ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL)PROTEOLITIK DARI KEFIR

(Skripsi)

Oleh

DIANA ISMAWATI

JURUSAN BIOLOGIFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS LAMPUNG2018

ABSTRAK

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL)PROTEOLITIK DARI KEFIR

Oleh

Diana Ismawati

Kefir merupakan salah satu produk fermentasi yang dapat dibuat dari susu hewanimaupun susu nabati dengan penambahan ragi sebagai mikroba starter. Mikrobayang diisolasi dari kefir berpotensi untuk menghasilkan enzim protease. Tujuanpenelitian ini adalah mendapatkan isolat dan karakter BAL dari kefir susu sapidan kefir susu kedelai yang memiliki kemampuan proteolitik berdasarkan ujimorfologi, biokimia, dan fisiologis serta mengetahui kemampuan proteolitik BALmelalui uji kualitatif menggunakan media MRS Agar + susu skim 1 %. Datadianalisis secara deskriptif dengan menampilkan data dalam bentuk tabel dangambar. Hasil penelitian menunjukan bahwa ditemukan 7 isolat BAL, 4 isolat darikefir susu sapi yaitu BAL S1, BAL S2, BAL S3, dan BAL S4, 3 isolat dari kefirsusu kedelai yaitu BAL K1, BAL K2, dan BAL K3. BAL dari kefir susu sapi dankefir susu kedelai yang mampu menghasilkan enzim protease. Isolat dari kefirsusu sapi dan susu kedelai tidak memiliki banyak perbedaan karakter baikmorfologi, biokimia maupun fisiologi. Isolat BAL dari kefir susu sapi dan kefirsusu kedelai tidak memiliki perbedaan indeks proteolitik yang signifikan, isolatdari kefir susu sapi dengan kode BAL S2 memiliki IP tertinggi yaitu 2,92 dan IPterendah dimiliki oleh isolat BAL S3 dengan IP sebesar 1,53. Untuk indeksproteolitik isolat kefir susu kedelai IP tertinggi sebesar 2,71 dari isolat BAL K1dan IP terendah dari isolat BAL K2 sebesar 1,77 keduanya menunjukan aktivitasprotease sedang.

Kata kunci: BAL, kefir, proteolitik, susu kedelai, susu sapi.

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL)PROTEOLITIK DARI KEFIR

Oleh

DIANA ISMAWATI

Skripsi

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh GelarSARJANA SAINS

Pada

Jurusan BiologiFakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS LAMPUNG

2018

vi

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di desa Podomoro kecamatan Pringsewu

pada tanggal 22 Februari 1995. Penulis merupakan anak

pertama dari dua bersaudara dari pasangan Bapak Kisworo

dan Ibu Satina.

Penulis mengawali pendidikan di SD Negeri 1 Podomoro pada tahun

2001, Penulis melanjutkan pendidikan ke SMP Negeri 4 Pringsewu pada tahun

2007 dan dilanjutkan ke SMA Negeri 1 Pringsewu pada tahun 2010 dan lulus

pada tahun 2013.

Pada tahun 2014, Penulis diterima sebagai mahasiswi Jurusan Biologi, Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung melalui jalur

Seleksi Bersama Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SBMPTN).

Selama menempuh pendidikan di kampus Penulis pernah menjadi asisten

praktikum mata kuliah Mikrobiologi Umum dan Mikrobiologi Tanah. Selain itu,

Penulis juga aktif Organisasi Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMBIO) FMIPA

Unila sebagai anggota biro Dana dan Usaha tahun 2014-2015.

Penulis melaksanakan Kuliah Kerja Nyata (KKN) di Kabupaten Lampung

Tengah, Kecamatan Pubian, Desa Kota Batu pada bulan Januari – Maret 2017.

Penulis mengikuti seleksi proposal Program Kreativitas Mahasiswa (PKM) dan

berhasil mendapatkan pendanaan hibah PKM Penelitian pada tahun 2017 dengan

vii

judul “Potensi Bakteri Asam Laktat Asal Tempoyak Sebagai Pengawet

Hayati Tahu”.

Penulis melaksanakan Kerja Praktik (KP) pada bulan Juli – Agustus 2017 di

SEAMEO BIOTROP Bogor dengan judul “Penentuan Kualitas Fisik, Populasi

Cendawan Perusak Pascapanen dan Kadar Air Biji Kopi Arabika

Menggunakan Cara Pengolahan Basah di SEAMEO BIOTROP”

vi

PERSEMBAHANDengan mengucapkan rasa syukur kepada ALLAH SWT atas segala

Rahmat, nikmat serta pertolongan yang selalu diberikan sehingga

berkat Ridho-NYA skripsi ini dapat terselesaikan. Kupersembahkan

karya ini untuk:

Bapak dan Ibu ku yang selalu mendoakanku setiap waktu, memberikan

kasih sayang yang tulus, tiada henti memberikan dukungan, nasihat

dan motivasi kepadaku, selalu menjadi penyemangat dan sumber

kekuatanku dalam meraih kesuksesan.

Adikku tersayang yang selalu memberikan semangat dan keceriaan.

Bapak dan ibu dosen yang telah mendidik dan memberikan begitu

banyak ilmu bermanfaat serta pembelajaran dalam kehidupan.

Saudara-saudaraku, sahabat-sahabatku, serta rekan-rekan

seperjuanganku yang telah memberikan banyak dukungan, semangat,

motivasi, saran, canda tawa serta pengalaman dan kenangan yang luar

biasa selama masa studi.

Almamater tercinta, Universitas Lampung.

vi

MOTTO

Allah akan mengangkat (derajat) orang-orang yang beriman diantaramu dan orang-orang yang diberi ilmu pengetahuan beberapa

derajat.”(Q.S. Al-Mujadalah : 11)

“Maka sesungguhnya bersama kesulitan itu ada kemudahan.Sesungguhnya bersama kesulitan itu ada kemudahan.”

(Q.S. Al-Insyirah: 5-6)

”Barang siapa yang keluar untuk mencari ilmu maka ia berada dijalan Allah hingga ia pulang”.

(HR. Turmudzi)

Lakukan yang terbaik, sehingga aku tak akan menyalahkan dirikusendiri atas segalanya.(Magdalena Neuner)

Kamu selalu melalui kegagalan di jalanmu menuju kesuksesan.(Mickey Rooney)

x

SANWACANA

Segala puji dan syukur Penulis haturkan kepada ALLAH SWT, Dzat Maha Esa,

dan Maha Agung,yang telah melimpahkan Rahmat dan Karunia-NYA sehingga

penulis mampu menyelesaikan skripsi yang berjudul “ISOLASI DAN

KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL) PROTEOLITIK

DARI KEFIR”. Penulis menyadari bahwa banyak sekali bantuan yang

didapatkan selama proses penyelesaian skripsi ini. Ucapan terima kasih penulis

haturkan kepada semua pihak yang telah berperan dalam memberikan bimbingan,

masukkan, saran dan kritik sehingga skripsi ini dapat terselesaikan, terutama

sebagai berikut:

1. Ibu dan bapakku yang selalu memberikan doa, kasih sayang yang tulus,

nasihat, motivasi dan dukungan baik materil maupun non-materil serta segala

pengorbanan yang telah diberikan.

2. Adikku satu-satunya Sendi Ismawan yang selalu memberikan keceriaan dan

penyemangat kepada Penulis.

3. Ibu Dra. C.N. Ekowati, M.Si. selaku Pembimbing I yang dengan sabar

membimbing, mengarahkan, memberikan saran, solusi, serta ilmu yang sangat

bermanfaat selama perkuliahan, proses penelitian sampai terselesaikannya

skripsi ini.

4. Bapak Dr. Sumardi, M.Si. selaku pembimbing II yang dengan sabar

membimbing, mengarahkan, memberikan saran, perhatian, solusi, serta ilmu

xi

yang sangat bermanfaat selama perkuliahan, proses penelitian sampai

terselesaikannya skripsi ini.

5. Bapak Ir. Salman Farisi, M.Si. selaku Pembahas yang telah memberikan

masukan, saran, dukungan dan nasihat serta ilmu yang sangat bermanfaat

selama perkuliahan, proses penelitian sampai terselesaikannya skripsi ini.

