ifcl;' /dcjrepository.unair.ac.id/82643/2/kk tf 04 88 poe o.pdf · 2019. 5. 23. · titrasi...

IR - Perpustakaan Universitas Airlangga

TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI

OPTIKASI FASE MOBIL PADA HPLC UN'M ANALISIS CAMPURAN

PARASETAMOL, KOFEINA DAN PROPIFENAZON

ifcl;' /dcJ Ice o

.'I.IL .. ItPUSTAJIi.ull

• ... SRSITAS Ala.IIA"-&"t ,---=1 U II. A B A 'I' A I

TESIS Diajukan Untuk Memenuhi Persyaratan Pendidikan

Pascasarjana Program Studi Ilmu Farmasi

OLEH : SRI POEDJIARTI

UNIVERSITAS AIRLANGGA FAKULTAS PASCASARJANA

1988



TESIS

DIAJUKAN UNTUK MEMENUHI PERSYARATAN

·PENDIDIKAN PASCA~ARJANA PROGRAM GELAR

PROGRA~ STUDI ILMU FARMASI

01eh

Sri Poedj iarti

NIM: 098410072 M

Disetujui oleh pemb~bing

"----=----,,....,.,-.....,,.---Dr so. Soem.adi

NIP: 130189849

Program Studi

NIP

.--===----------------

Cholies Zaihi

NIP : 130355372

130517154



•

PANTIA PENILAI / PENGUJI TESIS

Ketua Drs. LB. Pasha

Anggota . Drs. Soemadi . Dr. Ami Soewandi J.S

Dr. 1I. Zainuddin

Dr. Gunawan Indrayanto



UCAPAN TERIHA KASIH

Atas berkat rahmat Allah yang maha kuasa, tesis inl

dapat diselesaikan untuk memenuhi persyaratan Pendidikan

Pascasarjana Program Gelar , Program stud! llmu Farmasi,

Fakultas Pascasarjana Universitas Airlangga.

Untuk itu terima kasih yang sedalam-dalamnya saya sampaikan

kepada

Universitas Airlangga khususnya Fakultas Farmasi, yang

telah memberikan kesempatan untuk menglkutl Program

Pendidikan Pascasarjana dan Fakultas Pascasarjana yang telah

mengelola program pendidikan Pascasarjana.

Tim Manajemen Program Doktor TMPD}

Pendidikan dan Kebudayaan Republik Indonesia,

memberikan biaslswa selama pendidikan.

Jurusan Kimia Farmasi Fakultas Farmasi

Departemen

yang telah

Universitas

Airlangga, yang telah menyediakan £asilitas selama peneliti

an.

perpustakaan Universitas Airlangga, yang telah

menyedlakan acuan-acuan yang sangat membantu selama penelltl

an.

Drs. Soemadi dan Dr. H.Zainuddln, yang telah membimbing

dan banyak memberikan saran selama penelitlan.

Dr. Gunawan Indrayanto, yang telah membantu dalam

pengoperasian HPLC.

11



iii

Semua pihak yang tidak dapat saya sebut satu persatu,

yang telah memberikan dorongan moral maupun material selama

saya mengikutl program pendidikan Pascasarjana.

Suam!, anak-anak dan seluruh keluarga yang memberlkan

pengertian serta dorongan hlngga selesainya tests inl.

Semoga Allah SWT memberikan balasan yang setlmpal.

Amin.



ABSTRAK

Dalam usaha untuk mendapatkan kondisi optimal pada

anallsis sediaan analgesik campuran parasetamol, kofeina dan

propifenazon dengan HPLC, telah dilakukan optimasi fase

mobil, Buhu kolom dan pH.

Hasil optimasi fase mobil menggunakan campuran metanol-

air dengan cara "window diagram", dldapatkan kondisi optimal

pada campuran metanol-air dengan perbandingan masing-masing

65\ dan 35\ .

Berdasarkan kriteria hargaot dan Rs pada optimasl suhu

kolom dan pH dihasilkan kondisi optimal pada pH = 7 dan suhu o

kolom 50 C.

Aplikasi anal isis kuantitatif dilakukan terhadap serbuk

campuran parasetamol, kofeina dan propifenazon sesua! formula

sediaan memberikan ketelltian yang cUkup baik untuk

parasetamol ( "recovery" 102,58\ dan KV 1,49% ) dan

propifenazon ("recovery" 98,80\ dan KV 2,83\), sedangkan

ketelitlan untuk kofeina kurang balk ("recovery" 96,88\ dan

KV 9,70\). Hasil uji t menunjukkan ketepatan yang baik untuk

kofeina dan proplfenazon ( tidak ada perbedaan yang bermakna

antara kadar rata-rata yang dlperoleh dengan kadar

sesungguhnya dan ketepatan yang kurang balk untuk

parasetamol ada perbedaan yang bermakna antara kadar

rata-rata yang dlperoleh dengan kadar sesungguhnya ) pada

derajat kemaknaan 0(= 0,05

iv



DAFTAR lSI

UCAPAN TERIHA KASIH ............................ .

ABSTRAK ••• ...................................... DAFTAR lSI ... ................................... DAFTAR TABEL. .................................. DAFTAR GAMBAR. . .............................. . DAFTAR LAMP IRAN •

BAB

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

I. PENDAHULUAN .................................

II.

1. Latar belakang · ......................... . 2. Permasalahan · ........................... . 3. Tujuan penelitian ........................

TINJAUAN PUSTAKA · ......................... . 1. Tinjauan tentang HPLC

1.1. Teari dasar

................... · ......................... .

1.2. Kromatografi fase balik · ............. . 1.3. Optimasi dalam kromatografi cair

1.3.1 .Optimasi fase mobil · ............. . 1. 3.2 .Optimasi suhu dan pH · ............. .

1.4. Analisis kuantitatif .................. 1.5. Peralatan · ........................... .

·2. Tinjauan tentang bahan obat ................•

2.1. Parasetamol · ........................... . 2 .2.

2.3.

Propifenazon ............................ .

Kofeina . ................................ .

v

Halaman

il

iv

v

ix

xi

xiii

1

1

4

5

6

6

6

1/'

16

18

22

23

24

21

28

28

28



III. BAHAN, ALAT DAN METOOE ••••.•• .•••••••••..• 30

1. Bahan ..•...••............••.......•...• 30

2. Alat •....•..•••..••••..•...•....••.•••. 30

3. Hetode ...•...........••...•.........••• 31

3.1. Uji kualitatif bahan obat yang digunakan 31

3.2. Pembuatan larutan sampel .... ..••.••.. 31

3.2.1.Pernbuatan larutan standar tunggal ••• ~1

3.2.2.Pembuatan l~rutan sampel campuran

parasetamol,Kofeina dan propifenazon

3.3. Optimasi parameter •.•••••••••••.••••• 32

3.3.1.0ptimasi fase mobil................. 32

3.3.2.Penentuan campuran fase mobil optimal 33

3.3.3.Penentuan suhu optimal ".............. 33.

3.3.4.Penentuan pH optimal •...••.•.••••.•• 33

3.4. Penetuan Kadar parasetamol,kofeina dan

propifenazon dalam sampel ............ 33

3.4.1.Pembuatan sampel campuran parasetamol,

kofelna dan proplfenazon ........... . 34

3.4.2.Penetuan kurva kalibrasi campuran

parasetamol, kofeina dan proplfenazon 34

3.4.3.Pembuatan larutan sampel

................... 3.4.4.Perhitungan kadar

3.5. Analisa data .........................

35

35

3.5

IV. HASIL PENELITIAN •.•..••••••••••••••••.•.••. 37

I.Hasil uji kualitati£ palasetamol, kofeina

d 'f 3.7' an propl enazon ........................ .

vi



1.1. Penentuan spektra absorbs! ........... .

1. 2. Penentuan suhu lebur ................. .

2. Optimasi parameter ..................... .

2.1. Optimasi fase mobil .................. .

2.1.1. Penentuan harga Rs dan 0(. dengan fase

mobil asetonitril-air ............... .

2.1.2. Penentuan harga Rs dan 0( dengan fase

mobil metanol~air

2.2. Penentuan suhu kolom optimal ......... .

2.3. Penentuan pH optimal ................. .

3. Penentuan kadar parasetamol, ko£eina dan

propifenazon dalam sampel .... : ......... .

