ik lab biologi tanah ub 11_7 agustus 2012
TRANSCRIPT
INSTRUKSI KERJA LABORATORIUM BIOLOGI TANAH
JURUSAN TANAH FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG
2012
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
i
INSTRUKSI KERJA LABORATORIUM BIOLOGI TANAH
JURUSAN TANAH FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
Kode Dokumen : 0040206200
Revisi : 3
Tanggal : 08 Oktober 2012
Diajukan oleh : Tim Unit Jaminan Mutu
Ketua
ttd
Dr.Ir. Sugeng Prijono, MS
Dikendalikan Oleh : Sekretaris Jurusan
ttd
Dr.Ir. Sugeng Prijono, SU.
Disetujui oleh : Ketua Jurusan
ttd
Prof.Dr.Ir. Zaenal Kusuma, SU
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
ii
DAFTAR ISI
Halaman
LEMBAR PENGESAHAN………………………………………. i
DAFTAR ISI …………………………………………………….. ii
DAFTAR GAMBAR……………………………………………… iii
I. ANALISA LIGNIN………………………………………… 1
II. ANALISA POLIPHENOLIC….……………………..….. 3
III. FRAKSIONASI BOT METODE POM………………… 6
IV. PENGAMATAN DAN IDENTIFIKASI
MAKROFAUNA TANAH: CACING TANAH DAN RAYAP…………………………………………………….…
8
V. PENGAMATAN MIKROORGANISME TANAH METODE SLIDE CONTACT……………………..…….
12
VI. ISOLASI MIKROBIA DARI LINGKUNGAN……….. 15
VII. PENGAMATAN MIKORIZA…………………………….. 20
VIII.ISOLASI DAN PEMURNIAN RHIZOBIUM…...…… 31
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
iii
DAFTAR GAMBAR
No Uraian Halaman
Gambar 1. Skema prosedur fraksionasi bahan
organik berdasarkan ukuran partikel
(Particulate Organic Matter = POM)……….
7 Gambar 2 Posisi Pengambilan Sampel Cacing Tanah
dan Rayap di Lapangan…………………………
9 Gambar 3 Morfologi Ekto, Endo, dan Ektendo
Mikoriza………………………………………………
22
Gambar 4 Karakteristik Morfologi Spora Genus Gigaspora……………………………………………
23
Gambar 5 Sistem Perakaran yang Terinfeksi oleh
Mikoriza Menunjukkan Eksternal Hifa……..
24 Gambar 6 Koloni VAM Masuk Melalui Titik E dan
Menyebar ke dalam Jaringan Akar………….
24
Gambar 7 Karakteristik Penciri Morfologi Spora Genus Glomus……………………………………..
26
Gambar 8 Karakteristik Morfologi Spora Genus
Scutellospora……………………………………….
27 Gambar 9 Karakteristik Morfologi Spora Genus
Entrohospora……………………………………….
28
Gambar 10 Karakteristik Morfologi Spora Genus Sclerocystis………………………………………….
28
Gambar 11 Karakteristik Morfologi Spora Genus Acaulospora…………………………………………
29
Gambar 12 Bintil Akar pada Tanaman Kedelai dan
Irisan Melintang Bintil Akar……………………
33
Gambar 13 Arah Penggoresan Jarum Ose, pengolesan suspensi bintil akar pada media MEK +
Kongo Red (A) dan penggoresan jarum isolasi (B)…………………………………………….
36
Gambar 14 Rhizobium sp. pada agar YEMA……………. 37
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
1
ANALISA LIGNIN (0040207501)
II.
1. Ruang Lingkup
Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang
akan mengukur kualitas bahan organik menggunakan parameter konsentrasi Lignin.
2. Alat dan Bahan A. Bahan pereaksi
1. Acid detergent solution
8 g CTAB ( cetylmethyl-ammonium bromide) dilarutkan dalam 400 ml H2SO4, 0.5 ( larutkan 28 ml H2SO4 pekat p.a ke dalam aquadest sampai mencapai volume 1000
ml), 2. Antifoam solution
2.5 ml silicon antifoam 30% dilarutkan dalam 100 ml aquadest. Silicon antifoam : 30 ml silicon antifoam dilarutkan dalam 100 ml aquadest, dan
3. H2SO4 72% Larutkan 720 ml H2SO4 pekat p.a ke dalam aquadest sampai mencapai volume 1000 ml.
3. Referensi
Prosedur Layanan Analisa Laboratorium dan Panduan Analisa
Biologi Tanah.
4. Definisi
-
5. Uraian Prosedur
1. Timbang 0.5 g contoh tanaman (WI) dan tambahkan 25 ml acid detergent solution dan 1 ml antifoam ke dalam 250 ml botol volumetric,
2. Panaskan sampai T = 150oC selama 1 jam, setelah mendidih (turunkan suhu pada awal terjadinya pembuihan
dan dikocok sambil digoyang untuk beberapa waktu),
I.
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
2
3. Kemudian disaring dalam filter glass crucible ( W2) dan cuci
dengan aceton ( 1 kali saja) dan disusul dengan air panas sampai tidak berwarna,
4. Crucible dan isinya di oven pada T = 105oC selama 24 jam
dan didinginkan dalam desikator dan timbang ( W3), 5. Crucible dan isinya ditempatkan dalam beaker glass dan
tambahkan H2SO4 72% secukupnya sampai setengah dari
volume crucible dan didiamkan selama 3-4 jam, 6. Gunakan vacum pump untuk membilas / menyedot dan
setelah bersih dibilas dengan air panas sampai tidak asam (
tidak berwarna dan tidak berbuih), 7. Crucible dan isi dioven pada T = 105oC selama 24 jam,
dinginkan dan timbang ( W4), sedangkan isinya diabukan
pada T = 500oC untuk waktu 4-5 jam, dinginkan dan timbang ( W5 ).
Perhitungan:
ADF ( % ) = ( W3 – W2) X 100 W1
ADL (%) = (W4 – W5) X 100 W1
Keterangan :
ADF : Acid Detergent Fiber ADL : Acid Detergent Lignin W : Weight (g)
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
3
ANALISA POLIFENOL (0040207502)
III.
1. Ruang Lingkup
Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang akan mengukur kualitas bahan organik menggunakan
parameter konsentrasi polyphenolic.
2. Alat dan Bahan
A. Alat Spectronic T21, Cuvet, Tabung Reaksi, Pipet, Labu Ukur, Beaker Glass 100 ml, Timbangan Digital Mettler, Botol
Semprot, Water Bath dan Kertas Saring Whatman No.42
B. Bahan Pereaksi
1. Methanol 50 % Larutkan 101.01 ml methanol 99% dalam 200 ml aquadest.
2. Sodium Carbonat ( Na2CO3 17%) 25.5 g Na2CO3 dalam 124.5 ml aquadest dilarutkan dalam beaker glass.
3. Sodium tungstate ( Na2WO4) 4. Asam orthophosphoric. 5. Asam phosphomolybdic.
6. Asam tannic. 7. Reagent Folin-Denis
25 g sodium tungstate + 5 g asam phosphomolybdic dan 12.5 asam orthophosphoric dimasukkan ke dalam 250 ml botol volumetrik yang berisi 187.5 ml aquadest.
