ISOLASI BAHAN ALAM LAUT

Organisme laut memberikan sejumlah senyawa kimia beragam yang telah evolusioner

Terpilih untuk memodulasi jalur biokimia. Banyak kelompok-kelompok industri dan akademis

mengakses sumber ini menggunakan platform teknologi canggih. Tujuan dari bab ini adalah

untuk memberikan beberapa petunjuk praktis dalam proses ekstraksi dan isolasi bahan alam

laut. Perhatian khusus diberikan kepada prosedur isolasi yang disesuaikan dengan karakteristik

fisika dan kimia dari senyawa-senyawa yang terisolasi. Kemajuan terbaru dalam teknologi

isolasi, termasuk otomatisasi dan integrasi langsung menjelaskan pemikiran yang tinggi tentang

sistem skrining.

Kata kunci : Produk alami laut; Koleksi invertebrata laut; ekstraksi; fraksinasi;

pemurnian; isolasi; Kromatografi; fraksinasi otomatis; HPLC-SPE coupling.

I. Pendahuluan

Organisme laut telah berevolusi mendiami suatu daerah baru berbagai relung

ekologi. Untuk mengatasi berbagai habitat, mereka telah mengembangkan beragam jalur

metabolit sekunder yang menghasilkan sejumlah besar gugus kimia untuk

mengakomodasi gaya hidup mereka. Senyawa ini mencakup berbagai macam kelas

kimia, termasuk terpen, shikimat, polyketida, asetoginins, peptida, alkaloid, dan banyak

struktur tidak teridentifikasi dan tidak terkarakterisasi. Dalam sepuluh tahun terakhir

saja, lebih dari 5000 struktur produk alami laut telah diterbitkan . Banyak dari senyawa

ini telah membuktikan potensi mereka dalam beberapa bidang, terutama sebagai agen

terapeutik yang potensial untuk berbagai penyakit. Sepuluh tahun yang lalu, hampir

semua pemurnian produk alami merupakan suatu usaha yang sangat besar. Sebagai akibat

dari kemajuan teknologi, proses ini telah hampir menjadi rutin. Selain itu, kecenderungan

pemisahan yang lebih cepat dan otomatis telah menghasilkan minat secara meluas,

terutama dalam bidang industri farmasi.

Beberapa ulasan (11 – 14) telah membahas teknik-teknik yang terlibat dalam

isolasi bahan alam laut. Bab ini disusun untuk menyoroti tantangan yang ditemui dalam

proses isolasi, dan teknologi yang paling terbaru serta strategi yang diaplikasikan baik

pada timbangan laboratorium dan industrial. Namun, rincian lebih lanjut tentang teori

dasar kromatografi dan aplikasi yang dapat ditemukan di Bab 4-9. Bagian terakhir dalam

bab ini ditujukan untuk mendiskusikan mengenai fraksinasi otomatis dan integrasi

langsung ke dalam sistem penyaringan (HTS) tinggi-throughput. Catatan dengan

informasi yang lebih spesifik tentang topik-topik tertentu disediakan untuk bantuan lebih

lanjut apabila pembaca tertarik.

I.1. Tantangan dalam isolasi produk alami laut

Beberapa faktor yang dapat menyulitkan isolasi bahan alam laut telah

didiskusikan secara rinci dalam review isolasi bahan alam laut oleh Amy Wright

(14). Kami menekankan kembali beberapa faktor selain orang lain yang mungkin

menambah tantangan tambahan untuk proses pemisahan.

I.1.1. Ketidakpastian taksonomi informasi dapat memfasilitasi pencarian Literature

Dilaporkan hasil oleh spesies di bawah penyelidikan dan tentu saja metode

pemurnian senyawa. Hal ini memiliki beberapa dampak pada pemilihan skema

pemurnian terbaik bagi metabolit baru. Identifikasi taksonomi kelautan organisme

menantang, dan tugas-tugas taksonomi yang benar atau tidak lengkap dapat

menyebabkan kesulitan jika asumsi yang dibuat hampir mungkin mengandung

suatu organisme kimia. Penggunaan kemotaksonomi untuk memprediksi jenis

senyawa pada organisme mungkin tidak selalu sukses. 

I.1.2. Kuantitas kecil Metabolit

Kehadiran metabolit dapat mempersulit proses ekstraksi dan isolasi.

Menurut Houssen dan Jaspars, sebagian besar dari 354 organisme diperlukan

untuk isolasi metabolit aktif pada tingkat yang dapat memudahkan penjelasan

struktur berikutnya (lihat Bab. 17).

Salah satu contoh adalah hanya 10,7 mg isolasi macrolide spongistatin 4

sangat ampuh sebagai antitumor (Gbr. 1) dari sekitar 2,5 ton spons laut

Spirastrella spinispirulifera dari Afrika Selatan. Uji untuk mengurangi biomassa

spons. Satu titik dalam usaha ini, perlu digunakan kolom kromatografi cair kinerja

tinggi (HPLC) yang panjangnya hampir 3 m dan berdiameter 15 cm. Contoh lain

adalah isolasi 1 mg peptida dolastatin 10 sangat penting sebagai antitumor (Gbr.

2). Hampir 2 ton kelinci laut Dolabella auricularia dikumpulkan dari Pulau

Mauritius di Samudra Hindia. Langkah koleksi yang diperlukan lebih dari 10

tahun. Cara termudah untuk isolasi terlibat sekitar 20.000 pecahan dan 23 terpisah

langkah kromatografi menggunakan berbagai teknik. Selanjutnya, itu menjadi

jelas bahwa peptida dolastatin 10 mungkin diproduksi oleh cyanobacterium yang

tumbuh di Dolabella auricularia.

I.1.3. Ketidakstabilan metabolit

Ekstrak laut mungkin mengandung senyawa yang sangat labil.

Dekomposisi dari senyawa ini dapat terjadi pada setiap langkah selama proses

pemurnian. Panas, cahaya, udara, dan pH adalah faktor-faktor lain yang dapat

menyebabkan degradasi senyawa. Bahan yang digunakan untuk pemisahan juga

dapat mengaktifkan beberapa reaksi. Alumina dapat mengkatalisasi kondensasi

aldol, penataan ulang, reaksi hidrasi dan dehidrasi, sementara silika dapat

meningkatkan oksidasi, penataan ulang N dan O demethylation. Beberapa lainnya

seperti aseton, metanol (MeOH), etilena glikol, dan dimethylformamide (DMF)

dapat menimbulkan hasil adisi. Sifat asam beberapa pelarut NMR (misalnya,

CDCl3) dapat menyebabkan degradasi yang sangat sensitif terhadap pH senyawa.

I.1.4. Pemurnian senyawa yang larut air : pengaruh air tinggi dan kandungan garam

Ada banyak kesulitan yang terkait dengan isolasi dan pemurnian senyawa-

senyawa yang larut dalam air . Karena senyawa target sangat polar, media air atau

pelarut sangat polar seperti MeOH harus digunakan untuk ekstraksi. Dalam kasus

larutan, masalah yang pasti terjadi adalah pertumbuhan bakteri dan jamur, yang

sering mendegradasi komponen aktif atau memberikan hasil palsu dalam uji

hayati karena endotoksin yang dihasilkan oleh mikroorganisme. Konsentrasi

larutan ekstrak juga merupakan masalah karena suhu tinggi pada saat penguapan

air. Selain itu, ekstrak cair sering mengandung agen surface-active. Surfaktan ini

dapat menyebabkan berbusa dan membentur selama proses konsentrasi.

Kelimpahan garam yang dibawa dari air laut ke ekstrak cair membuat proses

isolasi lebih sulit. Dalam kebanyakan kasus, ekstraksi dan fraksinasi senyawa-

senyawa yang larut dalam air memerlukan penggunaan penyangga. Struktur

dolastatin 10, menurut Houssen dan Jaspars. Namun, pemisahan penyangga

garam dari senyawa bukanlah tugas yang mudah.

I.1.5. Senyawa yang kekurangan gugus kromofor

Deteksi Ultraviolet (UV) adalah teknik deteksi untuk analisis HPLC

produk alami karena kemudahan penggunaan dan sensitivitasnya yang tinggi.

Namun, satu kekurangan detektor UV adalah ketidakmampuan untuk mendeteksi

senyawa yang kurang gugus kromofor. Selain itu, beberapa pelarut yang

digunakan dalam kromatografi fase normal itu sendiri kuat dari cahaya UV, yang

berarti bahwa pengaturan panjang gelombang detektor tidak mungkin rendah

(Lihat tabel 5 untuk nilai-nilai cutoff UV pelarut yang berbeda).

Detektor indeks bias (RI), sampai saat ini, hanya tersedia alternatif untuk

deteksi UV. Namun, detektor RI jauh lebih sensitif dan terbatas elusi isokratik.

Elusi gradient melibatkan pencampuran pelarut RI yang berbeda, sehingga

menimbulkan garis besar yang melintas. Kelemahan ini membuat deteksi sangat

sulit pada konsentrasi rendah dari metabolit non kromofor.

I.1.6. Biaya dan waktu efektifitas

Sampai saat ini, pemurnian produk alami laut memakan waktu, dan biaya

yang mahal. Perkembangan terakhir di HTS telah menciptakan hambatan baru

untuk penemuan obat dari alam. Sebuah asupan dengan sejumlah besar struktural

menarik sampel dengan konsentrasi cukup adalah suatu keharusan untuk

mengoperasikan sistem HTS secara optimal. Integrasi pustaka produk alami laut

ke sistem HTS tidak begitu lama dan sama sekali tidak layak.

