32

HASIL

Identifikasi Isolat PMP 0126y

Isolat PMP 0126y merupakan isolat koleksi BBP4BKP yang diisolasi dari

limbah hasil pengolahan rumput laut Glacilaria sp. menjadi agar-agar di daerah

Pemeungpeuk, Jawa Barat. Isolat PMP 0126y dapat tumbuh baik pada media

agar-agar nutrien dan tergolong pada bakteri mesofilik karena tumbuh pada suhu

37 0C.

Isolat PMP 0126y diidentifikasi secara langsung dengan melihat morfologi

koloni bakteri (Gambar 7). Ciri morfologi yang dimiliki oleh isolat PMP 0126y

yaitu warna koloni kuning jingga, bundar, mengkilat. Berdasarkan hasil

pewarnaan Gram menggunakan mikroskop (Olympus DP12) dengan perbesaran

1000 x, isolat PMP 0126y tergolong dalam bakteri Gram negatif berbentuk batang

pendek (Gambar 8).

Gambar 7 Isolat PMP 0126y. Gambar 8 Pewarnaan Gram isolat

PMP 0126y dengan

perbesaran 1000 x.

Analisis gen penyandi 16S-rRNA isolat PMP 0126y dilakukan dengan

proses amplifikasi dengan PCR (GeneAMP PCR System 9700, Applied

Biosystem) menggunakan sekuen komplemen DNA genom isolat PMP 0126y

yang digandakan dengan primer 63f dan 1387r. Gen penyandi 16S-rRNA dari

isolat PMP 0126y yang berhasil diamplifikasi dengan PCR sebesar ±1282 pasang

basa (Gambar 9). Hasil analisis sekuen parsial DNA penyandi 16S-rRNA isolat

PMP 0126y sebanyak 1282 pasang basa dari arah 5’-3’ (Gambar 10).

33

Gambar 9 Hasil amplifikasi dari gen penyandi 16S-rRNA isolat PMP 0126y.