Kemudian di reflux selama 2 jam dan diencerkan untuk 250 ml dengan menggunakan aquadest.
3. Referensi Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Panduan Analisa Biologi Tanah.
4. Definisi
-
II.
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
4
5. Uraian Prosedur
Membuat Standart: 1. Siapkan 0,1 mg/ml asam tannic. 2. Larutkan 0.01 g asam tannic dalam 100 ml botol volumetrik
dengan aquadest. 3. Pipet 0,1,2,3,4,5 dan 6 ml dari 0.1 mg/ml asam tannic
dimasukkan dalam 50 ml cuvet yang berisi 20 ml aquadest.
4. Tambahkan 2.5 ml reagent Folin- Denis dan 10 ml Na2CO3 17% dan kemudian dibaca dengan spectrophotometer, absorbance 760 nm.
Cara Kerja:
1. Timbang 0.75 g contoh tanaman dan diekstrak dengan 20
ml methanol 50% dalam beaker glass 100 ml kemudian tutup dengan para film atau aluminium foil.
2. Didihkan dalam water bath pada T = 70-80oC selama 1 jam dan hasil ekstraksi disaring dengan kertas saring (Whatman No. 42) dan dibilas dengan menggunakan
methanol 50 % kemudian diencerkan sampai 50 ml dalam botol volumetrik ( konsentrasi = 15 mg/ ml ).
3. Pipet 1 ml hasil ekstraksi ke dalam cuvet 50 ml dan
tambahkan 20 ml aquadest, 2.5 ml reagent Folin Dennis dan 10 ml Na2CO3 ( sodium carbonat 17%), kemudian encerkan sampai 50 ml dengan menggunakan aquadest
dan diamkan selama 20 menit. 4. Baca dengan menggunakan Spectrophotometer,
absorbance 760 nm.
Perhitungan :
1. Carilah persamaan regresi dari larutan standart.
2. Tentukan TAE sampel dan TAE blanko (X) berdasarkan
persamaan regresi diatas.
Keterangan: TEP : Total Extractable polyphenols (mg) TAE : Tannic Acid Equivalent (mg)
W : weight of sample (g)
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
5
Tabel Pengamatan :
A. Tabel Pengamatan
X Y XY X2 Y2
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
∑ =
Catatan : X = konsentrasi larutan standart (mg/ml), Y = absorbance
Sampel Y bacaan TAE sampel
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
6
FRAKSIONASI BAHAN ORGANIK TANAH METODE POM (0040207503)
I.
1. Ruang Lingkup Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang akan mempelajari dinamika karbon dalam tanah, melalui
pemisahan partikel bahan organik tanah berdasarkan distribusi ukuran partikel dengan menggunakan Metode POM (Particulate Organic Matter)
2. Alat dan Bahan
1. Satu set ayakan basah : ukuran kasa 2 mm, 250 μm,
150 μm dan 50 μm.
2. Tanah segar.
3. Na hexametaphosphate (hanya untuk tanah liat).
3. Referensi
Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Panduan Analisa Biologi Tanah.
4. Definisi Fraksi BOT berukuran pasir (5.0 mm – 2.0 mm) biasanya lebih labil daripada BOT berukuran liat dan debu (Tiesen dan
Steward, 1983). Bahan organic tanah yang mempunyai ukuran pasir selanjutnya oleh Cambardella dan Elliot (1992) disebut dengan bahan organic berukuran partikel (particulate organic matter = POM). Prinsip penetapan fraksi BOT berdasarkan ukuran partikel adalah menentukan jumlah absolute dan proporsi relative C
dan N dari partikel organic dalam tanah. Metode penetapan fraksi POM dari TSBF (Okalebo, 1993) adalah metode yang relative cepat, murah dan tidak menimbulkan pencemaran
lingkungan karena hanya menggunakan air. Klasifikasi ukuran partikelnya sedikit berbeda dengan POM dari Cambardella dan Elliot (1992); pada teknik dari TSBF POM adalah fraksi BOT
berukuran 50-250 nm. POM adalah fraksi bahan organic yang
III.
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
7
mudah didekomposisi, oleh karena itu dalam mempelajari
dinamika C fraksi ini sangat penting untuk ditetapkan. Mengingat pentingnya fraksi BOT dalam mempelajari dinamika C di daerah tropis, maka pemilihan teknik penetapan fraksi
BOT yang murah dan cepat dengan hasil yang baik sangat dibutuhkan.
5. Uraian Prosedur a. Ambil 25 g subsample tanah segar kemudian tentukan
kandungan air tanahnya. Bila tanah yang dimiliki adalah
tanah kering udara, maka tanah harus dibasahi terlebih dahulu pada kapasitas lapang selama 1-2 minggu, kemudian tetapkan kadar air tanahnya.
b. Atur ayakan diatas mesin kocok dengan urutan ayakan 2 mm diatas 250 μm, 150 μm, 50 μm, yang terbawah adalah
penampung. c. Timbang 500 g contoh tanah basah (segar) dan letakkan
pada ayakan ukuran kasa 2 mm, pengayakan basah dapat
dimulai. d. Setelah 20 menit ambil semua partikel yang terdapat pada
ayakan 2 mm, 250 μm, 150 μm, dan 50 μm secara
terpisah. e. Keringkan masing-masing fraksi tersebut dalam oven pada
suhu 650C selama 24 jam, timbang berat keringnya dan
tetapkan kandungan C dan N nya. f. Tetapkan juga total C dan N dari total tanah.
Gambar 1. Skema prosedur fraksionasi bahan organic berdasarkan ukuran partikel (Particulate Organic Matter = POM)
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
8
PENGAMATAN DAN IDENTIFIKASI
MAKROFAUNA TANAH : CACING TANAH DAN RAYAP
(0040207504)
1. Ruang Lingkup
Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang akan melakukan pengamatan biodiversitas makrofauna (cacing tanah dan rayap) masing-masing menggunakan
metode monolit yang dimodifikasi oleh BGBD (2005) dan metode transek.
2. ALAT dan BAHAN Alat yang diperlukan meliputi: 1. Cetok,
2. Nampan (4 buah), 3. Pinset serangga, 4. Kuas lukis,
5. Bingkai kuadrat dari besi ukuran 25 x 25 x 10 cm, 6. Frame 50 cm x 50 cm 7. Pensil 2B,
8. Kertas HVS yang telah dipotongi untuk label, dan 9. Botol film.
Bahan: 1. Formalin 4% 2. Ethanol 70%
3. Air bersih 3. REFERENSI
Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Panduan Analisa Biologi Tanah.
4. DEFINISI Fauna tanah berperanan penting dalam mempertahankan: ketersediaan hara (misalnya mikoriza dan rhizobium),
porositas dan infiltrasi air tanah (misalnya cacing tanah). Dengan demikian, laju limpasan permukaan dan erosi bisa dikurangi sehingga produktivitas tanah dan tanaman dapat
IV.