3.1. Penentuan kurva kalibrasi campuran

parasetamo!, kofeina dan propifenazon .

3.2. Penentuan kadar campuran parasetamol,

kofeina dan propifenazon dengan metode

standar eksternal ..................... 3.3. Perhitungan kadar ..................... 4. Analisa data ........................... .

V. PEMBAHASAN . ............................. . VI. KESIMPULAN ............................... VI I . SARAN -SARAN ............................. .

VIII. OAFTAR PUSTAKA .......................... .

r-------WI all.

nlIlPUSTAI~ • nlTBaSIT A.S A.lllU ..... I

IUJlA .... Y4

37

37

45

45

45

51

56

56

62

62

:67

68

68

74 . '. eo

.81

82

vU



DAFT AR TABEL

TABEL

1. Retensi relatif (C() dan resolusi (Rs) dari

parasetamol terhadap kofeina dan propifena-

zon dengan fase mobil asetonitril-air ••.•.

2. Retensi relatif (c() dan resolusi (Rs) dari


zon dengan lase mobil metanol-air

3. Retensi relatif (ae) dan resolusi (Rs) dari


zon dengan lase mobil metanol-air ( 65:35 )

pada suhu yang berbeda ••••••••••••••••••••

4. Retensi relatif (c(.) dan resolusi (Rs) dari


zon dengan fase mobil metanol-air ( 65:35 ) o

suhu 50 C pada pH yang berbeda •..•••••••••

5. Hasil pengamatan penetapan kadar

parasetamol, ko£eina dan propifenazon dalam

sampel dengan HPLC ...................... 6. Hasil penetapan kadar parasetamol dalam sam-

pel dengan metode standar eksternal

7. Hasil penetapan kadar kofeina dalam sampel-

dengan metode standar eksternal •. , ••.•••..

8. Hasil penetapan kadar propifenazon dalam

sampel dengan metode standar eksternal ....

Lx

Halaman

46

51

56

58

70

71

72

73



9. Waktu retensi dari parasetamol, kofeina dan

propifenazon dengan fase mobil metanol-air

dalam berbagai perbandingan •..•....•..•••• 76

x



DAFTAR GAMBAR

GAMBAR

1. Spektra absorbsi parasetamol dalam pelarut-

metana! ................................... 2. Spektra absorbsi kofeina dalam pelarut

metanal ........... ~ ....................... . 3. Spektra absorbsi propifenazon dalam pelarut

metano! .................................... 4. Termogram DSC parasetamol ................ .

5. Termogram DSC kofeina .................... .

6. Termogram DSC propifenazon ............... .

7. Kromatograrn dengan fase mobil rnetanol-air

masing-masing 50%:50\, 60\:~O%, 65\:35\

dan 70\:30% .............................. .

8. Kromatogram dengan fase mobil

air masing-masing 40%:60\,

asetonitril-

50'1.: 50'1. dan

60%:40% .•••.••••••••••••••••••••••••••••••

9. Kurva hubungan harga 0( dengan fase mobi 1

asetonitrl1-air pada berbagai macam

perbandingan ............................. .

10.Kurva hubungan harga Rs dengan £ase mobil

asetonitril-air pada berbagai macam

perbandingan ............•.................

11. Kurva hubungan harga oc:: dengan fase mobIl

metanol-air pada berbagai rnacam perbanding-

an ........................................ xi

Halaman

38

39

40

42

43

44

47

48

49

50

53



12. Kurva hubungan harga Rs dengan fase mobil

metano!-air pad a berbagai macam perbanding-

an ........................................ 13. "Window diagram" untuk pemisahan

parasetarnol, kofeina dan propifenazon .....

14. Kromatogram dengan fase mobil metanol-air o 0 0

(65:35) pada suhu 30 C, 40 C dan 50 C ...

15. Kurva hubungan suhu dengan harga oc ,dengan

fase mobil metanol-air (65:35) ........... .

16. Kurva hubungan suhu dengan harga Rs dengan

lase mobil metano!-air (65:35) ............ 17. Kromatograrn dengan lase mobll metanol-air

o (65:35), suhu 50 C pada pH=3, pH=4, pH=5,

pH=6 dan pH=7 ............................ 18. Kurva hubungan pH dengan harga OC dengan

0

fase mobil metano!-air (65:35), suhu 50 C . 19. Kurva hubungan pH dengan harga Rs dengan

0

fase mobil metanol-air (65:35), suhu 50 C . 20. Kurva kalibrasi parasetamol ....•...••.••..

21. Kurva kalibrasi kofelna .................. .

22. Kurva kalibrasi propifenazon .............•

23. Kromatogram ana1isis kuantitatif campuran

parasetamol, kofeina dan propifenazon .....

54

55

57

59

60

61

63

64

65

55

67

69

xii



DAFT AR LAMP I RAN

LAMP IRAN

1. Uji t kadar rata-rata "recovery"

parasetamol dengan kadar sesungguhnya ....

2. Uji t dari rata-rata "recovery"

ko£eina dengan kada"r sesungguhnya •••••.••

3. Uji t dari rata-rata "recovery" propifena-

zon ....................................... 4. Hasli penetapan kadar campuran parasetamol,

kofeina dan propifenazon dengan HPLC

menggunakan standar eksternal .. ~ ......... . 5. Tabe 1 t .................................. .

6. Koefisien korelasi r xy •••..•••.••••.•••.••

7. Hasll perhitungan adanya korelasi linier

antara konsentrasi dan area ••.•••••..•..

xiii

Halaman

86

87

BB

B9

9~

91

92



1. Latar belakang.

BAS I

PENDAHULUAN

Produksi obat-obatan di Indonesia dalam dua dekade

.terakhir ini mengalami perkembangan yang sangat pesat baik

dalam jenis maupun jumlahnya. Termasuk di dalamnya ohat-obat

golongan

campuran.

analgesik, baik dalam bentuk tunggal maupun

Dari jumlah sediaan analgesik yang beredar di Indonesia

lebih ku~ang 35\ adalah kombinasi yang mengandung parasetamol

(1) • Dimana 10\ kombinasi tersebut adalah campuran

parasetamol, kofeina dan propifenazon yang diformulasi selain

untuk mengurangi des is parasetame1 dan prepifenazon, juga

untuk efek potensiasi dan memperkecil efek samping. Sedangkan

kofeina ditambahkan untuk menaikkan ni1ai

sakit (2).

ambang rasa

Berdasar kenyataan diatas, maka perlu dicari suatu meto-

de analisis kuantitatif maupun kualitatif yang dapat

diandalkan untuk kontrol kualitas obat guna menjamin mutu

ohat yang sedang diproduksi maupun yang telah beredar.

Penentuan kadar parasetamol dalam campuran obat

analgesik sangat sul1t dan memerlukan waktu yang cukup lama.

cara-cara yang selama ini diqunakan antara lain metode

spektrofotometri lembayung-ultra untuk campuran parasetamol

vitamin C (3), metode spektrofotometri in1 mempunyai kerugian

1



2

yaitu waktu analisisnya relatif lebih lama dan untuk

penentuan kadar secara simultan masing-masinq komponen dalam

campuran obat analgesik terse but harus mempunyai panjang

gelombang maksimum yang berbeda (4). Metode volumetri tidak

dapat digunakan secara langsung oleh karena dlperlukan

pemisahan komponen-komponennya terlebih dahulu. Misalnya

titrasi bebas air untuk penentuan kadar parasetamol, tidak

dapat dilakukan secara simultan dengan obat-obat yang

bersifat basa misalnya kofeina (5).

Untuk beberapa campuran parasetamol dalam sediaan obat

analgesik dapat dipisahkan dan sekaligus ditentukan kadarnya

dengan kromatografi cair tekanan tinggi ( HPLC ) (6,7).

Sampai saat in1 penentuan kadar kombinasi parasetamol,

kofeina dan propifenazon dengan HPLC belum pernah dilaporkan.