6. Ibu Dr. Endang Nurcahyani, M.Si. selaku Pembimbing Akademik yang telah

memberikan arahan dan motivasi selama perkuliahan maupun dalam

penyusunan skripsi.

7. Bapak Prof. Dr. Ir. Hasriadi Mat Akin, M.P. selaku Rektor Universitas

Lampung.

8. Bapak Prof. Warsito, S.Si., D.E.A., Ph.D., selaku Dekan Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.

9. Ibu Dr. Nuning Nurcahyani, M.Sc., selaku Ketua Jurusan Biologi FMIPA

Universitas Lampung.

10. Seluruh Dosen dan Staf Jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung, terima

kasih telah banyak memberikan ilmu dan pengalaman selama perkuliahan.

11. Rekan seperjuangan tim penelitian kefir, Rosmaida La Sinurat, Agung Setia

Ningsih, Ketut Mahendri dan Benny Hartanto, terima kasih atas segala

bantuan, kebersamaan, perhatian, semangat, kerja sama dan sarannya selama

perjalanan penelitian sampai proses pengerjaan skripsi.

12. Sahabat-sahabat seperjuanganku selama perkuliahan Nurjulia Jashinda Akas,

Rosmaida La Sinurat, Titin Aprilia, Agung Setia Ningsih, Komang Rima,

Rizka Oktavia, Ketut Mahendri, Nandia Putri Aulia, Indria Ratna Anggraeni,

Theodorius Aprienta, Benny Hartanto, terima kasih atas kebersamaan, canda

xii

tawa, semangat, dukungan, perhatian, pengalaman dan kenangan yang tak

terlupakan selama perkuliahan.

13. Saudaraku tercinta Nuzulul Istikomah yang selalu memberikan semangat,

perhatian, canda tawa serta tempat berbagi cerita.

14. Sahabat-sahabatku sedari SMA Adilah Tazkia Azzahra, Lailatus Syifa dan

Indra Intan Saputri terima kasih atas semangat, dukungan dan perhatian yang

telah diberikan walaupun kita jauh dan jarang bertemu, semoga silaturahmi kita

dapat terjalin sampai kapan pun.

15. Teman-teman Microholic 2014 Milsa Solva Diana, Suminta Frida, Rismayanti,

Sesti, Syahnas, Tryana terima kasih atas canda tawa, kebersamaan dan kerja

samanya selama bergabung di Lab. Mikrobiologi.

16. Kakak-kakak Microholic 2013, terima kasih atas saran, masukan, dan nasihat

yang telah diberikan.

17. Teman-teman seperjuangan Biologi 2014 terima kasih atas kebersamaan, canda

tawa, kerja sama dan kenangan yang indah selama perkuliahan.

18. Kakak kosan selama KP di Bogor, Kak Iean dan Kak Mei, terima kasih atas

perhatian, canda tawa dan semangat yang diberikan.

19. Teman-teman sekamarku Shindy Dwiyanti, Evi Muharoroh, Eka Sari, Wahyu

Wijiati, dan Gita Elisia terima kasih atas kebersamaan, keceriaan dan semangat

yang diberikan.

20. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu-persatu yang telah

memberikan penulis bantuan, dukungan, berbagai kritik dan saran.

21. Almamaterku tercinta, Universitas Lampung.

xiii

Semoga segala kebaikan yang telah diberikan mendapat balasan kebaikan pula

dari Allah SWT. Penulis berharap skripsi ini dapat memberikan manfaat dan

wawasan kepada setiap orang yang membacanya.

Bandar Lampung, 1 Agustus 2018

Diana Ismawati

xiv

DAFTAR ISI

Halaman

COVER DEPAN .................................................................................................... i

ABSTRAK ............................................................................................................. ii

COVER DALAM ........................................................................................ ........iii

HALAMAN PERSETUJUAN ................................................................... ........iv

HALAMAN PENGESAHAN ...............................................................................v

RIWAYAT HIDUP ..................................................................................... ........vi

PERSEMBAHAN ...................................................................................... ........viii

MOTTO ....................................................................................................... ........ix

SANWACANA ......................................................................................................x

DAFTAR ISI .................................. ....................................................................xiv

DAFTAR TABEL .............................................................................................. xvi

DAFTAR GAMBAR........................................................................................ xviii

I. PENDAHULUAN ..............................................................................................1

A. Latar Belakang................................................................................................1

B. Tujuan Penelitian ............................................................................................3

C. Manfaat Penelitian ..........................................................................................3

D. Kerangka Pikir................................................................................................3

E. Hipotesis ........................................................................................................5

xv

II. TINJAUAN PUSTAKA....................................................................................6

A. Kefir ...............................................................................................................6B. BAL .............................................................................................................10C. Enzim Protease ............................................................................................12D. Bakteri Proteolitik.........................................................................................14E. Faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim ..............................................15

III. METODE PENELITIAN .............................................................................17

A. Waktu dan Tempat Penelitian ....................................................................17

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN.....................................................................27

A. Karakterisasi BAL Proteolitik dari Kefir Susu sapi dan Kefir Susu

Kedelai .......................................................................................................27

B. Uji Kualitatif Proteolitik BAL Kefir Susu Sapi dan Kefir Susu Kedelai ...36

V . SIMPULAN DAN SARAN ............................................................................39

A. Simpulan ....................................................................................................39

B. Saran ..........................................................................................................39

DAFTAR PUSTAKA……………………………………………..………….…40

LAMPIRAN..........................................................................................................46

B. Alat dan Bahan ...........................................................................................17

C. Metode Penelitian.......................................................................................18

D. Analisis Data ..............................................................................................18

E. Prosedur Kerja ..........................................................................................18

F. Diagram Alir ..............................................................................................26

xvi

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Kandungan Gizi dalam tiap 100 gram Biji Kedelai Kering......................7

Tabel 2. Komposisi Gizi Susu Kedelai Cair dan Susu Sapi (dalam 100 gram) ......8

Tabel 3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum ............................................21

Tabel 4. Morfologi Koloni Isolat Kefir Susu Sapi dan Kefir Susu Kedelai ..........27

Tabel 5. Pengamatan Mikroskopis Hasil Isolasi Kefir Susu Kedelai ....................28

Tabel 6. Hasil Uji Biokimia Isolat Kefir Susu Sapi dan Kefir Susu Kedelai .......30

Tabel 7. Hasil Uji Katalase dan Motilitas Isolat Kefir Susu Sapi dan KefirSusu Kedelai ...........................................................................................35

Tabel 8. Hasil Uji Biokimia Isolat Kefir Susu Sapi ...............................................47

Tabel 9. Hasil Uji Biokimia Isolat Kefir Susu Kedelai..........................................47

Tabel 10. Jumlah Bakteri Berdasarkan Standar Kekeruhan Mc. Farland .............48

Tabel 11. Komposisi lautan Standar Mc. Farland ................................................48

Tabel 12. Nilai Absorbansi Larutan Standar .........................................................49

Tabel 13. Nilai Absorbansi Uji pH Optimum Isolat Kefir Susu Sapi....................51

Tabel 14. Nilai Absorbansi Uji pH Optimum Isolat Kefir Susu Kedelai...............51

Tabel 15. Hasil Perhitungan Jumlah Bakteri Pada Uji pH Optimum IsolatKefir Susu Sapi ......................................................................................52

Tabel 16. Hasil Perhitungan Jumlah Bakteri Pada Uji pH Optimum IsolatKefir Susu Kedelai .................................................................................53

Tabel 17. Nilai Absorbansi Uji Suhu Optimum Isolat Kefir Susu Kedelai ...........53

xvii

Tabel 18. Nilai Absorbansi Uji Suhu Optimum Isolat Kefir Susu Sapi.................54

Tabel 19. Hasil Perhitungan Jumlah Bakteri pada Uji Suhu Optimum IsolatKefir Susu Sapi ......................................................................................54

Tabel 20. Hasil Perhitungan Jumlah Bakteri pada Uji Suhu Optimum IsolatKefir Susu Kedelai ..............................................................................55

Tabel 21. Hasil Perhitungan Uji Kualitatif Isolat BAL Proteolitik .......................56

xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Penentuan Indeks Proteolitik Secara Kualitatif....................................25

Gambar 2. Diagram Alir Penelitian .......................................................................26

Gambar 3. pH Optimum Isolat BAL Kefir Susu Sapi dan Kefir SusuKedelai .................................................................................................33

