benar akan diperolehDNA kromosom dan plasmid dengan kemurniannya cukup tinggi, dapat dilihat daripenampakan hasil elektroforesis yang baik. Ketelitian dan kecermatan dalam pelaksanaanpenelitian, sangat menentukan hasil kemurnian DNA kromosom dan plasmid.

Kata Kunci: Isolasi, purifikasi, digesti, dan DNA.

ABSTRACT

Isolation of DNA/RNA is the first step that must be completed in process of genetic engineering. The basic principal of total DNA/RNA isolation is breaking down and extract-

ing cells’ components. Cells extract then was further purified, producing pellets which iscontain of DNA, RNA, and other substances. DNA isolation has several steps, i.e. (1)cellsisolating, (2)cells membrane and wall lysing, (3)extracting, (4)purifiying, and (5)precipi-tating. Two principal in the DNA isolation are cells centrifuge and precipitate. Centrifuga-tion separates the cells substance due to their molecular weight. Completing this procedureswill give a high-pured DNA, showed in the electrophoresist banding results.

Keywords: Isolating, purification, digestion, dan DNA.

PENDAHULUAN

DNA memiliki struktur pilinan utasganda yang antiparalel dengan komponen-

komponennya, yaitu gula pentosa (deok-siribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa.Pasangan basa pada DNA terdiri atas duamacam, yaitu basa purin dan pirimidin.

Jurnal Penelitian Sains & Teknologi, Vol. 10, No. 1, 2009: 61 - 6762

Basa purin terdiri atas adenin (A) danguanin (G) yang memiliki struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiriatas sitosin (C) dan timin (T) yangmemiliki struktur cincin-tunggal. Ketikaguanin berikatan dengan sitosin, makaakan terbentuk tiga ikatan hidrogen,sedangkan ketika adenin berikatan dengantimin maka hanya akan terbentuk duaikatan hidrogen. Satu komponen pem-bangun (building block) DNA terdiri atassatu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satupasang basa yang disebut nukleotida.

Sebuah sel memiliki DNA yangmerupakan materi genetik dan bersifatherediter pada seluruh sistem kehidupan.Genom adalah set lengkap materi genetik(DNA) yang dimiliki suatu organisme danterorganisasi menjadi kromosom. DNAdapat diisolasi, baik dari sel hewan, manu-sia, maupun pada tumbuhan. DNA ma-nusia dapat diisolasi melalui darah. Darahmanusia terdiri atas plasma darah, globuluslemak, substansi kimia (karbohidrat, pro-tein dan hormon), dan gas (oksigen, nitro-gen dan karbon dioksida). Plasma darahterdiri atas eritrosit (sel darah merah),leukosit (sel darah putih) dan trombosit(platelet). Komponen darah yang diisolasiyaitu sel darah putih. Sel darah putihdijadikan pilihan karena memiliki nukleus,dimana terdapat DNA di dalamnya. DNApada tumbuhan juga dapat diisolasi,contohnya pada tumbuhan bawang merah(Allium cepa) dan pada pisang (Musa sp.).

Isolasi DNA memiliki beberapatahapan, yaitu: (1)Isolasi sel; (2)Lisis din-ding dan membran sel; (3)Ekstraksi dalamlarutan; (4)Purifikasi; dan (5)Presipitasi.Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasiDNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presi-pitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalahmemisahkan substansi berdasarkan berat

jenis molekul dengan cara memberikangaya sentrifugal sehingga substansi yanglebih berat akan berada di dasar, sedangkansubstansi yang lebih ringan akan terletakdi atas. Teknik sentrifugasi tersebutdilakukan di dalam sebuah mesin yangbernama mesin sentrifugasi dengankecepatan yang bervariasi, contohnya 2500rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm.

Isolasi DNA/RNA merupakanlangkah awal yang harus dikerjakan dalamrekayasa genetika sebelum melangkah keproses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi to-tal DNA/RNA dari jaringan adalah denganmemecah dan mengekstraksi jaringantersebut sehingga akan terbentuk ekstraksel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA,dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipuri-fikasisehingga dihasilkan pelet sel yang me-ngandung DNA/RNA total. Prinsip-prinsipisolasi DNA plasmid hampir sama denganisolasi total DNA/RNA dari jaringan.

