6

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Nitrifikasi

Definisi nitrifikasi di dalam tanah secara umum adalah pengubahan

nitrogen secara biologis di dalam tanah dari bentuk tereduksi menjadi bentuk yang

lebih teroksidasi atau dengan kata lain oksidasi biologis garam amonium dalam

tanah menjadi nitrit dan selanjutnya oksidasi nitrit menjadi nitrat (Rao, 1994).

Oksidasi amonia ke nitrat dapat diselesaikan dengan 3 bentuk proses, yaitu

proses kimiawi (chemical), proses physicochemical, dan proses biologis

(biological chemical) yang merupakan proses yang amat penting. Mengenai

proses biologis dari amonia menjadi nitrat sesungguhnya berlangsung melalui 2

tingkatan, yang selanjutnya dikenal sebagai proses nitritasi dan nitratasi (Sutedjo

et al., 1991).

Menurut Spotte (1979), nitrifikasi adalah proses oksidasi amonia menjadi

nitrit dan kemudian menjadi nitrat secara biologis oleh bakteri autotrof, umumnya

berasal dari genus Nitrosomonas sp. dan Nitrobacter sp. yang merupakan genus

yang terpenting dari bakteri autotrof. Bakteri autotrof yang melakukan proses

nitrifikasi membutuhkan senyawa anorganik sebagai sumber energi dan

karbondioksida sebagai sumber karbon.

Nitrifikasi melalui dua tahapan reaksi, yaitu tahap pertama oksidasi

amonium menjadi nitrit yang dilakukan oleh mikroba pengoksidasi amonium

(Nitrosomonas sp.), pada tahap kedua oksidasi nitrit menjadi nitrat oleh mikroba

pengoksidasi nitrit (Nitrobacter sp.). Tahapan reaksi yang dilakukan oleh bakteri

adalah sebagai berikut (Spotte, 1979):

Faktor-faktor yang mempengaruhi proses nitrifikasi adalah jumlah NH4+

dalam tanah, populasi mikrob, reaksi tanah, aerasi tanah, kelembaban tanah, dan

temperatur. Amonium (NH4+) dapat berasal dari proses dekomposisi bahan

organik. Apabila perbandingan C/N dari satu bahan organik tinggi, maka NH4+

yang dihasilkan dari proses dekomposisi akan sebanding dengan pertambahan

populasi mikroba Penelitian-penelitian yang dilakukan Universitas Iowa

NH3 + H2O NH4+ + OH-

NH4+ + 3/2 O2

Nitrosomonas sp.

Enzim amonia monooksigenase

NO2- + 2H+ + H2O

Energi = -66 Kkal mol N-1

Enzim nitrit oksidase

Nitrobacter sp.NO2

- + 1/2 O2NO3

- Energi = -18 Kkal mol N-1

7

membuktikan bahwa apabila faktor-faktor yang berpengaruh terhadap proses

nitrifikasi pada dua tempat yang sama, proses tersebut tetap terhambat jalannya.

Ternyata hambatan ini disebabkan oleh populasi mikroba yang berbeda di kedua

tempat. Proses nitrifikasi biasanya berlangsung antara pH 5.5 sampai pH 10

dengan pH optimum sekitar 8.5, tetapi juga diketahui bahwa nitrat dapat

dihasilkan pada tanah dengan pH 4.5 dan terdapat laporan bahwa proses nitrifikasi

terjadi pada padang rumput dengan pH 3.8. Nitrifikasi berlangsung lebih lambat

dibandingkan dengan pupuk amonium sebab ada pengaruh NH3 bebas terhadap

kegiatan mikroorganisme (Leiwakabessy et al., 2003).