Gambar 4. Suhu Optimum Isolat BAL Kefir Susu Sapi dan Kefir SusuKedelai. ...............................................................................................34

Gambar 5. Hasil Uji Kualitatif Proteolitik BAL Kefir Susu Sapi dan SusuKedelai .................................................................................................36

Gambar 6. Hasil Pewarnaan Gram Isolat Kefir Susu Sapi ....................................56

Gambar 7. Hasil Pewarnaan Gram Isolat Kefir Susu Kedelai ...............................57

Gambar 8. Hasil Pewarnaan spora Isolat Kefir Susu Sapi .................................... 57

Gambar 9. Hasil Pewarnaan Spora Isolat Kefir Susu Kedelai ...............................58

Gambar 10. Kefir Susu Kedelai dan Susu Sapi Inkubasi 24 Jam ..........................58

Gambar 11. Hasil Foto Uji Biokimia ....................................................................59

Gambar 12. Hasil Foto Uji Motilitas .....................................................................59

1

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kefir merupakan salah satu produk fermentasi yang dapat dibuat dari susu

nabati maupun hewani yang telah ditambahkan bibit kefir (kefir grain/kefir

granule) atau ragi. Bahan baku susu nabati dapat diperoleh dari kacang

kedelai, kacang merah atau kacang hijau sedangkan susu hewani dapat

diperoleh dari susu sapi, susu kambing atau susu kuda.

Susu kedelai mengandung komposisi gizi (dalam 100 gram) sebagai berikut

protein 3,50 gram, kalsium 50 mg, karbohidrat 5,00 gram, fosfor 45 gram,

lemak 2,5 gram besi 0,70. Susu sapi juga memiliki kandungan gizi

diantaranya adalah protein 3,20 gram, kalsium 143 mg, karbohidrat 4,30

gram, fosfor 60 gram, lemak 3,50 gram dan besi 1,70 gram yang terkandung

setiap 100 gram susu sapi (Aman dan Hardjo, 1973). Walaupun komponen

yang terkandung dalam susu kedelai hampir sama dengan susu sapi namun

jumlah nutrisi yang terkandung pada susu kedelai dan susu sapi terlihat

adanya perbedaan. Perbedaan jumlah nutrisi ini akan mempengaruhi

karakter mikrobanyang aktif pada fermentasi kefir. Mikroba yang berperan

dalam fermentasi kefir didominasi oleh BAL. BAL dapat ditemukan pada

ragi tape diantaranya Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum

(Rahayu, 2003), Weisella, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus spp., dan

Enterococcus spp. (Sujaya et al., 2010). Menurut Ernawati (1997),

2

penggunaan ragi tape sebanyak 1 % menghasilkan curd yang lebih lembut

dan aroma yang lebih baik untuk fermentasi kefir.

Kwok dan De Vos (1994) mengatakan bahwa beberapa strain bakteri asam

laktat diketahui mempunyai sistem proteolitik sehingga memungkinkan

tumbuh pada substrat yang kaya akan protein seperti susu.

Hal ini dibuktikan oleh penelitian Putranto (2007) bahwa salah satu strain

BAL yaitu Lactobacillus acidhopilus memiliki kemampuan mengekskresikan

ekstraseluler protease. Melliawati et al. (2015) menemukan BAL dari dadih

dan danke. Dadih adalah makanan fermentasi susu yang berasal dari

Sumatera Barat sedangkan danke merupakan makanan dari susu yang

dikoagulasi menggunaan getah buah papaya. Dari penelitian ini diperoleh 18

isolat BAL yang memiliki kemampuan proteolitik dan Lactobacillus

plantarum strain LAB12 memiliki aktivitas enzim protease paling tinggi yaitu

0,598 unit/mL selama proses fermentasi 72 jam. Menurut Putranto (2006)

salah satu jenis BAL yaitu Lactobacillus acidophilus dalam fermentasi susu

sapi perah mampu mengekskresikan enzim protease ekstraseluler dengan

aktivitas tertinggi pada jam ke-18 sebesar 0,752 U/mg. Aktivitas proteolitik

juga ditemukan pada isolat BAL dari susu kedelai yang terfermentasi spontan

(Yusmarini, 2009).

Sejauh ini informasi tentang BAL proteolitik dari kefir dengan starter ragi

tapi belum banyak diketahui, oleh karena itu perlu dilakukan penelitian

tentang isolasi dan karakterisasi bakteri asam lakat proteolitik dari kefir

dengan starter ragi tape.

3

B. Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah:

1. Mendapatkan isolat BAL dari kefir susu sapi dan kefir susu kedelai yang

memiliki kemampuan proteolitik.

2. Mengetahui karakter isolat BAL dari kefir susu sapi dan kefir susu kedelai

berdasarkan uji makroskopis, mikroskopis, biokimia, dan fisiologis.

3. Mengetahui kemampuan proteolitik BAL dari kefir susu sapi dan kefir

susu kedelai melalui uji kualitatif proteolitik.

C. Manfaat Penelitian

Hasil dari penelitian ini diharapkan mampu menjadi bahan kajian dan

informasi ilmiah tentang BAL proteolitik untuk penelitian lebih lanjut

maupun aplikasi di bidang mikrobiologis.

D. Kerangka Pikir

Pembuatan kefir umumnya berlangsung dengan bantuan starter kultur

tertentu yang disebut bibit kefir (kefir grains) yang mengandung kumpulan

BAL dan khamir nonpatogen yang masing-masing berperan dalam

pembentukan cita rasa dan struktur kefir. Starter yang dapat digunakan

adalah ragi tape. Menurut Ernawati (1997), penggunaan ragi tape sebanyak

1 % menghasilkan curd yang lebih lembut dan aroma yang lebih baik

dibandingkan penggunaannya sebanyak 3 %. Mikroorganisme yang

terkandung dalam ragi umumnya berupa kultur campuran yang terdiri dari

kapang, khamir, dan bakteri. Menurut Gandjar (2003), ragi tape terdiri dari

4

kapang (Rhizopus oryzae , Mucor ), khamir (Sacharomyces cerevisiae,

Sacharomyces verdomanni ) dan bakteri Pediococcus sp.

Menurut Park et al. (2007), air susu kaya akan protein, lemak, karbohidrat

terutama laktosa, vitamin dan mineral. Oleh karena itu susu dapat menjadi

substrat yang ideal bagi pertumbuhan mikroorganisme. Protein yang

terkandung dalam susu merupakan kelompok molekul yang sangat

heterogen, terdiri dari lima kategori yaitu kasein, protein whey, protein globul

lemak susu, enzim dan protein minor lainnya (Ng-Kwai-Hang, 2003). Protein

yang ada dalam susu sebagian besar adalah kasein (76 %) dan protein whey

(18 %) (Susilorini, 2006). Kasein terdiri dari campuran tiga komponen

protein, yaitu protein alpha (40-60 %), kasein beta (20-30 %), dan kasein

gamma (3-7 %). Setelah kasein dipisahkan dari air susu, sisanya yang

merupakan larutan dinamakan whey. Kira-kira 0,5-0,7 % dari bahan protein

yang dapat larut dan tertinggal dalam whey yaitu protein laktoglobulin dan

laktalbumin (Astuti, 1995).

Karena molekul protein terlampau besar untuk dapat melewati membran,

bakteri mengekskresikan enzim yang disebut protease yang berfungsi untuk

menghidrolisis protein tersebut menjadi peptida-peptida. Bakteri

menghasilkan peptidase yang menguraikan peptida menjadi asam-asam

amino, yang kemudian dikatabolisme melalui cara yang bergantung pada tipe

asam aminonya dan spesies atau galur bakteri yang menguraikannya. BAL

yang mampu menghidrolisis ikatan peptida pada protein merupakan BAL

dengan kemampuan proteolitik atau disebut BAL penghasil enzim protease.

5

Kemampuan proteolitik BAL selain dipengaruhi oleh faktor nutrisi substrat

seperti protein, karbohidrat, lemak, mineral dan vitamin, juga dipengaruhi oleh

faktor suhu dan pH . Kondisi lingkungan yang berbeda di setiap substrat

mengakibatkan karakter setiap jenis BAL akan berbeda. BAL akan

menyesuaikan diri dengan lingkungan sesuai dengan ketahanannya.