Sejak tahun 1967 HPLC merupakan salah satu metode

anal isis yang banyak dikembangkan untuk analisis obat-

obatan. Untuk mendapatkan

anal isis bidang farmasi

gambaran perkembangan

antara lain dengan

HPLC dalam

meninjau

banyaknya publikasi mengenai anal isis obat-obatan memakai

HPLC dalam jurnal-jurnal antara lain Journal of

Pharmaceutical Sciences atau Journal of Chromatography,

dimana ditemukan 5 - 10 publlkasi analisis obat dengan HPLC

setiap bulan pada tahun 1983 (8). Pada tahun 1984 92\

diantara obat-obatan baru yang didaftarkan ke FDA, memakai

HPLC sebagai metode analisisnya (9).



3

Geja!a in1 disebabkan karena HPLe mempunyai selektivitas

yang tinggl dan dapat digu.nakan untuk penetapan senyawa-

senyawa balk yang menguap, yang tidak menguap maupun yang

terurai karena pemanasan (10).

Ada beberapa parameter pada anal isis HPLC yang

mempengaruhi hasil anallsisnyai untUk mendapatkan pemisahan

yang terbaik dengan waktu anal isis yang relatif singkat

parameter-parameter t~rsebut dapat dioptimasikan (11) •

Optimasi dapat dilakukan terhadap kolom (fase diam), fase

mobil, suhu dan pH.

Menurut tear! solvofobik dari Horvath (12) yang

didasarkan pada polaritas solut dan £ase mobil, maka ada

beberapa macam cara optimasi £ase mobil yang dikemukakan oleh

para ahli antara lain: cara diagram tiga titik kapasitas

faktor (13), cara komputer (14), cara "window diagram"

(13,15,16) dan cara segi tiga dari Snyder (17).

Optimasi kolom jarang dilakukan karena biasanya kolom

yang dipakai sudah tertentu (panjang, ukuran partikel, cara

paking) (9).

Pada pemisahan dengan HPLC, perubahan suhu kolom

ditujukan untuk mempercepat analisis. Kenaikan suhu, pada

beberapa kasus dapat menyebabkan penurunan harga kapasitas

faktor (k) dari komponen. Besarnya pengaruh suhu kolom pada

barga kapasitas faktor ini berbeda untuk komponen-komponen

sampel tertentu. Efek ini telah terbukti dapat mempertinggi

selektivitas (IS).

r-- .. --1-"'-1-.----- l

t J1Il!.PUSTA&:....... \ -UIYBltSlTAS AlRh.,C.:~~1I t

'UitABAYA ~._ ---------_.



4

Pengaturan pH dapat mengubah waktu retensi, oleh karena

so!ut-solut yang mengion akan berantaraksi lebih kuat dengan

lase mobil dari pada solut-solut yang tidak mengion. Sehingga

solut-solut yang mengion akan dielusi lebih cepat.

Beberapa keunggulan lain dari HPLC adalah . . dapat

digunakan untuk analisis kuantitatif campuran obat sekaligus

tanpa melakukan pemisahan terlebih dahulu, "reproducible" dan

waktu anal iSis yang slngkat (19).

2. Permasalahan.

cara analisis kombinasi obat analgesik secara simultan

dengan metode-metode : spektrofotometrl lembayung ultra dan

titrasi volumetri masih dijumpai kesulltan-kesulltan. Pada

penggunaan metode HPLC didapat hasil yang relatif memuaskan

dengan melakukan optimasi. parameternya.

Pada umumnya anal isis sediaan-sediaan analgesik dapat

dilakukan dilakukan dengan car a HPLC, antara lain karena

adanya perbedaan polaritas dari masing-masing komponen

analgesik.

Sampai saat ini , anal isis campuran parasetamol, kofeina

dan propifenazon belum pernah dilaporkan

Berdasarkan hal-hal tersebut diatas, maka timbul

permasalahan apakah campuran parasetamol, kofeina dan

propifenazon dapat dianalisis dengan metode HPLC melalui

optimasi parameter-parameternya.



5

3. Tujuan penelitian.

Bertitik tolak dart permasalahan yang telah diuraikan

dlatas, maka tujuan penelitian In1 adalah mendapatkan keadaan

kondisi parameter optimal pada anal isis HPLC untuk campuran

parasetamol, kofeina dan propifenazon.

Untuk mencapai tujuan itu dilakukan tahapan-tahapan :

1. Pemilihan dan optimasi fase mobil, optimasi suhu kolom dan

optimasi pH, yang dlukur berdasar kriteria harga resolusi

(Rs) dan harga retensi relatif (ot).

2. Pengujian hasil optimasi yang didapat, untuk analisis

contoh sediaan tablet campuran parasetamol, kofeina dan

propifenazon yang dibuat sesuai formula sediaan dan

diukur dengan ketepatan dan ketelitian pada 0(= 0,05 dan

replikasi lima kali. •



BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

10 Tinjauan tontanq HoPoLoCo

Kromatografi terutama kromatografi cair sangat luas

digunakan untuk pemisahan dan analisis kimia. Tetapi sejak

diperkenalkan kroma~ografi gas oleh James dan Martin (20),

maka penggunaan kromatografi ca~r boleh dikatakan tidak

berkembang. Baru sejak 1967 krornatografi cair mengalami

kemajuan yang dramatis dan dapat menyaingi krornatografl

gas dalam hal kecepatan analisis, selektivitas dan

sensitivitas. Teknik yang baru in1 dikenal sebagai HPLC

(High Performance Liquid Chromatography) (20,21).

Meskipun kolom yang dlpakai pada HPLe relatif pendek

dibandingkan dengan kromatografi gas, tetapi kesulitan

pemisahan dapat diatasi karena HPLe mempunyai selektifitas

tingqi 0 Hal itu dipero1eh melalui pemilihan fase

mobil,pengaturan perbandingan fase mobil dan dapat

digunakan bermacam macam mekanisme pemisahan rnisalnya

adsorpsi, petukaran ion atau partisi (21).

Usaha pengembangan penggunaan kromatografi cair

pertarna tama dilakukan dengan pemilihan kolom yang lebih

efisien dan pengaturan fase mobil •

1.1. Teori dasar

Hekanisme pemisahan yang mendasari HPLC adalah proses

6



7

adsorpsi, partisi, pertukaran ion atau permeasi gel,

dimana mekanisme terse but pada dasarnya ada satu

kesamaan konsep yaitu konsep distribusi solut dalam

sistem dua fase yang dlnyatakan dengan koefisien

distribusi ( K ).

Distribusi solut dalam dua fase tersebut, yaitu

fase diam dan fase mobil dapat terjadl karena perbedaan

gaya adsorpsi . (kromatografi adsorps i) kelarutan

(kromatografl partial) afinltas terhadap resin penukar

ion (kromatografl pertukaran ion) atau ukuran/berat

molekul solut (kromatografl permeasi) (19).

Prinsip dasar yang dapat digunakan untuk semua tipe

kromatografi di atas adalah mekanisme pemisahan

berdasarkan perlstiwa partisl (22).

Dalam kromatografi partisl cair-cair, peristiwa

pemisahan dapat diterangkan melalui skema sebagai berikut:

------------------------------------------------------1

Fase mobil (M) 'I'" 1 -------------'t 1 1 1 1

------------------1----1-----1-----1------------------1 1 1 1

Fase dlam (8) 1 1 1 1 1 1 .v 1

------------------------------------------------------Fase mobil berfungsi sebagai pembawa dan penggerak

solut, yang akan bergerak sepanjang kolom (fase diam)

dengan kecepatan konstan.

Distribusi molekul salut (sampel) diantara dua fase



8

diatur oleh konstante kesetimbangan, yang dikenal

sebagai koefisien distribusi It, dalam hal partisl

disebut dengan koefisien partisi. Partisi adalah

proses dinamis dimana molekul selama bergerak rnengalami

kesetimbangan (keluar-masuk diantara dua fase) sehingga

pada suatu waktu tertentu perbandingan konsentrasi rata-

rata solut menurut hukum dist~ibusi sebagai berikut :

Cs K = ( 1 )

Cm

Cs = konsentrasi solut dalam fase diam

em = konsentrasi solut dalam fase mobil

Harga K menentukan perbandingan konsentrasi solut dalarn

dua fase. Bila harga K besar, maka Cs relatif lebih

besar dari pada em dan mo!eku!-molekul solut terse but

secara rata-rata akan tinggal lebih lama dalam fase

dlam. Pada kesetlmbangan dinamis fraksi waktu (terhadap

total waktu) yang dialami solut berada dalam fase mobil

ekivalen dengan fraksi solut (terhadap jumlah total

solut) yang berada dalam fase mobil.