II. Kromatografi

Bagian ini memberikan gambaran singkat mengenai teknik kromatografi berbeda

yang umumnya diterapkan dalam isolasi bahan alam laut. Gambaran singkat tentang

sifat-sifat pelarut yang paling umum digunakan dan fase stationer juga disertakan.

Pemisahan tergantung pada afinitas komponen terhadap fase diam dan fase gerak.

Menurut sifat fase gerak, kromatografi dapat diklasifikasikan menjadi

kromatografi gas (GC), kromatografi cair (LC) dan cairan kromatografi superkritis

(SFC). GC dan SFC adalah teknik analisis yang digunakan secara luas tetapi tidak dapat

digunakan untuk persediaan isolasi bahan alam, dan tidak dibahas dalam bab ini. Namun

LC, secara luas digunakan dan terdiri dalam berbagai bentuk.

a. Klasifikasi LC

LC dapat diklasifikasikan dalam beberapa cara (21):

1. Klasifikasi menurut modus operasi.

Kromatografi dapat dilakukan dalam empat bentuk utama: countercurrent

kromatografi (CCC), kromatografi lapis tipis (TLC), ekstraksi fase solid (SPE)

dan Kromatografi kolom (Lihat 2.3 subpos., untuk rincian).

2. Berdasarkan metode pemisahan (Gbr. 3) ada lima mekanisme pemisahan yang

dapat terjadi dan mungkin lebih dari satu bertanggung jawab selama pemisahan

tertentu. Mode pemisahan ini yang akan dibahas.

II.1.1. Adsorpsi

Kromatografi adsorpsi berdasarkan kemampuan molekul zat terlarut

secara fisik berinteraksi dengan fase diam (lihat juga Bab. 5). Suatu sifat interaksi

dapatdilihat dari ikatan hidrogen, van der Waals, atau dipol-dipol. Semakin kuat

interaksi, semakin lama zat terlarut akan dipertahankan pada fase diam.

Pilihan fase diam yang tidak tepat dapat menyebabkan adsorpsi ireversibel

zat terlarut ke kemasan material, atau setidaknya pemulihan yang sangat buruk.

Selain itu, molekul fase gerak bersaing dengan molekul zat terlarut untuk situs

adsorpsi. Semakin fase gerak berinteraksi dengan adsorben, semakin cepat zat

terlarut akan dielusi. Karena zat terlarut harus berinteraksi dengan fase stasioner

yang akan terserap, semakin besar luas permukaan yang ditawarkan oleh fase

stasioner, semakin besar jumlah kemungkinan terjadinya interaksi. Dengan

demikian, adsorben yang menawarkan rasio tinggi luas permukaan untuk kemasan

Volume menimbulkan pemisahan yang lebih baik. Luas permukaan adalah fungsi

dari ukuran partikel, ukuran pori, dan tingkat porositas. Semakin kecil ukuran

partikel adsorben, semakin tinggi luas permukaan yang akan tersedia. Partikel

yang ukurannya sangat kecil umumnya hanya disediakan untuk HPLC, karena

mereka menimbulkan substansial tekanan balik ketika dilewatkan melalui fase

gerak.

Porositas partikel mencerminkan rasio volume pori-pori permukaan untuk

total volume partikel. Senyawa lebih besar dari ukuran pori tidak akan mengikat

efisien karena mereka tidak akan dapat menembus pori-pori. Untungnya, ukuran

pori dapat sangat bervariasi dari kira-kira 50nm untuk ukuran makroskopis.

Tabel 1 berisi informasi terperinci mengenai absorben yang paling umum

digunakan.

II.1.2. Partisi

Kromatografi partisi didasarkan pada kemampuan zat terlarut untuk

mendistribusikan antara dua fase cair. Paling umum, fase diam yang cair secara

kimia terikat pada pendukung inert, misalnya, gel silika berpori untuk

memberikan “fase berikat”. Hal ini melibatkan pembentukan obligasi hidrolitikal

yang stabil, antara kelompok silanol permukaan dukungan silika dan chlorosilane.

Silan biasanya membawa sebuah gugus fungsional organik dan ini berada di

Akibatnya, fase diam cair (21).

Besar ligan organo-silan tidak bisa bereaksi dengan semua kelompok

silanol yang tersedia karena halangan sterik. Kelompok silanol yang tidak

bereaksi dapat mengganggu proses pemisahan dan menghasilkan efek yang tidak

diinginkan seperti reaksi, adsorpsi, tailling, dan sebagainya. Untuk meminimalkan

interaksi sekunder, fase terikat biasanya mengalami reaksi “endcapping” dimana

sisa silanols yang termetilasi, biasanya dengan kelompok trimetilsilil (TMS). Oleh

karena itu, ukuran pori dari gel silika dan jumlah fasa cair atau kelompok

fungsional terikat pada silika dan tingkat endcapping antar faktor yang harus

dipertimbangkan dalam pemilihan tahap berikatan yang tepat. Beberapa dari sifat-

sifat umum digunakan fase terikat dirangkum dalam

Tabel 1

Fase stasioner yang umumnya digunakan di Kromatografi Adsorpsi

Adsorban Catatan

Silica Fase normal (fase diam lebih polar daripada

fase gerak).

Senyawa polar dipertahankan sementara yang

nonpolar tidak.

Pelarut polar memiliki kekuatan elusi yang

lebih baik.

Tidak bisa digunakan dengan pelarut air

dengan air menonaktifkan permukaan.

Larut pada nilai pH lebih tinggi dari 7,0.

Beberapa reaktif terhadap produk alami yang

tidak stabil di atasnya.

Alumina Fase normal.

Bentuk asam, basa, dan netral yang tersedia

digunakan dalam pemisahan asam, basa, dan

senyawa yang relatif nonpolar, masing-masing.

Cukup reaktif.

Styrene–divinylbenzene polymer

Fase terbalik (fase diam kurang polar

dibandingkan fase gerak).

Stabil pada pH rendah dan tinggi.

Kurang reaktif (masalah karena terkena silanol

kelompok dihindari).

Memiliki kapasitas yang lebih tinggi untuk

senyawa polar daripada C18 karena persentase

karbon yang lebih tinggi.

Memberikan resolusi lebih rendah dari C18

karena ukuran manik yang lebih besar.

Idealnya digunakan untuk desalting dan

adsorpsi-elusi produk alami dari ekstrak air.

Lebih ekonomis daripada C18.

Brominasi membuat polimer lebih kuat.

Fase stasioner Umumnya Digunakan di

Adsorpsi Kromatografi

Fase Berikat Umum Digunakan di Isolasi

Bahan Alam Laut

Fase terbalik (pelarut umum adalah air, MeOH,

asetonitril, dan THF).

Yang paling kuat untuk senyawa nonpolar

(hidrofobik).

Senyawa yang dielusi dalam rangka

peningkatan hidrofobik (air adalah eluen

terlemah).

Beberapa produsen menawarkan ODS yang

dapat mentolerir up untuk pH 10.0

Namun, cairan juga dapat bertindak sebagai fase diam bahkan ketika itu tidak

terikat dukungan, seperti dalam kasus CCC (lihat Bab. 7).

II.1.2.1. REAGENTS ION-PAIRING DAN PENGARUH PH

Senyawa ion yang sangat mudah larut dalam air juga dapat dipisahkan

dengan menggunakan fasa diam yang nonpolar, misalnya, oktadesil silika. Hal ini

dapat dicapai dengan mengubah pH fase gerak untuk menekan ionisasi senyawa

sehingga mereka dapat dipertahankan sebagai spesies netral pada permukaan

hidrofobik dari fase diam. Cara alternatif adalah dengan menambahkan reagen

pasangan-ion sesuai dengan fase gerak. Reagen pasangan-ion adalah senyawa

biasanya ionik yang mengandung rantai hidrokarbon hidrofobik. Mereka dapat

bertindak baik dengan berinteraksi dengan sampel, membentuk sepasang ion

netral reversibel yang dapat dipertahankan pada fase stasioner, atau berinteraksi

dengan fase diam melalui bagian hidrofobik, membentuk fase diam dengan

kelompok-kelompok yang dibebankan pada senyawa ion yang dapat mengikat

secara reversibel (21). Asam trifluoroasetat (TFA), pentafluoropropionic acid

(PFPA), dan asam Heptafluorobutyric (HBA) adalah contoh dari reagen anion

pasangan-ion sementara trietilamina (TEA) adalah salah satu contoh dari kationik.

Keuntungan tambahan dari TFA dan TEA termasuk volatilitas tinggi

(memungkinkan untuk penghapusan cepat) dan kompatibilitas dengan analisis

spektrometri massa (22) (lihat Catatan 2).

Tabel 2

Fase Berikat Umum Digunakan di Isolasi Bahan Alam Laut

Fase stasioner Catatan

C18 (Octadecyl)a Fase terbalik (pelarut umum adalah air,

MeOH, asetonitril, dan THF).

Yang paling kuat untuk senyawa nonpolar

(hidrofobik).

Senyawa yang dielusi dalam rangka

peningkatan hidrofobik (air adalah eluen

terlemah).

Beberapa produsen menawarkan ODS yang

dapat mentolerir up untuk pH 10.0

C8 (Octyl)a Fase terbalik.