1 GAGAGCGGCG TACGGGTGCG GAACACGTGT GCAACCTGCC TTTATCTGGG

51 GGATAGCCTT TCGAAAGGAA GATTAATACC CCATAATATA TTGAATGGCA

101 TCATTTGATA TTGAAAACTC CGGTGGATAG AGATGGGCAC GCGCAAGATT

151 AGATAGTTGG TGAGGTAACG GCTCACCAAG TCAGCGATCT TTAGGGGGCC

201 TGAGAGGGTG ATCCCCCACA YTGGTAMTTG AGACAMGGRC CCAGAMTYCT

251 TACGGGAGGG CAGCCAGTGA AGGAATATTT GGACAATGGG GTGAGAGCCT

301 TGATCCCAGC CATCCCGGCG TGAAAGGACG ACGGCCCTTA TGGGTTGTAA

351 ACTTYTTTTT GTATAGGGGA TAAACCTACC CTCGTGAGGG TAGCTGAAGG

401 TACTATACGA ATAAGCACCG GCTAACTCCG TGCCAGCAGC CGCGGTAATA

451 CGGAGGGTGC AAGCGTTATC CGGATTTATT GGGTTTAAAG GGTCCGTAGG

501 CTGATTTGTA AGTCAGTGGT GAAATCTCAC AGCTTAACTG TGAAACTGCC

551 ATTGATACTG CAAGTCTTGA GTGTTGTTGA AGTAGCTGGA ATAAGTAGTG

601 TAGCGGTGAA ATGCATAGAT ATTACTTAGA ACACCAATTG CGAAGGCAGG

651 TTACTAAGCA ACAACTGACG CTGATGGACG AAAGCGTGGG GAGCGAACAG

701 GATTAGATAC CCTGGTAGTC CACGCCGTAA ACGATGCTAA CTCGTTTTTG

751 GGCTTTTGGG TTCAGAGACT AAGCGAAAGT GATAAGTTAG CCACCTGGGG

801 AGTACGAACG CAAGTTTGAA ACTCAAAGGA ATTGACGGGG GCCCGCACAA

851 GCGGTGGATT ATGTGGTTTA ATTCGATGAT ACGCGAGGAA CCTTACCAAG

901 GCTTAAATGG GGAAATGACA GGCTTAGAAA ATAGGCTTTT CTTCGGACAT

951 TTTTCAAGGT GCTGCATGGT TGTCGTCAGC TCSTGCCCGT GAGGTGTTAA

1001 GGTTAAGTCC TTGCAACGAA GCGCAACCCC TTGTCACTAR TTTGCCATCA

1051 TTTAAKTTGG GGGACTCTAG TKARAACTGC CTACSCCAAG TARARARGAA

1101 AAGKTGGGGA TRAMGTCAAA TCATCACGGC CCTTACGCCT TGGGCCACAC

1151 ACGTAATACA ATGGCCGGTA CAGAGGGCAG CTACACTGCG AAGTGATGCA

1201 AATCTCGAAA GCCGGTCTCA GTTCGGATTG GAGTCTGCAA CTCGACTCTA

1251 TGAAGCTGGA ATCGCTAGTA ATCGCGCATC AG

Gambar 10 Sebagian sekuen DNA penyandi 16S-rRNA isolat PMP 0126y dari

(arah 5’-3’).

Sekuen komplemen DNA penyandi 16S-rRNA isolat PMP 0126y

dianalisis dengan program FASTA dari koleksi Genebank National Center

Biotechnology Information (NCBI). Berdasarkan analisis sekuen DNA tersebut,

isolat PMP 0126y memiliki kemiripan sebesar 96% dari 1282 nukleotida yang

M + - PMP 0126Y

1282 bp

bp

34

overlapped (bertumpang tindih) dengan 1234 nukleotida dengan bakteri

Chryseobacterium indologenes galur McR-1 (Gambar 11).

Gambar 11 Pohon filogenetik isolat PMP 0126y.

Pertumbuhan dan Produksi Enzim Selulase

Isolat PMP 0126y ditumbuhkan pada media agar-agar yang mengandung

1% CMC membentuk zona bening pada uji kualitatif yang dilakukan (Gambar

12). Zona bening yang dihasilkan menunjukkan adanya enzim selulase

ekstraseluler yang dikeluarkan oleh isolat PMP 0126y. Indeks selulolitik isolat

PMP 0126y sebesar 1,9 pada inkubasi hari kelima dengan pH media 6 dan suhu

37 0C.

35

Gambar 12 Zona bening isolat PMP 0126y.

Isolat PMP 0126y merupakan bakteri aerob yang membutuhkan oksigen

untuk pertumbuhannya. Pada saat dilakukan optimasi produksi enzim, isolat ini

ditumbuhkan pada suhu 30 0C dengan kecepatan agitasi 150 rpm. Pertumbuhan

bakteri dilihat dari nilai kerapatan optis yang dihasilkan pada setiap jam

pengukuran yaitu setiap 3 jam pada panjang gelombang 600 nm (Lampiran 4).

Isolat PMP 0126y mulai mengalami peningkatan pertumbuhan bakteri

(fase eksponensial) pada 6-12 jam inkubasi dengan jumlah sel yang tertinggi

dihasilkan sebesar 9,7 log10 CFU/mL. Selanjutnya pada jam ke-12 sampai jam ke-

21, jumlah sel yang dihasilkan konstan yaitu 9,7 log10 CFU/mL. Pada jam ke-24

sampai jam ke-27 isolat PMP 0126y terjadi penurunan menjadi 8,9 log10 CFU/mL

(Gambar 13).

Gambar 13 Kurva pertumbuhan isolat PMP 0126y.

Kurva pertumbuhan isolat PMP 0126y yang dihasilkan menjadi dasar

waktu penuangan inokulum yang terbaik yaitu saat isolat berumur 6-9 jam.

