iii. metodologi penelitian 3.1. tempat dan waktu ...eprints.umm.ac.id/58564/4/bab iii.pdfbroth)...

34

III. METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan di laboratorium Ilmu dan Teknologi Pangan dan

laboratorium Kimia Universitas Muhammadiyah Malang. Penelitian dilaksanakan

pada 19 Februari 2018 hingga 18 Januari 2019.

3.2. Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rimpang kunyit kuning

(Curcuma domestica.) kunyit putih (Curcuma zedoaria), dan temu hitam

(Curcuma aeruginosa) yang diperoleh dari petani didaerah Ngawi, Jawa Timur,

kemudian daging sapi segar yang diperoleh dari swalayan Superindo, Kota

Malang. Selanjutnya bahan-bahan untuk ekstraksi dan analisis diantaranya

aquades, etanol 96% Merck (Darmstadt, Jerman), etanol 96% teknis, toluene

Smart-Lab (Bogor, Indonesia), petroleum eter Merck (Darmstadt, Jerman), media

PDA (Potato Dextrose Agar) Himedia (Mumbai, India), SDB (Saboraud Dextrose

Broth) Himedia (Mumbai, India), Na2CO3 Merck (Darmstadt, Jerman), Na2SO4

Merck (Darmstadt, Jerman), spiritus, reagen Folin-Ciocalteau Merck (Darmstadt,

Jerman), asam galat Sigma (Missouri, United States), asam asetat, asam asetat

glasial Merck (Darmstadt, Jerman), asam borat Merck (Darmstadt, Jerman), asam

oksalat Merck (Darmstadt, Jerman), DMSO (Dimetil Sulfoksida) Merck

(Darmstadt, Jerman), chloramfenikol, safranin, kristal violet, iodine, dan

methylene blue.

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pengering oven Hock, mesin

penggiling (grinder) merek Jimo, peralatan distilasi, sterling bidwel, rotary

vacuum evaporator merek IKA HB 10 basic, lemari pendingin, spektrofotometer

35

UV-Vis 1800 Shimadzu, petridish, sarung tangan karet, botol semprot, timbangan

analitik Pioneer Ohaus, soxhlet, autoklaf, inkubator, laminair air flow, kertas

saring, gelas beker, kompor (alat pemanas), erlenmeyer PYREX, tabung reaksi

PYREX, rak tabung reaksi, micro pipet, tip, alat colony counter Today’s galaxy

230, waterbath, jarum ose, mikroskop Olympus, gelas ukur, pipet tetes, dan pH

meter SI Analytics.

3.3. Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan dengan dua tahap: tahap pertama yakni ekstraksi

oleoresin, kemudian tahap kedua yakni pengaplikasian oleoresin sebagai

antikhamir yang diisolasi dari daging sapi.

3.3.1. Tahap Pertama

Tahap ini dilakukan ekstraksi oleoresin kunyit dengan metode maserasi.

Terdapat dua faktor didalam tahap ini yakni jenis Curcuma dan lama perendaman

(maserasi). Jenis Curcuma terdiri dari 3 level dan lama ekstraksi terdiri dari 3

level. Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Kelompok

(RAK) faktorial.

Faktor 1: Jenis Curcuma Faktor 2: Lama

Perendaman (Maserasi)

K1: Kunyit Putih (Curcuma zedoaria)

K2: Kunyit Kuning (Curcuma domestica)

K3: Temu Hitam (Curcuma aeruginosa)

L1: 6 jam

L2: 24 jam

L3: 48 jam

Kombinasi perlakuan (Tc) = 3x3=9, dengan jumlah ulangan minimum

perlakuan (n) adalah:

Tc (n-1) ≥ 15

9 (n-1) ≥ 15

36

9n ≥ 24

n≥ 2,6 … dibulatkan menjadi n=3

Tabel 7. Matrik Kombinasi Perlakuan

Faktor I

Faktor II

Jenis

Curcuma

zedoaria

(K1)

Jenis

Curcuma

domestica

(K2)

Jenis

Curcuma

aeruginosa

(K3)

Lama Perendaman 6 jam (L1) K1L1 K2L1 K3L1



Keterangan:

K1L1 = Oleoresin dengan perlakuan jenis Curcuma zedoaria dan lama

perendaman 6 jam


perendaman 24 jam


perendaman 48 jam

K2L1 = Oleoresin dengan perlakuan jenis Curcuma domestica dan lama

perendaman 6 jam


perendaman 24 jam


perendaman 48 jam

K3L1 = Oleoresin dengan perlakuan jenis Curcuma aeruginosa dan lama

perendaman 6 jam


perendaman 24 jam


perendaman 48 jam.