Selektivitas Mirip dengan C18 tapi kurang

kuat.

Ph (Phenyl-hexyl) Fase terbalik.

Senyawa aromatik dipertahankan lagi.

CN Cyanopropyl Bisa digunakan dalam mode normal dan

fase terbalik.

Sedikit polar.

Selektivitas yang unik untuk polar

senyawa.

II.1.3. Pertukaran ion

Kromatografi penukar ion (IEC) berlaku untuk pemisahan spesies atau

komponen ion yang terionisasi pada pH tertentu (lihat Bab. 6). Hal ini umumnya

digunakan dalam pemurnian peptida karena hampir semua makromolekul

membawa muatan permukaan yang memungkinkan untuk adsorpsi mereka ke

dukungan yang solid. Keuntungan dari teknik ini adalah kenyataan biologi

Kegiatan hampir selalu dipertahankan karena komposisi fase gerak biasanya

berair (22). Di sisi lain, penggunaan teknik ini sering memperkenalkan sejumlah

besar garam penyangga anorganik dan dengan demikian memerlukan langkah

desalting berikutnya. Fase diam terdiri dari partikel tidak larut dalam air bantalan

kovalen terikat muatan positif atau negatif kelompok fungsional. ion lawan bebas

dari muatan yang berlawanan terkait dengan kelompok-kelompok fungsional ini.

Spesies ion dalam sampel dapat bertukar dengan ion lawan ini dan mengikat ke

fase stasioner. Pemisahan dicapai karena perbedaan dalam afinitas komponen

ionik terhadap fase diam. untuk lebih rinci tentang mekanisme proses pertukaran

ion, pembaca harus berkonsultasi dengan ulasan yang sangat otoritatif yang ditulis

oleh Claude Dufresne.

II.1.3.1. Dukungan matriks

Dukungan matriks yang membentuk partikel fase stasioner resin

polystyrene, polimer karbohidrat, atau gel silika. Sifat dukungan matriks memiliki

dampak pada karakteristik aliran kolom ini, porositas dari stasioner fase partikel,

dan ketahanan terhadap tekanan mekanik. Namun, batas pengecualian (ukuran

pori) yang diberikan oleh produsen perlu dicatat, karena molekul lebih besar dari

batas-batas ini akan tidak mengikat efisien untuk fase diam karena pori mereka

yang terbatas aksesibilitas. Tabel 3 meringkas sifat fisikokimia dari yang paling

umum matriks dukungan IEC.

II.1.3.2. Kelompok fungsional

Kelompok fungsional yang melekat pada dukungan matriks bisa positif

atau bermuatan negatif untuk memberikan anion- atau kation-tukar kromatografi,

masing-masing. Jumlah kelompok fungsional ini persatuan volume dari matriks

menentukan kapasitas kolom. PKa nilai fungsional kelompok menentukan

kekuatan exchanger. Dalam kromatografi pertukaran anion, ionisasi penuh terjadi

pada nilai pH 2,0 unit di bawah pKa sementara netralisasi penuh terjadi pada nilai

pH 2,0 unit di atas pKa.

Tabel 3

Matriks dukungan di IEC

Matriks Catatan

Styrene-divinil benzena polimer Permukaan hidrofobik.

Kaku, menawarkan kekuatan mekanik yang

sangat baik.

Dapat mentolerir kisaran pH 1,0-14,0.

Dapat berinteraksi dengan (teradsorpsi) zat

terlarut yang mengarah ke

pemulihan yang buruk. Ini disebut

'' Interaksi backbone ''.

polimer karbohidrat Contohnya adalah silang dekstran dan

agarosa silang.

Membengkak mudah dalam air

menghasilkan gel yang

memiliki sifat aliran yang sangat baik.

Tidak menunjukkan interaksi backbone.

Hidrofilik, tidak menyebabkan denaturasi

protein.

silika gel Tidak membengkak dalam air.

Menawarkan ukuran-cocok partikel yang

sangat kecil untuk HPLC.

Tidak stabil pada pH di atas 7,5.

Sebaliknya adalah benar untuk kromatografi kation-tukar. Nilai pKa untuk

berbagai kelompok fungsional digunakan dalam IEC ditunjukkan pada Tabel 4.

Hal ini dapat terlihat bahwa penukar kuat dibebankan selama rentang pH penuh,

sementara penukar yang lemah hanya dikenakan biaya pada rentang pH yang

terbatas. Nilai PKaanalit harus dipertimbangkan juga. Asam organik yang negatif

dibebankan pada saat pH larutan berada di atas asam ini pKa, dan amina

bermuatan positif pada pH di bawah nilai dasar pKa ini. Namun, pH fase gerak

harus memfasilitasi ionisasi kedua sorben kelompok fungsional dan analit. Perlu

dicatat bahwa penukar ion lemah harus digunakan untuk menangkap spesies ion

yang kuat (misalnya, asam sulfonat dan amina kuaterner).

Tabel 4

Kelompok Fungsional dalam IEC

Kelompok fungsi Catatan

Asam sulfonat (-SO3H)

Asam karboksilat (-CO2H)

Amina Kuarter (-NR3þ)

Amina tersier (-NR2)

Kuat kationik-pKa <1

Lemah kationik-pKa FFI 4-5

Kuat anionik-pKa> 13

Lemah anionik-pKa FFI 8

Hal ini karena pemulihan analit tersebut sering rendah pada ion kuat

exchanger karena ketidakmampuan untuk menetralkan amina kuaterner atau

gugus asam sulfonat baik pada sorben atau analit. Di sisi lain tangan, analit yang

mengandung amina lemah atau gugus asam karboksilat dapat diekstraksi dengan

baik penukar ion lemah atau kuat, seperti pengaturan pH dapat digunakan untuk

menetralkan muatan pada analit untuk membawa elusi (24). Namun, penukar ion

lemah umumnya lebih disukai di alam kerja produk, elusi dapat dicapai melalui

ringan, tak rusak kondisi.

II.1.3.3.Ion lawan dan kekuatan ion

Ion lawan dalam matriks dan fase gerak menyaingi sampel ion untuk situs

mengikat dikenakan di permukaan sorben. Oleh karena itu, kehadiran ion lawan

yang memiliki afinitas yang lebih besar untuk sorben dari analit atau adanya

konsentrasi tinggi (kekuatan ionik) dari hampir ion lawan pun bisa menghalangi

pengikatan analit ke fase stasioner (24). Anion dapat peringkat menurut afinitas

mereka untuk pertukaran anion matriks sebagai berikut :

hidroksida <fluoride <asetat <bikarbonat; format <klorida <Fosfat; garam sitrat

Dengan cara yang sama, kation dapat peringkat dalam hal afinitas mereka

untuk penukar kation sebagai berikut :

lithium <hidrogen <natrium <amonium <kalium <magnesium <kalsium

Sebagai aturan umum, retensi analit difasilitasi oleh sampel yang terdapat

dalam buffer kekuatan ion rendah yang terdiri dari afinitas rendah atau ion lawan

displacer lemah pada pH yang tepat. Elusi dipromosikan oleh garam kekuatan ion

tinggi dan buffer yang mengandung ion lawan displacer kuat dan / atau dengan

mengubah pH untuk sepenuhnya menetralisir kelompok dibebankan di kedua

sorben atau analit.

II.1.3.4. Pertukaran ion

Dalam kebanyakan penukar ion, kelompok fungsional tetap langsung pada

permukaan matriks. Hanya sejumlah kelompok ionik dapat melekat karena

permukaan dari bagian matriks terbatas. Dengan tentakel 364 Houssen dan

Jaspars ion exchanger, namun, kelompok penukar kovalen berlabuh ke matriks

melalui rantai polimer linier. Oleh karena itu, kapasitas tukar dapat meningkat

secara signifikan. Keuntungan lain adalah bahwa penukar ion tentakel tidak

menunjukkan interaksi backbone sebagai matriks stasioner tahap tersembunyi.

Oleh karena itu, penukar ion tentakel jauh lebih cocok untuk pemisahan molekul

protein besar dimana risiko denaturasi dan hilangnya aktivitas biologis yang

signifikan.

II.1.4. Ukuran Pengecualian

Kromatografi ukuran eksklusi (SEC), juga dikenal sebagai filtrasi gel atau

gel permeasi kromatografi, memisahkan molekul-molekul berdasarkan ukuran

molekul mereka (lihat Bab. 5). Fase diam terdiri dari partikel berpori dimana

ukuran pori secara ketat dikontrol. Fase gerak mengalir di atas dan melalui

partikel-partikel ini, ia membawa bersama dengan zat terlarutnya, tergantung pada

ukuran dan bentuk mereka, dapat mengalir ke dalam dan keluar dari pori-pori.