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
9
dipertahankan. Untuk itu pemahaman akan pentingnya peran
fauna tanah dalam proses-proses biologi tanah sangat diperlukan. Metode monolit untuk pengambilan sampel cacing tanah
diadopsi dari prosedur ASB (Swift and Bignell, 2001) yang dimodifikasi (BGBD, 2005). Fungsinya adalah untuk mengkoleksi cacing tanah dan makroarthropoda.
Metode standar untuk pengambilan contoh rayap di lapangan adalah metode transek semi kuantitatif 100 m X 2 m yang bisa disederhanakan menjadi 20 x 2 m. Data yang dihasilkan dari
pengukuran dengan metode semi kuantitatif transek merupakan data kualitatif bukan merupakan nilai mutlak. Namun data ini memiliki tingkat keakuratan tinggi. Metode transek
dideskripsikan pertama kali oleh Jones dan Eggleton (2000).
5. URAIAN PROSEDUR Skema pengambilan contoh makrofauna tanah (cacing tanah dan rayap) dapat dilihat pada Gambar 2.
Keterangan :
Monolit Cacing Tanah dengan ukuran (0,5 x 0,5) m2 diambil pada kedalaman 0-10 cm dan 10-20 cm
Monolit Cacing Tanah dengan ukuran (0,3 x 0,3) m2 diambil pada kedalaman 0-10 cm, 10-20 cm dan 20-30 cm
1. Monolith cacing tanah (0.5x0.5 m2) 2. Transek semi kuantitatif untuk pengambilan contoh rayap
Gambar 2. Posisi Pengambilan Sampel Cacing Tanah dan Rayap dalam satu transek pengamatan di lapangan
5 m
40
m
5 m 5 m 5 m 10
m
10
m
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
10
A. Cara Kerja Pengambilan Sampel Cacing Tanah
dengan Metode Sampling Monolit Pada setiap plot 200 m2 dalam suatu sistem penggunaan lahan ditentukan 4-6 titik monolit cacing tanah. Pada 1 plot
hutan ditentukan 4 monolit cacing tanah yakni 1 monolit berukuran 25 cm x 25 cm x 10 cm dan 3 monolit lainnya berukuran 50 cm x 50 cm x 10 cm (Gambar 2), sedangkan
pada lahan pertanian misalnya perkebunan sawit diambil 6 monolit masing-masing dengan ukuran 50 cm x 50 cm x 10 cm dan jarak antar monolit 5 m. Pengambilan contoh
monolit dilakukan pada lapisan (1) seresah, di atas tanah mineral (2) tanah kedalaman 0-10 cm, (3) tanah kedalaman 10-20 cm, dan (3) tanah kedalaman 20-30 cm.
Semakin banyak monolit yang dibuat dalam plot pengamatan atau transek berukuran (40 x 5) m2 akan
semakin akurat untuk memberikan gambaran sebaran populasi sampel cacing tanah dalam plot yang diamati.
B. Cara Kerja Pemilahan Sampel Cacing Tanah dengan Metode Hand Sortir 1. Lapisan tanah yang diperoleh dari tiap monolit per
lapisan kedalaman dimasukkan ke dalam nampan. 2. Setiap cacing yang ditemukan diambil secara manual
(hand sortir). 3. Cacing tanah tidak langsung dimasukkan ke dalam
ethanol 70% tetapi terlebih dahulu dimasukkan ke dalam nampan yang sudah diisi air. Tujuan perlakukan
ini pertama, untuk menghilang tanah yang menempel pada tubuhnya. Kedua, cacing dimasukkan dalam nampan kedua yang berisi etanol 70 % untuk relaksasi.
Ketiga, cacing dimasukkan dalam formalin 4% selama beberapa detik hingga tubuhnya kaku. Keempat, cacing
tanah siap dimasukkan dalam botol film yang berisi ethanol 70 % dan sudah diberi label.
C. Cara Pengambilan Sampel Rayap 1. Tali sepanjang 20 m ditarik dan dipasang di permukaan
tanah sebagai garis tengah transek (midline of transect). Jaraknya dari sub-plot pengambilan monolit adalah 8 meter. Pemilihan lokasi untuk transek dilakukan dengan mempertimbangkan jarak terhadap
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
11
monolit, dan kemiringan lahan. Transek diletakkan
sejajar kontur. 2. Transek dibagi dalam 4 seksi berukuran 5 x 2 m
(selanjutnya disebut seksi 1, seksi 2, seksi 3, seksi 4).
Tiap seksi dibagi oleh garis tengah transek menjadi 8 sub seksi yaitu S1 kiri dan kanan, S2 kiri dan kanan, S3 kiri dan kanan, S4 kiri dan kanan. Satu orang kolektor
bekerja di satu seksi. 3. Dalam setiap sub seksi digali 6 monolit kecil berukuran
12 x 12 x 10 cm. Pada lima menit pertama, kolektor
menggali monolit 1, tanah dimasukkan ke dalam nampan. Pengambilan contoh rayap dilakukan secara in situ dengan hand sortir.
4. Contoh rayap yang diperoleh, baik dari kasta pekerja maupun prajurit, dimasukkan ke tabung film berisi
etanol 70 % dan diberi label. Kolektor diberi waktu 5 menit untuk menggali, memilah, memilih dan mengkoleksi contoh ke dalam tabung film sekaligus
memberikan label. Setelah lima menit pertama berlalu, kolektor segera pindah ke monolit berikutnya. Sehingga total waktu yang dibutuhkan untuk menyelesaikan
pengambilan contoh pada 6 monolit kecil adalah 30 menit.
5. Selama lima belas menit berikutnya, dilakukan
pengambilan contoh pada lokasi alam kecil (micro sites) yang diperkirakan representatif untuk mendapatkan rayap untuk tiap sub seksi, misalnya:
a. Pada tanah yang terdapat remukan dan sisa-sisa lapukan kayu
b. Posisi samping kayu-kayu mati, tunggul
c. Pada tanah dengan akumulasi humus yang tebal di bawah pohon, dan diantara perakaran.
d. Disamping sarang rayap, gundukan, dan sarang karton, jalan rayap pada pepohonan dan sarang-sarang di atas pohon hingga ketinggian 2 m di atas
permukaan tanah.
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
12
PENGAMATAN MIKROORGANISME TANAH
METODE SLIDE CONTACT (0040207505)
1. Ruang Lingkup Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang akan melakukan pengamatan mikroorganisme dalam tanah
menggunakan metode slide kontak. 2. Alat dan Bahan
1. Tabung reaksi 25 ml untuk pengenceran, 2. Gelas slide yang disterilkan dengan api sebelum digunakan.
3. Larutan Bengal Rose Fenol: larutan 1.0 g Bengal Rose dan 0.01g CaCl2.2H2O dalam 100 ml akua-fenol 5% .
3. Referensi Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Iswandi Anas.1989. Petunjuk Laboratorium, Biologi Tanah dalam Praktek,
Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Bioteknologi Institut Pertanian Bogor.