Oleoresin yang telah diperoleh kemudian dilakukan analisis. Parameter uji

oleoresin ini terdiri dari rendemen oleoresin, nilai pH, kadar total fenol, kadar

kurkumin, dan kadar minyak atsiri dianalisa menggunakan analisis data statistik

37

one way ANOVA dan uji banding DMRT (Duncan’s Multiple Range Test)

dengan taraf nyata 5% (α=0,05).

3.3.2. Tahap Kedua

Tahap ini dilakukan pengaplikasian kesembilan perlakuan oleoresin yang

telah diperoleh sebagai anti khamir yang diisolasi dari daging sapi. Parameter

analisis mikrobiologi ini terdiri dari pengamatan koloni, perhitungan jumlah

koloni, uji anti yeast pewarnaan gram, pewarnaan sederhana (methylene blue), dan

uji daya hambat metode sumuran dianalisa menggunakan metode analisis

deskriptif. Sedangkan untuk mengetahui pengaruh nilai pH, kadar total fenol,

kadar kurkumin dan kadar minyak atsiri oleoresin terhadap jumlah koloni (jumlah

mikroorganisme) dianalisa dengan rancangan regresi linier berganda

menggunakan aplikasi SPSS.

3.4. Pelaksanaan Penelitian

3.4.1. Pembuatan Oleoresin

Pembuatan oleoresin ini yakni dengan cara ekstraksi dengan menggunakan

metode maserasi. Jenis Curcuma yang digunakan terdiri dari kunyit kuning

(Curcuma domestica), kunyit putih (Curcuma zedoaria), dan temu hitam

(Curcuma aeruginosa). Ekstraksi dilakukan dengan tiga tingkatan lama waktu

(perendaman) yang berbeda yakni 6 jam, 24 jam, dan 48 jam.

Ekstraksi metode maserasi ini mengacu pada Nugraha dkk. (2014) dengan

modifikasi. Rimpang segar dikupas untuk dipisahkan dari kulitnya. Kemudian

dicuci bersih dan dikeringkan. Rimpang kering dikecilkan ukurannya (dilakukan

penepungan) dengan mesin penepung (grinder) untuk menghasilkan bubuk.

Bubuk tersebut kemudian diayak. Selanjutnya bubuk yang diperoleh ditimbang

38

sebanyak 10 gram. Ekstraksi maserasi dengan rasio bahan: pelarut yakni 1:10.

Pelarut yang digunakan yakni etanol 96%. Perendaman (maserasi) dilakukan

selama 6 jam, 24 jam dan 48 jam. Filtrat diuapkan dengan rotary vacuum

evaporator pada suhu 50ºC dengan kecepatan 60 rpm sampai pelarut menguap.

Oleoresin yang terbentuk dianalisa.

39

Ampas

Penguapan filtrat dengan rotary evaporator

T= 50⁰C, kecepatan 60 rpm, t’= 20 menit

Oleoresin Parameter uji:

1. Rendemen

2. Nilai pH

3. Kadar Total Fenol

4. Kadar Kurkumin

5. Kadar Minyak

Atsiri

6. Daya Antimikroba

Penimbangan 10 gram

Ekstraksi Maserasi 6 jam,

24 jam, 48 jam

Pengecilan ukuran dan pengayakan ukuran 20 mesh

Bubuk

Rimpang segar C. zedoaria,

C.domestica, C. aeruginosa

Pencucian dan pengupasan Kulit, air Air

Pengirisan

Etanol 96% 100ml

Gambar 7. Diagram Alir Ekstraksi Oleoresin Metode Maserasi (Nugraha, dkk.,

2014) dengan Modifikasi

Penyaringan

Pengeringan oven T=60⁰C,t’= 24 jam

Parameter uji:

1. Kadar Air

2. Nilai pH

3. Kadar Total Fenol

4. Kadar Kurkumin

5. Kadar Minyak

Atsiri

40

3.4.2. Isolasi Khamir dari Daging Sapi Segar

Sampel yeast diisolasi dari daging sapi segar yang disimpan pada suhu

refrigerator (0,2oC - 5oC) selama 7 hari. Daging sapi tersebut ditimbang sebanyak

1 gram dan dilakukan pengenceran 10−1. Suspensi yeast tersebut kemudian

diambil sebanyak 1 ml dan ditanam pada media SDB. Media SDB yang

digunakan sebelumnya ditambahkan chloramphenicol sebanyak 0,010 gram per

100 ml untuk memastikan agar bakteri tidak tumbuh. Selanjutnya media yang

telah ditanami yeast diinkubasi pada suhu 37°C selama 96 jam.