Langkah pertama untuk mendapat-kan DNA plasmid adalah denganmenumbuhkan sel-sel bakteri yang me-ngandung plasmid rekombinan. Setelah itusel dipanen, dinding serta membran seldipecah sehingga isi sel (ekstrak sel) keluar.Ekstrak sel ini kemudian dipurifikasidengan serangkaian perlakuan sehinggadiperoleh DNA plasmid yang murni. IsolasiDNA yang dilakukan dalam penelitian inimenurut standar prosedur yang sudah biasadilaksanakan. Homogenisasi sel denganprosedur ini akan menghasilkan DNA utuhkarena proses ini menyebabkan disrupsi seldan tercucinya komponen-komponen sellain selain DNA. Penambahan kloroformsetelah sentrifugasi memisahkan larutanmenjadi fase cair dan padat dimana fasecair merupakan DNA dan fase padatadalah campuran protein dan DNA.

Lia Is

Highlight

Lia Is

Highlight

Lia Is

Highlight


METODE PENELITIAN

Untuk penelitian prosedur isolasiDNA jaringan total diperlukan kolonibakteri, Buffer lisis (100 mM Tris HCl, pH8; 100 mM NaCl; 50 mM EDTA; 2%SDS), Proteinase-K, Phenol, Etanol,

Sedangkan untuk isolasi plasmiddengan diperlukan kultur bakteri, Lysingsolution 1 (50 mM Glukosa, 25 mM Tris-HCl dan 10 mM EDTA, pH 8,0), Lysingsolution 2 (0,4 N NaOH dan 2% SDS),Lysing solution 3 (3 M kalium asetat pH 4,8),LB medium, Trypton, Yeast ekstrak, NaCl,dan Aquabidest.

Adapun alat yang diperlukan adalahmikropipet, sentrifus mikro, Eppendorf,microtube dan conical tube.

Pelaksanaan penelitian dimulaiprosedur isolasi DNA kromosom, yaitu:1. Bakteri ditumbuhkan pada medium LB,

digojog pada suhu 370C,selama 1 malam.2. 15 ml kultur disentrifugasi 3000 rpm,

15 menit, pada suhu 40C.3. Supernatan dibuang, pada pelet

ditambahkan 750 µl buffer lisis(100mM Tris HCl pH 8,100mMNaCl,50 mM EDTA,2% SDS ), laludivortek.

4. 10 µl ( 10 mg/ml) Proteinase-K ditam-bahkan.

5. Diinkubasi pada suhu 550C selama 30menit.

6. Disentrifugasi dengan kecepatan 3.000rpm, selama 15 menit, pada suhu 40C.

7. Dipindahkan supernatannya padatabung eppendorf 1,5 ml.

8. Kemudian ditambahkan 700 µl phe-nol, digojog pelan.

9. Disentrifugasi 12000 rpm selama 10menit, lapisan atas dipindahkan dalamtabung eppendorf 1,5 ml.

10. Ditambahkan etanol dingin, perban-dingan 1:1 (v/v), dicampur pelan-pelan

sehingga timbul benang-benang halusDNA.

11. Benang-benang halus DNA diambildan dicuci dengan etanol 70%

12. Disentrifugasi 12000 rpm, 10 menit,supernatan dibuang, pelet dikeringkan.

13. Ditambahkan TE, hingga volume 200 ml

Langkah kedua adalah prosedurisolasi DNA plasmid, yaitu:1. Diambil sebanyak 1-2 koloni bakteri

dari lempeng agar, dipindahkankedalam tabung yang telah berisi 5 mlLB-medium dan antibiotik.

2. Digojok kuat-kuat dalam shaker incu-bator 37oC, semalam

3. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10menit.

4. Supernatan dibuang, pelet diresuspensidengan 100 ml Lysing solution 1,didiamkan dalam es selama 5 menit.

5. Ditambahkan 200 ml Lysing solution 2,diinkubasi pada es selama 5 menit.

6. Ditambahkan 150 ml Lysing solution 3,dicampur dengan cara membolak-balik-kan, diinkubasi dalam es selama5 menit.

7. Disentrifus dengan kecepatan 12.000rpm selama 10 menit.

8. Supernatan diambil dalam filter, pel-let dibuang.

9. Ditambah phenol CIAA sebanyak vol-ume supernatan, dicampur denganvortek

10. Disentrifugasi dengan kecepatan12.000 rpm selama 5 menit.

11. Lapisan atas diambil, ditambahkanCIAA dengan perbandingan 1:1 (v/v)

12. Dicampur dengan vortek13. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 5

menit, kemudian lapisan atas diambil14. Ditambah 1/10 volume 3M Na asetat,

dan 2 kali volume ethanol absolutdingin.