4. Definisi
Cara slide kontak adalah pengamatan mikroorganisme tanah
yang menempel pada gelas slide yang dibenamkan ke dalam tanah selama beberapa waktu. Tujuan dari cara slide kontak ini adalah untuk mengamati populasi mikroorganisme tanah
dalam keadaan alami. Pemindahan mikroorganisme ke dalam gelas slide memungkinkan pengamatan yang baik karena
menghilangkan kesalahan yang disebabkan oleh adanya partikel tanah. Pembenaman gelas slide dilakukan secara hati-hati ke dalam
tanah, untuk mendapatkan sampel mikroorganisme tanah dilakukan dengan cara menggosokkan bongkah tanah pada permukaan slide tersebut. Pada waktu gelas slide dibenamkan
untuk beberapa waktu di dalam tanah, kelompok organisme yang dapat menempel pada permukaan slide dapat diamati. Bila dikerjakan dengan hati-hati seandainya ada pembentukan
5 v.
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
13
spora maka spora tersebut dapat diusahakan agar tetap utuh.
Demikian pula pengamatan terhadap sifat – sifat koloni, bahan yang digunakan mikroorganisme sebagai sumber energi dan responnya terhadap faktor lingkungan dan sebagainya dapat
dilakukan. Cara ini mempunyai arti yang sangat penting dalam mengamati hubungan penyusunan dan morfologi
mikroorganisme dalam tanah. Pembuatan foto akan sangat berguna dalam penyampaian apa yang diperoleh. Dengan memanfaatkan gelas slide yang berbeda baik dari segi waktu
dan lama inkubasinya, maka urutan proses ekologi dari mikroorganisme dapat diamati dan dipelajari. Metode ini adalah metode kualitatif dan dengan cara ini isolasi
sukar dilakukan. Koloni berkembang sesuai pada tempatnya pada gelas slide. Bila isolasi dan identifikasi lebih lanjut
dikehendaki, hal ini dapat dilakukan akan tetapi tidak semua organisme dapat tumbuh pada media buatan. Pemasukan gelas slide ke dalam tanah akan mengubah keadaan alami
dengan terbentuknya permukaan yang baru untuk kolonisasi, akan tetapi pengaruhnya sukar dievaluasi.
5. Uraian Prosedur 1. Buatlah celah di dalam tanah dengan mengusahakan sedikit
mungkin gangguan pada tanah. Untuk ini dapat digunakan
pisau. 2. Masukkan dengan hati-hati gelas slide dengan arah vertikal,
sampai tersisa kira-kira 1.5 cm dari permukaan tanah.
Tekan kembali tanah ke arah gelas slide. 3. Gelas slide diinkubasi sesuai dengan waktu yang
dikehendaki, biasanya sekitar 1-3 minggu.
4. Bersihkan permukaan gelas slide sebelah atas dari tanah, kemudian tarik gelas slide dari belahan yang tidak
terganggu dengan mengangkat gelas slide tersebut secara hati-hati. Setelah agregat tanah yang menempel pada gelas slide dilepaskan, kering udarakan gelas slide
tersebut. Dengan bantuan aliran air, partikel tanah yang menempel pada permukaan tanah yang tidak terganggu dilepaskan dengan hati-hati sampai hanya ada lapisan tipis
yang tertinggal. Bersihkan permukaan gelas slide pada belahan yang terganggu dengan kain basah yang steril. Lengketkan mikroorganisme tanah pada gelas slide dengan
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
14
membiarkan gelas slide tersebut kering udara dan
panaskan di atas nyala api. 5. Tempatkan gelas slide di atas bejana air yang mendidih dan
basahi selama 6 sampai 10 menit dengan Bengal Rose
Fenol. Bila perlu tambahkan Bengal Rose Fenol agar gelas slide tersebut tidak kering. Buang kelebihan pewarna dengan mencuci gelas slide dengan air sampai tidak ada
pewarna yang tercuci bersama air cucian. 6. Keringkan gelas slide tersebut dan amati gelas slide dengan
menggunakan mikroskop.
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
15
ISOLASI MIKROBIA DARI LINGKUNGAN
(0040207506)
1. Ruang Lingkup Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang akan melakukan isolasi mikrobia dari lingkungan.
2. Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang diperlukan dalam kegiatan pembuatan
media dan sterilisasi secara aseptik yakni Erlenmeyer, cawan petri, kertas payung, plastik wrapping, kapas, benang kasur,
autoklaf, Media TPC sebagai media isolat total mikrobia, Nutrien Agar (NA) sebagai media isolat bakteri, Potato Dextrose Agar (PDA) sebagai media isolat fungi.
Berikut ini alat dan bahan yang diperlukan untuk sterilisasi dengan pembakaran Jarum oose, bunsen, korek api, media padat dalam cawan petri (berisi Na/PDA).
Sedangkan alat dan bahan berikut ini digunakan dalam sterilisasi dengan Panas basah Bertekanan Tinggi (autoklaf): Media PDA dan NA dalam tabung reaksi, cawan petri steril,
kertas payung, kapas, benang kasur dan inkubator. Alat dan bahan yang diperlukan dalam isolasi mikrobia dari lingkungan:
1. Sampel air rendaman bahan kompos. 2. Aquades steril dalam erlenmeyer (45 ml) 3. Aquades steril dalam tabung reaksi (9 ml)
4. Media Nutrien agar (NA) 5. Media Potato Dextrose Agar (PDA)
6. Oose
3. Referensi
Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Panduan Analisa Biologi Tanah.
4. Definisi Mikrobia yang berasal dari lingkungan, berada dalam populasi campuran. Mikrobia di alam sangat jarang berada dalam
VI.
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
16
spesies tunggal. Dalam bidang bioteknologi, ketersediaan
biakan murni sangatlah penting. Selain itu pemeliharaan kemurnian isolat selama penyimpanan juga sangat perlu mendapatkan perhatian, karena berkaitan dengan
didapatkannya produk atau metabolit tertentu dari suatu spesies tunggal yang hanya dapat dipelajari apabila spesies tunggal mikroba terpisah dari populasi campuran. Untuk itu
perlu dilakukan isolasi/pemisahan untuk mendapatkan mikroba biakan murni. Untuk melakukan isolasi mikroba alat-alat yang digunakan
dalam kegiatan di laboratorium harus disterilisasi. Sterilisasi adalah suatu usaha atau tindakan untuk membebaskan alat atau media dari mikroba. Hal ini diperlukan agar mikroba yang
ingin ditumbuhkan, diamati dan diisolasi terbebas dari mikroba lain. Suatu alat atau bahan dikatakan steril bila alat atau
bahan terbebas dari mikroba, baik dalam bentuk sel vegetatif maupun spora. Dengan kata lain dalam bahan dan alat yang akan digunakan tidak didapatkan mikroba yang tidak
diharapkan kehadirannya, baik yang menggangu atau merusak media. Sterilisasi terdiri dari beberapa cara. Pemilihan cara sterilisasi ditentukan berdasarkan sifat alat
atau bahan yang akan disterilisasi dan tujuan sterilisasi. Bekerja dengan mikroorganisme membutuhkan teknis aseptis untuk mencegah ataupun mengurangi kontaminasi yang tidak
diinginkan, karena setiap benda yang digunakan maupun pekerja dilaboratorium dapat menjadi kontaminasi.