E. HIPOTESIS

Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah:

1. Isolat BAL dari kefir susu sapi dan kefir susu kedelai mampu

menghasilkan enzim protease.

2. Adanya perbedaan karakter BAL proteolitik dalam kefir susu sapi dan

kefir susu kedelai yang dipengaruhi oleh faktor nutrisi, pH, dan suhu

inkubasi.

3. Adanya perbedaan kemampuan proteolitik antara BAL dari kefir susu

sapi dan kefir susu kedelai.

6

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Kefir

Susu merupakan sumber kalsium, fosfor, dan vitamin A yang sangat baik.

Kandungan air di dalam susu sangat tinggi, yaitu sekitar 87,5 %, dengan

kandungan gula susu (laktosa) sekitar 5 %, protein sekitar 3,5 %, dan lemak

sekitar 3-4 % (Widodo, 2002).

Menurut Toruan (2008) sumber makanan yang mengandung asam amino

lengkap adalah protein hewani dan satu satunya tumbuhan yang memiliki

asam amino lengkap seperti hewan adalah kedelai. Sumber susu dari hewani

seperti susu sapi adalah salah satu sumber protein yang paling baik dan ini

dapat dikaitkan dengan konten yang kaya protein berkualitas. Protein dalam

susu sapi murni mengandung asam amino esensial yang dibutuhkan oleh

tubuh. Sedangkan kedelai dikenal sebagai salah satu makanan yang memiliki

tingkat protein nabati yang sangat tinggi. Toruan (2008) mengatakan bahwa

kedelai merupakan salah satu sumber protein nabati yang sangat baik

dikonsumsi, dalam jumlah gram yang sama, kandungan protein yang terdapat

dalam kedelai lebih tinggi dibandingkan dengan yang terdapat dalam daging

ayam.

Kedelai dipilih sebagai bahan baku susu karena memiliki kandungan gizi

yang tinggi. Di antara kacang-kacangan, kadar protein kedelai memang

7

paling tinggi. Kandungan gizi kedelai ditunjukkan pada Tabel 1. Pada

dasarnya semua biji-bijian dapat diproses menjadi susu. Dengan diolah

menjadi susu akan menaikkan nilai cerna dari biji-bijian tersebut. Susu

kedelai memiliki bentuk menyerupai susu sapi, cara menyiapkannya mudah

sehingga memungkinkan untuk menjadi minuman bergizi di negara-negara

berkembang. Pembuatan susu kedelai pada dasarnya adalah memproses biji

kacang kedelai untuk diambil sarinya.

Tabel 1. Kandungan Gizi dalam Tiap 100 gram Biji Kedelai Kering

Kandungan Gizi Proporsi nutrisidalam biji

Protein (gram) 268,00

Lemak (gram) 30,90

Karbohidrat (gram) 15,10

Kalori (kal) 30,10

Kalsium (mgram) 196,00

Fosfor (mgram) 506,00

Zat besi (mgram) 6,90

Vitamin A (SI) 95,00

Vitamin B1 (mgram) 0,93

Vitamin C (mgram) 0,00

Air (gram) 20,00

Bagian yang dapat dimakan (%) 100,00

Sumber: Rahmat Rukmana, 1997

Susu kedelai yang mengandung protein nabati yang tidak kalah gizinya

dengan susu yang berasal dari hewan (susu sapi). Komposisi gizi di dalam

8

susu kedelai dan susu sapi dapat dilihat pada Tabel 2. Dapat dilihat bahwa

kandungan protein dalam susu kedelai hampir sama dengan kandungan

protein dalam susu sapi.

Tabel 2. Komposisi Gizi Susu Kedelai Cair dan Susu Sapi (dalam 100 gram)

Komponen Susu Kedelai Susu SapiKalori (Kkal) 41,00 61,00

Protein (gram) 3,50 3,20

Lemak (gram) 2,50 3,50

Karbohidrat (gram) 5,00 4,30

Kalsium (mg) 50,00 143,00

Fosfor (gram) 45,00 60,00

Besi (gram) 0,70 1,70

Vitamin A (SI) 200,00 130,00

Vitamin B1 (tiamin)(mgram)

0,08 0,03

Vitamin C (mgram) 2,00 1,00

Sumber: Aman dan Hardjo, 1973

Salah satu produk fermentasi susu yang dikenal adalah kefir. Di Indonesia

kefir relatif lebih banyak dibuat sendiri di rumah-rumah. Ilmu dan bahan

yang di perlukan untuk membuat kefir oleh sebagian besar masyarakat kita

diperoleh dari Arab dan Timur Tengah. Kefir, seperti halnya yogurt,

merupakan salah satu minuman susu fermentasi yang tertua sebab sudah

dikenal dan diminum sejak beribu-ribu tahun. Kefir mirip dengan yogurt,

tetapi kefir lebih encer dan gumpalan susunya lebih lembut. Selain itu kefir

9

mengandung gelembung gas karbondioksida dan juga sekitar 1 % alkohol.

Keunikan kefir di bandingkan susu fermentasi lain adalah cara pembuatannya

yang menggunakan biji-biji kefir (Widodo, 2002).

Biji kefir merupakan kumpulan berbagai jenis mikroba yang menempel di

permukaan kasein (protein susu). Jenis mikroba yang ada pada biji kefir

cukup banyak tetapi semua hidup bersama-sama dan saling mempengaruhi.

Bakteri penghasil asam laktat yang ditemukan pada biji kefir umumnya

adalah Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus

kefir, Lactococcus lactis, bakteri penghasil asam cuka Acetobacter sp. serta

ragi Torula, Saccharomyces cerevisiae, Candida kefir dan dua bakteri yogurt

L.bulgaricus dan S. thermophilus dalam jumlah relatif sedikit. Ukuran dan

jumlah biji kefir dapat bertambah dari waktu ke waktu, bahkan berlipat ganda

karena mikroba yang berkembangbiak dan protein susu kasein yang

menempel pada permukaan biji kefir (Widodo, 2002).

Kefir adalah produk fermentasi susu yang mengandung probiotik yang sangat

berguna bagi kesehatan tubuh. Kefir merupakan susu fermentasi yang

mengandung alkohol 0,5-1 %. Kefir mempunyai kelebihan dibandingkan

dengan susu segar karena asam yang terbentuk dapat memperpanjang masa

simpan, mencegah pertumbuhan mikroorganisme pembusuk sehingga

mencegah kerusakan susu, dan mencegah pertumbuhan mikroorganisme

patogen sekaligus meningkatkan keamanan produk kefir (Haryadi, 2013).

Adesokan et al. (2011) mengatakan nilai pH sangat berkaitan dengan kadar

asam yang dihasilkan. Peningkatan kadar asam dan penurunan pH pada

10

fermentasi susu dengan kultur bakteri asam laktat sudah terlihat selama

inkubasi 24 jam. Proses fermentasi akan mengubah laktosa dalam susu

menjadi glukosa dan galaktosa oleh aktivitas kultur starter sehingga akan

mengurangi gangguan pencernaan bila mengonsumsinya. Produk susu

fermentasi dibedakan berdasarkan jenis bakteri asam laktatnya. Bakteri asam

laktat akan menghidrolisis laktosa yang di dalam susu menjadi berbagai

macam senyawa karbohidrat lebih sederhana. Proses fermentasi

mengakibatkan aktivitas mikroba meningkat, penurunan pH, dan peningkatan

kadar asam dalam produk fermentasi (Afriani, 2010).

B. Bakteri Asam Laktat

Bakteri asam laktat merupakan kelompok bakteri Gram positif, berbentuk

bulat atau batang, tidak membentuk spora, mampu memfermentasi

karbohidrat, bersifat katalase negatif dan merupakan kelompok mikroaerofilik

(Axelsson, 2004). Secara umum yang termasuk kelompok BAL adalah

Lactococcus, Enterococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus,

Leuconostoc dan Lactobacillus (Salminen et al., 2004). Menurut Suardana

(2007) Lactobacillus lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus

bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii adalah bakteri

berbentuk batang, Gram positif dan sering berbentuk pasangan dan rantai dari

sel-selnya.

Bakteri asam laktat (BAL) merupakan golongan bakteri yang dapat

menghasilkan asam laktat sebagai produk akhir fermentasi. BAL

memiliki cici-ciri, yaitu berbentuk batang atau kokus, tidak motil, tidak

11

dapat menghasilkan spora, katalase negatif, Gram positif, tahan

terhadap kondisi asam dan bersifat anaerob fakultatif (Hutkins, 2006).