15. Dicampur dengan dibolak-balik,didiamkan dalam -20oC selama 10menit.

16. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10menit, lalu pellet dicuci dengan etha-nol 70%

17. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10menit

18. Pellet dikeringkan, ditambah TE 50 µl,DNA dielektroforesis.

Langkah ketiga adalah melakukanprosedur digesti kromosom, plasmid danpUC19 dengan Eco RI, yaitu:

Kromosom, plasmid dan pUC 19(Konsentrasi 0,5 µg/µl)

2µl Buffer Eco RI2µl Eco RI

8 µl Nuclease Free Water

Volume Akhir 20µlCampur dengan baik

Inkubasi 370C, 2 jam(Untuk melihat hasil pemotongan

dilakukan running)

HASIL DAN PEMBAHASAN

DNA adalah asam nukleat yangmengandung materi genetik dan berfungsiuntuk mengatur perkembangan biologisseluruh bentuk kehidupan secara seluler.Dilihat dari organismenya, struktur DNAprokariot berbeda dengan struktur DNAeukariot. DNA prokariot tidak memiliki pro-tein histon dan berbentuk sirkular, sedangkanDNA eukariot berbentuk linear dan memilikiprotein histon. Pada isolasi DNA, penger-jaannya harus sangat hati-hati karena DNAsangat mudah rusak oleh enzim DNAse yangterdapat pada kulit, saliva maupun air mata

pemeriksa. Oleh karena itu selama penger-jaan harus mengenakan sarung tangan danberbicara sesedikit mungkin.

Buffer lysis dan Proteinase-K disinidipakai sebagai reagen pelisis supayakomponen DNA dalam sitoplasma sel bisakeluar dan diisolasi. Phenol digunakanuntuk mengendapkan komponen proteinlain yang tidak dikehendaki sedangkanetanol 70% sebagai pencuci hasil isolasi.Hasil isolasi DNA diperlihatkan dengan dielektroforesis pada agarose gel (gambar 1).

Gambar 1. Hasil Elektroforesis GelAgarose (1%) dari Total DNA

kromosom.

Keterangan : Line 1 : marker; Line 2 : E.coli; Line 3 : E. coli; Line 4 : Salmonellasp.; Line 5 : E. coli; Line 6 : Salmonellasp.; Line 7 : E. coli; Line 8 : Salmonella sp;Line 9 : Salmonella sp.

Dari hasil elektroforesis menun-jukkan pita DNA tampak jelas (berartijumlah DNA yang terdeteksi banyak),sedangkan bagian bawah gel agarose masihterdapat berkas. Kemungkinan hal itudisebabkan adanya protein lain atau adabagian-bagian sel yang terikut (debris sel)pada saat isolasi DNA. Jadi pada isolasiDNA ini kita mendapatkan DNA yangbelum benar-benar murni.

Line: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Lia Is

Highlight

Lia Is

Highlight


Tabel 1. Konsentrasi DNA KromosomHasil Isolasi

Nilai perbandingan serapan padapanjang gelombang 260 dan 280 nm dapatdigunakan sebagai indikator kemurnianDNA (tabel 1). DNA dinyatakan murniapabila memiliki nilai perbandinganserapan pada panjang gelombang 260 dan280 nm (Aë260:Aë280) berkisar 1,8-2.Hasil pengamatan kualitas DNA denganspektrofotometer menunjukkan bahwarata-rata isolat menghasilkan DNA plas-mid dengan nilai perbandingan serapanAë260:Aë280 < 1,8. Hal ini menunjukkanmasih besarnya kontaminasi RNA dalamsampel. Hal ini memang telah diperkirakansebelumnya, karena tidak ada perlakuandengan RNAse dalam isolasi DNA kro-mosom ini. DNA kromosom dengan nilaiA260:A280 >1,8 kemungkinan mengan-dung asam nukleat dan nilai A260:A280<1,6 kemungkinan mengandung konta-minan seperti protein serta senyawa-senyawa organik lainnya.