Sedangkan menurut Paul dan Clark (1996); Jenie dan Rahayu (2004),

faktor-faktor yang mempengaruhi nitrifikasi antara lain (1) kemasaman, nilai pH

maksimum berkisar dari 6.6 sampai 8.0. Tingkat nitrifikasi dalam tanah pertanian

di bawah pH 6.0 dan menjadi lebih rendah di bawah 4.5. Nilai pH yang tinggi

menghambat transformasi NO2- ke NO3

-; (2) aerasi, karena O2 merupakan

kebutuhan obligat bagi semua spesies, maka aerasi penting bagi nitrifikasi. Difusi

O2 ke dalam tanah dan untuk aerasi dikendalikan oleh faktor-faktor seperti

struktur dan kelembaban tanah; (3) Kelembaban dan temperatur, kelembaban

mempengaruhi regim aerasi dalam tanah. Kadar air tanah berpengaruh dalam

produksi NO3-. Kelembaban optimum bervariasi untuk tanah-tanah berbeda, tapi

kebanyakan nitrifikasi berlangsung pada kelembaban -0.1 sampai -1 MPa. Reaksi

mineralisasi secara umum menghasilkan NH4+ lebih rendah jika dibandingkan

saat kekurangan air atau temperatur rendah; NH4+ terakumulasi dalam kadar air

rendah atau tanah yang beku. Meskipun nitrifikasi berjalan lambat di bawah 5oC,

namun dapat berlangsung pada tanah-tanah yang tertutup salju. Nitrifikasi juga

berjalan lambat pada suhu di bawah 40oC. Suhu optimumnya antara 30 dan 35oC.

Hubungan antara temperatur, kelembaban, aerasi, dan faktor lainnya membuat

efek musim. Di daerah beriklim sedang, nitrifikasi terjadi sangat cepat saat musim

semi dan gugur, dan paling lambat terjadi saat musim panas dan dingin.

Faktor-faktor lain yang mempengaruhi proses nitrifikasi adalah waktu

tinggal sel rata-rata (mean cell residence time/MCRT), laju hidraulik, tingkat

kompetisi dengan bakteri (nitrifikasi) heterotrof, Rasio AOB/NOB, dan

konsentrasi senyawa toksik/penghambat proses nitrifikasi seperti aseton, fenol,

8

etilendiamin, kloroform, heksametilendiamin, etanol, seng, tembaga, air raksa,

krom, nikel, perak, kobalt, kadmium, dan logam berat lainnya (Magdalena, 2009)

Nitrifikasi tidak hanya berperan dalam ketersediaan N, akan tetapi juga

berpotensi mencemari air tanah lewat pelindian NO3- (nitrat) karena kemampuan

tanah menjerap anion pada umumnya kecil dan mencemari tanah oleh NO2- yang

beracun bagi tumbuhan. Untunglah konversi nitrit ke nitrat berlangsung lebih

cepat daripada konversi amonia ke nitrit (Notohadiprawiro, 1999).

Nitrifikasi dapat pula menyebabkan kerugian. Amonium merupakan

kation, diadsorbsi oleh tanah, dan relatif stasioner. Di sisi lain, nitrat adalah anion

yang mobil di dalam larutan tanah. Di bawah kondisi tertentu, khususnya pada

tanah berpasir dengan curah hujan tinggi atau irigasi berlebihan dilakukan, NO3-

akan tercuci dari daerah perakaran. Hal tersebut juga dapat terjadi akibat

kehilangan dalam denitrifikasi. Hal ini dapat mengkontaminasi atmosfer.

Pencucian kelebihan NO3- dari tanah seringkali berakhir dalam air bawah tanah,

danau, dan sungai. Hal ini dapat berimplikasi pada: (1) kelebihan pertumbuhan

tanaman dan alga (eutrofikasi), (2) masalah kesehatan seperti methemoglobin

hewan, (3) terbentuknya nitrosamin yang bersifat karsinogen akibat adanya reaksi

dengan senyawa nitrogen lainnya. Gas intermediet hasil nitrifikasi merupakan

polutan atmosfer (Paul dan Clark, 1996).