5. Uraian Prosedur 1. Prosedur umum yang harus diperhatikan dalam teknik
aseptis yakni :
a. Disinfektan area kerja. Meja yang akan digunakan terlebih dahulu diberi disinfektan untuk membunuh
mikroorganisme yang ada. b. Jarum oose. Pemindahan mikroorganisme dari kultur
cair maupun padat ke medium lain membutuhkan jarum
oose. Sterilisasi dari jarum oose ini dengan cara membakar jarum tersebut dengan api bunsen hingga berwarna merah. Sterilisasi ini dilakukan sebelum
maupun setelah jarum digunakan. c. Mulut tabung. Sterilisasi pada mulut tabung reaksi atau
erlenmeyer dapat dilakukan dengan membakar mulut
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
17
tabung setelah tutup kapas dibuka dan sesaat sebelum
menutup kembali. d. Cawan petri. Sebelum cawan petri dibuka untuk
melakukan inokukasi maupun setelah ditutup, tepi
cawan petri didekat di api bunsen. Selama inokulasi, bagian cawan petri yang terbuka, didekatkan ke api bunsen untuk mencegah kontaminasi mikroba yang
berasal dari udara.
2. Prosedur Sterilisasi
A. Pembuatan Media dengan sterilisasi secara Aseptik Cara kerja:
a) Media TPC, Nutrien Agar dan Potato Dextrose Agar
ditimbang masing-masing 2 gram. b) Masing-masing media dilarutkan dalam aquades 100
ml. c) Dilarutkan sampai mendidih. d) Masukkan dalam erlenmeyer dan ditutup dengan
kapas. e) Semua bahan dan alat dimasukkan dalam autoklaf
selama 15 menit dengan tekanan 1 atmosfir, dan
dengan suhu 1210C. B. Sterilisasi dengan pembakaran Cara kerja:
a) Nyalakan lampu bunsen, atur nyala api secara maksimal.
b) Ambil jarum oose, bakar mulai dari bagian pangkal
kawat oose secara perlahan menuju ujung kawat jarum oose. Pembakaran jarum oose ini dilakukan sampai kawatnya merah membara.
c) Goreskan masing-masing jarum oose tersebut pada permukaan media padat dalam cawan petri.
d) Inkubasi media tersebut pada 300C selam 48 jam. e) Amati mikroba yang tumbuh.
C. Sterilisasi dengan Panas Basah Bertekanan Tinggi
(autoklaf) Cara Kerja: 1. Tutup tabung reaksi yang berisi media dengan kapas,
beberapa tabung diikat jadi satu dan bagian tutupnya dibungkus dengan kertas payung. Sisakan satu tabung untuk tidak disterilkan.
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
18
2. Isi autoklaf dengan aquades sampai permukaan air
dibawah ansang autoklaf. 3. Masukkan semua alat dan bahan kedalam autoklaf. 4. Tutup autoklaf dan kencangkan setiap mur pada
penutupnya sampai kencang. 5. buka klep pada pengatur tekanan uap air, dan
biarkan sampai mendidih.
6. Tutup klep tersebut setelah air mendidih dan media disterilkan selama 15 menit pada suhu 1210C dan tekanan 1 atmosfir.
7. Setelah selesai sterilisasi maka matikan autoklaf dan tunggu sampai dingin.
8. Buka autoklaf dan tunggu sampai media agak dingin
(450C). 9. Tuangkan media (PDA dan NA) pada cawan petri
steril. 10. Inkubasi media tersebut selama 48 jam dengan
suhu 380C.
11. Amati pertumbuhan mikroba.
3. Isolasi Mikrobia dari Lingkungan
Teknik isolasi/pemisahan dilakukan dengan berbagai cara, antara lain: melakukan pengenceran berseri dilanjutkan dengan mebiakkan pada media yang sesuai yaitu dengan
metode cawan tung (pour plate) dan cawan gores (streak plate) Cara Kerja :
1. Pembuatan Seri Pengenceran Bahan yang akan dijadikan sebagai bahan pembuatan isolat merupakan air rendaman yang berasal dari bahan
kompos kampus yang telah diinkubasi kemudian direndam selama 7 hari, diambil sebanyak 5 ml
kemudian secara aseptis masukkan ke dalam 45 ml aquades steril. Kemudian dilakukan homogenitas dengan memvortek sampel. Sampel yang telah
homogen ini disebut dengan pengenceran 10-1. Dari sampel ini diambil 0,1 ml dan dimasukkan kedalam cawan Petri steril dan ditambahkan dengan media yang
sesuai. Dari pengenceran 10-1 diambil 1 ml dan secara aseptis dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi 9 ml aquades steril dan dihomogenasi dengan vortek.
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
19
Pengenceran ini disebut dengan pengenceran 10-2. Dari
pengenceran ini diambil 1 ml sampel untuk dimasukkan pada tabung reaksi berisi aquades berikutnya. Dan 0,1ml dimasukkan kedalam cawan petri steril. Dengan
cara yang sama akan didapatkan pengenceran 10-3 dan seterusnya sampai pada pengenceran 10-6.
2. Metode Cawan Tuang (pour plate) Masing –masing pengenceran berseri tersebut, diambil 0,1 ml sampel dan dimasukkan dalam cawan petri steril.
Untuk mengisolasi bakteri maka ditambahkan dengan media Nutrien Agar, sedangkan untuk mengisolasi jamur ditambahkan media Potato Dextrose Agar.
Inkubasi dilakukan pada suhu kamar, untuk bakteri selama 24 jam sedangkan untuk jamur dilakukan
inkubasi selama 3 x 24 jam.
3. Metode Cawan Gores (steak plate)
Media Nutrien Agar dan Potato Dextrose agar dituangkan secara aseptis kedalam cawan petri steril. Biarkan memadat. Setelah media memadat, sampel dari
pengenceran berseri diambil dengan menggunakan oose dan dilakukan teknik penggoresan. Sampel yang digores cukup satu oose. Sebelum berpindah dari satu
kuadran ke kuadran berikutnya oose disterilkan terlebih dahulu, selanjutnya penggoresan dilanjutkan kembali . Dua metode ini dilakukan secara bergantian agar dapat
diketahui metode mana yang dapat menghasikan banyak bakteri.
4. Penyimpanan Biakan Murni Biakan murni (isolat) yang diperoleh dari tiga tahap,
selanjutnya dapat disimpan pada jangka waktu yang lama, dengan cara memindahkan kedalam media agar miring (slant agar) yang mengandung media yang
sesuai (Nutrien agar atau Potato Dextrose agar).
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
20
PENGAMATAN MIKORIZA
(0040207507)
1. Ruang dan Lingkup Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang akan mempelajari dan mengamati mikoriza.
2. Alat dan Bahan 2.1 Koleksi mikoriza di lapangan
- Bor tanah, - Plastik, - Spidol permanen dan
- Cooling box.
2.2 Pengambilan spora Mikoriza dengan Wet Sieving
2.3 Identifikasi Spora - Mikroskop - Cawan Petri
- Aquadest
2.4 Perhitungan persentase infeksi mikoriza - Mikroskop, - Beaker glass, - Petridish,
- Tanaman dan tanah yang diamati, - KOH 10%, HCl 2% dan Trypan blue 0.05% dalam
laktofenol.