Diperkirakan bahwa kultur isolat yang akan dituang ke dalam media produksi

sekitar 9,4-9,5 Log sel10/mL. Selanjutnya, optimasi produksi enzim selulase

dilihat dengan mengukur aktivitas selulase yang dihasilkan selama waktu

inkubasi/fermentasi. Pada akhirnya diperoleh aktivitas enzim selulase yang

tertinggi selama enam hari pengamatan yaitu pada hari ketiga inkubasi (Lampiran

36

5), dengan aktivitas selulase sebesar 0,108 U/mL dan aktivitas spesifik

0,120 U/mg serta kadar protein sebesar 0,895 mg/mL. Kadar glukosa yang

dihasilkan pada saat itu sebesar 0,117 mg/L. Fase pertumbuhan eksponensial

bakteri pada media produksi pada hari pertama dan kedua sebesar 9,1 log10

CFU/mL dan jumlah sel terus stabil sampai hari keempat dan semakin menurun

sampai hari keenam dengan jumlah sel bakteri sebesar 8,9 Log10 CFU/mL

(Gambar 14, Lampiran 5).

Gambar 14 Kurva aktivitas selulase, aktivitas spesifik, dan jumlah sel bakteri

PMP 0126y.

Produksi selulase oleh isolat PMP 0126y pada media yang mengandung

glukosa 0,1% menunjukkan aktivitas selulase tertinggi dihasilkan pada hari ketiga

inkubasi (Gambar 15, Lampiran 5) sama seperti pada media produksi yang tidak

mengandung glukosa (Gambar 14).

Gambar 15 Kurva aktivitas selulase, aktivitas spesifik, dan jumlah sel bakteri

PMP 0126y pada media yang mengandung glukosa 0,1%.

37

Penambahan glukosa sebanyak 0,1% pada media produksi menghasilkan

jumlah sel sebesar 9,4 log10 CFU/mL, sedangkan jumlah sel tertinggi pada media

produksi tanpa glukosa hanya 9,1 log10 CFU/mL. Aktivitas selulase yang tertinggi

pada hari ketiga sebesar 0,070 U/mL dan aktivitas spesifik 0,116 U/mg dengan

kadar protein sebesar 0,606 mg/mL pada media produksi yang mengandung

glukosa 0,1%.

Pemurnian Enzim Selulase

Enzim selulase diproduksi selama 3 hari yang menunjukkan waktu

produksi tertinggi, kemudian dimurnikan dengan melakukan pemekatan enzim

melalui dua cara pemekatan yaitu pengendapan amonium sulfat dan ultrafiltrasi.

Persen kadar amonium sulfat yang menghasilkan aktivitas selulase tertinggi

diperoleh pada 50% kejenuhan amonium sulfat. Aktivitas selulase yang dihasilkan

sebesar 0,072 U/mL dan aktivitas spesifik sebesar 0,128 U/mg pada endapan,

sedangkan pada supernatan dihasilkan aktivitas selulase sebesar 0,068 U/mL dan

aktivitas spesifik sebesar 0,105 U/mg. Selulase tanpa penambahan amonium sulfat

(kontrol) memiliki aktivitas sebesar 0,064 U/mL dan aktivitas spesifik

0,075 U/mg (Gambar 16, Lampiran 5).

Gambar 16 Aktivitas spesifik dari pengendapan selulase dengan amonium sulfat.

Selain melakukan pemekatan enzim dengan amonium sulfat, pemekatan

enzim juga dilakukan dengan ultrafiltrasi. Aktivitas selulase yang diperoleh pada

ultrafiltrasi 10 kali pemekatan (10.000 NMWC) sebesar 0,112 U/mL pada hasil

ultrafiltrasi (retentat), dan 0,059 U/mL pada filtrat yang keluar dari alat

38

ultrafiltrasi (permeat). Aktivitas selulase tanpa pemekatan dengan ultrafiltrasi

(kontrol) menghasilkan aktivitas sebesar 0,069 U/mL (Tabel 7).