Produk samping atau gas intermediet dari reaksi oksidasi amonium dapat

berupa gas N2O atau dapat juga digunakan sebagai senyawa nitrogen yang terlibat

dalam metabolisme bakteri pengoksidasi amonium setelah diasimilasi oleh sel

(Tresnawati, 2006). King dan Nedwell (1985) menjelaskan bahwa produksi N2O

meningkat secara proporsional dengan menurunnya konsentrasi amonium karena

proses oksidasi.

2.2. Bakteri Penitrifikasi

Bakteri penitrifikasi termasuk ke dalam dua kelompok fisiologi yang

berbeda, yang terpenting dari masing-masing kelompok adalah Nitrosomonas

yang mengoksidasi amonium menjadi nitrit dan Nitrobacter yang mengoksidasi

nitrit menjadi nitrat. Kedua macam bakteri itu berbentuk batang kecil, Gram

negatif, tidak membentuk endospora, berflagella polar, dan bersifat aerob obligat

9

(Imas et al., 1989). Nitrosomonas dan Nitrobacter lebih menjadi perhatian karena

adanya pendapat yang menginginkan agar proses nitrifikasi ini perlu dikendalikan

sehubungan dengan efisiensi pemupukan N dan pengendalian pencemaran

lingkungan (Iswandi, 1989).

Bakteri pengoksidasi amonia tergolong Gram negatif yang memiliki

bentuk sel batang (panjang 0.6-4 µm), ellipsoid, sferikal, dan spiral. Sel tidak

motil dan motil dengan flagella polar sampai subpolar atau peritrik. Semua spesies

aktivitasnya berjalan pada kondisi aerobik, temperatur pertumbuhan optimum 25-

30oC, tidak aktif pada suhu 4oC dan pH optimum berkisar 7.5-8.0. berkoloni pada

media seperti kerikil, pasir, atau media sintetik lain, memerlukan oksigen untuk

mengkonversi senyawa anorganik sebagai sumber energinya, dan memerlukan

CO2 sebagai sumber karbon. Rasio reproduksi sangat lambat (waktu generasi 20-

40 jam) (Holt et al., 1994; Magdalena, 2009).

Bakteri nitrifikasi tumbuh sangat lambat meskipun pada kondisi optimum.

Waktu generasinya bergantung pada pH dan bervariasi dari 100 jam pada pH 6.2

sampai 38 jam pada pH 7.6 bagi Nitrosomonas dan dari 58 jam pada pH 6.2

sampai 21 jam pada pH 6.6 atau lebih bagi Nitrobacter. Waktu generasi ini

dihitung dari laju pengubahan nitrogen amonium dan nitrogen nitrit dan dengan

anggapan bahwa hubungan antara waktu generasi dan hilangnya substrat di dalam

tanah itu seperti yang terjadi pada biakan (Imas et al., 1989).

Menurut Alexander (1999), Nitrosomonas dan Nitrobacter tergolong ke

dalam bakteri kemoautotrof obligat. Kemoautotrof obligat memerlukan sumber

energi yang spesifik, misalnya saja Nitrosomonas membutuhkan amonium sebagai

sumber energi dan Nitrobacter memerlukan nitrit. Akan tetapi, menurut laporan,

Nitrobacter dapat menggunakan asetat sebagai satu-satunya sumber karbon dan

energi, sehingga sebenarnya istilah ‘autotrof fakultatif’ mungkin lebih sesuai

(Imas et al., 1989).