Blla fraksi waktu solut dalam fase mobil adalah t,

maka

jumlah solut dalam fase mobil t = -------------------------------------______ _

jumlah total solut dalam fase mobil dan diam

Cm • Vm = ------------------

Cm . Vm t Cs . Vs

3



9

dimana Vm = volume fase mobil

Va = volume fase diam

Biia pembilang dan penyebut dibagi dengan Cm.Vm maka:

1 t = ----------------

l+Cs.Vs

Cm.Vm

1 = ----------------

Vs 1 + K -------

Vm

bila Vs K = k f

Vrn maka

1 t = --------- ( 2 )

1 + k t

dimana k I disebut fat tar kapasitas, yaitu perbandingan

jumlah molekul solut dalam £ase diam dan fase mobil.

Jarak tempuh solut (d) dalam pergerakannya

dlsepanjang fase diam adalah sama- dengan hasil kali

kecepatan linier fase mobil ~), dengan fraksi waktu

solut berada dalam fase mobil (t), maka dart persamaan 2

di atas didapat

1 d = Al -------- ( 3 )

1 + k I



10

Waktu yang dlbutuhkan solut untuk menempuh jarak

sepanjang kolom L, disebut waktu retens i « tL.

Darl definisi dan persamaan 3 maka :

L tr = ----- ( 1 + k' )

,u

tr = tm ( 1 + k' ) ( 4

dimana trn = waktu yang diperlukan molekul fase mobil

menempuh kolom • C. tm = L/jU ) (22, 23).

Pengukuran waktu retensi tidak dapat dipakai untuk

mengidentifikasi suatu komponen, karena tr dltentukan

oleh susunan dan cara kerja kolom, sehingga tr adalah

karakteristlk terhadap suatu komponen, tetapi tidak

spesifik. Haka untuk dapat mengidentifikasi suatu

komponen dapat dipakai parameter lain yang disebut

retensi relatif (0() dengan jalan membandingkan waktu

retensi komponen terse but dengan waktu retensi standar

pada kondisi kromatografi yang sarna

dapat dirurnuskan sebagai berikut

tr - tm oC =

tr* - tm

Retensi relatif

dirnana tr* = waktu retensi dari standar

tm = waktu yang diperlukan un~uk mengelusi

kornponen yang tidak ditahan oleh kolorn.

tr = waktu retensi dari kornponen sampel.

disini tm pada kondisi kromatografi yang sarna adalah

konstan (23).



11

untuk pemisahan ~ua kornponen, maka harga adalah

perbandingan waktu retensi dari komponen A dan a, dapat

dinyatakan seperti persamaan berikut :

tr B 0<: =

tr A

Sebagai pembilang adalah waktu retensi yang leblh

besar (24).

Hartin dan Synge mengernukakan adanya kesamaan

antara proses yang terjadl dalam kromatografi kolom dan

kolom destilasi fraks! yang disesuaikan dengan konsep

teeri pelat. Digambarkan bahwa kolom pada kromatografl

partisi terdiri dari sejumlah besar Delat teQritis iRl

yaitu sekat-sekat datal dimana terjadl kesetlmbangan

solut diantara fase mobil dan £ase dlam. Satu pelat

teoritis analog dengan satu unit mesln Craig ( akan

menghasilkan pemisahan yang sarna ).

Jumlah pelat teoritis (N) dapat dihitung secara

emplris dari kromatogram yang terjadl gambar 1 ) I

yai tu :

4 tr 2 N = ------ J ( 5 )

W

tr = waktu retensi.

W = lebar puncak kromatografi.



12

'. Gambar 1 Hasil kromatogram sebuah komponen dalam

HPLC.

Banyaknya pelat tear i tis dapat digunakan sebagai

ukuran efisiensi kolom. Berdasarkan konsep in1 keadaan

ideal dapat didekati dengan cara meningkatkan jumlah

pelat teoritis, yang dapat dilakukan dengan cara mem-

perpanjang kolom yang digunakan. Tetapi cara In1 ter-

nyata tidak membantu banyak, sebab dengan memperpanjang

kolom dua kali lipat penyempitan lebar puncak yang

diperoleh hanya Vi dar i semula (23).

Besaran lain yang berhubungan dengan pelat teoritis

adalah HEIf. ("Height equivalent to a theoretical plate")

yaitu ukuran besarnya ruang atau unit kolom yang di

tempati oleh satu pelat teoritis ( = H). Dapat diru-

muskan sebagai berikut :

L H = ----- dar! persamaan 5, maka

N

L W 2 H = [ 1

16 tr

Keadaan ideal dicapai bila harga H mendekati 0 yang

dapat dilakukan dengan cara mengatur faktor-faktor yang

mempengaruhi harga H tersebut (23).

i .



13

Hal yang penting dalam melakukan pemisahan komponen

adalah dapat terpisahnya masing-masing komponen yang

dinyatakan sebagai derajat pemisahan atau Resolusi (RS).

Resolusi dari dua komponen seperti terlihat pada gambar

2 yang mempunyai waktu retensi ttl lebar dasar

puncak WI adalah

2 Rs = ----------------~----

~" ==:;/\t-'rl

~w~- -,.H --w;::.;r;....·_--

Gambar 2 Hasil kromatogram dua komponen

Untuk suatu pemisahan yang baik ( kedua puncak kom-

ponen terpisah sempurna hingga garis dasarnya ) maka

harga Rs hendaknya lebih besar dari 1,5 (22,23) Tetapi

untuk mencapai resolusi yang cukup pada pemisahan sampel

yang terdiri banyak komponen adalah sangat sukar. Cara

umum untuk memperbaiki resolusi adalah sebagai berikut :

1. Meningkatkan ~tr = tr2 dapat dilakukan

antara lain dengan :

a. meningkatkan panjang kolom L.

b. memperbaiki faktor pemisahan



14

tr 2 0<: =

tr 1

dengan merubah fase diarn dan fase mobil

2. Hempersempit lebar puncak (W) antara lain dengan:

a.menggunakan partikel paking kolom yang lebih

keell dan bentuknya seragam.

b.menlngkatkan area an tar fase, dilakukan dengan:

- optimasl·kecepatan aliran fase mobil.

- mengurangi jumlah sampel.

- menurunkan diameter kolom (23).

1.2. Kromatografi fase balik (Reversed phase chromatography).

Kelom bersifat non polar terdlri dar! ligand non polar

yang terikat pada permukaan partike! slIika mikro

porous. Dikenal beberapa macam kolom RPe antara lain:

- O.D.S.(Oktadesil sllan) : C 18.

- O.S.(Oktll allan) : C 8.

- C.N.(Sianopropil).

- Fenil etil.

Kerangka fase diam non polar dar! kolom RPC dapat

digambarkan sebagal berikut

c, c, c, C, I I I I

HO - 51- 0" SI _ 0 _Si_ D _ 5i

I /\ I /\ 0 0 0 0" 0 0

"=2,8,18 I / \ / \ -Si _ 0 - s, - 0 - s. - o - 50

- 0 _ ,,-I I I I I

P E R M U K A A N S I L I K A

Gamhar 3 . Kerangka fase diam kolom RPC. .



15

Fase mobil yang digunakan dalam RPC bersifat polar me

rupakan campuran metanal, asetonitril atau tetrahldro

furan dengan air.

Proses pemlsahan HPLC sebagian besar (70%J dl1akukan

memakai kolom RPC yang memiliki

antara lain :

keuntungan-keuntungan

- dapat digunakan dengan lingkup yang lebih luas.

- pada paklng RPC c~pat diperoleh kesetimbangan.

- solven organik yang digunakan lebih sedikit.

- pengoperasiannya lebih mudah.