Ada 5 tahap untuk melakukan isolasiDNA, yaitu: isolasi sel, pelisisan dindingdan membran sel, pengekstraksian dalamlarutan, purifikasi, dan presipitasi. Tahappertama yang dilakukan yaitu mengisolasisel yang ingin digunakan, yaitu sel bakteri.Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dindingdan membran sel dengan larutan pelisis sel.

Setelah dilakukan inkubasi, sitoplasma selyang telah bercampur dengan pelisis seltersebut lalu disentrifugasi selama 15 menitdengan kecepatan 3000 rpm. Selanjutnyasupernatan yang terbentuk dibuang dankemudian dilakukan ekstraksi di dalamlarutan. Hal tersebut bertujuan agar dida-pat ekstrak nukleus sel. Tahap berikutnyaadalah purifikasi. Tahap ini bertujuanuntuk mem-bersihkan nukleus sel dari zat-zat lainnya, dan tahap terakhir, yaitu pre-sipitasi bertujuan untuk mengendapkanprotein, se-hingga untai-untai DNA tidaklagi menggulung (coiling), yang menyebab-kan DNA menjadi terlihat.

Gambar 2. Hasil Elektroforesis PlasmidDNA

Keterangan: Line 1: Marker; Line 2:Plasmid E. coli; Line 3: Plasmid Salmonellasp.; Line 4: plasmid E. coli (yang diambiluntuk digesti); Line 5: plasmid Salmonellasp.

Hasil elektroforesis DNA plasmid(gambar 2) menunjukkan pita-pita yangtebal dan smear, berarti dalam penelitianini menghasilkan isolasi DNA plasmid yangbelum murni (terdapat berkas debris selatau DNA kromosom) dan dalam jumlahyang banyak. Pada line 2 dan 3 plasmid E.

Line: 1 2 3 4 5

Absorbansi DNA λ 260 λ 280

Konsentrasi DNA

(µg/ml)

Rasio λ260 / λ280

E. coli

1 0.276 0.158 13.8 1.75

2 1.415 1.11 70.75 1.27

3 0.207 0.195 10.35 1.06

4 1.275 0.663 63.75 1.92

Salmonella

1 1.117 0.976 55.85 1.14

2 0.793 0.531 39.65 1.49

Lia Is

Highlight


coli dan Salmonella sp. tidak terlihat adanyapita, disebabkan oleh konsentrasi yangterlalu rendah atau bahkan plasmid tidakterisolasi. Line 4 dan 5 terlihat adanya pitayang menunjukan bahwa plasmid sudahterisolasi dari sampel. Ukuran sebenarnyadari plasmid ini belum dapat ditentukanmelalui gel agarose elektroforesis karenatidak adanya penanda berat molekul yangsesuai. Dalam beberapa isolat (line 4 dan5) dapat dilihat adanya pita DNA plasmidsamar. Pita DNA ini dapat berarti adanyaplasmid yang berukuran sama yang telahterpotong menjadi linear akibat prosesisolasi DNA plasmid.

Dalam pelisisan dinding sel diguna-kan antibiotik, lalu disentrifugasi untukmemperoleh sel. Selanjutnya digunakanlarutan pelisis sel lysing solution yangmengandung EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) yang akan membentukkompleks (chelate) dengan ion logam,seperti Mg2+ yang merupakan kofaktorDNAse. Selanjutnya tabung dibolak-balikdengan gerakan memutar yang membentukangka 8 agar larutan dapat menyatudengan sempurna selama 10 menit. Selyang telah bercampur dengan pelisis seltersebut lalu disentrifugasi selama 10 menitdengan kecepatan 12000 rpm. Selanjutnyasupernatan yang terbentuk dimbil dalamfilter, sedangkan pellet dibuang. Tahapselanjutnya yaitu purifikasi. Purifikasibertujuan untuk membersihkan plasmiddari zat-zat lainnya, kedalam larutan tadikemudian diberikan fenol CIAA lalu divor-tek dan disentrifugasi, dilakukan berulang.Hal tersebut bertujuan untuk meng-optimalkan kerja CIAA. Sehingga super-natan yang mengandung plasmid dipisah-kan, pellet dibuang. Tahap berikutnya yaitupresipitasi; dilakukan dengan cara mene-teskan larutan presipitasi protein dankemudian divortex yang bertujuan untuk

menghomogenkan larutan. Larutanpresipitasi protein terdiri atas kalium asetatatau Na-asetat yang jika berikatan denganprotein mengakibatkan terbentuknyasenyawa baru yang memiliki kelarutan yanglebih rendah, sehingga menyebabkan plas-mid mengendap. Hasil dari sentrifugasiadalah terdapatnya pelet DNA plasmidpada dasar tabung yang kemudianditambahkan etanol 70% dan dibolak-balikkembali. Pemberian etanol bertujuanuntuk membersihkan DNA plasmid daripengotor-pengotornya. Hasil akhirnyaadalah DNA plasmid yang berada pada tepidasar tabung. Langkah akhirnya adalahdengan pemberian Tris-EDTA yangbertujuan untuk melarutkan kembali DNAplasmid untuk dipreservasi.