2.2.1. Bakteri Pengoksidasi Amonium

Bakteri-bakteri yang tergolong ke dalam bakteri pengoksidasi amonium

antara lain bakteri yang berasal dari Genus Nitrosomonas. Bakteri yang tergolong

ke dalam Genus Nitrosomonas adalah Nitrosomonas aestuarii, Nitrosomonas

10

communis, Nitrosomonas europaea, Nitrosomonas eutropha, Nitrosomonas

halophila, Nitrosomonas marina, Nitrosomonas nitrosa, Nitrosomonas

oligotropha, dan Nitrosomonas ureae. Selain dari Genus Nitrosomonas, bakteri

pengoksidasi amonium yang lain berasal dari Genus Nitrosococcus

(Nitrosococcus briensis, Nitrosococcus oceani), Genus Nitrosospira (Nitrosospira

briensis, Nitrosospira multiformis, Nitrosospira tenuis), Genus Nitrosolobus

(Nitrosolobus multiformis), dan Genus Nitrosovibrio (Nitrosovibrio tenius)

(Magdalena, 2009).

Bakteri-bakteri tersebut menurut Holt et al. (1994) termasuk ke dalam

genus bakteri pengoksidasi amonium dan bersifat obligat kemoliautotrof yang

membutuhkan energi untuk mengoksidasi amonium atau nitrit menjadi nitrat.

Kebutuhan sumber karbon diambil melalui proses fiksasi CO2. Spesies bakteri

pengoksidasi amonium ini terdistribusi mulai dari tanah, laut, danau, sungai, dan

sistem pembuangan limbah.

Nitrosomonas sp. adalah bakteri aerob khemolitotrof obligat yang

memperoleh energi dari oksidasi senyawa amonium dan menggunakan CO2

sebagai sumber utama karbon di dalam sintesa biomassanya. Secara morfologis,

bakteri ini berbentuk batang pendek, kadang-kadang bentuk sel elips, motil dan

non motil, terdapat dalam bentuk konsorsium, berpasangan sebagai rantai pendek

maupun sendiri. Bakteri ini adalah bakteri Gram negatif dan memiliki

sitomembran. Sel tumbuh bebas pada medium dan membentuk matriks tipis.

Bakteri ini dapat tumbuh optimum pada temperatur 5-30oC dan pH optimum 5.8-

8.5, serta hidup pada habitat air laut, air tawar, dan tanah (Holt et al., 1994;

Hairiyah dan Handayanto, 2007).

Jenis Nitrosococcus sp. bentuk selnya sferik sampai ellipsoidal, Gram

negatif, bersifat motil dengan satu atau dua flagella, mampu tumbuh pada suhu

sekitar 15-30oC dengan pH 6.5-8.0, dan habitatnya di air tawar atau air laut.

Bakteri yang berasal dari Genus Nitrospira sp. bentuk selnya spiral, Gram negatif,

mempunyai sitomembran yang tidak merata, kadang-kadang membentuk seperti

membran plasma, non motil dan motil dengan menggunakan flagella peritrikus,

dan memiliki habitat di air tawar (Holt et al., 1994).

11

2.2.2. Bakteri Pengoksidasi Nitrit

Salah satu bakteri yang berperan dalam mengoksidasi nitrit menjadi nitrat

berasal dari genus Nitrobacter. Genus Nitrobacter ini terdiri atas Nitrobacter

alakticus, Nitrobacter hamburgensis, Nitrobacter vulgaris, dan Nitrobacter

winogradsky. Nitrobacter sp. diketahui dapat mengoksidasi nitrit oksida (NO)

menjadi nitrat (NO3-), kebutuhan sumber karbon diambil melalui proses fiksasi

CO2. Habitat kelompok bakteri ini tersebar pada air tawar, air laut, serta tanah.

Jenis Nitrobacter sp. selnya berbentuk batang pendek, pleomorfik, seringkali

berbentuk pears, Gram negatif, dan biasanya non motil (Holt et al., 1994).

Selain genus Nitrobacter, genus lain yang mampu mengoksidasi nitrit

adalah genus Nitrococcus (Nitrococcus mobilis merupakan satu-satunya spesies

yang termasuk Nitrococcus yang dijumpai hanya di perairan laut), genus

Nitrospina (Nitrospina gracilis), dan Nitrospira (Magdalena, 2009).