Peristiwa

polaritas

terelusi

pemisahan pada RPC didasarkan atas perbedaan

solut. Molekul-molekul yang lebih polar akan

lebih dahulu dan molekul-molekul yang kurang

polar akan terelusi kemudian. In1 disebabkan karena

molakul-molekul polar berinteraksi relatif lebih kuat

dengan £ase mobil dan molekul-molekul yang kurang polar

akan diikat oleh fase diam (17).

Perbedaan kecepatan elusi solut dalam RPC dlnyatakan

sebagai waktu retensi atau faktor kapasitas, yaitu hasil

interaksi antara komponen- komponen sampel dan £ase diam

dalam kolom (6).

Mekanisme ikatan solut dengan rantai hidrokarbon pada

kolom RPC digambarkan oleh teori solvo£obik, yang secara

skematik dapat digambarkan sebagai berikut :



16

..... ' .. , sv

18·J7 • LG : •

SL :+- ~= gaya tarik

· ~ -= ikatan LG & SL

~\ LG = ligand non polar

SL = salut

SV = solven

Gambar 4 Ikatan antara solut dan ligand non

polar dari permukaan fase diam dalam RPe.

Garnbar diatas, terlihat adanya pengikatan dart LG dan SL

yang akan diperrnudah oleh penurunan luas permukaan

molekul SL yang berhubungan dengan solven. Blia daerah

kontak didalam ikatan dan tegangan permukaan sernakin

besar, maka lkatan SL (salut) dan LG (fase diam) sernak!n

kuat. Sebaliknya gaya tarik ("attractive interaction")

antara salut dengan solven disebabkan karena gugus-gugus

polar dalam solut mengurangi kekuatan ikatan. Jadi

kekuatan ikatan salut dengan ligand non polar pad a

permukaan Ease diam dihasilkan oleh perbedaan antara dua

efek diatas (12).

1.3. Optimasi dalam kromatografi cairo

Optimasi dalam pemisahan kromatografi calr adalah hal



17

yang penting, walaupun tidak mungkin melakukan optimasi

semua parameternya. Pada umumnya kriteria yang

dlgunakan untuk melakukan pemisahan beberapa komponen

dalam sampel adalah kualitas pemisahan, yang dihubungkan

dengan waktu pemisahan. Untuk in1 petlu diketahui e£ek-

efek yang mempengaruhi pemisahan •

Ada dua efek utama yang mempengaruhi mekanisme pernisah-

an yaitu :

Efek fislka, yaitu efek yang berhubungan dengan

f~ktor-faktor efisiensi kolom yang biasanya dlukur

dengan jumlah pelat teoritis (n) dan faktor kapasitas

( k ' ) •

Efek kimia I yaitu e£ek yang digambarkan oleh faktor

selektivitasOC::.

Pengaruh efek kimia dan fisika dalam pemisahan

digambarkan dalam persamaan sebagai berikut :

Vfl' k' « - 1 Rs = . ( ----- ) . (------- J

4 1 + k' oC

Dengan mempertimbangkan efek fisika, jika pakingnya

balk, ukuran partikel kelom keell ( 3 - 10 ~m maka

ternyata bahwa harga k" lebih kurang 1 10 akan

menghasilkan resolusi yang balk (11).

Dari efek-efek kimla dan fisika pada persamaan diatas

tidak dapat diramalkan pengaruh komposisi fase mobil

atau suhu terhadap retensi relati£ dari komponen yang

berbeda .



18

Lima variabel yang digunakan untuk mengubah

selektifitas kimia pada sistim kromatografi cair, yaitu:

- komposis! fase mobil

- komposisi fase diam

- suhu

- pH atau efek 10nik lain

- kesetlmbangan kimia sekunder

1.3.1. Optimasi fase mobil

Teari solvofobik dar! Horvath (12) menunjukkan bahwa

efek fase mobil adalah penting dalam pemisahan RPC

Pendekatan sistematik dimulai dengan konsep seql tiga

selektifitas solven yang dipakai dalam pengernbangan

dasar strategi pada optimasi komposisi fase mobil

(11) •

Beberapa cara optimasi fase mobil antara lain :

a. Diagram tiqa titik faktar kapasitas (kO) atau waktu

retensi (tr).

Diagram in1 menunjukkan dengan mudah komposisi fase

mobil yang diperlukan untuk menghasilkan suatu

pernisahan •

Secara garis besar tabapan yang dilakukan adalah :

Pertama, mencari komposisi isokratis dari fase

mobil biner ( didapat dari elusi gradien ).



19

Kedud, mencari sistem biner yang lain dengan cara

yang sarna diatas atau memakai diagram isaeluotropik

dari Schoenmakers et a1 (25) yang menunjukkan fase

biner lain dengan kekuatan yang sarna

Ketiga, dilakukan elusi terhadap sarnpel dengan

memakai tiga macam £ase mobil yaitu A , B dan

kombinasi A dan B masing-masing 50 \ dan dibuat ta-

bel waktu retensi dari ketiga fase mobIl diatas

Keempat, dibuat diagram tiga titik seperti gambar 5

dibawah in1 :

, k

~ ~ 1 y

,

A .% 50 B oA

Gambar 5 Diagram tiga titik untuk pemisahan

tiga komponen.

Dari diagram diatas dapat dll1hat bahwa Ease mobil

A tidak dapat memisahkan komponen Y dan Z, beqitu

pula fase mobil B . Dengan memakai kombinasi £ase

mobil A dan B rnasing-rnasing 50 \ maka kornponen X, Y

dan Z dapat terpisah (13).

111

,,-----------------------------------------



20

b. Cara " window diagram II

c.

Tahapan pertama dan kedua pada cara ini sarna dengan

cara diagram tiga titik I kemudian dibuat "window

diagram" berdasar data perbandingan waktu retensi.

Dari kurva dapat diketahui fase mobil optimum, yang

dltunjukkan oleh puncak yang tertinggi, seperti

terlihat pacta gambar berikut (lS)

'allo It:!

r A,L:::::::::~.~%rA~~--~.

Gambar 6 : "Window diagram" untuk pernisahan komponen

X,Y,Z

Cara segi tlga Snyder

Tahapan yang dilakukan pada cara in1 yaitu

Pertama, memilih kondisi umum yang

diinginkan, misalnya waktu analisis maksimum yang

diinglnkan, suhu kolorn dan kecepatan aliran fase

mobil. Kemudian mencari satu serf kondisi isokratls

yang memuaskan dengan cara elusi gradien atau

membuat 1 serf data elusi isokratik dengan

menurunkan persentase fase mobil secara bertahap.

Kromatogram yang didapat tidak mutlak semua

komponen harus terpisah sempurna. Komposisi £ase



21

mobil in1 diletakkan pada posisi A dalam segi tiga

optimasi pada garnbar 7.

Kedua, mencari kondisi isoeluotropik dari dua fase

mobil yang berbeda , berdasarkan kekuatan solven

atau dengan cara mengeliminasikan pada suatu nomo-

gram ( gambar 8 ). Kedua fase mobil in1 diletakkan

pada posisi B da·n C seqi tiga optimasi (gambar 7)

•

Gambar 7

" . 50/50

A

"IDle

• • .. 33/33 / 33

"C 50/50

." . B.'-,--__ ~~--.....J·a

Optlmasl fase mobil dengan cara II Seq!

T 19a Snyder "

60 DO 100 120 140 • I-+-t-I +I-t--l-H--il-+I -I -I- -\-1- ;-1 A celonll die I 'II a lor

o :;>0 40 un ." I..JIHI-+I-+I +1-11---t-+-1-11 MulhunollWulor

""

• " " ." '1 Tolrahydroluran/Walo r

Gambar 8 Nomogram isoeluotropik fase mobil pad a

kromatogra~i eair fase balik (RPe)(1?).



22

Ketiga, membuat empat kromatogram lagi dengan

komposisi fase mobil seperti yang dltunjukkan

titik-titik pada seqi tiga optimasl (gambar 7).

Hasil dari tujuh kromatogram dari tujuh macam fase

mobil dipilih yang memberikan pemisahan yang

terbaik (11,17,25).

1.3.2. Optimasi suhu dan pH

Kenaikkan a~au penurunan pH dapat merubah retensi

terutama pada solut yang terionisasi denqan kenalkkan

atau penurunan pH .Karena 501ut-solut 1n1 dalam bentuk

terionkan akan berinteiaksi lebih kuat dengan fase ,

mobil dari pada solut yang tidak terionkan, sehingga

akan terelusi lebih cepat (17).