BAL umumnya bersifat mesofilik namun ada beberapa jenis yang

dapat tumbuh pada suhu 4 oC. BAL memiliki pH pertumbuhan 4,0-4,5

namun beberapa galur tahan pada pH 3,2 dan pH di atas 9,0 (Bamforth,

2005).

Menurut Suardana (2007) BAL dapat dibedakan menjadi 2 kelompok

berdasarkan hasil fermentasinya, yaitu:

1. Bakteri homofermentatif, dimana glukosa difermentasi menghasilkan

asam laktat sebagai satu-satunya produk. Contohnya yaitu Streptococus,

Pediococcus, dan beberapa Lactobacillus.

2. Bakteri heterofermentatif, glukosa difermentasikan selain menghasilkan

asam laktat juga memproduksi senyawa-senyawa lainnya yaitu etanol,

asam asetat dan CO2. Contohnya yaitu Leuconostoc dan beberapa spesies

Lactobacillus.

Secara alami susu mengandung BAL dan umumnya digunakan untuk

pembuatan kultur starter pada berbagai produk olahan. Bakteri asam laktat

asal susu juga berpotensi dikembangkan sebagai probiotik untuk

pengembangan pangan fungsional. Beberapa peneliti telah berhasil

mengidentifikasi BAL dari berbagai sumber. Menurut Guessas dan Kihal

(2004) hasil identifikasi BAL pada susu adalah Lactococcus sp. (76,16 %),

S. thermophilus (14,78 %), dan Leuconostoc sp. (8,6 %).

12

Jumlah populasi bakteri asam laktat dalam suatu produk susu fermentasi

menjadi indikator kualitas mikrobiologis produk tersebut. Menurut Fuller

(1992) bahwa jumlah bakteri asam laktat yang diperlukan untuk dikonsumsi

dan baik untuk kesehatan adalah berkisar antara107-109.

Bakteri asam laktat telah lama dikenal sebagai kelompok bakteri yang

menguntungkan. Pemanfaatannya sangat luas baik untuk pangan maupun

pakan. Pemilihan bakteri asam laktat sebagai probiotik sangat berkaitan

dengan sifatnya yang memenuhi kriteria aman untuk dikonsumsi sehingga

mampu bertahan hidup baik dari ransum dan saluran pencernan. Bakteri

asam laktat juga memiliki sifat seperti antimikroba, aktivitas antikolestrol,

efek stimulasi sistem imun, meningkatkan penyerapan laktosa oleh tubuh,

mencegah diare, dan aktivitas antimutagenik sehingga dapat mencegah

penyakit kanker usus ( Surono, 2004 dan Hill, 1995).

C. Enzim protease

Protease disebut juga peptidase atau proteinase, merupakan enzim golongan

hidrolase yang akan memecah protein menjadi molekul yang lebih sederhana,

seperti menjadi oligopeptida pendek atau asam amino, dengan reaksi

hidrolisis pada ikatan peptide. Enzim ini diperlukan oleh semua mahkluk

hidup karena bersifat esensial dalam metabolisme protein. Protein ini

memiliki banyak struktur sekunder beta-sheet dan alpha-helix yang sangat

pendek (Poliana, 2007).

13

Enzim protease dapat dihasilkan dari berbagai sumber, yaitu bakteri, jamur,

virus, tumbuhan, hewan, dan manusia. Protease yang dihasilkan dari

berbagai bakteri kebanyakan bersifat basa dan netral, sedangkan protease

yang dihasilkan oleh berbagai jamur dapat bersifat asam, netral, dan basa

(Rao et al., 1998).

Salah satu sumber penghasil enzim protease yang banyak diteliti adalah

bakteri. Pemilihan bakteri sebagai sumber enzim protease disebabkan

beberapa alasan yaitu:

a. bakteri lebih mudah tumbuh dengan kecepatan yang lebih cepat

dibandingkan makhluk hidup lainnya.

b. skala produksi enzim mudah ditingkatkan.

c. biaya produksi enzim relatif rendah.

d. kondisi produksi tidak tergantung pada musim dan waktu proses produksi

enzim lebih pendek (Poernomo, 2003).

Untuk menguji suatu biakan bakteri menghasilkan enzim protease

ekstraseluler, maka bakteri tersebut harus ditumbuhkan pada medium padat

yang mengandung kasein yaitu Skim Milk Agar (Fardiaz, 1993). Kasein

adalah salah satu jenis protein. Hidrolisis kasein digunakan untuk

memperlihatkan aktivitas hidrolitik protease yang memutuskan ikatan peptida

CO-NH. Hidrolisis protein ditunjukkan dengan adanya zona jernih di

sekeliling pertumbuhan bakteri (Susanti, 2003). Pengujian secara kualitatif

bakteri penghasil enzim protease ekstraseluler dilakukan dengan cara

mengamati zona jernih yang berada disekitar koloni bakteri, kemudian

14

membagi diameter zona jernih dengan diameter koloni bakteri. Hasil bagi

diameter tersebut dinyatakan sebagai aktifitas protease secara relatif (Sastono,

2008). Besar-kecil diameter zona menunjukkan konsentrasi dan aktivitas

enzim yang dihasilkan (Palmer, 1995).

D. Bakteri Proteolitik

Bakteri proteolitik merupakan bakteri yang mampu memproduksi enzim

protease ekstraseluler, yaitu enzim yang mampu memecah protein yang

diproduksi di dalam sel kemudian dilepaskan keluar dari sel (Abraham et al.,

1993). Pada umumnya bakteri proteolitik adalah bakteri dari genus Bacillus,

Pseudomonas, Proteus (Schlegel, 1994), Steptobacillus, Staphylococcus

(Akmal, 1996). Aktivitas proteolitik merupakan tingkat keaktifan enzim

untuk menghidrolisis protein. Aktivitas proteolitik BAL memecah protein

menjadi peptida-peptida menyebabkan penurunan kadar protein. Peningkatan

asam laktat akibat proses fermentasi oleh BAL akan meningkatkan aktivitas

lipolitik dalam mereduksi lemak susu sehingga terjadi penurunan kadar lemak

dalam susu fermentasi (Sunarlim dan Setiyanto, 2008). Jumlah asam lemak

bebas akan mengalami peningkatan karena lemak akan terhidrolisis oleh

enzim lipase yang dihasilkan oleh BAL sehingga terbentuk asam lemak

bebas (Murti dan Hidayat, 2009).

15

E. Faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim

1. Suhu

Suhu sangat mempengaruhi aktivitas suatu enzim, karena sejumlah panas

tertentu dibutuhkan enzim untuk dapat aktif. Peningkatan suhu

akan menyebabkan aktivitas enzim juga meningkat hingga titik optimum

tercapai. Aktivitas enzim akan meningkat sebanyak dua kali

lipat seiring peningkatan suhu sebsesar 10 oC di atas suhu minimum.

Aktivitas enzim akan terus meningkat hingga tercapai titik optimum.

Akan tetapi peningkatan suhu melebihi titik optimum akan

menyebabkan aktivitas enzim mengalami penurunan (Pratiwi, 2008).

Suhu maksimum akan menyebabkan enzim mengalami denaturasi.

Denaturasi terjadi karena struktur protein terbuka dan gugus nonpolar

yang berada di dalam molekul menjadi terbuka keluar. Hal ini

menyebabkan kelarutan protein di dalam air menjadi turun, sehingga

aktivitas enzim juga mengalami penurunan (Lehninger, 2005).

2. pH

Kenaikan dan penurunan pH akan mempengaruhi efektivitas enzim dalam

membentuk kompleks enzim-substrat. Peningkatan pH di atas titik

optimum akan menyebabkan enzim mengalami denaturasi sehingga

mengakibatkan menurunnya aktivitas enzim (Winarno, 1989).

16

3. Aktivator dan Inhibitor

Beberapa enzim memerlukan aktivator dalam reaksi katalisnya.