Gambar 3. Hasil digesti DNA dan plamidkromosom. Digesti menggunakan

ECoR I.

Keterangan : Line 1: marker lambda DNAECoR I/HindIII; Line 2: Plasmid PUC 19utuh; Line 3: Kromosom Salmonella sp.utuh; Line 4: digesti PUC hasil isolasi (E.coli line no 4); Line 5: digesti KromosomE. coli (kelompok 4); Line 6: Digestkromosom E. coli (kelompok 2); Line 7:digest kromosom Salmonella sp. (kelompok2); Line 8: digest kromosom Salmonella(kelompok 1)


DAFTAR PUSTAKA

Artama, W.T. 1991. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi. UGM. Yogyakarta.

Ausabel. F.M, et al. 1992. Short Protocols in Moleculer Biology, Third ed. John Wiley & Sons.Inc. USA.

Brown, A.T. 1991. Pengantar Kloning Gen (Alih bahasa: S.A. Muhammad dan Praseno).Yayasan Esensia Medika. Yogyakarta.

Kimbal, John W. 1989. Biologi. Edisi kelima cetakan kedua. Penerbit Erlangga. Jakarta.

Lehninger, A.L. 1982. Dasar - dasar Biokimia. jilid 1. Penerbit Erlangga. Jakarta.

Lodish, Harvey, et al. 2001. Molecular Cell Biology, Fourth Edition. W.H. Freeman andCompany. New York.

Murray. R.K, at al. 1995, Biokimia Harper, edisi ke-22. Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta.

Mubarika, Sofia. 1990. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi UGM. Yogyakarta.

Sambrook, L., et al. Molecular Clonning : A laboratory Manual, second edition. Cold SpringHarbor Laboratory Press. New York.

Schmid, R.D. 2003. Pocket Guide to Biotechnology and Genetic Engineering. Wiley-VCH. Germany.

Watson, James D. Tooze, John. Kurtz, David T. 1988. DNA Rekombinan. Penerbit Erlangga. Jakarta.

Weaver, R.F. 1999. Molecular Biology. WCB McGraw-Hill Publisher. USA.

DNA kromosom dan plasmid hasilisolasi dipotong dengan enzim restriksiendonuklease Eco RI, kemudian dilakukananalisa melalui elektroforesis (gambar 3).Line 2 terlihat pita yang lebar, disebabkanada plasmid yang supercoil sehinggamempunyai ukuran yang lebih pendekdibanding yang relaks. PUC masih dalamkeadaan sirkuler sehingga ukurannya tidakbisa dibandingkan dengan marker. Line 3 :adalah kromosom utuh sehingga tidak bisadibandingkan dengan marker. Line 4 : Hasildigesti PUC, PUC 19 hanya memiliki satusite untuk Eco RI sehingga hasil digestimenghasilkan membentuk satu pitadengan ukuran (lihat dimarker). Line 5sampai 8 : perbedaan pola pita dan smearini, hal ini disebabkan karena konsentrasiDNA yang berbeda dan jumlah DNA yang

terpotong. Kromosom mempunyai restric-tion site Eco RI banyak dan panjang frag-ment yang dihasilkan bervariasi, sehinggaterlihat pita-pita yang sangat rapat (smear).

SIMPULAN

Isolasi DNA kromosom ataupunDNA plasmid dapat dilakukan denganmenggunakan prosedur isolasi sel; lisisdinding dan membran sel; ekstraksi dalamlarutan; purifikasi; dan presipitasi.Diperoleh DNA kromosom dan plasmiddengan kemurniannya cukup tinggi dilihatdari hasil elektroforesis yang baik. Kete-litian dan kecermatan dalam pelaksanaanpenelitian, sangat menentukan hasilkemurnian DNA kromosom dan plasmid.

isolasi dna

Documents