Perubahan Buhu tidak digunakan secara luas untuk

merubah selektifltas dalam kromatografi call, walaupun

demikian Snyder et al (11), telah menunjukkan patensi

selektifitas pemisahan terhadap perubahan suhu .

Efek suhu dan pH dapat digambarkan sebagai variabel

terpisah terhadap fase mobil, karena masing-masing

sedikit pengaruhnya pada fase mobil. Menurut Glajach

dan Kirkland (11 ) dimungkinkan untuk melaku

kan optimasi pada jarak pH 3 - 8 dan suhu 300 - 70 0 C

dengan kombinasi fase mobil pada kolom RPC.



23

1.4. Analisis kuantitatlf dengan HPte

Analisis kuantitatif dalam HPte didasar kan pada prinsip

bahwa tinggi puncak atau luas puncak kromatogram

adalah berbanding linier dengan konsentrasi solut (22).

Analisis HPte dapat dilakukan dengan tiga metode yaitu :

- metode standar eksternal

- metode standar internal

- metode adisi st'andar •

1.4.1. Metoda standar eksternal

Pada. cara In1 harus dibuat kurva kalibrasi dart satu

seri larutan standar yang konsentrasinya mendekati

• larutan sampel. ,Kurva kalibrasi dibuat antara luas

puncak tinggi puncak ) berbanding konsentrasi. Kadar

sampel diperoleh dengan menginterpolasikan pada grafik

yang dldapat. Bl1a dipakai metoda in1 maka seluxuh

tahapan anal isis harus di standarkan

mengurangi kes~lahan anal iSis (22).

1.4.2. Hetode standar internal

, untuk

Pada cara ini balk sampel maupun standar, dltambahkan

suatu komponen (standar internal) dengan konsentrasi

tertentu. Kurva kalibrasi dibuat antara ratio luas

(tinggi) puncak zat (sampel) terhadap lua. (tlnggi)

puncak standar internal dengan konsentrasi. Standar

internal yang dipakai harus mempunyai sifat fisika dan

kimia sarna atau harnpir sarna dengan zat yang akan

ditentukan dan mempunyai harga Rs (resolusl) yang

cukup balk pada proses analisis (22)., -ru.

"ItPUSTAI:.u. •• ... -''''BRSIT AS A1ltlJ./J(JQA':

.. IUIl.ABAV" { ......



24

1.4.3. Hetode adisi standa~ .

Pada cara in1 ditambahkan zat yang sarna dengan sampel

yang akan dltentukan kadarnya. Paling sediklt

diperlukan tiga konsentrasi yang berbeda Kurva

kalibrasi dibuat antara luas (tinggi) puncak dengan

jumlah penambahan

ekstrapolasl dapat

sesungguhnya.

1.5. Peralatan

standar.

dltentukan

Dengan

kadar

melakukan

sampel yang

Komponen utama pada HPLC adalah sistem pompa tekanan

tinggi, kolom dengan partikel fase diam yang keell dan

sistem detektor dengan sensitivitas tinggi. Syarat umum

untuk bag ian alat-alat itu adalah tahan tekanan dan ko

rosi, tidak bocor dan detektornya bervolurne mati yang

rendah (20).

Reservoir ~ mobil-

Dapat dibuat dari gelas atau baja tahan karat. Volume

nya tergantung dari tujuan analisa yang akan dilakukan.

Sebelum digunakan, fase mobil harus dibebaskan dari gas

yang terlarut ( degassing ) untUk mencegah terjadinya

penyumbatan pada kolom dan gangguan pada garis dasar

(base line) yang tergantung kepekaan detektornya.

Degassing dapat dilakukan dengan cara, dipanaskan sambil

diaduk dan direfluks, divakumkan, atau dlgetarkan dengan

qetaran ultrasonik (20,26).



25

Sistem pompa

Pompa HPLC digunakan untuk mendo~ong fase mobil melalui

kolom , biasanya dibuat dari gelas I baja tahan karat,

Teflon dan Sapphire. Tekanan pada sistem pompa dapat

mencapai 5000 psi pada kecepatan aliran fase mobil 3ml

per meni t. Pada analisa rutin, untuk menghasllkan

kecepatan aliran 2ml per menit tekanan diatur hanya

sampai 500 psi .. Aliran fase mobil dar! pompa harus

bebas dari pulsa-pulsa, karena dapat mengganggu

detektor. Kecepatan aliran yang dihasilkan dari pompa

harus reprodusibel dan konstan. Berdasar klasifikasinya

pompa HPLC dapat dibedakan menjadl 2 tipe, yaitu pompa

dengan kecepatan aliran konstan dan pompa dengan

tekanan konstan. Masing-masing tipe rnempunyal keuntungan

dan kerugian sendiri tergantung cara yang dipakai.

Sistem pompa ini dilengkapi dengan manometer untuk

memonitor tekanan pompa ), pengatur katup-katup tekanan

dan pencampur fase mobil (19,20).

F i 1 ter

Karena kecilnya diameter dari pipa-pipa yang digunakan

dalam HPLC, maka untuk mencegah penyumbatan digunakan

suatu penyaring ( filter) yang diletakan antara pompa

dan kolom. Filter ini harus tahan tekanan dan biasanya

digunakan filter tahan karat dengan diameter 2 um.

Filter juga perlu dipasang diantara reservoir dan pompa

untuk mencegah kerusakan katup pompa karena debu. Oleh



26

karena itu fase mobil dan larutao sampel sebelum

dilakukan dengan HPLC harus dibebaskan dar! partikel-

partikel yang tidak larut dengan alat khusus (19,20).

Injektor

Dikenal sistem injektor dengan septum dan sistem injek-

tor tanpa septum yang masing-masing mempunyai keuntung-

an dan kerugian sendiri. Untuk menginjeksikan sampel

dapat d~gunakan dua cara, yaltu :

on flow method, terutama bila digunakan tekanan ku-

.rang 1000 psi.

stop flow method, untuk cara inl aliran fase mobil

dihentikan sementara sarnpel diinjeksikan ke dalam

injektor.

Kalom untuk HPLC bervariasi, tergantung tipe pemisahan

yang diinginkan dan karakter fisika dar! mater! paklng.

dibuat dari baja tahan karat dengan presisi tinggi. Oi-

ameter dalam (internal diameters) sangat menentukan ha-

511 analisis. Untuk penggunaan analisis diameter kolom

pada umumnya 2,1 mm, 3,2 rom dan 4,5 mm. Panjang kolom

/ populer antara 10 - 39 em dan berbentuk lurus. Pa-yang

king kolom yang berdiameter keell 3 dan SUm )

digunakan untuk kolom yang pendek (10 - 15 em) karena

tingginya eflsiensi kolom yang diperoleh dan besarnya

penurunan tekanan. Kolom yang berbentuk U dan spiral

dapat menurunkan efisiensi kolom (20,27).

Sambungan kolom harus dibuat sedemikian rupa sehingga



27

volume mati keell dan .dan dicegah terjadinya ruang-ruang

yang menyebabkan sampel terkumpul dan diencerkan oleh

£ase mobil. Sambungan kolom biasanya berdiameter dalam

2,5 - 5 mm (20).

Pengatur suhu kolom

Kontrol suhu kolom pada HPLC sangat penting untuk men-

jaga reprodusibilitas hasil. Sebagai gambaran pada suao·

tu pemisahan kenaikan suhu 6 C dapat menyebabkan pe-

ngurangan waktu retensi sebesar 30 \ . Hal in1 terutama

bila digunakan kolorn RPC atau pertukaran ion.

Untuk kontrol suhu dapat dipakai pengatur s,uhu berke

mampuan dari suhu kamar sampai 60° C, dengan kepekaan

kurang lebih 0,2 0 C.

DetektoI"

Tujuan penggunaan detektor adalah untuk mengukur

konsentrasi sampel dalam fase mobil dan menghasilkan

sinyal listrik yang sebanding dengan konsentrasi sam-

pel (26). Detektor yang dipakai untuk HPLC adalah :

- detektor fotometrik .