Tabel 7 Aktivitas selulase hasil ultrafiltrasi

Enzim

selulase

Kadar

glukosa

(mg/L)

Aktivitas

selulase (U/mL)

Kadar protein

(mg/mL)

Aktivitas

spesifik

(U/mg)

Ultrafiltrasi

Retentat 0,121 0,112 0,822 0,136

Permeat

Kontrol

0,064

0,069

0,059

0,064

0,598

0,750

0,099

0,086

Hasil ultrafiltrasi kemudian dimurnikan dengan menggunakan

kromatografi penukar anion menggunakan alat Akta Purifier. Dari 75 fraksi hasil

kromatografi penukar anion, puncak tertinggi dihasilkan oleh fraksi ke-48 pada

konsentrasi NaCl sebesar 37,3 mM (Gambar 17). Hasil uji aktivitas selulase fraksi

ke-48 sebesar 0,154 U/mL dan aktivitas spesifik sebesar 1,301 U/mg. Aktivitas

selulase pada fraksi ke-51 sebesar 0,147 U/mL dan aktivitas spesifik sebesar

1,591 U/mg.

No Fraksi

Gambar 17 Profil elusi enzim selulase pada kromatografi DEAE penukar ion

menggunakan matriks Sepharose.

Hasil uji aktivitas selulase yang dilakukan, memperlihatkan bahwa fraksi

yang membentuk fraksi puncak (fraksi 46-55) dapat menghasilkan aktivitas

mA

U

1 M

NaCl (0,5 M)

0,0 M

46

6

55

6

48

6 51

6

39

selulase (Lampiran 5). Selulase dari fraksi ke-48 dan 51 digabung dan diukur

aktivitasnya sebesar 0,143 U/mL dengan aktivitas spesifik sebesar 1,361 U/mg.

Gabungan fraksi ke-46 sampai fraksi ke-55 (tanpa fraksi 48 & 51) menghasilkan

aktivitas selulase sebesar 0,157 U/ml dengan aktivitas spesifik sebesar

1,297 U/mg.

Hasil pengukuran tingkat kemurnian enzim selulase yang dihasilkan oleh

ultrafiltrasi sebesar 1,58 kali dibandingkan ekstrak kasar, dan tingkat kemurnian

enzim hasil penukar anion (fraksi 48 & 51, fraksi 46-55) secara berturut-turut

sebesar 15,82 dan 15,08 kali (Tabel 8).

Tabel 8 Hasil uji aktivitas selulase PMP 0126y pada beberapa tahap pemurnian

Tahap

pemur-

nian

Volu

me

(ml)

Aktivi-

tas

selulase

(U/mL)

Aktivi-

tas total

(unit)

Konsen-

trasi

protein

(mg/mL)

Protein

total

(mg)

Aktivi-

tas spe-

sifik

(U/mg)

Ren-

de

men

(%)

Ting-

kat

Kemur-

Nian

Ekstrak

kasar 500 0,064 32,0 0,750 375 0,086 100 1,000

Ultrafil-

trasi 50 0,112 5,6 0,822 41,1 0,136 17,5 1,581

Penukar

anion

(fraksi

48 & 51)

10 0,143 1,43 0,105 0,840 1,361 4,47 15,825

Penukar

anion

(46-55)

40 0,157 6,28 0,121 4,84 1,297 19,6 15,081

Analisis Berat Molekul Enzim Selulase Menggunakan SDS-PAGE dan

Zimogram

Pada setiap tahap pemurnian, selulase dari isolat PMP 0126y dianalisis

jumlah pita protein dan berat molekulnya dengan SDS-PAGE (Gambar 18), dan

zimogram dengan menggunakan substrat CMC 0,1% (Gambar 19). Pita protein

enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat PMP 0126y hasil pemekatan

ultrafiltrasi, dengan pewarnaan perak nitrat didapatkan sebanyak 13 pita dengan

berat molekul masing-masing sebesar : 84, 59, 55, 44, 39, 34, 30, 25, 21, 20, 17,

16, 14 kDa. Setelah dilakukan pemurnian ke dalam kolom dengan matriks

Sepharose, pita protein yang dihasilkan sebanyak 5 pita dengan berat molekul

masing-masing pita yaitu 75, 55, 39, 25, 19 kDa.