1. Pisau 7. Cawan petri
2. Kantong Plastik 8. Contoh Tanah
3. Blender tanah 9. Aquadest
4. Penyemprot 10. Mikroskop
5. Tabung silinder 11. Air gula konsentrasi 60%
6. Saringan bersusun (diameter kisi 710 µm, 250 µm, 105 µm dan 53 µm)
VII.
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
21
3. Referensi
Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Panduan Analisa Biologi Tanah.
4. Definisi
Mikroorganisme yang hidup dalam tanah dikenal dalam beberapa kelompok, yaitu kelompok patogen, non-patogen;
parasit, non-parasit; saprofit; dan epifit, dengan berbagai macam bentuk interaksi yang terjadi antara mikro organisme
itu sendiri atau dengan makro organisme (tumbuhan tingkat tinggi). Salah satu mikroorganisme menguntungkan yang berasosiasi
(bersimbiosis) dengan akar tanaman yaitu mikoriza (Myches = jamur, Rhiza = akar), yang berperanan penting dalam meningkatkan ketersediaan dan serapan P oleh tanaman.
Manfaat utama yang didapat dari adanya simbiosis tersebut adalah saling mendukung dalam memenuhi kebutuhan hidupnya. Jamur (myches) membutuhkan karbohidrat yang
dapat diperoleh dari tanaman inang, sementara tanaman memperoleh hara P dalam jumlah yang lebih banyak. Jamur dibedakan menjadi dua kelompok besar yaitu jamur
yang hidup di permukaan akar (ekto-mikoriza) dan yang hidup di dalam korteks akar (endo-mikoriza) yang juga dikenal sebagai Vesicular-Arbuscular Mycorhiza (VAM). Jamur memiliki
hypha atau miselium yang menembus jauh ke luar akar yang sangat bermanfaat untuk meningkatkan serapan P oleh tanaman inangnya. Berdasarkan pada morfologi sporanya,
VAM dibagi dalam enam genus yaitu : Glomus, Gigaspora, Acaulospora, Sclerocystis dan Scutellospora, Entrophospora.
Tipe-tipe mikoriza yang dikenal ada 3 (Gambar 3): Ektomikoriza, strukturnya terdiri dari selimut miselium yang menyelimuti akar yang sel korteksnya membesar dan hifa
cendawan yang masuk ke dalam ruang interselluler. Endomikoriza, strukturnya tidak membentuk selimut dengan hifa yang menginvasi sel korteks akar tanpa mematikannya.
Ektendomikoriza, strukturnya antara endo dan ektomikoriza.
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
22
Gambar 3. Morfologi Ekto, Endo, dan Ektendo Mikoriza
Jamur berkembang biak dengan jalan membentuk spora. Spora jamur yang ditemukan di dalam tanah dapat dipakai
sebagai salah satu indikator keberadaan mikoriza dalam suatu zone perakaran. Jumlah spora yang terbentuk dapat pula
digunakan sebagai indikasi keberadaan mikoriza dan pengenalan terhadap jenis mikoriza yang ada. Pengenalan lebih jauh dan mendalam adalah dengan mengamati bentuk,
ukuran, ornamen, ketebalan dan jumlah dinding spora serta warnanya (DeLa Cruz, 1989). Vesicular-Arbuscular Mycorhiza (VAM) merupakan
Zygomycetes yang berasal dari order Glomales. Di dunia berhasil diidentifikasi 150 spesies fungi yang berasosiasi dengan 70 % Angiosperm. Pengelompokan VAM secara
taksonomi menurut Morton dan Benny (1990) adalah sebagai berikut: ORDER
o SUBORDER Family
Genus
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
23
GLOMALES
o GIGASPORINAE Gigasporaceae
Gigaspora Scutellospora
o GLOMINEAE
Glomaceae Glomus Sclerocystis
Acaulosporaceae Acaulospora Entrophospora
Guna mengetahui peran mikoriza dalam meningkatkan serapan P oleh akar tanaman, maka diperlukan perhitungan tingkat infeksi mikoriza. Perhitungan persentase infeksi
dilakukan dengan metode yang dikembangkan oleh Nemec (1982), yaitu dengan pewarnaan akar tanaman yang terinfeksi mikoriza dan pengamatan di bawah mikroskop (Gambar 4, 5
dan 6).
Gambar 4. Karakteristik Morfologi Spora Genus Gigaspora
a. spora bergerombol, bentuk spora bulat hingga bulat telur
b. spora mikoriza dalam jaringan sel akar tanaman
A B
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
24
Gambar 5. Sistem Perakaran yang Terinfeksi oleh Mikoriza Menunjukkan Eksternal Hifa (yang ditunjukkan
dengan tanda panah) dengan Spora (S) yang Dihasilkan oleh Glomus mossae.
Gambar 6. Koloni VAM Masuk Melalui Titik E dan Menyebar ke dalam Jaringan Akar
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
25
5. Uraian Prosedur
5.1 Prosedur untuk kegiatan koleksi Mikoriza di lapangan
Cara Kerja :
a. Pilih jenis tanaman yang akan diambil contohnya, sebaiknya dilakukan pada musim penghujan. Untuk pengambilan contoh spora sebaiknya dilakukan pada
musim kemarau. b. Pegunakan bor tanah untuk mengambil contoh tanah.
Contoh tanah diambil pada jarak 0.5 m dan 1.0 m dari
batang tanaman, pada kedalaman 0-10, 10-20 dan 20-40 cm. Contoh tanah diambil sebanyak 200-250 g.
c. Masukkan contoh ke dalam kantong plastik, beri label
yang jelas dan masukkan ke dalam kotak es (cooling box).
5.2 Pengambilan contoh spora mikoriza dengan cara
pengayakan basah (Wet Sieving)
Cara Kerja : a. Ambil contoh tanah pada rizosfer (daerah perakaran)
tanaman semusim sebanyak 50 g, letakkan ke dalam
kantong plastik. b. Ambil 50 g contoh tanah, campur dengan 400 ml
aquadest untuk membuat suspensi dengan cara
diblender. c. Tuang suspensi tanah tersebut ke dalam saringan
bersusun (ukuran lubang 2 mm, 500 µm, 45 µm).
d. Bagian tanah yang tertinggal pada saringan paling atas hanya kerikil, pasir dan partikel-partikel organik besar. Ambillah saringan terbawah. Bilaslah dengan air kran
hingga yang keluar dari saringan adalah air yang jernih.
e. Endapan tanah halus yang masih tertinggal dalam saringan 45 µm dimasukkan dalam gelas beker sambil dibilas dengan aquades hingga mencapai 200 ml; aduk
dengan pengaduk kaca dantuang secara merata pada 12 tabung reaksi yang bisa untuk sentrifusi.
f. Tambahkan larutan gula 60 % kurang lebih 10 ml.
g. Sentrifus contoh tersebut selama 2 menit dengan kecepatan 2700 rpm.
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
26
h. Ambil bagian teratas (bening) yang merupakan
kumpulan spora VAM dengan menggunakan pipet isap, saring dan letakkan pada cawan petri, tambahkan sedikit aquadest. Amati spora mikoriza menggunakan
mikroskop.