Aktivator adalah senyawa atau ion yang dapat meningkatkan

kecepatan reaksi enzimatis. Ion logam yang dapat bertindak sebagai

aktivator, diantaranya Ca, Mg, Zn, dan Fe yang menginduksi aktivitas

enzim protease ( Emmanuelle, 2013). Aktivitas enzim juga dipengaruhi

oleh senyawa penghambat enzim (inhibitor). Inhibitor dapat bersaing

dengan substrat untuk berikatan dengan sisi aktif enzim sehingga dapat

terjadi pengurangan laju reaksi. Inhibitor biasanya menyerupai substrat

normal dengan bentuk tiga dimensinya. Karena persamaan ini, enzim

dapat berikatan dengan inhibitor (Pratiwi, 2008).

17

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari 2018 sampai dengan bulan

Maret 2018 di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.

B. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini, yaitu cawan petri, tabung

reaksi, tabung Durham, erlenmeyer, gelas ukur, mikropipet, mikrotip, gelas

objek, gelas beaker, botol akuades, oven, low inkubator, inkubator, pH meter,

timbangan digital, shaker incubator, laminar air flow cabinet, autoclave, hot

plate magnetic stirer, mikroskop, water bath, vortex mixer, alumunium foil,

jarum ose, sarung tangan, dan masker.

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini, susu sapi segar, susu

kedelai, ragi tape, susu skim, MRSA (De Man Rogosa and Sharpe Agar,

MRS Broth (De Man Rogosa and Sharpe Broth), cat Gram, dan cat spora

(larutan kristal violet, larutan iodin, larutan safranin, larutan malachite green),

larutan hidrogen peroksida (H2O2), HCL 1 M, NaOH 1 M alkohol 70 %,

akuades, garam fisiologis, dan spirtus.

III. METODE PENELITIAN

18

C. Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan 2 tahap. Tahap I adalah isolasi dan karakterisasi

BAL dari kefir susu sapi dan kefir susu kedelai. Karakterisasi isolat meliputi

morfologi makroskopis dan mikroskopis, karakter biokimiawi dan fisiologis.

Karakter morfologi BAL secara makroskopis antara lain warna koloni,

elevasi, serta bentuk tepian koloni dan mikrokopis yaitu mengamati

morfologi koloni dengan pengecatan Gram dan spora. Karakter biokimia

meliputi uji fermentasi gula yaitu glukosa, laktosa, sukrosa, dan galaktosa

sedangkan karakter fisiologis yaitu penentuan pH optimum dengan variasi pH

2,3,4,5, dan 6, pengujian suhu pertumbuhan dengan variasi suhu 20, 30, 40,

50, dan 60 oC, uji motilitas dan uji katalase. Tahap II yaitu pengujian

kemampuan proteolitik bakteri asam laktat (BAL) secara kualitatif

menggunakan media MRS Agar + susu skim 1 %. Kemampuan proteolitik

pada BAL ditentukan dengan adanya zona jernih pada medium skim agar

dan aktivitas proteolitik diukur berdasarkan rasio diameter zona jernih/

diameter koloni (R).

D. Analisis Data

Data yang diperoleh dalam penelitian ini dianalisis secara deskriptif.

E. Prosedur Kerja

1. Pembuatan Kefir Susu Sapi dan Kefir Susu Kedelai

Susu segar (susu sapi dan susu kedelai) masing-masing sebanyak 50 ml

dipasteurisasi, yaitu dipanaskan pada suhu 60 oC selama 30 menit,

19

kemudian didinginkan sampai mencapai suhu kamar (±28 oC).

Selanjutnya ke dalam susu pasteurisasi dimasukkan ragi tape 1 % sebagai

starter dan diaduk merata. Kemudian dibiarkan/diinkubasi selama 24

jam (semalam) pada suhu kamar (suhu 25-37 oC) agar proses fermentasi

berlangsung. Bila susu sudah menggumpal lalu disaring dengan

menggunakan saringan plastik untuk mendapatkan butir-butir kefir

kembali. Butir-butir kefir yang diperoleh dicuci dengan air matang dingin

yang dapat dipakai sebagai starter atau biji kefir kembali. Kefir yang

sudah disaring yang akan digunakan untuk penelitian (Usmiati, 2007).

2. Isolasi BAL dari Kefir Susu Sapi dan Kefir Susu Kedelai

Isolasi dilakukan dengan mengencerkan masing-masing 1 ml sampel

kefir susu sapi dan susu kedelai ke dalam tabung reaksi steril yang berisi

9 ml larutan pengencer garam fisiologis 0,85 % kemudian dihomogenkan

menggunakan vortex mixer ( suspensi 10-1). Media MRS agar yang telah

ditambahkan susu skim 1 %, dituang ke dalam cawan petri steril dan

dibiarkan memadat. Suspensi diambil menggunakan jarum ose, kemudian

diinokulasikan secara goresan (streak ) pada media padat dan diinkubasi

pada suhu 37 oC selama 24 jam. Zona jernih yang terbentuk disekitar

koloni bakteri menandakan BAL proteolitik.

3. Pemurnian

Koloni BAL yang memiliki zona jernih dimurnikan pada media MRSA

miring. Isolat kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0C.

20

4. Karakterisasi BAL

Karakterisasi dilakukan untuk membedakan antara isolat BAL yang sudah

terpilih. Ada 4 langkah identifikasi untuk melihat karakter setiap isolat

yaitu:

4.1 Makroskopis

Merupakan pengamatan secara morfologi untuk melihat morfologi

koloni seperti warna, koloni, elevasi, dan bentuk tepian koloni.

4.2 Mikroskopis

Pengamatan mikroskopis dilakukan untuk mengamati morfologi sel

BAL dengan pengecatan Gram dan spora.

4.3 Biokimia

Media MRSB steril dalam tabung reaksi dengan tambahan 1 %

gula-gula antara lain sukrosa, glukosa, galaktosa, laktosa, dan

dilengkapi tabung Durham di dalamnya. Media uji juga dilengkapi

dengan indikator asam berupa phenol red. Isolat BAL sebanyak 1 ose

diinokulasikan ke dalam media uji, kemudian diinkubasi selama 24

jam pada suhu 37 oC. Adanya gelembung gas pada tabung Durham

dan perubahan warna media menjadi kuning menunjukkan aktivitas

fermentasi oleh BAL .

21

4.4 Karakter Fisiologis

a. Penentuan pH Optimum

Media MRS cair steril sebanyak 9 ml disiapkan pada tabung

reaksi dengan variasi pH 2, 3,4, 5, dan 6. Isolat bakteri sebanyak

1 ml diinokulasikan ke dalam masing-masing tabung reaksi,

selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam.

Perhitungan BAL dilakukan dengan spektrofotometer (Hogg,

2005), sebagai berikut:

1. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Spektrofotometer Media MRS Broth

Tahap pertama yang dilakukan adalah menentukan panjang

gelombang maksimum larutan blanko (MRS Broth) dengan

cara mengukur absorbansi larutan pada berbagai panjang

gelombang. Berdasarkan hasil pengukuran absorbansi

tersebut, maka diperoleh absorbansi maksimum yaitu pada

panjang gelombang 400 nm dan ini ditetapkan sebagai

panjang gelombang maksimum.

Tabel 3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Panjang Gelombang Absorbansi

400 0.97

450 0.91

500 0.29

550 0.63

600 0.71

22

2. Pembuatan suspensi Standar

Pembuatan suspensi standar berdasarkan standar kekeruhan

Mc. Farland. Standar Mc. Farland 0,5 yang setara dengan

1,5x108 sel/ml. Dalam pembuatan larutan standar Mc. Farland

0,5 digunakan media MRS Broth, karena untuk menyesuaikan

media yang akan digunakan dalam inkubasi bakteri dan

memudahkan dalam melihat tingkat kekeruhannya.

Selanjutnya larutan standar Mc. Farland 0,5 diukur

absorbasinya dan diperoleh angka 0,07.

Kemudian media MRS broth yang ditambah suspensi bakteri

uji, tingkat kekeruhannya disesuaikan dengan larutan standar

Mc. Farland 0,5 sedemikian rupa sehingga absorbansinya

0,07. Kesetaraan ini dilakukan untuk memenuhi standar

jumlah bakteri dalam suatu media. Tahap selanjutnya

dilakukan pengenceran suspensi standar dan diukur

absorbansinya menggunakan spektrofotometer sampai angka

menunjukan 0,00.