Oleh karena Nitrobacter adalah bakteri autotrof maka proses nitrifikasi

hanya berlangsung bila ada oksigen. Makin tinggi kadar oksigen makin tinggi

pula laju proses nitrifikasi. Pada suasana anaerob proses ini akan terhambat. Pada

pH yang terlalu tinggi (pH 7.5-8.0) aktivitas bakteri Nitrobacter berkurang

sehingga terjadi penumpukan NO2- karena konversi ke NO3

- tertekan. Tetapi

sebaliknya pada pH 7.0 kecepatan konversi NO2- ke NO3

- melebihi kecepatan

konversi NH4+ ke NO3

- (Leiwakabessy et al., 2003).

Jenis Nitrospina sp. bentuk selnya batang panjang, Gram negatif, bersifat

non motil, memiliki habitat di air laut, dan tumbuh baik pada kondisi lingkungan

yang mengandung senyawa organik. Suhu optimum untuk pertumbuhannya

berkisar 25-30 oC dan pH 7.5-8.0 (Holt et al., 1994).

2.3. Peranan Bakteri Penitrifikasi dalam Proses Pengolahan Limbah

Limbah ialah kumpulan air bekas yang telah dipakai oleh suatu masyarakat,

yang terdiri dari: (1) limbah domestik (rumah tangga), termasuk kotoran manusia

dan air cucian, semua air yang mengalir dari saluran pembuangan perumahan dan

kota ke dalam sistem pembuangannya, (2) limbah industri, seperti senyawa yang

bersifat asam, minyak, minyak pelumas, sisa-sisa hewan, dan sayur-sayuran yang

12

dibuang oleh pabrik, (3) air tanah, air permukaan, yang masuk ke dalam sistem

pembuangan (Pelczar and Chan, 2008).

Menurut Warlina (2004), dampak yang ditimbulkan oleh limbah yang

mencemari kawasan perairan antara lain dampak terhadap kehidupan biota air

(terganggunya perkembangan biota laut dan kematian biota laut), dampak

terhadap kualitas air tanah, dampak terhadap kesehatan (seperti: Diare, Disentri,

Hepatitis A), dan dampak terhadap estetika lingkungan.

Salah satu cara yang dapat dilakukan untuk menanggulangi pencemaran

akibat limbah yaitu melalui bioremediasi. Bioremediasi merupakan salah satu cara

untuk membersihkan senyawa polutan baik kimia maupun organik yang bersifat

toksik menjadi bentuk lain yang tidak berbahaya. Prosesnya melibatkan aktivitas

mikroba dan sasaran yang akan dicapai dalam proses tersebut adalah menurunkan

polutan sampai tingkat konsentrasi yang aman (Alexander, 1999). Dalam hal ini,

dilakukan dengan proses nitrifikasi oleh bakteri-bakteri penitrifikasi, khususnya

Nitrosomonas sp. dan Nitrobacter sp.

Bakteri-bakteri penitrifikasi mulai banyak digunakan untuk mengatasi

pencemaran yang disebabkan oleh limbah hasil kegiatan industri, khususnya

untuk penanggulangan pencemaran pada kawasan perairan maupun sistem

akuakultur. Di Indonesia sendiri, penanggulangan pencemaran oleh limbah cair

secara biologis melalui proses nitrifikasi ini semakin berkembang.

Salah satu contoh penggunaan bakteri penitrifikasi (nitrifying bacteria)

dalam mengatasi pencemaran oleh limbah di Indonesia yaitu pada industri minyak

kelapa sawit. Industri minyak kelapa sawit adalah industri hasil pertanian yang

selama proses produksinya banyak menghasilkan air buangan yang memiliki

kandungan TSS (Total Suspended Solid), COD, BOD, dan amonia cukup tinggi.