- detektor refraktometer.

- detektor elektro kimia.

- detektor radio aktif.

Pada penelitian in1 digunakan detektor fotometrik

lembayung ultra pada panjang gelombang 254 nm.

2. Tinjauan tentang bahan obat.



28

2.1. Parasetamol.

Parasetamol merupakan serbuk hablur berwarna putih,

larut dalam 70 bagian air, larut dalam 7 bagian etanol

(9S\},sangat sedikit larut dalam kloroform dan larut

dalam larutan alkali hidroksida (29). Mempunyai rumus

bangun sebagai berikut :

Panja~g gelombang serapan maksimum dalam metanal adalah

249 nm ( 29,30), melebur o

172 C (29).

pada jarak lebur 169

2.2. Propifenazon ( Isopropil antipirina ).

Propifenazon merupakan serbuk putih, tidak berbau dan

berasa pahit. Hempunyai rumus bang un sebagai berikut ;. ... •

°C=r~ '<><,Y'" CHo

Propifenazon larut dalam 400 baglan air, cepat larut

dalam alkohol dan kloroform (31,32). Panjang gelombang

serapan maksimum dalam metanal adalah 247 nm dan 275 nm o

dan mempunyai suhu lebuz: 103' C (30).

2.3. Kofeina ( 1,3,7 tz:imetilksantina ).

Kofeina mez:upakan sez:buk atau habluz: bentuk jarum,

bez:warna putih dan be rasa pahit. Hempunyai rumus bangun



29 o C"" o ."

sebagai berikut Ii •

Kofeina dapat larut dalam 46 bag ian air, larut dalam 66

bag ian etanol (95\), larut dalam 7 bagian kloroform dan

sukar larut dalam eter (29,31). Panjang gelombang

serapan maksimum dalam metana! adalah 272 nm dan rnelebur o

pada jarak suhu lebur 235 - 237,5 C (29).



BAB III

BAHAN, ALAT DAN METODE

1. Bahan

Selaln yang tersebut di bawah in1 adalah dari derajat

analitlk, sedangkan air adalah air bidestilata

a. Parasetamol, prod.uks i P. T. Riacima Abadi, Jakarta,

No.Batch JUP-214-1.

b. Isopropil antipirina (propifenazon), dari P.T.Hoechst

Pharmaceutical, Jakarta, No.Batch 227L856.

c. Kofeina, produksi E.Merck (4125156).

d. Metanal, derajat kromatografi, J.T.Beaker (9093-3).

e. Asetonitril, derajat kromatografi, B.D.H. UN No.1648.

2. Alat.

"High Performance Liquid Chromatograph" I Shimadzu LC SA,

dilengkapi dengan :-"Column oven unit eTO 2A"

filter Ultipor

-Rekarder "Chromatopac CR 2A (X)

-Detektor "Spectrophotometric gPO-I".

-Kolom O.D.S Zorbax (4,6 mm x 25cm)

-Penyaring millipore, dengan membran

TM N yang mempunyai

66 pori O,2..u •

Spectrofotometer, ItShimadzu Double Beam Spectrophotomete'r

U.V.260".

Differential scanning calorimeter Shimadzu DSC 30

dilengkapi dengan :-unit kontrol suhu DT.30

-rekorder R.22T

30



31

-sampel holder SeC-30

pH meter Fisher.

3. Hetode

3.1. Uji kualitatif terhadap bahan obat yang digunakan yaitu

denqan melakukan reaks! warna (spot test), menetapkan

spektra dengan alat spektrofotometer.

Henentukan Buhu Ie bur yang dl1akukan dengan D.S.C.

3.2. Pembuatan larutan sampel.

Sampel yang dlpakai adalah parasetamol, kofeina dan

propifenazon dalam bentuk tunqqal dan campuran dengan

konsentrasi masing masing 50 ppm dllarutkan dalam

pelarut metanal.

3.2.1. Pembuatan larutan standar tunggal.

Dibuat larutan standar tunggal parasetamol, kofelna

dan propifenazon masing masinq denqan kadar 50 ppm , dengan cara sebagai berikut . . Timbang seksama

parasetamol,kofeina dan propifenazon masing masinq 50

mg kemudian masing masing dilarutkan dalam metanol

sampai volume tepat 100,0 ml, kemudian masing masinq

dipipet sebanyak 1,0 ml dimasukkan kedalam 1abu ukur

10 ml dan ditambahkan metanol sampai volume tepat 10,0

ml.Larutan larutan tersebut sebelum digunakan disaring

melalui penyaring millipore.

3.2.2. Pembuatan larutao campuran parasetamol, kofeina dan

propifenazon sebagai larutao sampel



32

01 timbang seksama parasetamol, kofeina dan

propifenazon masing masing sebanyak 50 mg, bersama

sarna dilarutkan dalam metanol sampai volume tepat

100,0 mI. Dari larutan in1 dipipet I,D ml dan

diencerkan dengan metano! sampai volume tepat 10,0 mI,

didapat larutan sampel yang mengandung parasetamol,

kofeina dan propifenazon masing masing 50 ppm. Larutan

in1 sebelum digunakan dlsarlng rnelalui penyaring

millipore.

3.3. Optlmasi parameter

3.3.1. Optimasi eluen (fase mobil).

a. Pembuatan eluen campuran metanol-air

Dibuat lima macam eluen campuran metanol dan air

dengan konsentrasi masing masing 3D, 40, 50, 60 dan 70

% metanol. Semua larutan tersebut sebelum

dlsaring melalui penyaring millipore dan

"degassing" denqan getaran ultrasonlk.

b. Pembuatan eluen campuran asetonitril-air.

digunakan

dilakukan

Dibuat empat macam eluen campuran asetonitril dan air

dengan konsentrasi asetonltril masing masing 3D, 40,

50, ·dan 60 % .Semua larutan terse but sebelum digunakan

disarinq melalui saringan millipore dan dilakukan

"degassing" dengan getaran ultrasonik

tarutan sampel diatas dielusi menurut cara Snyder (17)

dengan fase mobil campuran metanol air dengan lima

,

"--------------------------------



33

perbandingan, dan campuran macam

dengan

menggunakan

empat

HPLC

macam

asetonitril-air

perbandingan,

Keadaan optimal dltentukan

berdasarkan kriteria harga Rs (resalusi) dan harga

retensi relatif (ot).

3.3.2. Penentuan campuran fase mobil optimal.

Penentuan fase mobil yang optimal dilakukan menurut

cara diagram Window (15).

3.3.3. Penentuan suhu optimal dari fase mobil optimal.

Oilakukan elusi sampel dengan £ase mobil optimal

dengan tiga macam temperatur. Keadaan optimal

berdasarkan kriteria harga Rs dan oC

3.3.4. Penentuan pH optimal dari fase mobil optimal dan suhu

optimal.

Dilakukan elusi sampel dengan £ase mobil optimal dan

suhu optimal dan yang dibuat dengan lima macam pH

dengan rnenambahkan larutan Hel 0,1 N sampai pH yang

dlkehendaki. Keadaan optimal dltentukan berdasarkan

harga Rs dan oC •

3.4. Penentuan kadar parasetamol, kofeina dan propifenazon

dalam sampel. Dilakukan penentuan kadar sampel campuran

parasetamol, kofeina dan propifenazon dengan

perbandingan yang sesuai formula sediaan yaitu 5:1:3

menggunakan fase mobil, pH dan temperatur

menurut cara standar eksternal.

optimal



34

3.4.1. Pembuatan sampel campuran parasetamol,kofeina dan

propifenazon.

Dibuat serbuk campuran parasetamol,kofeina dan pro-

pifenazon dengan perbandingan 5 : 1: 3, ditimbang

parasetamol 500 mg, kofeina 100 mg, propifenazon 300

mg dan serbuk pengisi 400 mg. Digerus sampai homagen.

3.4.2. Penentuan kurva kalibrasi parasetamol,kofeina dan

propifenazon.