40

Gambar 18 Hasil elekroforesis SDS-PAGE enzim ultrafiltrasi dan fraksi

pemurnian kromatografi penukar anion (kiri) dan ilustrasi berat

molekul protein selulase PMP 0126y (kanan). Keterangan:

A: Penanda berat protein rendah, B: Ultrafiltrasi, C: Fraksi 47, D:

Fraksi 48, E: Fraksi 49.

Selain SDS-PAGE, analisis zimogram juga dilakukan untuk mengetahui

berat molekul protein enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat PMP 0126y.

Hasil zimogram ditandai dengan terbentuknya zona bening pada gel yang

menunjukkan adanya aktivitas selulase pada gel akrilamida yang mengandung

0,1% CMC. Hasil optimasi waktu inkubasi gel memperlihatkan waktu terbaik

yaitu 60 menit dengan menggunakan bufer sitrat fosfat pH 5 yang didahului

dengan perlakuan renaturasi menggunakan larutan 2,5% Triton X-100 selama

1 jam. Hasil zimogram enzim hasil pemekatan (ultrafiltrasi) menunjukkan ada tiga

molekul protein yang memiliki aktivitas selulolitik pada gel dengan masing-

masing berat molekul yaitu 39, 30, 14 kDa yang dihitung berdasarkan mobilitas

relatif terhadap standar protein (Gambar 19).

41

Gambar 19 Hasil zimogram PMP 0126y pada gel akrilamida mengandung CMC

0,1% (kiri) dan ilustrasi pita yang terbentuk dalam zimogram (kanan).

Keterangan: M: Marker protein rendah A : Enzim hasil ultrafiltrasi,

B : Fraksi KPA (Fraksi 48 & 51).

Ketiga pita protein yang dapat diukur ditunjukkan pada enzim selulase

hasil ultrafiltrasi. Enzim hasil pemurnian dengan kromatografi penukar anion

(gabungan fraksi 48 & 51) tidak dapat terdeteksi. Jumlah enzim yang terlalu

sedikit pada selulase hasil pemurnian kromatografi diduga menjadi penyebab

sehingga zona bening tidak terlihat pada gel dan hanya terlihat pada enzim hasil

ultrafiltrasi.

Karakterisasi Enzim Selulase

pH Optimum. Aktivitas selulase enzim hasil ultrafiltrasi tertinggi

didapatkan pada bufer sitrat fosfat pH 5 dengan nilai aktivitas selulase sebesar

0,088 U/mL (Gambar 20), sedangkan aktivitas tertinggi enzim selulase hasil

pemurnian dengan kromatografi penukar anion (KPA) didapatkan pada bufer dan

pH yang sama yaitu pH 5 dengan aktivitas selulase sebesar 0,142 U/ml (Gambar

21).

42

Gambar 20 Pengaruh pH terhadap aktivitas selulase PMP 0126y hasil ultrafiltrasi.

Pengukuran dilakukan pada suhu 30 0C.

Gambar 21 Pengaruh pH terhadap aktivitas selulase PMP 0126y hasil

kromatografi penukar anion. Pengukuran dilakukan pada suhu

30 0C.

Suhu Optimum. Aktivitas selulase tertinggi yang dihasilkan oleh isolat

PMP 0126y pada enzim hasil ultrafiltrasi didapatkan pada suhu 30 0C dengan nilai

aktivitas sebesar 0,086 U/mL, sedangkan suhu optimum enzim hasil kromatografi

penukar anion ialah suhu 40 0C dengan aktivitas sebesar 0,145 U/mL (Gambar

22).