Molekul lebih besar dari ukuran pori tidak bisa masuk ke pori-pori dan elusi

bersama-sama sebagai puncak pertama dalam kromatogram, fenomena yang

disebut “Pengecualian total”. Molekul yang lebih kecil yang bisa masuk ke pori-

pori akan memiliki waktu tinggal rata-rata dalam partikel yang tergantung pada

ukuran dan bentuk molekul. Molekul yang berbeda, karena itu, memiliki jumlah

angkutan yang berbeda kali melalui kolom. Bagian dari kromatogram disebut

wilayah permeasi selektif. Molekul-molekul terkecil dapat menembus pori-pori

terkecil sehingga memiliki waktu tinggal terpanjang pada kolom dan mengelusi

bersama sebagai puncak terakhir dalam kromatogram. Puncak terakhir ini

menentukan batas permeasi keseluruhan. SEC adalah teknik yang banyak

digunakan untuk pemisahan peptida dan protein karena kondisi elusi keras tidak

diperlukan. Selain itu dapat digunakan dengan sukses untuk desalting. Yang

paling umum digunakan sorbents ukuran-pengecualian adalah gel polydextran,

mis, Sephadex® diproduksi oleh Pharmacia. Gel ini tersedia secara komersial

dalam bentuk manik-manik, yang harus tenggelam dalam fase gerak untuk

beberapa jam sebelum digunakan untuk memungkinkan pengembangan

berlangsung. Sephadex diproduksi oleh ikatan silang dari dekstran dengan

epiklorohidrin dan tersedia dalam berbagai kelas dengan ukuran pori yang

berbeda (lihat Bab. 5). Sephadex G gel hidrofilik dan penggunaannya terbatas

pada solusi berair. Dengan demikian, mereka ideal untuk fraksionasi campuran

yang larut dalam air. Meskipun modus utama mereka pemisahan adalah filtrasi

gel, adsorpsi tambahan mekanisme mungkin ada, sehingga menimbulkan resolusi

yang baik. Sephadex LH-20 adalah hydroxypropylated G-25. Pengenalan

kelompok hidroksipropil tidak mengubah jumlah gugus hidroksil tapi

meningkatkan rasio karbon untuk hidroksil. Resultan gel yang dimiliki, oleh

karena itu, baik hidrofilik dan lipofilik properti. Lipofilisitas tambahannya

memungkinkan gel ini untuk digunakan dengan pelarut berair. Sephadex LH-20

umumnya digunakan untuk fraksinasi produk alami organik larut. Ketika pelarut

tunggal digunakan, pemisahan terutama terjadi dengan filtrasi gel modus. Ketika

campuran pelarut yang digunakan, gel akan mengambil sebagian besar komponen

polar dari campuran pelarut. Hal ini menghasilkan dua sistem fase yaitu fase diam

dan gerak dengan komposisi yang berbeda. Pemisahan kemudian terjadi

berdasarkan partisi dan ukuran eksklusi. Fraksinasi terbaik biasanya diperoleh

ketika campuran pelarut polar dan nonpolar yang digunakan. Selain itu, harus

dipertimbangkan bahwa fenolik, heteroatomic, dan siklik Senyawa istimewa gel

Sephadex tertahan terutama ketika alkohol rendah digunakan sebagai pelarut

elusi. Senyawa ini biasanya tinggal lagi pada gel dari yang diharapkan

berdasarkan ukuran mereka. Sephadex gel cukup inert, sehingga pemulihan

sampel biasanya sangat baik. Mereka stabil di semua pelarut, yang tidak asam

kuat (misalnya, di bawah pH 2.0), dan tidak mengandung zat pengoksidasi kuat.

Di sisi lain, gel ini rentan terhadap serangan jamur dan bakteri. kelemahan lainnya

termasuk waktu elusi yang lama dan resolusi relatif rendah. Operasional itu

diperpanjang terutama karena kebutuhan untuk panjang kolom sempit dan laju

aliran lambat untuk efek resolusi yang memadai. Sorbents lain untuk eksklusi

ukuran telah dikembangkan menggunakan jenis matriks yang berbeda, misalnya,

stirena-divinil benzena polimer dan gel silika. Kedua matriks menawarkan

kekuatan mekanik yang baik dan dapat digunakan dalam HPLC modus. Silica gel

yang digunakan di SEC benar-benar endcapped untuk meminimalkan interaksi

spesifik. Hal ini stabil pada pH berkisar 2,0-7,5. Bagaimanapun Styrene-divinil

benzena polimer, menawarkan rentang pH yang lebih luas yang stabil tetapi

menunjukkan efisiensi yang lebih rendah daripada silika. SEC memiliki kapasitas

muat yang rendah dalam hal massa sampel dan volume sampel. Sampel harus

terkonsentrasi tetapi tidak melampaui titik curah hujan untuk kinerja optimal.

II.1.5. Afinitas biologi

Kromatografi afinitas jauh lebih spesifik daripada teknik pemurnian

lainnya. Hal ini tergantung pada persiapan bunga matriks yang kompleks, dan

sebaiknya hanya senyawa ini, akan mengikat secara reversible. Matriks itu

biasanya berupa manik-manik agarosa (Sepharose atau BioGel A), poliakrilamida

(misalnya, BioGel P), dekstran silang (misalnya, Sephacryl), atau silica gel yang

ligan biospecific (antibodi, enzim, atau protein reseptor) telah kovalen. Ligan

amobil berinteraksi hanya dengan molekul yang selektif dapat mengikat. Senyawa

lain dalam sampel, tidak mampu mengikat biospecific, yang larut. Senyawa

ditahan bisa pulih dengan mengubah pH dan / atau komposisi penyangga untuk

mengganggu interaksi ligan-solut. Sebuah teknik elusi alternatif melibatkan

penambahan agen kompetitif yang dapat bersaing dengan zat terlarut yang

menarik situs pengikatan spesifik pada kolom. beberapa ligan mungkin memiliki

afinitas kepada sekelompok zat terkait daripada tunggal dan dapat digunakan

untuk memurnikan beberapa zat. Terlepas dari selektivitas yang tinggi,

kromatografi afinitas tidak sering diterapkan pada isolasi hasil alam laut. Hal ini

terutama karena teknik ini sangat mahal. Banyak kesulitan yang dihadapi dalam

pemilihan ligan yang sesuai dan persiapan fase diam. Ligan harus menunjukkan

afinitas pengikatan yang spesifik dan reversibel untuk substansi yang akan

dimurnikan. Hal ini juga harus memiliki modifikasi kelompok kimia yang

memungkinkan untuk melekat pada matriks tanpa merusak mengikat aktivitas.

Selain itu, hubungan kovalen digunakan untuk melumpuhkan ligan harus stabil di

segala kondisi yang digunakan selama kromatografi.

II.2.Fasa gerak di LC

Dalam adsorpsi dan sistem kromatografi partisi, aturan lama ''memiliki

afinitas seperti'' memegang makna khusus dalam hal sistem pelarut yang dapat

berhasil digunakan untuk sampel elusi. Sebuah pelarut polar dibutuhkan untuk

mengelusi analit polar dari kolom fase normal yang polar, sedangkan pelarut

organik hidrofobik diperlukan untuk elusi analit hidrofobik dari kolom fase

terbalik hidrofobik. Sifat-sifat pelarut lainnya seperti volatilitas, viskositas, mudah

terbakar, toksisitas, reaktivitas, kompatibilitas dengan metode deteksi, dan biaya

harus dipertimbangkan. Tabel 5 berisi informasi rinci tentang sifat-sifat pelarut

organik yang paling umum. Penambahan berbagai pengubah fase gerak seperti

asam (atau kurang umumnya, basa), reagen pasangan-ion, atau garam penyangga

anorganik bisa berharga dan menimbulkan resolusi yang lebih baik. Garam Buffer

biasanya ditambahkan ke fase gerak kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik

(RP-HPLC). Bagaimanapun, pilihan garam penyangga dikendalikan oleh banyak

faktor. Ini harus transparan pada panjang gelombang deteksi dan bebas dari

kontaminan organik. Selain itu, harus menunjukkan larut sempurna ketika

komponen organik dan fase gerak berair dicampur.

Tabel 5

Sifat umum Pelarut Digunakan Pemurnian Bahan Alam

Umumnya, garam penyangga digunakan pada konsentrasi 10-100mM

(20). Namun, penggunaan garam-garam ini memerlukan langkah desalting

berikutnya. Di IEC, fase gerak terutama larutan buffer. Faktor-faktor kritis adalah

pH dan kekuatan ion dari fase gerak. Tradisional buffer anorganik seperti fosfat,

asetat, dan format biasanya digunakan dalam pemisahan pertukaran ion. Beberapa

penulis lebih suka menggunakan buffer volatile untuk menghilangkan langkah

desalting berikutnya. Contoh buffer volatile yaitu amonium bikarbonat dan

amonium asetat. Buffer volatile terutama mengandung piridin, yang sangat

beracun. Namun, penguapan buffer ini bukanlah tugas yang mudah, dan selama

proses penguapan larutan penyangga, perubahan drastis dalam pH dapat terjadi

sehingga dapat mempengaruhi komponen yang diinginkan (19).

II.3.Bentuk LC

II.3.1. Berlawanan Chromatography (CCC)

Kedua fase diam dan gerak yang cair. Pemisahan zat terlarut

dicapai dengan partisi. Dua bentuk CCC tersedia (lihat Bab. 7). Bentuk

lama adalah tetesan berlawanan dan didasarkan pada berlalunya tetesan

dari fase gerak melalui fase diam yang jaraknya lebih lama. Fase diam

yang terkandung dalam 200 atau lebih tabung kaca dihubungkan secara

seri dengan lembam Teflon tabung. Fase gerak dipompa melalui sebagai

serangkaian terus menerus tetesan yang cukup kecil untuk naik (atau

jatuh) melalui fase diam tanpa menyentuh sisi tabung. CCC sentrifugal ini

merupakan lanjutan mengenai hal ini dan memberi hasil jauh lebih cepat.