Selanjutnya isolasi tahap kedua dilakukan untuk menumbuhkan khamir

pada media padat agar dapat dilakukan identifikasi khamir. Media SDB yang telah

diinkubasi pada isolasi tahap pertama diambil sebanyak 10 mikroliter dan ditanam

pada media PDA. Selanjutnya media yang telah ditanami yeast diinkubasi pada

suhu 37°C selama 96 jam.

Untuk mendapatkan kultur murni dilakukan isolasi tahap akhir. Dari media

PDA yang ditumbuhi kultur campuran diamati morfologinya dan diambil koloni

yang menyerupai khamir (yeast) dan diidentifikasi. Selanjutnya koloni yang

memiliki morfologi sel seperti khamir ditanam pada media PDA dengan metode

streak kuadran.

3.5. Parameter Penelitian

Parameter penelitian ini dilakukan beberapa pengamatan antara lain:

1. Analisis bahan baku yaitu pada bubuk rimpang Curcuma spp. Analisis

bahan baku meliputi analisis kadar air, kadar kurkumin, total fenol, dan

kadar minyak atsiri.

41

2. Analisis pada produk oleoresin. Analisis pada produk oleoresin meliputi

rendemen oleoresin, pH, total fenol oleoresin, kurkumin, kadar minyak

atsiri, pengamatan koloni, perhitungan jumlah koloni, penanaman yeast

pada media perlakuan (dengan penambahan oleoresin), pewarnaan gram,

pewarnaan sederhana (methylene blue), dan uji daya hambat metode difusi

sumuran.

3.6. Prosedur Analisis

3.6.1. Kadar Air Bahan Baku Metode Distillasi Azeotropik (SNI 01-3181-

1992 dengan modifikasi yang Diacu dalam Faridah et al., 2010)

Labu didih dan tabung Bidwell-Sterling dikeringkan dalam oven bersuhu

105°C dan didinginkan dalam desikator. Sebanyak 3 g sampel (Ws) dimasukkan

dalam labu didih yang telah dikeringkan dan ditambahkan 60-80 ml toluena. Alat

destilasi, labu didih, dan pemanas dirangkai dan direfluks dengan suhu rendah

(skala hot plate 4-5) selama 45 menit. Suhu dinaikkan dan dilakukan pemanasan

selama 60-90 menit. Hasil analisis dapat dibaca dengan melihat volume air yang

terdestilasi (Vs).

Kadar air bahan dapat dihitung dengan rumus:

Kadar air = 𝑉𝑠

𝑊𝑠x 100%

3.6.2. Rendemen Oleoresin

Oleoresin hasil ekstraksi ditimbang dalam wadah yang sudah diketahui

beratnya. Kemudian rendemen oleoresin dihitung berdasarkan berat kering bahan.

Rendemen oleoresin % = 𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑜𝑙𝑒𝑜𝑟𝑒𝑠𝑖𝑛 𝑘𝑎𝑠𝑎𝑟 (𝑔𝑟)

𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑏𝑎ℎ𝑎𝑛 𝑏𝑢𝑏𝑢𝑘 (𝑔𝑟) x 100%

42

3.6.3. Nilai pH (Sudarmadji dkk., 2006)

Elektroda pH meter dikalibrasi ke dalam larutan buffer pH 4 dan ke dalam

larutan buffer pH 7 kemudian dibilas dengan aquades. Elektroda pH meter

dicelupkan ke dalam sampel, kemudian ditunggu hingga menunjukkan angka

konstan dan pH sampel dapat dibaca.

3.6.4. Kandungan Total Fenol

3.6.4.1. Pembuatan Kurva Kalibrasi Asam Galat dengan Reagen Fenol

Folin–Ciocalteu (Waterhouse, 1999)

Ditimbang 50 mg asam galat, ditambahkan 1 mL etanol 96 %, lalu

ditambahkan aquades sampai volume akhir 50 mL, sehingga diperoleh konsentrasi

1 mg/mL. Dari larutan induk asam galat konsentrasi 1 mg/mL dipipet 1 mL, 1,25

mL, 1,5 mL, 1,75 mL dan 2 mL, secara berturut turut lalu diencerkan dengan

aquades sampai volume akhir 10 mL sehingga dihasilkan konsentrasi 100, 125,

150, 175, 200 μg/ml asam galat, secara berturut-turut. Dari masing-masing

konsentrasi larutan asam galat dipipet 0,2 mL lalu ditambah 15,8 mL aquades dan

1 mL Reagen Folin-Ciocalteu dan dikocok sampai homogen serta didiamkan

selama 8 menit. Diambahkan 3 mL larutan , 𝑁𝑎2𝐶𝑂3 10% lalu dikocok homogen,

dan selanjutnya didiamkan selama 2 jam pada suhu kamar. Ukur serapan pada

panjang gelombang serapan maksimum 765 nm, lalu dibuat kurva kalibrasi

hubungan antara konsentrasi asam galat (μg/ml) dengan serapan.