5.3 Identifikasi Spora
Langkah-langkah dalam identifikasi spora adalah sebagai berikut: a. Siapkan mikroskop,
b. Letakkan cawan petri yang sudah diberi sedikit aquadest dan diberi spora mikoriza, dan
c. Amatilah dengan mikroskop dan cocokkan dengan
gambar pada kunci identifikasi untuk spora VAM.
Gambar 7. Karakteristik Penciri Morfologi Spora Genus Glomus
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
27
Keterangan:
A. Spora mikoriza dari genus Glomus yang berwarna putih B. Spesies Glomus clarum memiliki inner layer di bagian dalam dinding
sporanya (yang ditunjukkan dengan anak panah)
C. Sporocarp dari Glomus invermaium yang sudah mati sering kita jumpai di dalam lapisan tanah,
D. Spora Glomus invermaium yang masih hidup yang diambil dari dalam pot biakan
Gambar 8. Karakteristik Morfologi Spora Genus Scutellospora
Keterangan: A. Spora Scutellospora berwarna pputih yang didalamnya
terdapat bakal benih yang terlindung dalam lapisan
perlindungan yang kokoh B. Spora dari Scutellospora reticulata
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
28
Gambar 9. Karakteristik Morfologi Spora Genus Entrohospora
Gambar 10. Karakteristik Morfologi Spora Genus Sclerocystis
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
29
Gambar 11. Karakteristik Morfologi Spora Genus Acaulospora Keterangan: A. Spora Acaulospora memiliki lubang yang menembus dinding
sel bagian luar dan dalam; diamati dengan reagen Melzer B. Spora Acaulospora memiliki beberapa lapisan dinding sel
(ditunjukkan oleh tanda panah); diamati dengan
menggunakan reagen Melzer
5.4 Perhitungan Persentase Infeksi Mikoriza
Cara Kerja : a. Cuci contoh akar tanaman dengan bersih untuk
melepaskan semua kotoran dan misellium luar.
b. Rendam dalam KOH 10% pada suhu 90oC selama 1-2 jam.
c. Bilas contoh tersebut dengan air sebanyak 4 kali, untuk
menghilangkan kelebihan KOH yang menempel. d. Masukkan ke dalam HCl 2% selama 2 menit.
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
30
e. Tuangkan asam (dipisahkan dari akar) dan tambahkan
zat pewarna (0.05 % trypan blue dalam laktofenol). f. Rebus akar dalam zat pewarna tersebut selama 3 menit. g. Tuangkan (pisahkan) kembali pewarna dan laktofenol,
biarkan semalam. h. Periksa melalui mikroskop dengan meletakkan akar
yang telah diberi warna ke dalam gelas preparat.
Bulatan-bulatan berwarna gelap (biru jika digunakan trypan blue dan merah jika digunakan acid fuchsin) adalah vesikel yang saling bersambungan satu sama
lain, atau misellium-misellium yang beda warnanya dari sel-sel akar atau arbuskular.
Perhitungan persentase infeksi :
% infeksi= %100
diamatiyangakar
terinveksiyangakar
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
31
ISOLASI DAN PEMURNIAN RHIZOBIUM
(0040207508)
1. Ruang Lingkup Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang akan melakukan kegiatan isolasi dan pemurnian Rhizobium.
2. Alat dan Bahan
2.1 Isolasi Bintil Akar
Alat dan bahan yang diperlukan untuk kegiatan ini meliputi:
- garpu tanah - cutter - botol film
- alat tulis - gunting - silika gell
- kertas label 2.2 Isolasi Rhizobium
Berikut ini alat-alat yang perlu disiapkan sebelum
memulai kegiatan isolasi Rhizobium : - Autoklave - Cawan petri
- Pengaduk - Spatula - Timbangan
- Jarum ose - Kotak transfer
- Bunsen - Vial yang dapat diautoklave - Hot plate
- Mortar - Cutter/gunting - Kertas label
- Erlenmeyer 500 ml - Tabung reaksi
VIII.
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
32
Bahan yang diperlukan pada tahap kegiatan ini meliputi : a) Bintil akar, b) Bahan media Yeast Extract Mannitol Agar,
c) K2HPO4 0.5 g d) MgSO47H2O 0.2 g e) NaCl 0.1 g
f) Mannitol 10 g g) Air ragi 100 ml h) Air destilata 900 ml
i) Agar bacto 15 g j) CaCO3 0.3 g k) Kongo red 10 ml (250 mg dilarutkan dalam 100 ml air
destilata) l) Bahan Air Ragi
- Ragi kue 100 g - Air dingin yang didiamkan 1-2 jam
m) Bahan Sterilisasi Nodul : H2O2 3-5 %
3. Referensi
Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Panduan Analisa
Biologi Tanah. 4. Definisi
Bintil akar pada tanaman leguminosa merupakan petunjuk adanya simbiosis antara akar tanaman dengan bakteri bintil akar (Rhizobium sp.). Fungsi dari bintil akar ini adalah untuk
menambat nitrogen bebas dari atmosfer (rongga udara tanah). Isolasi bakteri Rhizobium sp. dilakukan dengan menggunakan tanah di daerah perakaran tanaman legum atau
dengan menggunakan bintil akar. Namun isolasi dengan menggunakan bintil akar lebih praktis dan lebih cepat bila
dibandingkan dengan isolasi dari tanah. Bintil akar seringkali harus diambil dari lokasi yang jauh dari laboratorium, untuk itu bintil akar harus mendapatkan perlakuan khusus agar bakteri
di dalamnya tidak mati. Berikut ini diuraikan tentang teknik koleksi bintil akar. Isolasi bakteri Rhizobium dilakukan pertama kali oleh
Beijerinck pada tahun 1888 dari bintil akar legum. Sampai saat ini sudah banyak diisolasi bakteri Rhizobium dari berbagai jenis legum dari berbagai tempat di seluruh dunia. Di dalam
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
33
bintil akar tidak hanya terdapat satu galur bakteri Rhizobium
saja, mungkin dua atau lebih galur hidup bersama-sama di dalam satu bintil akar. Galur Rhizobium. pada suatu tempat mungkin tidak terdapat di tempat lain. Dengan isolasi dan
pemurnian ini diharapkan dapat diperoleh galur-galur Rhizobium yang murni, efektif dan dapat di pindahkan dari satu tempat ke tempat lain dengan prektis dan biaya murah.
Dalam isolasi dan pemurnian ini digunakan media kaya manitol Ekstrak Khamir (MEK) di mana semua mikroorganisme (bakteri dan cendawan) dapat tumbuh di dalamnya. Sehingga
untuk mencegah kontaminasi, harus diperhatikan kebersihan dan kesterilan meja kerja dan pelaksana.
Gambar 12. Bintil Akar pada Tanaman Kedelai (a) dan Irisan
Melintang Bintil Akar (b) (K. Minamizawa of Tohoku University)
5. Uraian Prosedur 5.1 Isolasi Bintil Akar
Persiapan di laboratorium : a. Masukkan beberapa butir silika gell ke dalam botol film
secukupnya. Jumlah botol film yang dibawa ke
lapangan disesuaikan dengan kebutuhan, dan b. Periksa kembali kelengkapan peralatan sebelum
berangkat ke lapangan.