Fase diam diadakan di tabung sebagai lapisan tipis dengan kekuatan

sentrifugal. Meskipun CCC menawarkan pemulihan sampel sangat baik,

terbatas berbagai campuran pelarut yang dapat digunakan dan tingginya

biaya yang terlibat membatasi penerapannya (25).

II.3.2. Kromatografi Lapis Tipis

Fase diam padat dan tersebar di lembaran datar. kedua adsorpsi

dan partisi fase diam yang tersedia. Fae diam yang paling umum

digunakan adalah silika gel dan oktadesil silika. Teknik ini berguna dalam

fraksinasi, tidak hanya sebagai proses akhir untuk pemurnian relatif

sejumlah kecil senyawa yang hampir murni, tetapi juga sebagai metode

untuk merancang beberapa jenis pemisahan kolom dan juga untuk

monitoring komposisi fraksi yang diperoleh oleh proses fraksinasi lain

(lihat Bab. 4) (25).

II.3.3. Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom adalah bentuk paling umum dari

kromatografi. Semua cara pemisahan diwakili. Fase diam solid dan

dikemas dalam kolom yang terbuat dari kaca, stainless steel, atau material

inert lainnya. Campuran sampel diterapkan ke bagian atas kolom dan fase

gerak melewati kolom dengan baik oleh gravitasi, vakum, atau tekanan

untuk memberikan LC gravitasi terbuka, LC vakum, atau menengah atau

HPLC, masing-masing (lihat Bab. 5).

II.3.4. Ekstraksi Fase Padat (SPE)

SPE menyediakan cara yang cepat dan sederhana untuk pemurnian analit

dan konsentrasi. Keuntungan dari teknik ini adalah bahwa ia menghindari

masalah emulsi yang sering dihadapi dengan prosedur ekstraksi cair-cair. Teknik

ini dapat digunakan dengan semua jenis fase diam, kecuali yang digunakan untuk

kromatografi eksklusi. Format yang paling umum digunakan terdiri dari laras

jarum suntik (cartridge) yang berisi 50 mg sampai 20 g sorben materi melalui

larutan sampel sehingga dapat dengan perlahan dipaksa oleh plunger atau vakum

(lihat Bab. 5). Ketika digunakan untuk pemurnian sampel, fase diam

mempertahankan zat terlarut yang diinginkan dengan baik sementara lewat

komponen yang tidak diinginkan (mode kuat) atau melewati zat terlarut yang

diinginkan sementara mempertahankan komponen campur (mode nonretentive).

Pengenceran sampel larutan juga dapat terkonsentrasi dengan mengekstraksi zat

terlarut ke SPE sorben diikuti oleh elusi dalam volume kecil eluen yang kuat

(24,26).

III. Pendekatan Umum untuk Pemurnian Bahan Alam Laut

III.1. Pengumpulan dan Penyimpanan Organisme Laut

Penanganan organisme laut selama pengumpulan sangat kritis. Tindakan

harus diambil untuk menghindari dekomposisi senyawa. Informasi pada

organisme dan tempat pengumpulan harus hati-hati dicatat untuk memfasilitasi

pengumpulan kembali dan identifikasi taksonomi berikutnya.

Gambar 4 menyajikan contoh lembar catatan koleksi yang harus selesai

untuk setiap sampel yang dikumpulkan.

Di tempat pertama, masing-masing sampel harus memiliki sejumlah

koleksi khusus. Jumlah ini dapat dipilih untuk menunjukkan koleksi tahun, nomor

ekspedisi, dan nomor spesimen, misalnya, koleksi nomor 97212 berarti tahun

1997, nomor ekspedisi yaitu 2, dan nomor spesimen yaitu 12. Lokasi harus

direkam pada peta atau grafik daerah dengan skala yang sesuai untuk

mengaktifkan koleksi kembali. Jika memungkinkan, aparat posisi global (GPS)

harus digunakan untuk mendapatkan koordinat yang akurat untuk 10 m. Informasi

tentang habitat (misalnya, sampel tumbuh di atas batu atau pada permukaan

organisme lain) sebagai pengamatan ekologi juga (misalnya, mampu mencegah

pertumbuhan organisme tetangga) harus dicatat. Sebuah penjelasan rinci tentang

ciri-ciri morfologi organisme, termasuk warna, bentuk, tekstur, harus ditulis. Foto

closeup organisme, diambil di bawah dan di atas air, adalah sangat penting untuk

identifikasi taksonomi dan harus melekat pada lembar pengumpulan (lihat Catatan

3). Spesimen voucher untuk tujuan taksonomi harus disiapkan dengan mengambil

sebagian kecil (misalnya, 2-5 cm) bagian dari jaringan dan melestarikan dalam

larutan formalin 10% dalam air laut. Spesimen ganggang biasanya diawetkan

dalam larutan formalin 5% dalam air laut. Spesimen harus mewakili dari seluruh

organisme dan mencakup banyak jaringan yang relevan dengan taksonomi,

misalnya, untuk spons, baik exo- dan endosome sangat penting untuk identifikasi

akurat. Untuk tunicates dan karang lunak, sering menjadi bagian dari organisme

atau seluruh organisme (jika tidak terlalu besar) harus dikumpulkan, termasuk

'”root”. Setelah spesimen mencapai laboratorium, larutan formalin harus

dituangkan dan diganti dengan etanol 70% untuk penyimpanan jangka panjang.

Jumlah organisme yang akan dikumpulkan biasanya ditentukan mengingat

kelimpahan. Ukuran sampel yang ideal adalah 1-2 kg berat basah (100-200 g

berat kering). Pemanenan lengkap organisme harus dihindari. Jika hanya

organisme tunggal yang besar tersedia, bagian dari itu mungkin dikumpulkan.

Idealnya, sampel harus liofilisasi segera setelah pengumpulan untuk mencegah

degradasi kimia. Jika hal ini tidak mungkin, sampel harus harus disimpan pada

suhu -20⁰C sampai 0⁰C sampai pengeringan beku. Sebuah pendekatan alternatif

adalah untuk memperbaiki sampel dengan merendamnya dalam campuran etanol-

air (50:50 v/v) untuk kira-kira 24 jam setelah cairan tersebut akan dibuang.

Organisme basah tersebut kemudian ditempatkan dalam botol high-density

polyethylene (Nalgene 2 L wadah lebar mulut adalah yang terbaik) dan dikirim

kembali ke laboratorium rumah di suhu lingkungan (27) (lihat Catatan 4). Sampel

diawetkan dengan cara ini biasanya tetap dalam kondisi baik hingga 2 minggu

dalam kondisi tropis dengan tidak ada kerugian yang signifikan dari konten

metabolit sekunder. Penambahan MeOH harus terjadi segera setelah sampel

mencapai laboratorium.

EKSTRAKSI

Strategi ekstraksi tiga yang banyak digunakan di bidang bahan alam laut . Pilihan

metode tergantung pada tujuan proses isolasi, fasilitas yang tersedia, serta keuntungan

intrinsik dan kerugian prosedur (lihat Catatan 5). Metode pertama melibatkan maserasi

sampel dengan pelarut, diikuti dengan penyaringan atau sentrifugasi. Residu jaringan

dikembalikan ke wadah ekstraksi dan diekstraksi lagi. Proses berlanjut sampai tidak ada

hasil ekstraktif diperoleh (lihat Catatan 6). Sampel biasanya dipotong menjadi potongan-

potongan kecil atau ditumbuk menjadi partikel halus untuk memfasilitasi penetrasi

pelarut.

Pengadukan atau sonikasi dapat diterapkan untuk meningkatkan tingkat difusi.

Dalam kebanyakan kasus, MeOH atau EtOH adalah pelarut pilihan. Namun, penggunaan

serangkaian pelarut meningkatkan polaritas juga umum untuk mencapai tingkat fraksinasi

tertentu. Bantuan filter dan vakum biasanya digunakan untuk mempercepat proses filtrasi.

Setelah ekstraksi, pelarut dihilangkan dengan penguapan rotary tidak lebih dari 35⁰C

untuk menghindari degradasi senyawa (lihat Catatan 7). Metode ini sederhana dan tidak

memerlukan peralatan yang canggih. Di sisi lain, sejumlah besar pelarut yang terlibat dan

energi yang dibutuhkan untuk penguapan mereka, serta prosedur yang panjang dapat

membatasi aplikasi industrinya. Skema ekstraksi kedua dikembangkan oleh para ilmuwan

di US National Cancer Institute (NCI) sebagai bagian dari program skrining yang luas

dari produk alami untuk mendeteksi senyawa dengan aktivitas antitumor atau anti-HIV.

Sampel beku yang digiling dengan es kering (CO2) dan diekstraksi dengan air pada 4°C.

Ekstrak air dihilangkan dengan sentrifugasi dan liofilisasi. The marc kering kemudian

berturut-turut diekstraksi dengan MeOH-CH2Cl2 (1: 1 v / v), diikuti oleh MeOH (100%).

Ekstrak organik digabungkan dan dipekatkan menggunkan vakum (28,29). Metode ini

sangat efisien. Selain itu, liofilisasi dalam menghilangkan ekstrak air berisiko menabrak

dan terjadi degradasi panas. Protokol ekstraksi ketiga melibatkan penggunaan SCFs (lihat

Bab. 3). Titik kritis didefinisikan sebagai suhu tertinggi dan tekanan di atas yang tidak

ada perbedaan dalam kepadatan antara bentuk cair dan gas dari substansi. Pada suhu dan

tekanan di atas titik kritis, cairan homogen tunggal terbentuk dan dikatakan superkritis.