43

Gambar 22 Suhu optimum aktivitas selulase PMP 0126y hasil ultrafiltrasi dan

kromatografi penukar anion. Pengukuran dilakukan pada bufer sitrat

fosfat pH 5.

Hasil uji stabilitas pada variasi suhu 30, 40, 50 0C yang diperlakukan pada

enzim selulase PMP 0126y memperlihatkan bahwa enzim selulase relatif stabil

pada ketiga suhu tersebut. Sampai dengan 240 jam waktu inkubasi enzim, tidak

terjadi penurunan aktivitas relatif enzim masih di atas 50% dari aktivitas relatif

optimum (Gambar 23).

Gambar 23 Pengaruh suhu dan waktu inkubasi terhadap aktivitas selulase PMP

0126y. Pengukuran dilakukan pada bufer sitrat fosfat pH 5 dan suhu

30 0C, 40

0C, 50

0C.

Substrat Spesifik. Pengujian aktivitas enzim selulase hasil ultrafiltasi

pada berbagai substrat menunjukkan aktivitas tertinggi pada substrat limbah

rumput laut Glacilaria sp. dari pengolahan agar-agar Pameungpeuk yang telah

(0C)

Waktu inkubasi enzim (menit)

44

didelignifikasi dengan NaOH 6% (Lampiran 6), dengan aktivitas selulase sebesar

0,149 U/mL, diikuti aktivitas selulase pada limbah rumput laut dari pengolahan

agar-agar PT. Agarindo sebesar 0,133 U/mL (Gambar 24).

Gambar 24 Substrat spesifik enzim selulase isolat PMP 0126y hasil ultrafiltrasi.

Pengukuran dilakukan pada bufer sitrat fosfat pH 5 dan suhu 30 0C.

Keterangan : a) CMC murni, b) CMC teknis, c) Avisel, d) kertas

Whatman No.1 e) limbah agar-agar PT Agarindo NaOH 6%, f) limbah

Alginat, g) limbah agar-agar Pameungpeuk NaOH 4%, h) limbah

agar-agar Pameungpeuk NaOH 6%, dan i) limbah agar-agar

Pameungpeuk H2SO4 1%.

Pengaruh Ion Logam terhadap Aktivitas Selulase. Beberapa ion logam

ditambahkan pada reaksi uji aktivitas selulase isolat PMP 0126y untuk

mengetahui pengaruh ion logam terhadap aktivitas selulase. Pada konsentrasi

5 mM logam dapat meningkatkan aktivitas relatif secara berturut-turut menjadi

153% pada CaCl2 dan 129% pada MgCl2 dari aktivitas relatif optimum (100%)

enzim selulase tanpa penambahan logam. Akan tetapi, pada konsentrasi 10 mM,

logam KCl dan FeCl3 dapat meningkatkan aktivitas relatif secara berturut-turut

menjadi 109% dan 111%. Penurunan aktivitas relatif sebanyak 50% terjadi pada

penambahan logam ZnCl2 10 mM yaitu sebesar 78% dengan aktivitas relatif yang

tersisa sebesar 22% (Gambar 25, Lampiran 4).

45

Gambar 25 Aktivitas relatif selulase isolat PMP 0126y hasil ultrafiltrasi pada

penambahan logam 5 mM dan 10 mM. Pengukuran dilakukan pada

bufer sitrat fosfat pH 5 dan suhu 30 0C.

Pada penambahan senyawa pengkelat logam seperti EDTA dapat

menurunkan aktivitas relatif selulase PMP 0126y sebesar 19% pada konsentrasi

5 mM dan 34% pada konsentrasi 10 mM. Penambahan senyawa pengkelat logam

dengan CaCl2 5 mM menurunkan aktivitas relatif sebesar 53% dengan aktivitas

relatif yang tersisa sebesar 47%.

MgCl2 FeCl3 CaCl2 ZnCl2