Pengumpulan bintil akar di lapangan : a. Tetapkan pohon yang akan diambil bintil akarnya,
(a) (b)
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
34
b. Bersihkan tumbuhan bawah yang tumbuh di sekitar
pangkal batang pohon yang akan diambil bintil akarnya, c. Periksa sekitar pangkal batang tersebut dengan
mengorek tanah menggunakan golok, apakah terdapat
bintil akar, d. Apabila tidak ditemukan maka dapat dilakukan
penggalian lebih dalam dengan menggunakan garpu
tanah, e. Setelah menemukan akar yang berbintil kemudian
potong akar tersebut dengan menggunakan gunting
atau cutter, f. Bersihkan tanahnya dengan hati-hati, pilih bintil-bintil
yang berukuran cukup besar dan masukkan ke dalam
tabung film yang sudah diisi silica gell dan tutup kembali (bintil akar yang baik adalah bintil yang bila
dibelah maka dalamnya berwarna merah jambu), dan g. Tempelkan kertas label pada tabung, sebutkan nama
kolektor, tanggal pengambilan, dan jenis pohon.
Catatan : Sebaiknya setelah sampai di laboratorium bintil akar langsung diisolasi, bila tidak langsung diisolasi simpan koleksi bintil akar dalam lemari pendingin tanpa
dikeluarkan dari dalam tabung film.
5.2 Isolasi Rhizobium di laboratorium
Prosedur Kerja :
A. Sterilisasi alat dan bahan 1. Sterilisasi semua peralatan yang akan digunakan.
2. Guntinglah kertas saring sesuai dengan ukuran gambar cawan petri, masukkan ke dalam cawan petri dan sterilisasi.
3. Siapkan air steril dalam erlenmeyer 250 ml. 4. Siapkan larutan garam fisiologis (0.1 g NaCl; 100 ml
aquades) steril dalam erlenmeyer 250 ml.
B. Pembuatan air ragi 1. Rendam 100 g ragi kue ke dalam 1 liter air dingin
2. Diamkan selama 1-2 jam 3. Autoklave selama 40-60 menit 4. Didiamkan supaya mengendap atau disentrifuse
C. Pembuatan media 1. Siapkan media mannitol ekstrak khamir (MEK) (10g
mannitol; 0,5g K2HPO4; 0.2g MgS04.7 H20; 0,1g
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
35
NaCl; 100 ml air ragi, 15 g Agar Bacto; air destilata
900 ml; dipanaskan untuk melarutkan agar bacto). 2. Bagilah media Agar MEK ke dalam 4 erlenmeyer 250
ml, tutuplah erlenmeyer tersebut dengan kapas dan
alumunium foil. 3. Siapkan larutan Kongo Red sebanyak 10 ml,
masukkan dalam botol vial yang dapat diautoclave.
4. Sterilisasi bahan-bahan di atas ke dalam autoclave pada tekanan 1 atm suhu 120o C selama 20 menit.
5. Setelah 20 menit, keluarkan bahan-bahan tersebut
dari autoclave. 6. Setelah media MEK agak dingin (belum membeku),
satu erlenmeyer ditambah dengan Kongo Red, kocok
sampai rata. 7. Tuangkan media MEK (3 erlenmeyer tanpa Kongo
Red dan 1 erlenmeyer ditambah Kongo Red) ke dalam cawan petri secara aseptik (dilakukan dalam kotak transfer) masing-masing cawan sebanyak 10
ml. 8. Setelah Agar MEK membeku, baliklah cawan petri
agar embun tidak menetes permukaan Agar MEK
tersebut.
D. Sterilisasi dan Isolasi Bintil Akar 1. Cucilah bintil akar dengan air yang mengalir untuk
menghilangkan tanah yang menempel pada permukaannya. Apabila kotoran sulit dihilangkan, dapat digunakan larutan tween 20.
2. Celupkan bintil-bintil akar tersebut ke dalam etanol 95% selama 5-10 detik. Cuci dengan air steril dalam gelas piala dan rendam dalam H2O2 3-5% selama 3-4
menit. 3. Untuk menghindari kontaminasi, kegiatan-kegiatan
berikut dilakukan di dalam kotak transfer. 4. Celupkan pinset dalam ethanol 95% kemudian bakar
ujung pinset beberapa lama pada bunsen agar steril.
5. Pindahkan bintil-bintil akar dengan menggunakan pinset steril ke dalam gelas piala yang berisi air steril untuk membilas H2O2 3-5% dan permukaan bintil
akar.
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
36
6. Buanglah air bekas bilasan bintil akar, gantilah
dengan air steril yang baru, untuk membilas. Ulangi pembilasan sampai 5 kali.
7. Biarkan bintil akar terendam dalam air steril.
8. Pindahkan bintil-bintil tersebut dengan menggunakan pinset steril ke dalam cawan petri yang berisi kertas saring steril.
9. Ambil satu bintil akar dan masukkan ke dalam mortar, hancurkan dengan menggunakan pengaduk steril atau ujung pinset steril. Tambahkan 1 tetes
larutan garam fisiologis. 10. Gunakan jarum ose untuk memindahkan suspensi
ke dalam cawan petri yang berisi media MEK yang
ditambah dan tanpa penambahan Kongo Red, oleskan secara zig-zag seperti pada Gambar 13 A.
11. Tuliskan kode isolat dan tanggal isolasi di atas kertas label, kemudian tempelkan pada cawan petri yang telah diolesi denqan suspensi bintil akar/
digores dengan jarum isolasi (Gambar 13 B), kode isolat sebaiknya mencerminkan asal daerah dan jenis pohon asal; misalnya PFMS: jenis pohon
Paraserianthes falcataria asal Malang Selatan). 12. Inkubasikan biakan dalam inkubator pada suhu
26oC dan amati pertumbuhan bakteri Rhizobium di
sepanjang garis-garis olesan/goresan. Inkubasikan selama 4-5 hari. Contoh hasil isolasi dan pemurnian Rhizobium pada media agar YEMA
Gambar 13. Arah Penggoresan Jarum Ose (A) Pengolesan suspensi bintil akar pada media MEK + Kongo Red, (B) penggoresan jarum isolasi
B A
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah Jurusan Tanah FP-UB
37
Gambar 14. Rhizobium sp. pada agar YEMA (sumber: Purwanto)
E. Pemurnian biakan
1. Koloni-koloni bakteri Rhizobium yang terpisah dipindahkan ke dalam cawan petri yang berisi media MEK tanpa Kongo Red dengan menggunakan jarum
ose. Pengolesan dilakukan secara zig-zag (Gambar 13 A), satu cawan petri hanya untuk satu koloni.
2. Tuliskan kode isolat baru dengan menambah angka 1,
2, 3 dan seterusnya di belakang kode isolat pada waktu isolasi, dan tanggal pemurnian pada kertas label. Tempelkan pada cawan petri yang telah diberi
biakan Rhizobium. 3. Inkubasikan isolat di dalam inkubator pada suhu
26oC. Amati pertumbuhan bakteri Rhizobium. Apabila
masih terdapat koloni-koloni yang terpisah, lakukan pemurnian sekali lagi.