Suhu dan tekanan kritis berbeda dengan substansi dan dengan kemurniannya. Untuk air,

masing-masing 37⁰C dan 220 atm, sedangkan untuk karbon dioksida nilai masing-masing

yang sesuai adalah 31⁰C dan 74 atm.

SCFs memiliki keuntungan dari viskositas rendah, sifat perpindahan massa

unggul, dan daya solvasi baik. Mereka juga memiliki kemampuan untuk menembus

bahan mikro. Dengan demikian, penggunaannya dalam ekstraksi produk alami secara

luas dihargai. Karbon dioksida superkritis adalah pelarut suhu rendah paling disukai dan

dapat digunakan. Keuntungan lain, seperti tidak beracun, nonflammability, tidak korosif,

inert, dan efektivitas biaya. Selain itu, akan mudah menguap ke atmosfer setelah ekstraksi

(30). CO2 superkritis menyerupai pelarut nonpolar heksana dan benzene dalam kekuasaan

pelarut mereka. Afinitas untuk senyawa polaritas yang lebih tinggi dapat ditingkatkan

dengan meningkatkan densitas (dengan perubahan kecil suhu dan tekanan) atau

menambahkan pelarut organik (misalnya, MeOH, EtOH, atau DCM). Namun,

penambahan tersebut pengubah organik akan mengubah suhu dan tekanan kritis pelarut

organik dan akan memerlukan modifikasi prosedur untuk menghapus cairan ekstraksi

pada akhir proses (25). Referensi (31,32) termasuk contoh untuk aplikasi teknik ini

dalam ekstraksi rumput laut. Meskipun metode ini menawarkan cara yang cepat dan

efektif untuk ekstraksi dan penghapusan pelarut selanjutnya, perlu peralatan canggih dan

beberapa eksperimen untuk memilih pengubah organik terbaik.

Fraksinasi Ektrak Laut

Ekstrak laut sangat kompleks, dan terdiri campuran senyawa netral, asam, basa,

lipofilik, dan amphiphilic. Sifat senyawa (s) dari bunga mungkin berbeda sesuai dengan

tujuan proyek, dan sebagai akibatnya tidak ada prosedur fraksinasi umum atau resep yang

dapat melayani segala kemungkinan. Perlu dicatat bahwa meskipun kemajuan terbaru

dalam teknologi pemisahan, pengalaman masih memiliki peran yang sangat diperlukan

dalam isolasi hasil alam laut.

Umumnya, prosedur fraksinasi melewati empat tahap (Gambar. 5). Tahap pertama

meliputi pengumpulan informasi tentang profil kandungan kimia dan aktivitas biologis

ekstrak, sifat senyawa yang menarik, serta jenis kotoran. Informasi ini sangat berharga

untuk perencanaan strategi isolasi. Pada tahap kedua, dereplication (lihat Bab. 12)

biasanya terjadi. Tujuannya adalah untuk mengidentifikasi ekstrak yang mengandung

senyawa dapat dikenal sedini mungkin sebelum langkah fraksinasi rumit yang dilakukan,

dan untuk memprioritaskan ekstrak dalam hal kandungan senyawa baru mereka dan / atau

aktif menarik. Ini mungkin berguna untuk menunjukkan bahwa semua prosedur yang

terlibat dalam tahap 1 dan 2 harus dilakukan untuk semua fraksi yang diperoleh setelah

langkah pemisahan. Dengan cara ini, komponen yang menarik dapat dilacak sampai

tahap pemurnian akhir. Tujuan dari tahap ketiga sering dilakukan untuk menghilangkan

sebagian besar bahan yang tidak diinginkan, misalnya, lemak dan garam menggunakan

resolusi cukup rendah pada langkah pemisahan, misalnya, partisi cair-cair, SPE, dan

SEC. Tahap keempat biasanya melibatkan langkah-resolusi tinggi pemisahan, misalnya,

HPLC dengan tujuan pemurnian senyawa yang menarik yang memungkinkan penjelasan

struktur berikutnya. Prosedur yang terlibat dalam empat tahap yang disebutkan dibahas di

bawah ini dengan beberapa rincian.

Gambar. 5. Pendekatan umum untuk fraksinasi ekstrak laut.

Tahap 1: Investigasi Sifat Komponen Ekstrak

Ini mungkin merupakan tahap yang paling penting dalam proses isolasi.

Perencanaan skema fraksionasi yang bijksana terutama tergantung pada informasi yang

tersedia pada sifat zat yang ada dalam ekstrak. Selain itu, pengetahuan tentang sifat kimia

dan/atau aktivitas biologis senyawa target yang efisien dapat memandu proses

pemisahan. Akibatnya, beberapa informasi dapat diungkapkan oleh taksonomi yang tepat

identifikasi organisme diselidiki. Pencarian literatur dapat memberikan informasi tentang

senyawa yang sebelumnya terisolasi dari spesies. Jika kandungan kimia spesies belum

diteliti, informasi yang berguna dapat diperoleh dengan mencari spesies yang terkait erat

dalam genus. Namun, perlu diingat bahwa kandungan kimia dari organisme laut dapat

benar-benar berbeda jika dikumpulkan dari sebuah wilayah yang berbeda dan / atau di

musim lain. Jenis pelarut yang digunakan dalam ekstraksi juga dapat memberikan

beberapa informasi yang berguna. Ekstrak air biasanya mengandung senyawa yang

sangat polar dan sejumlah besar garam anorganik. Di sisi lain, ekstrak organik sering

mengandung senyawa yang kurang polar dan banyak lemak. Informasi lebih lanjut dapat

diperoleh dengan melakukan pengujian biologis, analisis TLC, spektrometri massa (MS),

dan percobaan NMR.

PENYARINGAN BIOLOGI

Bioassay-dipandu fraksinasi sangat menarik untuk penelitian tentang penemuan

obat dari sumber alami. Hal ini penting untuk menjaga referensi sampel dari fraksi yang

diperoleh setelah setiap langkah pemisahan sehingga dapat diuji secara biologis dan

berfungsi sebagai catatan bahan pulih pada setiap tahap proses (21). Namun, salah satu

masalah yang paling sulit dalam bioassay-diarahkan fraksinasi adalah kemungkinan

mendapatkan positif palsu dan negatif palsu. Salah positif biasanya terjadi jika salah satu

komponen tidak aktif dalam ekstrak memiliki kemampuan untuk berinteraksi nonspesifik

dengan target molekul assay (misalnya, mampu mengendapkan protein dan karenanya

menunjukkan aktivitas penghambatan dalam banyak tes berbasis enzim). Demikian pula,

beberapa komponen tidak aktif dapat menimbulkan hit positif dengan berinteraksi dengan

beberapa komponen dari sistem uji selain target. Orang lain mungkin mengganggu

deteksi metode uji, misalnya, quenchers UV (18). Di sisi lain, negatif palsu biasanya

terjadi jika senyawa aktif bekerja pada target molekul lain daripada pengujian tersebut.

Hal ini juga harus dicatat bahwa banyak entitas kimia menarik mungkin diaktifkan secara

in vivo oleh enzim metabolik, faktor yang tidak dipertimbangkan dalam banyak sistem

penyaringan in vitro. Dengan demikian, kita dapat menyimpulkan bahwa proses

fraksinasi tidak boleh hanya mengandalkan skrining biologis.

ANALISIS TLC

Analisis pelat TLC dapat digunakan untuk mendapatkan ide tentang tingkat

polaritas dan/atau hidrofilisitas komponen ekstrak yang berbeda. Mereka juga banyak

diterapkan dalam mendeteksi senyawa melalui beberapa langkah pemisahan. Selain itu,

mereka dapat digunakan untuk memprediksi pola pemisahan pada kromatografi kolom,

dan dengan demikian membantu dalam memilih sistem kolom kromatografi terbaik.

Mereka mungkin membantu juga dalam menilai tingkat kemurnian senyawa hasil isolasi.

Dalam semua aplikasi di atas, lebih dari satu sistem pelarut harus diadili sebagai senyawa

yang berbeda mungkin memiliki nilai Rf yang sama dalam satu sistem dan dengan

demikian muncul sebagai satu tempat. Pelat TLC dapat disemprot dengan reagen yang

bereaksi khusus dengan kelas-kelas senyawa tertentu. Penggunaan reagen penyemprotan

yang berbeda dapat memberikan banyak informasi tentang kelas kimia yang ada dalam

ekstrak. Ada banyak reagen penyemprotan tercantum dalam beberapa teks standar pada

subjek (33,34) dan juga dalam Bab 4. Tabel 6 daftar penyemprotan reagen yang paling

banyak digunakan untuk produk alami laut.

Selain itu, kombinasi langsung TLC dengan bioassay (bioautografi) dapat

memberikan informasi lebih lanjut tentang komponen aktif dalam ekstrak campuran. Hal

ini dicontohkan dalam penemuan agen antimikroba.

