MAKALAH ISOLASI STANDARISASI BAHAN ALAM

HIGH PERFERPOMANCE THIN LAYER CHROMATOGRAPHY ( HPTLC )

Nama Kelompok :

Angga Pratama PS ( 1041011194)

Muladi Putra M ( 1041011093)

Noni Setiani ( 1041011103)

Novia Pangesti ( 1041011104)

SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI

“YAYASAN FARMASI”

SEMARANG

A. PENGERTIAN

High perferpomance thin layer chromatography (HPTLC) adalah suatu metode kromatografi

yang merupakan pegembangan dari TLC, hal yang dikembangkan adalah fase diam atau

stationary phase dari dari instrumen, yang diharapkan menghasilkan daya pisah yang lebih baik

dari TLC baik dilihat dari hasil, efisiensi waktu dan biaya.

HPTLC dari sisi peralatan tidak terlalu jauh berbeda dengan TLC hanya biasanya pada fase

diam ukuran pori dari fase penyerap lebih kecil sehingga diharapkan terjadi pemisahan yang

lebih baik karena terjadi interaksi antara analit dengan absorbent pada permukaan yang lebih

luas, kemudian ukuran dari lempeng lebih kecil karena menggunakan suatu absorbent dengan

pori yang lebih kecil hal ini akan berpengaruh terhadap waktu pengembangan yang

memungkinkan lebih pendek atau singkat.

Dari profil hasil kromatogram yang diperoleh dari HPTLC lebih baik dari TLC karena pada

HPTLC, HETP atau efisiensi dari teori keping lebih baik dari pada TLC hal ini disebabkan

permukaan dari absorbent ukuran porinya lebih kecil dari absorben0 dari TLC sehingga

permukaan interaksi analit dengan stationary fase lebih luas. HPTLC mempunyai beberapa

kelebihan di banding dengan TLC dalam hal:

Tebal, keseragaman manghasilkan garis dasar stabil dalam densitometry

Jarak pengembangan dan waktu lebih singkat

Pita difusi rendah manghasilkan keterpaduan pita sampel

Mikrosample (nanograms dan picogram) dapat dianalisis

Sifat reproduksibilitas dalam hasil kromatografi.

(Day. R.A, et,. al. 1997)

B. KOMPONEN ALAT

Secara umum alat HPTLC dapat dikelompokan menjadi bebrrapoa bagian yang penting antara lain:

1. fase diam (stationary phase)

2. ruang pengembang (chamber)

3. penyemprot penampak Noda (sprayer)

4. drops penetes sampel (micro pipet)

5. scaner (panampak spot)

6. detektor (keperluan kuantitatif)

a) Fase Diam/Sorbent TLC dan HPTLC

Unsur yang dipandang penting pada lempeng: Format, penunjang, lapisan, dan pengikat:

lempeng Precoated TLC dengan penunjang suatu gelas tersedia dalam format yang banyak, yang

berukuran 20 cm × 20 cm bisanya dipandang sebagai standar untuk TLC awal. Pelat Gelas

sangat kuat dan dapat dikembangkan secara vertikal dan horizontal tanpa bergoyang, kemudian

pemastian ketetapan gerakan dari fase gerak pada lempeng. Mereka benar inert ketika digunakan

dengan semua larutan pengembang dan derivating agent dan sebab itu dapat diaplikasikan secara

universal. Pemisahan optimum (migration) jarak pada lempeng TLC adalah 12–15 cm. Jika

hanya sedikit sampel yang akan dipisahkan pada waktu lempengnya sama, format yang lebih

kecil seperti 10 cm × 20 cm atau 5 cm × 20 cm (20 cm dalam pengembangan secara langsung),

yang juga memungkinkan perpindahan jarak optimum, terjadi. Jika efisiensi pemisahan optimum

sesungguhnya kurang penting (sebagai contoh, jika sample mangandung hanya satu atau sangat

banyak komponen), Jarak pengembangan dapat dikurangi sampai kira-kira 8 cm dan lempeng

format 20 cm × 10 cm (atau lempeng fraksional sekecil 2.5 cm × 10 cm) mungkin kurang.