3.6.4.2. Penetapan Kandungan Fenol Total dengan Metoda Folin–Ciocalteu

(Orak, 2006)

Ditimbang 100 mg oleoresin kemudian dilarutkan sampai 10 mL dengan

aquades sehingga diperoleh konsentrasi 10 mg/mL. Dari konsentrasi 10 mg/mL

dipipet 1 mL dan diencerkan dengan aquades hingga 10 mL dan diperoleh

43

konsentrasi ekstrak 1 mg/mL. Dipipet 0,2 mL ekstrak, ditambahkan 15,8 mL

aquades dan 1 mL reagan Folin–Ciocalteu lalu dikocok. Didiamkan selama 8

menit kemudian ditambahkan 3 mL , 𝑁𝑎2𝐶𝑂3 10% ke dalam campuran.

Didiamkan larutan selama 2 jam pada suhu kamar. Diukur serapannya dengan

spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang serapan maksimum 765 nm.

Dilakukan 3 (tiga) kali pengulangan sehingga kadar fenol yang diperoleh hasilnya

didapat sebagai mg ekuivalen asam galat/g sampel segar.

3.6.5. Kadar Kurkumin (Tonnasen, 1986 dalam Yulianti, 2010)

0,2 gram oleoresin ditimbang lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml.

Selanjutnya ditambahkan 25 ml asam asetat dan dipanaskan dalam waterbath

selama 1 jam pada suhu 100 °C. selanjutnya larutan didinginkan. Setelah dingin,

ditambahkan asam borat dan asam oksalat masing-masing sebanyak 1 gram.

Larutan dipanaskan kembali selama 10 menit pada suhu 100 °C kemudian

didinginkan. Larutan diencerkan dengan menggunakan asam asetat sampai

mencapai tanda tera. Lalu dipipet sebanyak 0.1 ml dan diencerkan dengan

menggunakan asam asetat glacial sampai menjadi 10 ml. larutan diukur dengan

menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 530 nm. Nilai

absorbansi yang diperoleh dari pengukuran dibandingkan terhadap kurva standar

untuk mengetahui konsentrasi kurkumin yang terdapat di dalam sampel oleoresin.

Kadar Kurkumin (%) = 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 𝑥 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑘𝑢𝑟𝑘𝑢𝑚𝑖𝑛 (𝑝𝑝𝑚)

𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑜𝑙𝑒𝑜𝑟𝑒𝑠𝑖𝑛 x 100%

44

3.6.6. Kadar Minyak Atsiri

3.6.6.1. Kadar Minyak Atsiri Bahan Baku (Metode Soxhlet, Abbasi et al.

2008 dengan modifikasi)

Bubuk Curcuma spp. ditimbang sebanyak 1 gram dan bungkus dengan

kertas saring serta dimasukkan kedalam soxhlet. Labu lemak diisi dengan

petroleoum eter sebanyak 31 ml dan dihubungkan dengan soxhlet. Kemudian

dipanaskan dengan waterbath suhu 79,5oC selama 6 jam. Labu lemak di oven

dengan suhu 35oC untuk menguapkan pelarut. Labu lemak ditimbang dan dicatat

hasilnya.

3.6.6.2 Kadar Minyak Atsiri Oleoresin (Metode Hidrodistilasi Rennecius et al

1988 dalam Yulianti, 2010 dengan modifikasi)

Oleoresin ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam labu didih

250 ml. Kemudian ditambahkan 25 ml air dan dihubungkan dengan alat penyuling

minyak atsiri. Labu didihkan selama 1 jam. Volume minyak atsiri yang ditampung

dalam alat penampung. Kemudian ditambahkan petroleum eter dan dikurangi

kadar airnya dengan penambahan 𝑁𝑎2𝑆𝑂4 anhidrat. Minyak atsiri beserta

petroleum eter dipindahkan pada botol dan didiamkan hingga pelarut menguap

kemudian ditimbang. Kadar minyak atsiri dihitung dengan menggunakan

persamaan berikut ini.