Tabel 6

Reagen Penyemprot Kromatografi Lapis Tipis yang Umum Digunakan di Kebanyakan

Laboratorium Bahan Alam Laut

Reagen Resep Perawatan Catatan

Vanillin /

asam sulfat

Larutkan vanillin(4g)

pada terkonsentrasi

H2SO4 (100 mL)

Panas pada 100° C

sampai warna

muncul

Reagen Penyemprot

Universal

Anisaldehida

/ asam sulfat

Tambahkan 0.5ml

anisaldehida ke 10

mL asam asetat

glasial dan kemudian

menambahkan ke

campuran 85mL

MeOH dan 5 mL

H2SO4

terkonsentrasi, dalam

Panas pada 100° C

sampai warna

muncul

Mendeteksi banyak

senyawa, terutama

terpen, gula, fenol, dan

steroid

urutan ini

Reagen

Dragendorff

Tambahkan 10 mL

larutan 40% dari KI

ke 10 mL larutan

0,85 g subnitrate

bismut dasar dalam

asam asetat (10 ml)

dan air suling (40

ml). Encerkan larutan

yang dihasilkan

dengan asetat asam

dan air dalam rasio:

1: 2: 10

Tidak ada panas yang

diperlukan

Mendeteksi alkaloid dan

senyawa heterosiklik

nitrogen

Ninhydrin

reagen

Larutkan ninhidrin

(30 mg) di 10 mL n-

butanol. Tambahkan

asam asetat 0.3mL

untuk solusi

Panas pada 100° C

sampai warna

muncul

Deteksi asam amino,

amina, dan peptida

Dari ekstrak laut. Setelah pengembangan, pelat KLT dari ekstrak kering

dan kemudian dilapis dengan lapisan tipis agar yang mengandung organisme uji

terhadap yang ekstrak aktif. Setelah masa inkubasi yang tepat, zona inhibisi

pertumbuhan agar dapat dilihat pada daerah-daerah pelat yang mengandung

senyawa aktif (35). Metode yang sama juga dapat diterapkan untuk mendeteksi

senyawa dengan aktivitas antitumor (36).

III.3.1.3. ANALISIS NMR

Analisis spektroskopi NMR memiliki peran yang sangat diperlukan dalam

menjelaskan struktur senyawa murni. Hal ini juga dapat memberikan banyak informasi

tentang sifat kimia senyawa dalam campuran. Maka dari itu, disarankan untuk

memperoleh 1H- dan 13C- spektrum NMR untuk ekstrak laut. Tujuannya adalah untuk

mendeteksi ada atau tidaknya artefak umum, misalnya, plasticizer (lihat Catatan 8) dan

untuk menetapkan komponen dalam campuran kelas kimia tertentu (lihat Catatan 9).

Kombinasi dari fraksi setelah pemisahan dapat ditetapkan atas dasar spektrum NMR

yang serupa.

III.3.1.4. ANALISIS MS

MS adalah teknik yang digunakan untuk mengidentifikasi berat molekul dari

senyawa yang tidak diketahui oleh pengionnya dan mendeteksi rasio massa terhadap

muatan (m / z) dari ion molekul yang dihasilkan. Molekul yang tidak terionisasi tidak

akan terdeteksi. Salah satu keuntungan dari teknik ini memiliki sensitivitas tinggi. Ia

bahkan bisa mendeteksi jumlah mikrogram senyawa. Masalah dalam generalisasi MS

untuk proses identifikasi komponen ekstrak adalah kurangnya mode ionisasi yang

universal dimana setiap senyawa yang tidak diketahui dapat terionisasi. Untungnya,

banyak teknik ionisasi MS telah diperkenalkan dimana sebagian besar produk alami

laut dapat terionisasi. Umumnya, electrospray (ESI) adalah teknik ionisasi yang

direkomendasikan untuk ekstrak polar, sedangkan ionisasi kimia tekanan atmosfer

(APCI) lebih disukai untuk yang agak polar (37). Analisis MS sulit untuk diterapkan

pada ekstrak laut mentah, tapi bisa digunakan untuk mengidentifikasi senyawa dari

campuran semi murni.

III.3.2. Tahap 2: Dereplikasi

Isolasi senyawa murni dari ekstrak laut adalah proses yang membosankan dan

mahal. Langkah-langkah harus diambil untuk menghindari isolasi senyawa yang dikenal.

Dereplikasi dapat didefinisikan sebagai upaya untuk menghapus duplikat lead atau

senyawa (lihat Bab. 12) (38). Proses ini tergantung pada ketersediaan database yang

komprehensif untuk senyawa yang dikenal. Ada 378 database Houssen dan Jaspars

tersedia saat ini, termasuk yang mengandung informasi mengenai sumber organisme,

identifikasi taksonomi, dan metode ekstraksi, serta karakteristik kromatografi dan

spektroskopi yang berbeda dari senyawa hasil isolasi. Sebagian besar database ini dapat

diakses melalui internet. Tersedia juga pada CD. Tabel 7 berisi beberapa dari database

yang berguna serta URL-nya, terutama dalam kaitannya dengan produk alami laut.

III.3.3. Tahap 3: Fraksinasi Crude

Tujuan dari tahap ini adalah untuk menyederhanakan komposisi ekstrak dengan

membaginya kedalam berbagai kelompok senyawa berbagi karakteristik fisikokimia

yang sama dan atau menghapus sebagian besar bahan yang tidak diinginkan dan dengan

demikian memperbanyak ekstrak sehubungan dengan senyawa sasaran. prosedur umum

melibatkan partisi pelarut, defatting, dan desalting.

III.3.3.1. Partisi pelarut

Prosedur yang dijelaskan pada Gambar. 6 merupakan modifikasi dari

metode yang dikembangkan oleh Kupchan (39). Hal ini dapat digunakan

untuk defatting dan desalting juga.

Tabel 7

Beberapa Database yang Berguna Untuk Dereplikasi Bahan Alami Laut

Database URL

MarinLit http://www.chem.canterbury.ac.nz/marinlit/marinlit.shtml

Dictionary of Natural

Products and others

http://www.chemnetbase.com/

Chemical Abstracts

(CAS)

http://info.cas.org/

NAPRALERT

(Natural Product

Alert) database

http://www.cas.org/ONLINE/DBSS/napralertss.html

Beilstein CrossFire http://www.mimas.ac.uk/crossfire/

Silverplatter http://web5.silverplatter.com/webspirs/start.ws

NCI data search http://dtp.nci.nih.gov/docs/dtp_search.html

United States Patents http://www.uspto.gov/patft/

Chemical Database

Services

http://cds.dl.ac.uk/cds/

National Institute of

Standards

http://webbook.nist.gov/chemistry/

Cambridge

Structural Database

http://www.ccdc.cam.ac.uk/products/csd/

Marine Biological

Laboratory, Woods

Hole, MA, USA

http://www.mbl.edu/

Chromatography

application database

http://www.chromatography.co.uk/apps/hplc/dbases/

form.htm

Gambar. 6. Modifikasi skema partisi Kupchan

Sebagian besar lemak akan hilang dengan fraksi n-heksana, sedangkan

garam anorganik akan hilang dengan sesuatu yang berair. Keuntungan dari

metode ini adalah perolehan kembali senyawa sasaran. Kelemahannya adalah

masalah pembentukan emulsi, ketidakefektifan waktu, dan banyaknya

penggunaan volume pelarut.

III.3.3.2. Defatting

Sejumlah prosedur telah dijelaskan untuk defatting ekstrak laut.

Penggunaan Sephadex LH-20 dan MeOH: CH2Cl2 (1: 1 v / v) sebagai eluen

adalah salah satu prosedur yang umum digunakan. Lemak dan senyawa

organik non polar biasanya dielusi pertama. Prosedur umum lainnya

melibatkan penggunaan cartridge SPE yang mengandung silika C18 dan

MeOH atau H2O sebagai cairan pencuci. Karena sifat hidrofobik yang kuat,

lemak dan lipid dipertahankan pada fase diam, sementara lainnya komponen

ekstrak hidrofilik berlebih dielusi. Prosedur terakhir tidak cocok apabila

senyawa sasaran menunjukkan perolehan kembali dari silika C18 yang buruk.

III.3.3.3.Penghilangan garam

Metode yang paling efisien untuk desalting ekstrak laut telah dijelaskan

oleh West dan Northcote (40) dan West. (41). Dalam prosedurnya, ekstrak

metanol dilewatkan melalui kolom Diaion HP20® resin (styrene-divinil

benzena polimer) sebelumnya dikalibrasi dengan MeOH. Eluen terkonsentrasi

dan melewati lagi kolom yang sama. Eluen yang dihasilkan diencerkan

dengan air dan melewati kolom. Langkah terakhir diulang untuk memastikan

bahwa semua senyawa yang mengandung domain hidrofobik teradsorpsi pada

resin. Desalting dapat dengan mudah dicapai dengan mencuci resin dengan air

yang banyak. Proporsi yang berbeda dari MeOH atau aseton dalam air dapat

digunakan untuk mengelusi senyawa teradsorbsi dan untuk mencapai tingkat

fraksinasi tertentu. Hasil yang lebih baik dapat diperoleh dengan

menggunakan manik-manik dengan ukuran partikel yang lebih kecil

(misalnya, Diaion HP20ss); namun, dalam hal ini, aplikasi tekanan yang

dibutuhkan untuk mencapai sifat alir yang baik.