3. Perhitungan Jumlah Sel BAL

Berdasarkan hasil pengukuran absorbansi suspensi standar

digunakan untuk penentuan jumlah BAL melalui persamaan

regresi dengan rumus

23

Keterangan :

Y = Kepadat

Keterangan:

Y = Kepadatan sel (sel/ml)

X = Absorbansi

Dari hasil perhitungan persamaan regresi diperoleh niai a dan b

yang digunakan untuk menghitung jumlah sel suspensi BAL.

b. Penentuan Suhu Optimum

Media MRS cair steril sebanyak 9 ml disiapkan pada tabung reaksi

kemudian diinokulasikan masing-masing 1 ml biakan isolat BAL

dan diinkubasi selama 24 jam dengan variasi suhu 20, 30,40, 50,

dan 60 oC. Kemudian jumlah BAL dihitung dengan metode

spektrofotometri dan rumus regresi.

c. Uji Motilitas

Media semi padat MRS disiapakan dengan komposisi 50 % agar

pada tabung reaksi kemudian isolat bakteri diinokulasikan dengan

cara menusukkan jarum ose secara tegak lurus hingga setengah

tinggi media. Kultur diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC.

Jika koloni tumbuh menyebar, maka bakteri tersebut bersifat motil

Y = a + bX

24

dan bila pertumbuhan bakteri tidak menyebar, hanya berupa garis

saja, maka bakteri tersebut bersifat nonmotil (Candra, 2006).

d. Uji Katalase

Secara aseptis isolat bakteri diambil menggunakan jarum ose dan

dipindahkan pada gelas objek. Preparat tersebut ditetesi dengan

larutan 3 % H2O2. Jika terbentuk gelembung gas menunjukkan

adanya enzim katalase.

5. Penentuan Proteolitik BAL Kefir Susu Sapi dan Kefir Susu Kedelai

Isolat bakteri ditumbuhkan pada media MRS Agar + susu skim 1 %.

Aktivitas proteolitik ditunjukan dengan terlihatnya zona jernih yang

muncul di sekitar koloni (Putri, 2012). Indeks proteolitik dihitung

dengan cara mengukur luas areal jernih dan luas koloni bakteri. Indeks

proteolitik ditetapkan dengan rumus:

Rumus indeks proteolitik:

Keterangan:

a = diameter zona jernih

b = diameter koloni (Setyaningsih et al., 2013).

25

Gambar 1. Penentuan Indeks Proteolitik Secara Kualitatif

26

F. Diagram Alir

Berikut merupakan diagram alir penelitian:

Gambar 2. Diagram Alir Penelitian

Pembuatan Kefir Susu Sapi dan

Susu Kedelai

Isolasi BAL dari Kefir Susu Sapi dan

Susu Kedelai

Pemurnian Isolat

Karakterisasi BAL dari Kefir Susu

Sapi dan Susu Kedelai

BiokimiaFisiologisMakroskopis Mikroskopis

Uji Kualitatif Kemampuan BAL

Proteolitik

Pengamatan Zona Jernih

1

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. SIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian maka dapat disimpulkan bahwa :

1. Diperoleh 4 isolat BAL dari kefir susu sapi dan 3 isolat dari kefir susu

kedelai yang menghasilkan enzim protease.

2. Isolat dari kefir susu sapi dan susu kedelai tidak memiliki banyak

perbedaan karakter baik morfologi, biokimia maupun fisiologi.

3. Isolat BAL dari kefir susu sapi dan kefir susu kedelai tidak memiliki

perbedaan indeks proteolitik yang signifikan, keduanya menunjukan

aktivitas protease sedang dengan nilai IP pada kisaran 1 < IP < 3.

B. SARAN

Disarankan untuk dilakukan pengujian lanjutan dengan uji kuantitatif

proteolitik sehingga diperoleh kemampuan proteolitik yang lebih tepat selain

itu perlu mengidentifikasi lebih lanjut spesies bakteri dari hasil penelitian,

sehingga penelitian kedepannya dapat menentukan spesies atau bahkan strain

dari bakteri tersebut.

40

DAFTAR PUSTAKA

Abraham, A.G., G. Antoni, dan A.C. Anon. 1993. Proteolytic Activity ofLactobacillus bulgaricus Grown in Milk. Journal of Diary Science. LaPlata. Argentina. 76:1498-1505.

Adesokan, I.A., B.B. Odetoyinbo, Y.A. Ekanola, R.E. Avanrenren, danS. Fakorede. 2011. Roduction of Nigerian nono using lactic startercultures. Pakistan J. Nutrit. 10(3):203-207.

Afriani. 2010. Pengaruh penggunaan starter bakteri asam laktat Lactobacillusplantarum dan Lactobacillus fermentum terhadap total bakteri asamlaktat, kadar asam dan nilai pH dadih susu sapi. JIIP. 13(6):279-285.

Aisyah, A., E. Kusdiyantini, dan A. Suprihadi. 2014. Isolasi, Karakterisasi BakteriAsam Laktat, dan Analisis Proksimat dari Pangan Fermentasi“Tempoyak”. Jurnal Biologi. 3(2):31-39.

Akmal, A.H. dan A. Romita. 1996. Isolasi Mikroba Tanah Penghasil Antibiotikadan Sampel Tanah pada Lokasi Penumpukan Sampah. Cermin DuniaKedokteran. 108:199645.

Aman dan Harjo. 1973. Perbaikan Mutu Susu Kedelai di dalam Botol.Departemen Perindustrian Bogor. Bandung.

Astuti, S. 1995. Bahan Ajar Pengetahuan Bahan Ikan, Susu, dan Telur.Universitas Lampung. Bandar Lampung.

Axelsson, L.T. 1998. Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology. MarcelDekker Inc. New York.

Axelsson, L. 2004. Lactic acid bacteria: classification and physiology. LacticAcid Bacteria. Microbiological and Functional Aspects Third edition,Revised and Expanded. Marcel Dekker Inc. New York.

Bamfort, C.W. 2005. Food, Fermentation and Micro-organisms. BlackwellScience Ltd. Iowa. University of California.

41

Candra, J.I. 2006. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari ProdukBekasam Ikan Bandeng (Chanos chanos). Skripsi. Institut PertanianBogor.

Emmanuelle, A. 2013. Integrated Process Production and Extraction of theFibrinolytic Protease from Bacillus sp. UFPEDA 485. BiochemBiotechnol (2013). 170:1676–1688.

Ernawati. 1997. Fermentasi Susu Menggunakan Ragi Tape dan Biji Kefir Kering.Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan 1. Gramedia Pustaka Utama Jakarta.

Fardiaz, S. 1993. Analisis Mirobiologi Pangan. Raja Grafindo Persada. Jakarta.

Fuller, R. 1992. Probiotics: The Scientific Basis. Chapman and Hall. London.

Ganjar, I. 2003. Tapai from Cassava and Sereals. First International Symposiumand Workshop on Insight into the World of Indigenous Fermented Foodsfor Technology Development and Food Safety. Bangkok.

Guessas, B. dan M. Kihal. 2004. Characterization of Lactic Acid Bacteria Isolatedfrom Algerian Arid Zone Raw Goats’ Milk. African Journal ofBiotechnology. 3(6):339-342.

Hardiningsih, R., R.N.R. Napitupulu, dan T. Yulinery. 2006. Isolasi dan UjiResistensi Beberapa Isolat Lactobacillus pada pH Rendah. Biodiversitas.7(1):15-17.

Haryadi, Nurliana, dan Sugito. 2013. Nilai pH dan Jumlah Bakteri Asam LaktatKefir Susu Kambing Setelah Difermentasi Dengan Penambahan GulaDengan Lama Inkubasi Yang Berbeda. Jurnal Medika Veterinaria.7(1), ISSN : 0853-1943. Program Studi Pendidikan Dokter HewanFakultas Kedokteran Hewan Universitas Syiah Kuala. Banda Aceh

Hill, M. J. 1995. Role of Gut Bacteria in Human Toxicology and Pharmacology.Taylor and Francis. New York.

Hogg, S. 2005. Essential Microbiology. John Wiley & Sons Ltd. England.

Hutkins, R.W. 2006. Microbiology and Technology of Fermented Foods. Lowa:IFT Press. Blackwell Publishing Ltd.