Gambar. Silika gel untuk TLC

lempeng Thin-layer chromatography (TLC) untuk diadsorbsi, partisi, dan teknik ion exchange

enam pilihan media dengan gelas, polyester, dan dasar aluminum. Lapisan adsorbent silica-based

dalam Sigma-Aldrich lempeng TLC dipadukan dengan suatu pengikat polymeric; lempeng silica

gel yang lebih murni dipadukan pada suatu pengikat gypsum (CaSO4/polimer). Atau dengan

mengunakan lempeng silika gel yang biasa di gunakan :

Gambar. lempeng silika gel untuk HPTLC (lebih kecil dari TLC)

Spesifikasi dari masing-masing sorbent :

Silika gel - untuk pemisahan polarisasi lamah sampai kuat

High purity silika gel -asam washed untuk pemisahan dari aflatoxins

Sellulosa - untuk kromatografi partisi

Sellulosa PEI - untuk pemisahan dari anion lemah (amino acids, peptides)

Aluminum oxida – alumina dasar, untuk pemisahan hormone and antibiotika

Chiral silika - untuk pemisahan dari isomer optis aktif melalui pertukaran ligan

Dibawah ini daftar beberapa spesifikasi sorbent yang dapat digunakan sebagai fase stationary yang

sekarang biasa digunakan :

Cat. No. Ordering informationlayer

thickness[µm]

size[cm] quantity

/pack

034.5035 HPTLC lempengs cellulose F 100 10x10 25

034.5036 HPTLC lempengs cellulose F 100 20x10 50

034.5787 HPTLC lempengs cellulose (without F) 100 10x10 25

034.5786 HPTLC lempengs cellulose (without F) 100 20x10 25

034.5631 HPTLC lempengs silica gel 60 (without F) 200 10x10 25

034.5633 HPTLC lempengs silica gel 60 (without F) 200 10x10 100

034.5641 HPTLC lempengs silica gel 60 (without F) 200 20x10 50

034.3748 HPTLC lempengs silica gel 60 (without F),

concentration zone

200 10x10 25

034.3749 HPTLC lempengs silica gel 60 (without F),

concentration zone

200 20x10 50

034.5628 HPTLC lempengs silica gel 60 F 254 200 10x10 25

034.5629 HPTLC lempengs silica gel 60 F 254 200 10x10 100

034.5564 HPTLC lempengs silica gel 60 F 254 GLP 200 10x10 25

034.5642 HPTLC lempengs silica gel 60 F 254 200 20x10 50

034.1764 HPTLC lempengs silica gel 60 F 254, extra

thin layer

100 20x10 25

034.3727 HPTLC lempengs silica gel 60 F 254,

concentration zone

200 10x10 25

034.3728 HPTLC lempengs silica gel 60 F 254,

concentration zone

200 20x10 50

034.5613 HPTLC lempengs silica gel 60 F 254 GLP 200 20x10 25

034.1552 HPTLC lempengs silica gel WR 60 F 254s 200 20x10 25

034.5445 HPTLC lempengs LiChrospher® Si 60 F

254s

180 20x10 25

034.5547 HPTLC aluminium sheets silica gel 60

(without F)

200 20x20 25

034.5548 HPTLC aluminium sheets silica gel 60 F 254 200 20x20 25

034.5543 HPTLC aluminium sheets silica gel 60 F

254s, RAMAN

200 10x10 25

034.5586 HPTLC aluminium sheets LiChrospher® Si

60 F 254s

100 20x20 25

034.3726 HPTLC lempengs RP-2 F 254s 200 10x10 25

034.3725 HPTLC lempengs RP-8 F 254s 200 10x10 25

034.4296 HPTLC lempengs RP-18 W (without F) 200 20x10 25

034.3124 HPTLC lempengs RP-18 W F 254s200

10x10 25

034.3724 HPTLC lempengs RP-18 F 254s200

10x10 25

034.6464 HPTLC lempengs CN F 254s 200 10x10 25

034.2571 HPTLC lempengs CN F 254s 200 20x10 25

034.2572 HPTLC lempengs NH2 (without F) 200 20x10 25

034.3192 HPTLC lempengs NH2 F 254s 200 20x10 25

034.5647 HPTLC lempengs NH2 F 254s 200 10x10 25

034.2668 HPTLC lempengs Diol F 254 200 10x10 25

034.5636 HPTLC lempengs MERCK Diol F 254 200 20x1025

034.5607 UTLC silica gel 60 w/o F 254 10 6x3.6 25

Secara umum bentuk dan ukuran dari pelat HPTLC lebih kecil dari pelat TLC ini bisa

sampai menjadi sepertiga dari Lempengf TLC hal ini lebih simple namun memang relatif sedikit

lebih mahal. Cara membaca kode pada fase diam/solid

SILICA GEL 60 G FSILICA GEL 60 G F254254

• Adalah Silica Gel dengan :