Pengolahan limbah cair industri minyak kelapa sawit ini dirancang dengan

menggunakan bioreaktor pertumbuhan lekat terfluidasi dengan media poliuretan

untuk proses degradasi senyawa organik dan amonium yang terkandung dalam

limbah cair industri minyak kelapa sawit. Hasil yang diperoleh dari aplikasi

bioreaktor ini yaitu efisiensi penurunan konsentrasi COD berkisar antara 72.85-

83.07% dan efisiensi penurunan amonium berkisar antara 59.64-76.72%

(Agustiyani dan Imamuddin, 2000).

13

Hasil pengujian lain menunjukkan bahwa aplikasi kultur mikroba N-Sw

(kultur mikroba campuran hasil kultivasi dari sludge pengolahan limbah industri

minyak kelapa sawit) selama 12 jam reaksi, konsentrasi N-NH4 mengalami

penurunan dari 178.99 mg/l menjadi 91.60 mg/l, efisiensi penurunan mencapai

48.82%. Efisiensi penurunan N-NH4 meningkat menjadi 100% setelah 24 jam

reaksi. Laju penurunan amonium mencapai 7.46 N-NH4/l/jam/g biomassa.

Efisiensi pembentukan nitrit dan nitrat (nitrifikasi) mencapai 89.59% (Agustiyani

et al., 2007).

Selain dalam pengolahan limbah industri, bakteri penitrifikasi ini juga

berperan dalam budidaya perairan, misalnya saja pada budidaya tambak udang di

Thailand. Sejak dulu, budidaya perairan, khususnya tambak udang di Thailand

memegang peranan utama dalam pertumbuhan ekonomi, seperti juga halnya pada

negara-negara di kawasan Aisa Tenggara lainnya. Penelitian mengenai peran

bakteri penitrifikasi yang diinokulasikan pada tambak udang ini dilakukan dengan

metode molekuler. Metode ini dilakukan dengan identifikasi dan kuantifikasi

bakteri penitrifikasi melalui Fluorescence In Situ Hybridization (FISH)

menggunakan gen 16S rRNA. Hal ini penting dilakukan untuk mengetahui bakteri

penitrifikasi mana yang memegang peranan penting dalam budidaya perairan

dengan tujuan untuk mengetahui bagaimana cara untuk memanipulasi sistem

budidaya tersebut (Paungfoo et al., 2006).

Upaya serupa juga dilakukan pada tambak udang Litopenaeus vannamei di

Indonesia. Akumulasi amonia dan nitrit pada sistem yang dihasilkan oleh udang

dalam sistem statis (batch) dapat menyebabkan kematian pada udang. Penggunaan

bakteri nitrifikasi yang terdiri dari AOB (Ammonium Oxidizing Bacteria) dan

NOB (Nitrite Oxidizing Bacteria) dapat diterapkan untuk meningkatkan kualitas

air dengan mereduksi jumlah amonia dan nitrit. Berdasarkan hasil penelitian

Nestiti (2008) ini, diperoleh bahwa inokulasi bakteri nitrifikasi 24 jam sebelum

udang dimasukan ke dalam tambak dengan sistem statis dapat mempertahankan

kesintasan udang tertinggi hingga 80.67% dengan penurunan konsentrasi amonia

dari 0.103 menjadi 0.01 mg/L. Selain itu, tidak hanya pada sistem statis, baik

strain bakteri pengoksidasi amonia maupun bakteri pengoksidasi nitrit ini juga

14

dapat diinokulasikan pada biofilter dalam tambak udang Litopenaeus vannamei

dengan sistem resirkulasi (Kuhn et al., 2010).

Menurut Davis dan Cornwell (1991), nitrifikasi merupakan metode yang

terbaik karena alasan-alasan sebagai berikut: (1) efisiensi penyisihannya yang

tinggi, (2) reabilitas dan stabilitas prosesnya tinggi, (3) pengontrolan proses yang

mudah, (4) kebutuhan lahan yang minim, dan (5) biaya relatif murah.