III.3.4. Tahap 4: Pemurnian Akhir

HPLC preparatif, sejauh ini, merupakan alat yang paling berguna untuk

memisahkan campuran kompleks. Ketika dihubungkan dengan diode array detector

(DAD), HPLC memungkinkan seorang analis untuk mengidentifikasi senyawa yang

dikenal dengan perbandingan waktu retensi dan spektrum UV. Pengenalan evaporative

light scattering detector (ELSD) memungkinkan untuk mendeteksi senyawa yang tidak

memiliki gugus kromofor UV. Dalam beberapa tahun terakhir, tandem atau ditulis dgn

tanda penghubung teknik analisis seperti LC-MS, LC-MS-MS, LC-NMR, dan LC-

NMR-MS juga telah dikembangkan (lihat Bab. 9). Teknik ini menyediakan alat yang

ampuh untuk identifikasi secara cepat senyawa yang dikenal dan penentuan kelas

struktur yang baru.

III.3.4.1.UV DIODA ARRAY DETECTOR (DAD)

Detektor UV Fotodioda array memungkinkan pengumpulan data absorbansi UV

di banyak panjang gelombang secara bersamaan dan dengan demikian memungkinkan

penilaian kemurnian puncak. Kotoran dasar dapat dengan mudah dideteksi dengan

membandingkan spektra UV pada titik waktu yang berbeda di puncak. DAD paling

modern didukung dengan pustaka yang mengandung spektrum UV senyawa yang

dilaporkan sebelumnya. Operasi perangkat lunak ini memiliki detektor dengan

kemampuan untuk turunan pustaka spektral dan mencari dan dengan demikian

memungkinkan identifikasi cepat senyawa yang dikenal (20).

III.3.4.2.EVAPORATIVE LIGHT-SCATTERING DETECTOR (ELSD)

ELSD telah dikembangkan untuk melengkapi deteksi UV senyawa dengan daya

absorbansi yang lemah. Di ELSD, efluen HPLC nebulized dan kemudian menguap

dalam tabung melayang yang dipanaskan, yang menghasilkan embun partikel analit

yang melewati seberkas cahaya. Partikel analit menghamburkan cahaya dan

menghasilkan sinyal (42). Berbeda dengan detektor UV, koefisien kehilangan analit

tidak berpengaruh pada respon ELSD. Dengan demikian, ELSD sekarang merupakan

metode deteksi konsentrasi pilihan untuk LC. Ketika ELSD terhubung ke HPLC

preparatif, efluen dari kolom dibagi dan hanya sebagian kecil diarahkan ke detektor.

III.3.4.3.LC-MS DAN LC-MS-MS

LC-MS adalah alat yang paling banyak diterapkan untuk dereplikasi bahan alami

(lihat bab. 9 dan 12) (43,44). Hal ini terutama karena berat molekul nominal dapat

digunakan sebagai permintaan pencarian di hampir semua database. Menggunakan LC-

MS-MS, ion molekul tertentu dipisahkan dan mengalami putaran kedua pada

fragmentasi. Pola fragmentasi yang dihasilkan dapat memberikan banyak informasi

tentang struktur induk. Teknik ini cocok untuk identifikasi fragmen dari molekul yang

terbentuk dari beberapa unit individu seperti peptida, depsipeptida, oligosakarida, dan

saponin (13).

III.3.4.4.LC-NMR

Kemajuan terbaru dalam spektroskopi NMR telah memungkinkan rangkaian

langsung dengan sistem HPLC (lihat Bab. 9). Penggunaan medan magnet yang tinggi

(500 MHz atau lebih besar), Sel aliran volume kapiler mikroliter, dan sistem pemrosesan

sinyal digital telah secara dramatis meningkatkan sensitivitas untuk melacak jumlah

analit. Selain itu, desain pemeriksaan baru telah memfasilitasi efisiensi dan spesifikasi

penekanan sinyal NMR pelarut HPLC. Bagaimanapun, teknik ini masih lambat dan

sangat mahal. LC-NMR sangat berguna dalam kasus dimana data dari LC-MS tidak

memungkinkan identifikasi senyawa pasti (misalnya, isomer yang memiliki berat

molekul yang sama). Teknik ini telah berhasil diterapkan pada identifikasi alkaloid

aaptamine dalam ekstrak spons laut Aaptos spesies (45). Penggunaan HPLC-NMR-MS,

diomana sistem pemisahan digabungkan dengan kedua NMR dan MS, juga telah

dilaporkan (46).

IV. Vistas baru Pada Teknologi Pemisahan

Walaupun perbedaan tinggi, produk alami telah hadir dari program penelitian dari

berbagai perusahaan farmasi. Hal ini terutama karena dari penggunaan waktu tradisional

dan intensif biaya isolasi dan prosedur identifikasi, dan kurangnya ketersediaan produk

alami dalam format yang sesuai untuk teknologi HTS modern. Akibatnya, integrasi

ekstrak mentah produk alami dalam sistem HTS menjadi sulit. Hal ini terutama karena

ada kemungkinan positif palsu yang tinggi dan senyawa bioaktif berulang diketahui dan

pekerjaan membosankan yang diperlukan untuk identifikasi hit. Baru-baru ini, metode

telah dijelaskan untuk persiapan produk alami yang besar dan beragam dioptimalkan

untuk HTS (47). Salah satu metode bergantung pada menghasilkan sebuah pustaka besar

dari fraksi yang dimurnikan setengah. Keuntungan dari metode ini antara lain yaitu

peningkatan keandalan hasil pengujian biologis dan penurunan yang tajam dalam beban

kerja berikutnya untuk identifikasi hit dan dereplication. Strategi lain tergantung pada

persiapan pustaka senyawa alami murni. Meskipun jenis pustaka ini menawarkan

kehandalan yang paling tinggi dalam pengujian biologis, jumlah besar pekerjaan yang

dibutuhkan untuk persiapan sampel masih sangat kekurangan. Kedua pustaka

bergantung pada ketersediaan teknik fraksinasi yang cepat dan otomatis. Baru-baru ini,

Sepiatec GmbH (Berlin, Jerman) bekerjasama dengan Aventis Pharma Deutschland

GmbH (Frankfurt, Jerman) telah merancang sistem untuk meningkatkan produktivitas

persiapan sampel untuk HTS. Sebuah deskripsi singkat dari dua contoh representatif

sistem ini diberikan di sini.

IV.1. 8X HPLC Paralel

Sistem ini (Gbr. 7), yang dapat berjalan tanpa pengawasan untuk 24 jam dalam

sehari, mampu secara bersamaan menggunakan delapan fraksinasi campuran ekstrak

kompleks dengan sistem pompa gradien tunggal bertekanan tinggi, multi-channel (UV,

DAD, atau ELSD) detektor, dan perangkat lunak ahli. Sampel dipisahkan oleh sebuah

array dari kolom HPLC, menyediakan satu buah kolom untuk setiap sampel. Perlu

dicatat bahwa suntikan cairan dari sampel dengan berbagai polaritas yang luas adalah

pekerjaan yang menantang. Dimethyl sulfoxide (DMSO) benar-benar melarutkan

sebagian sampel untuk injeksi, tetapi juga dapat mengganggu pemisahan kromatografi

berikutnya. Modul injeksi SPE on-line (26) memecahkan kesulitan ini. Dengan

menggunakan autosampler, sampel dilarutkan dalam DMSO yang disuntikkan kedalam

modul, dan air atau buffer secara bersamaan dipompa sebelum inlet ke kolom SPE (48).

Karena peningkatan cepat ini dalam polaritas gradien, komponen ekstrak tetap

teradsorbsi ke kolom SPE dan DMSO / air dibuang. Selanjutnya, pelarut organik yang

sesuai menyuntikkan ekstrak ke kolom pemisahan.

Gambar. 7. garis Skema pipa dari 8X perangkat HPLC Paralel. Gambar

direproduksi dengan izin dari Perusahaan Brosur Sepiatec.

Elusi fraksi menjadi on-line dan pemeriksaan otomatis sebelum pengumpulan.

Mereka terabsorbsi lagi ke kolom SPE menggunakan prinsip yang sama seperti modul

injeksi sampel yang telah dijelaskan sebelumnya. SPE teradsorpsi fraksi yang memerah

dengan air dan kemudian dielusi dengan pelarut organik murni ke dalam 96-piring baik.

Sistem ini mampu memisahkan lebih dari 100 ekstrak produk alami perhari menjadi

beberapa ribu air dan fraksi penyangga bebas. Kualitas dan kemurnian fraksi yang

diperoleh sesuai dengan tuntutan HTS.

IV.2. Sepbox®: Pengaturan HPLC-SPE-HPLC-SPE

Sistem ini (Gbr. 8) didasarkan pada kombinasi HPLC dan SPE. Dalam pengaturan

HPLC-SPE-HPLC-SPE ini, polaritas eluen meningkat dengan penambahan air yang

sedemikian rupa sehingga fraksi dielusi dari kolom pemisahan I yang teradsorpsi ke

kolom perangkap I. Rute fraksi terperangkap kemudian melewati pemisahan kolom II

dimana pemisahan akhir selesai. Setiap komponen yang dielusi teradsorpsi ke kolom

perangkap II, terpisah dari buffer, dan memerah pada pengumpul fraksi. Sistem ini jauh

lebih cocok untuk menghasilkan sebuah pustaka senyawa yang hampir murni.

Gambar. 8. garis Skema pipa dari sepbox®. Gambar direproduksi dengan

izin dari Perusahaan Brosur Sepiatec.