• Ukuran pori : 60 Å

• G = CaSO4.½ H2O sebagai binder/gypsum

• F = bahan fluorescen / fosforescen yg ditambahkan

• 254 = dituliskan sesudah F atau UV untuk menandakan panjang gelombang eksitasi bahan

fluorescent atau fosforescen yang ditambahkan (Snyder, et al, 1997)

b) Chamber / Ruang Pengembang

Pada dasarnya chamber atau tempat untuk pengembangan dari kromatografi planar tidak

terlalu spesifik untuk masing-masing jenis kromatografi, yang membedakan chamber yang

digunakan adalah ukuran dari chamber, dimana ukuran dapat disesuaikan dengan kebutuhan:

Bahan dari chamber pisa dari kaca atau bahkan dari plastik yang kedap air, biasanya

bentuknya bisa bulat seperti toples atau kotak seperti gambar di bawah ini :

c) Instrumen Pendukung / Tambahan

Sprayer

Sprayer atu penyemprot bercak noda dari spot yang dihasilkan tidak terlalu bervariasi dari

metode planar kromatografi mulai dari alat yang sederhana atau alat yang sudah kompleks dapat

digunakan dengan baik pada penampakan noda dari spot yang sudah diperoleh dengan

sebelumnya memasukan suatu pereaksi penderivatisasi agar spot memendarkan cahaya, berikut

gambar dari sprayer mulai dari yang sederhana sampai dengan keluaran terbaru:

Gambar. Sprayer

Berikut beberapa derivating agent yang bisa di gunakan :

(Snyder, et al, 1997)

Scaner

Scaner merupakan suatu alat yang dimaksudkan untuk memperjelas suatu spot pada saat

mengamati, bisanya pada alat ini disertai dengan lampu baik itu lampu UV atau yang lainya

yang dapat memendarkan cahaya dari spot-spot analit setelah disemprot dengan larutan

penampak noda (derivating agent), berikut beberapa gambar alat scaner :

Gambar. UV Scaner 254 nm dan 366 nm

Detektor

Detektor yang bisa di gunakan pada analisis kromatografi planar adalah adalah detektor

photon, diamana sifat dari analit dapat dibuat atau di derivatisasi dengan senyawa yang

membuat senyawa tersebut berflourisensi dan dapat di deteksi atau di scanning dengan

detektor yang sesuai.

Detektor yang umum digunakan dalah detektor UV atau flourisensi detektor berikut gambar

dari beberapa detektor yang terkait erat dengan kromatografi planar: beberpa UV detektor

yang bisa digunakan dalam deteksi spot hasil kromatogram dari planar kromatografi.

1. Silicon Photodiodes

2. Germanium Photodiodes

3. InGaAs Photodiodes

4. Extended InGaAs Photodiodes

Prinsip kerjanya secara umum adalah lempeng yang terdapat spot didalamnya dikenai sinar

dan nanti akan berflourisensi kemudian flourisensinya akan ditangkap oleh detektor

kemudian intensitasnya akan terukur dan akan sebanding dengan kadarnya.

Gambar. UV- detektor 254 nm dan 366 nm

d) Alat Penderivatisasi

Alat ini dilmaksudkan untuk membuat senyawa yang terdapat pada spot dapat terdeteksi

yaitu dengan cara derivatisasi selain dengan cara disemprotkan dengan sprayer bisanya alat

ini di gunakan untuk fosforscent dan ini mengandung fosforscent anorganik yaitu spot yang

terbentuk di celupkan pada media yang mengandung zat penderivasi.

Gambar. Derivating tool

e)

f) Spray Cabinet

Alat ini untuk sebagai ruang untuk menyemprot spot dengan zat penampak noda/zat

penderivatisasi

Gambar. Spray Kabinet

g) Lempeng heater

Alat ini untuk memanaskan lempeng sebelum dipakai atau untuk mengaktifkan dengan cara

menguapkan uap air yang dikandungnya selain dengan menggunakan oven biasa:

Gambar. Plate

h) Lempeng Coater

Alat ini dapat di gunakan jika kita akan membuat sendiri lapisan penyerap yang akan

dilapiskan pada penunjang kaca atau plastik atau alumunium.