42

Jay, J.M. 1992. Modern Food Microbiology. 4th Ed. Chapman and Hall. NewYork

Jay, J.M. 2000. Modern Food Microbiology. Ed ke-6. Aspen Pub. Maryland.

Karina, A.N., D.R. Hussain, E. Johannes, dan N.H. Nawir. 2016. Isolasi danKarakterisasi Bakteri Proteolitik Dari Saluran Pembuangan LimbahIndustri Tahu. Jurnal Biologi. Universitas Hasanudin. Makassar.

Kwok, J., W.M. De Vos.1994. The Proteolytic System of Lactic Acid Bacteria.In :Genetics and Biotechnology of Lactic Acid Bacteria. Ed Gasson abdDe Vos. 1994. Balckie Academic & Profesional. Glasgow.

Lehninger, A.L. 2005. Dasar-Dasar Biokimia. Erlangga. Jakarta.

Ng-Kwai-Hang. K.F. 2003. Milk proteins-heterogeneity, fractionation andisolation. In: Roginski H, Fuquay JW, Fox PF, editors, Encyclopedia ofDairy Sciences. Academic Press. London. pp. 1881-1894.

Melliawati, R., A.C. Djohan, dan Yopi. 2015. Seleksi Bakteri Asam Laktatsebagai Penghasil Enzim Protease. Pros Sem Nas Masy Biodiv Indon.1(2):184-188.

Murti, T.W. dan T. Hidayat. 2009. Pengaruh Pemakaian Kultur Tiga MacamBakteri Asam Laktat dan Pemeraman Terhadap Komposisi Kimia danFlavour Keju. Journal of the Indonesian Tropical Animal Agriculture.

Palmer, T. 1995. Understanding Enzymes 4thedition. Prentice Hall. London.

Pakpahan, R. 2009. Isolasi Bakteri dan Uji Aktivitas Bakteri Protease TermofilikDari Sumber Air Panas Sipoholon Tapanuli Utara Sumatera Utara.Thesis. Universitas Sumatera Utara.

Park, Y.W., M. Ramos, dan G.F.W. Haenlein. 2007. Physicochemicalcharacteristics of goat and sheep milk. Small Rumin Re. 68:88-113.

Poernomo, A. T. dan D.A. Purwanto. 2003. Uji Aktifitas Crude EnzimProteolitik Bacillus subtilis FNCC 0059 Hasil Fermentasi Curah. MajalahFarmasi Airlangga. 3:103–107.

Poliana, J. dan Mac C.A.P. 2007. Industrial enzymes: structure, function, andapplications. Dordrecht Springer.

43

Pratiwi, S.T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga. Yogyakarta.

Putranto, W.S. 2006. Purifikasi dan karakterisasi protease yang dihasilkanLactobacillus acidophilus dalam fermentasi susu sapi perah. SeminarNasional Bioteknologi “Capturing opportunities through biotechnology”.15-16. Pusat Penelitian Bioteknologi. Cibinong.

Putranto, W.S. 2007. Aktivitas Proteolitik Lactobacillus Acidophilus DalamFermentasi Susu Sapi. Jurnal Ilmu Ternak. 7(1):69-72. FakultasPeternakan Universitas Padjadjaran Bandung.

Putri, W.D.R., Haryadi, D.W. Marseno, dan M.N. Cahyanto. 2012. Isolasi DanKarakterisasi Bakteri Asam Laktat Amilolitik Selama Fermentasi Growol,Makanan Tradisional Indonesia. Jurnal Teknologi Pertanian.13(1):52-60.

Putri, Y.S. 2012. Skrining Dan Uji Aktivitas Enzim Protease Bakteri Dari LimbahRumah Pemotongan Hewan . Skripsi. Universitas Airlangga.

Rahayu, E.S. 2003. Lactid Acis Bacteria In Fermented Foods Of IndonesianOrigin. Agritech. 23(2):75-84.

Rahmat, R. 1997. Kacang Hijau dan Budi Daya Pasca Panen. Kanisius.Yogyakarta.

Rao, M.B., A.M. Tanksale, M.S. Ghatge, dan V.V. Deshpande. 1998. Molecularand Biotechnologi Aspect of Microbial Proteases. Microbiol. Mol. Biol.Rev. 63(3):597−635.

Said, I.M. dan E.M. Ningrum. 2009. Karakterisasi dan purifikasi protease bakteriBacillus sp. dan jamur Aspergillus sp. serta aplikasinya sebagai soakingagent pada proses penyamakan kulit kambing (Abstrak). Hibah PenelitianKerjasama (Hibah Pekerti). LP2M, UNHAS. Makasar.

Salminen, S., A.V. Wright, dan A. Ouwehand. 2004. Lactic Acid BacteriaMicrobiological and functional Aspects. Marcel Dekker. Inc. New York.

Sastono,U. dan Sutardi. 2008. Opimasi Pemecahan Emulsi Kanil Dengan CaraPendinginan Dan Pengadukan Pada Virgin Coconut Oil (VCO): (Abstrak)Prosiding Seminar . Institut Pertanian Bogor .

Schlegel, H.G. 1994. Mikrobiologi Umum. Penterjemah Tedjo Baskoro. Edisikeenam. Gajah Mada University Press. Yogyakarta.

44

Setyaningsih, I., T.Nurhayati, dan U. Aremhas. 2013. Pengaruh Media KultivasiChaetoceros gracilis Terhadap Kandungan Kimiawi dan Potensi InhibitorProtease. J.Teknol. dan Industri Pangan. 24(2) . Institut Pertanian Bogor.Bogor.

Suardana, W. 2007. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari CairanRumen Sapi Bali sebagai Kandidat Biopreservatif. Journal of Veterinery.8(4):155-159.

Sujaya, I.N., K.A. Nociantri, dan K. Asano. 2010. Diversity Of Bacterial Flora OfIndonesian Ragi Tape And Their Dynamics Duringthe TapeFermentationas Determined by PCR-DGGE. International food researchjournal. 17:239-245.

Sunarlim, R dan H. Setiyanto. 2008. Pengaruh kombinasi Lactobacillusacidophilus dengan starter yoghurt (Lactobacillus bulgaricus danStreptococcus thermophilus) terhadap mutu susu fermentasi. SeminarNasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Bogor.

Sunaryanto, R. dan B. Marwoto. 2013. Isolasi, Identifikasi, Dan KarakterisasiBakteri Asam Laktat dari Dadih Susu Kerbau. Jurnal Sains dan TeknologiIndonesia. 14(3):228-233.

Suri,W.L., Syukur, S., Jamsari. 2013. Optimization of protease activity from lacticacid bacteria (LAB) Pediococcus pentosaceus isolated from soursopfermentation (Annona muricata L.). J Kimia Unand. 2(1).

Surono, I.S. 2004. Probiotik, Susu Fermentasi dan Kesehatan. Tri Cipta Karya.Jakarta.

Susanti, E. 2003. Penentuan Aktivitas dan Jenis Protease Dari Bacillus sp.BAC4¹.Sainmat. 1:56-57.

Susilorini, T.E., M.E. Sawitri, dan Muharlien. 2009. Budidaya 22 TernakPotensial. Penebar Swadaya. Jakarta.

Susilowati, S. 2016. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat (BAL) dariFermentasi Air Cucian Beras. Skripsi. UIN Syarifhidayatullah. Jakarta.

Toruan, P. 2008. Performance nutrition. Prima Diet Cathering. Jakarta.

45

Usmiati, S. 2007. Kefir, susu fermentasi dengan rasa menyegarkan. WartaPenelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian. 29(2):12-17.

Widodo, W. 2002. Bioteknologi Fermentasi Susu. Pusat PengembanganBioteknologi Universitas Muhammadiyah Malang. Jawa Timur.

Wikandari, P.R. Suparmo, Y. Marsono,E.S Rahayu. 2012. Karakterisasi BakteriAsam Laktat Proteolitik pada Bekasam. Jurnal Natur Indonesia.14(2):120-125.

Winarno, F.G. 1989. Enzim Pangan dan Gizi. PT. Gramedia Pustaka Utama.Jakarta.

Yusmarini, R., T. Indrati., Utami, dan Y. Marsono. 2009. Isolasi dan IdentifikasiBakteri Asam Laktat Proteolitik dari Susu Kedelai yang TerfermentasiSpontan. Jurnal Natur Indonesia. 12(1):28-33.