Kadar Minyak Atsiri = 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑚𝑖𝑛𝑦𝑎𝑘 𝑎𝑡𝑠𝑖𝑟𝑖

𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑜𝑙𝑒𝑜𝑟𝑒𝑠𝑖𝑛 x 100%

3.6.7. Pengamatan Koloni

Pengamatan dilakukan pada koloni yang terbentuk saat tahap isolasi dari

daging sapi maupun saat penanaman pada media perlakuan oleoresin. Koloni

yang tumbuh pada media diamati kenampakannya seperti ukuran, penampakan,

warna dan pola tumbuh koloni dan dicatat.

45

3.6.8. Perhitungan Jumlah Mikroorganisme (Wachid dan Sukardi, 2015)

Perhitungan dilakukan pada koloni yang terbentuk saat tahap isolasi dari

daging sapi maupun saat penanaman pada media perlakuan oleoresin. Koloni

yang tumbuh pada media dihitung jumlahnya dengan menggunakan colony

counter. Selanjutnya hasil perhitungan koloni dikonversikan menjadi CFU/g

untuk menghitung jumlah mikroorganisme.

3.6.9. Penanaman Yeast pada Media Perlakuan (dengan Penambahan

Oleoresin)

Isolat yeast yang telah didapat selanjutnya ditanam pada media PDA

dengan penambahan oleoresin perlakuan. Media PDA cair dituangkan pada cawan

petri sebanyak 20 ml dan ditambahkan oleoresin perlakuan sebanyak 100

mikroliter (konsentrasi 80%, pengenceran dengan DMSO) dengan total 9 media

PDA dengan oleoresin perlakuan dan 1 media PDA tanpa campuran sebagai

kontrol. Selanjutnya satu ose isolat yeast diambil dan dilakukan pengenceran

sebanyak 10−3. Sebanyak 0,5 suspensi yeast ditanam pada media dengan metode

spread plate. Selanjutnya media yang telah ditanami yeast diinkubasi pada suhu

37°C selama 96 jam.

3.6.10. Pewarnaan Gram (Wachid dan Sukardi, 2015)

Biakan diulaskan pada preparat dan difiksasi. Kemudian dilakukan

penetesan kristal violet pada ulasan selama 1 menit dan dicuci dengan aquades

mengalir. Selanjutnya mordan (lugol iodine) diteteskan pada ulasan selama 1

menit dan dicuci dengan aquades mengalir. Kemudian preparat ditetesi etanol

96% hingga etanol yang jatuh berwarna jernih dan dicuci dengan aquades

mengalir. Selanjutnya penetesan safranin pada preparat selama 45 detik dan dicuci

dengan aquades mengalir. Preparat dikeringkan dengan kertas tissue yang

46

ditempelkan disisi ulasan lalu biarkan mengering diudara. Preparat ditutup dengan

cover glass. Pengamatan dengan perbesaran 100 x 10 menggunakan mikroskop.

3.6.11. Pewarnaan Sederhana dengan Methylene Blue (Wachid dan Sukardi,

2015)

Suspensi biakan diulaskan pada object glass lalu ditetesi Methylene Blue

hingga rata (jangan difiksasi). Preparat ditutup dengan cover glass. Pengamatan

dengan perbesaran 100x10 menggunakan mikroskop.

3.6.12. Uji Pembentukan Zona Hambat Oleoresin terhadap Khamir (Metode

Sumuran)

Pengujian ini dilakukan dengan metode difusi sumur (Berghe dan

Vlientinck, 1992; Rios et al., 1988 dalam Rosihan, 2015 dengan modifikasi). Uji

ini dilakukan untuk menentukan daya hambat oleoresin dengan melihat

terbentuknya zona hambat disekitar sumur oleoresin, meliputi zona hambat total

yang ditandai dengan zona bening sempurna, zona hambat parsial yang ditandai

dengan zona hambat tidak bening sempurna dan zona hambat yang tidak dapat

terukur.

Sebanyak 1 ml suspensi isolat dengan konsentrasi 0,5 Mc Farland

(absorbansi 0,1-0,5 dengan panjang gelombang 530 nm) dimasukkan ke dalam

cawan petri kemudian dituangi media PDA 20 ml yang masih cair. Biakan

tersebut digoyang sampai isolat tercampur rata ke seluruh media. Setelah beku

dibuat lubang dengan sedotan steril ± 6 mm di media yang telah memadat.

Selanjutnya lubang sumur diisi 80 µl oleoresin (konsentrasi 80%, pengenceran

dengan DMSO). Biakan diinkubasi pada suhu 30-34°C selama 24-72 jam sampai

jamur (khamir) memenuhi petri. Selanjutnya diameter zona hambat diukur dengan

jangka sorong.

iii. metodologi penelitian 3.1. tempat dan waktu ...eprints.umm.ac.id/58564/4/bab iii.pdfbroth)...

Documents