Gambar. Coater Plate

kacaAlumunium/plastik

i) Pipet sampel/drods/Penetes Sampel

Adalah suatu kapiler dengan ukuran tertentu yang berguna untuk meneteskan sampel

pada lempeng atau fase diam, berikut dapat dilihat alah satunya ;

Gambar. Droper/Penetes Sampel

C. KEUNTUNGAN UTAMA DARI TLC DAN HPTLC:

analisis minyak atau lemak dan matriks sampel kompleks lainnya mungkin

dilakukan tanpa preparasi sampel.

sampel ganda (hingga 40) dapat dianalisis sekaligus dalam kondisi identik.

Metode pemisahan yang lebih cepat dan lebih murah dimungkinkan  tanpa 

memerlukan instrumentasi yang canggih.

Pemisahan 2-dimensi yang mudah dengan menggunakan dua fase gerak yang

berbeda dalam dua arah yang berbeda memberikan kualitas pemisahan yang unik.

Oleh karena material bahan baku yang identik ini tersedia untuk fase stationer TLC dan HPLC,

menghasilkan selektivitas kromatografi yang ekivalen untuk kedua teknik tersebut (lihat Gambar

1)

 

 Fig. 1: Pemisahan TLC (kiri) dan pemisahan HPLC (kanan)

Thin Layer chromatography (TLC) merupakan salah satu teknik pemisahan yang paling

serbaguna dalam industri farmasi, makanan, dan kosmetik serta digunakan juga untuk

pengembangan metode cepat HPLC

Pelat HPTLC dari Merck menawarkan kecepatan yang lebih cepat dan sensitivitas yang lebih

tinggi dibandingkan TLC klasik dan memberikan pemisahan yang sangat baik. Menggunakan

perlengkapan instrumental, pelat HPTLC memungkinkan kromatografi lapis tipis kuantitatif

yang modern yang dapat dibandingkan dengan performa HPLC.(lihat Gambar. 1 dan 2). 

Pemisahan menggunakan HPTLC dan HPLC memperlihatkan hasil yang sama, jika kedua teknik

digunakan pada kondisi kromatografik yang sama.

Contoh:

sorben yang identik

fase gerak yang sama

Pemisahan sampel sebenarnya (Lettuce) menggunakan TLC dan HPLC pada kondisi

kromatografik yang sama

HPTLC HPLC

Gambar 2: pemisahan lettuce (sampel sebenarnya) HPTLC dan HPLC pada

kondisi kromatografik [ Dinokap (1), Paration (2), Iprodon (3),Matilparation

(4), Metobromuron (5) dan Dimetoat (6)]

D. METODE

PERSIAPAN LARUTAN STOK

Pembuatan larutan standar kuersetin

Sebuah larutan stok standar kuersetin (20 mg / mL) disiapkan dengan memindahkan 2 mg

quercetin, Ditimbang akurat, ke dalam labu volumetrik 100 mL, dilarutkan dalam 50 mL

metanol. kemudian disonikasi selama 10 menit dan volume akhir dari solusi dibuat hingga 100

ml.

PERSIAPAN LARUTAN SAMPEL

Ditimbang Akurat 250 mg hydroalcoholic kering ekstrak N. stellata dipindahkan ke mL 100 labu

ukur dilarutkan dalam 80 mL metanol. kemudian disonikasi selama 10 menit dan isi termos

disaring melalui kertas Whatman NO 1. Volume akhir larutan dibuat sampai 100 mL dengan

metanol untuk mendapatkan larutan stok yang mengandung kadar 2,50 mg / mL.

INSTRUMENTASI DAN KROMATOGRAFI

HPTLC dilakukan pada 20 cm × 10 cm piring aluminium didukung dilapisi dengan silika gel

60F254. Larutan standar kuersetin dan larutan sampel yang diterapkan pada piring sebagai band

8.0 mm lebar, 30,0 mm terpisah, dan 10,0 mm dari bawah tepi lempeng kromatografi yang sama

dengan menggunakan sebuah Camag (Muttenz, Swiss) Linomat V sampel aplikator dilengkapi

dengan 100-uL Hamilton (USA) jarum suntik. Ascending pengembangan untuk jarak 80 mm

dilakukan pada suhu kamar (28 ± 2 ° C), dengan toluena: etil asetat: asam format, 5: 4: 0,2 (v /

v / v), sebagaimana fase gerak, dalam Chamber twin melalui kaca Camag yang sebelumnya

jenuh dengan fasa uap bebas selama 20 min. Setelah pengembangan, lempeng dikeringkan

dengan pengering dan kemudian dipindai di panjang gelombang 380 nm dengan TLC Scanner

Camag dengan software WINCAT, menggunakan lampu deuterium. Metode ini divalidasi sesuai

dengan ICH guidelines11.

KURVA KALIBRASI KUERSETIN

Larutan stok standar kuersetin (20μg/mL) adalah disiapkan dalam metanol. volume larutan stok

2, 4, 6, 8 dan 10 uL, yang terlihat pada pelat TLC diperoleh konsentrasi 40, 80, 120, 160, 180

dan 200 ng / spot quercetin, masing-masing. Data dari luas puncak diplot terhadap konsentrasi

yang sesuai (Gambar 1) \

METODE VALIDASI

Ketelitian Instrumental presisi, intra-assay presisi, dan presisi menengah metode ditentukan.

Presisi Instrumental diukur dengan meniru (n = 10) penerapan larutan standar quercetin yang

sama (Konsentrasi 80 ng). Presisi uji Intra-assay adalah dievaluasi oleh analisis dari tiga aplikasi

mereplikasi baru disiapkan standar solusi yang sama konsentrasi, pada hari yang sama. Presisi

menengah dievaluasi dengan analisis dari tiga aplikasi meniru larutan standar konsentrasi yang

sama pada tiga yang berbeda hari.

KETAHANAN METODE

Dengan memperkenalkan perubahan kecil dalam fase gerak komposisi, volume fase gerak dan

durasi saturasi fase gerak, efek pada hasilnya diperiksa. Ketahanan metode ini dilakukan dalam

tiga replikasi pada tingkat konsentrasi 160 ng / tempat dan R.S.D% luas puncak dihitung.

Kekasaran Sebuah solusi konsentrasi 160 tempat ng / disiapkan dan dianalisis pada hari 0 dan

setelah 6, 12, 24, 48 dan 72 jam. Data dirawat karena% R.S.D. untuk menilai kekasaran dari

Metode. Batas Deteksi dan Batas Penghitungan

Batas deteksi (LOD) dan (LOQ) ditentukan sebagai jumlah sinyal-to-noise rasio masing-masing

adalah 3:1 dan 10:1.

PEMULIHAN STUDI

Keakuratan metode dibuktikan dengan melakukan percobaan recovery pada tiga tingkat yang

berbeda menggunakan metode penambahan standar. Pada 2 uL (2,50 mg /mL) dari sampel N.

stellata, jumlah yang telah diketahui pada quercetin standar (80, 120 dan 160 ng per spot) adalah

ditambahkan oleh spiking. Nilai-nilai persen recovery dan nilai persen rata-rata recovery untuk

kuersetin dihitung, yang terlihat pada Tabel 2.

KEKHUSUSAN

Kekhasan dari metode ini dipastikan dengan menganalisis obat standar dan ekstrak. Tempat

untuk quercetin dalam sampel dikonfirmasi dengan membandingkan nilai Rf dan tempat

spektrum dengan standar. Kemurnian puncak quercetin dinilai dengan membandingkan spektra

pada tiga tingkat yang berbeda, yaitu puncak awal, puncak maksimal dan posisi akhir puncak

tempat.

E. PENGGUNAAN

Analisis makanan

Industri farmasi

Aplikasi klinik

Aplikasi industry

Forensik

Kosmetik

F. DAFTAR PUSTAKA

1. Chamberlain J, 1995, The Analysis Drugs in Biological Fluids, Second Edition, CRC

press, NewYork, P 105-117..

2. Day. R.A, and Underwood, A.L. 1996. Analisis Kimia Kuantitatif, Edisi kelima,

Erlangga press, Jakarta. P 551-554

3. Sherma Joseph, 2004, Planar Chromatography. Department of Chemistry, Lafayette

College, Easton, Pennsylvania 18042, Analytical Chemistry, Vol. 76, No. 12, June

15,

4. Snyder, R.L., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC method

development, 2nd edition, p.686-697, John Wiley & Son, Inc., New York

5. Suherman, M. Mulja. 1995. Analisis Instrument. Airlangga University Press, Surabaya,

P 223-234.

6. Sachin U. Rakesh,dkk. 2009. HPTLC method for quantitative determination ofquercetin in hydroalcoholic extract of dried flower of nymphaea stellata willd. ISSN : 0974-4290. Govt. College of Pharmacy, Vidyanagar. India