Dibuat larutan tunggal murni parasetamol, kofeina dan

propifenazon dalam metanal dengan konsentrasi

parasetamol maslng-maslng 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm dan

150 ppm; konsentrasi Kofeina 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm dan

25 ppmj konsentrasi propifenazon 10 ppm, 25 ppm, 50

ppm dan 75 ppm. Kemudian dilakukan elusi terhadap

larutan-larutan diatas dengan fase mobil metanol-air

terpilih dan suhu terpilih, kecepatan fase mobil 1 ml

per menit. Dari data kromatogram yang didapat,

dibuktikan apakah luas area mempunyai korelasi yang

linier dengan konsentrasi dengan rumus

n. ~xy -':!x. ~y

rxy V "i-~~~ 7-=-"i;;-iT-)"i ~~-;;2--=-(~;-)2} Bila ada korelasi ( rxy > r tabel ) (lampiran 6), maka

dilanjutkan dengan perhitungan persamaan garis

regresi, dengan rumus

Y = B x + A

n.lxy - ,lx. SOY

B = -~~-i;2--=-(-i; )2



35

EY - B.:Ex A = ------------_ ( 33 ) •

n

3.4.3. Pembuatan larutan sampel.

Ditimbang teliti sampel butir 3.4.1. kurang lebih 290

mg (yang setara dengan 200 mg campuran bahan obat

berkhasiat) dilarutan dalam metanal sampai volume

tepat 100,0 mI. Kemudian disaring dengan kertas

saring. Dipipet -I,D ml filtrat dan diencerkan dengan

metanal sampai volume tepat 10,0 mI. Didapat larutan

sampel yang mengandung 200 ppm bahan berkhasiat.

Larutan in1 kemudian disaring melalui penyar Ing

millipore.

3.4.4. Perhitungan kadar.

Untuk mengetahui harga "recovery" ,( \ kadar yang

didapat kembal i) dapat

sebagai berikut

kdr Recovery =---- x 100 \

5.5

Keterangan

dihitung dengan

kdr = kadar yang ditunjukkan pad a kromatogram

5.S = kadar sesungguhnya (yang ditimbang)

3.5. Analisa data.

cara

Untuk mengetahui ketepatan akurasi dari hasil

percobaan, maka digunakan uji t dengan rumus

(Al-X)v"

+ t = ---------------SD



36

Keterangan

t = harga tetapan yang harganya tergantung pada

derajat bebas ( " degree of freedom" ) dan

peluang ( "probabi 11 ty" ) . .... = harga benar = 100 \.

V x - l! r so = "standard deviasl" = ---------------N - 1

Bila harga t perhltungan lebih keel! dari t tabel maka

dikatakan ketepatannya baik, karena tidak ada perbedaan

yang bermakna aotara " recovery " dengan kadar

sesungguhnya.

untuk mengetahul ketelitian (presisi) dari hasil

percobaan, maka digunakan rumus berikut :

so K V = X 100 \

x

K V = koefisien variasi.

Dalam hal ini, sernakin keel! harga koefisien variasi

sernak!n teliti.



BAB IV

HASIL PENELITIAN

1. Hasil uji kualitatif terhadap parasetamol, kofeina dan

propifenazon.

Uji kualitati£ dilakukan penetapan spektra absorbsi

dan suhu lebur.

1.1. Penentuan spektra absorbsi, penentuan in1 dilakukan di

daerah panjang gelombang lembayung ultra dengan

menggunakan spektrofotorneter yang dilengkapi dengan alat

pencacat spektra. Hasi! yang diperoleh tertera pada

gambar 1,2 dan 3. Dari spektra lembayung ultra yang

didapat ternyata bahwa parasetamol rnenunjukkan adanya 2

puncak absorbs! yaitu pad a 251,8 nm dan 203,9 nm.

Ko£eina menunjukkan adanya 2 puncak absorbsi yaitu pada

A272,3 nm dan A206,4 nm. Propifenazon menunjukkan 3

puncak absorbs! yaitu pada ]"'275,5 nm, "-247,2 nm dan

A 202,8 nm. Dari spektra dapat disimpulkan bahwa

parasetamol,kofeina dan propifenazon memenuhi syarat

kemurnian karena puncak absorbsi ketiganya sesual

dengan data pus taka (29,30,31,32). Puncak dalam spektra

absorbsi pada daerah 200-206 nm ada1ah "cut off"

dari metanol sebagai pelarut.

1.2. Penentuan suhu lebur.

Penentuan in1 d11akukan dengan menggunakan D.S.C yang

dilengkapi alat pencatat. Termogram yang diperoleh ter-

37



r+-t-i -L

I

I ; - ~

200

1.

".f

, , ~~ . ,

-_,?o.

o . ,

-z.--,

I

250

38

i.

Gambar 1 : Spektra absorbs! parasetamol dalam pelarut metanal.

-. -.



• • • • " • • ·

· ~

I . , ,

· , · , ., , J' . , -

i , · ,

"

"

, -.- I , , , , , I , , ,

" , --en- ,

, , , , .. , , , , i , i , , , , , , , , , , ,

-j r--+-- ,

, , , , , , ! , , , , , '.

2 ••

, , i , , , i , I , , , , I , , , , , , I , , , , , I , , , , , , , i , , , I , , I , , i , , , , , , , , , , ,

, , , , , , , , , , i , , , I , ,

, , , , , , , , , , , , , , , , , , I , , , , , , , . , ,

, , , , , , I , , , , i , , I ,

, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , i , , , , , , , , , , !

, , , I , , , I , , , , :

, : , , , ! , , : , , , , , ,

, , I I , i , : , , , , , , , , , , , , , , , , , ! I ! : , , , , , , , ,

, I i : , , , , , ,

)

, , , , , , , , I , i , , , , i , I , i I I , , , , , , , I I , , , , i , ; , I I I I I I , , I I , , , I , , , , I I , I , , , , , , , , , , , I , , I I

I , I , I , . , i '" i I , , , , , N I I I , I , . , I , i , , I , , , I , , , I Z I , i , , , , , , , , , , , I , , I

, , , I I -+ , , • i , , , ,

'" , , , I I , , , OJ , , , , I ~ I

, I :- .

, , , , , , , , , , , , I I I , , -, • , , , I , , , I ,

, , , I i --!--, ~+. , I ,

, , , , , : , . , , , , ! , , , , , , , , , , ! i I , , , , , ,

, , , : I , I , , : , ! , , , I , , , , , ! , : I , I , , , , , ! , ,

i , , , , I , , , , , , , 2 •• 300 I

Gambar 2 : Spektra absorbs! kofeina dalam pelarut metanal.

39



.

I '\

I I I I I I I \, I I I I ! I I I I I I I , I

! I I I I I I I I I I

" , I I I I I I " lit i '

I

r-j--

• · , ., ,..,-. • • .. -or' ~!-e-· ~

I I I I ! I I I I

I I " I i

-1_-"- 1-1 ;~i

I , ~

tJ I ,

, , I t-j-I

" , I '! I I I I Ii I

: ! ' j 1.1 i , , i ,

. --'- I I -,--- I

: -+ ~ I Ii, ! ,

, , /--. ~;" ,

~',

I I '

200 l

I I , I 1 , I I

I

! : 1\), ~l ]'1"- I r; I

z I

I ! -riJ I

'-, ! ! I~ I I

, ,

250

I I I I , I

1"0' ~-

.1 U'I

'- -". I VI' ,2 , I

I-L~ '-1 ' ! 'C·: I .,

j -l : 1-

t- ' , r---;---i ! I

I , ' I I , I ,

, ! J ••

I ;

,

, , , ,

f.---i.,..-:..... I _ I , .

, , lY " -;-- X

, .~

I I r u~':' H- "!.-, ,

300 I

Gambar 3 : Spektra absorbsi propifenazon dalam pelarut

metanol •

40


TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTIi

41

tera pada gambar 4,5 dan 6.Ketlga termogam yang didapat

menunjukkan bahwa parasetamol melebur pada suhu 172,3° C

kofeina pada suhu 237,1° C dan propifenazon pada suhu o 103,17 C.

Berdasar data spektra lembayung ultra dan suhu lebur

diatas dapat dlsimpulkan bahwa Parasetamol, Kofeina dan

Propifenazon yang diperiksa memenuhi syarat kemurnian

(29,30,31,32) •

1.3. Uji kualitatif dengan reaksl warna ( spot test ).

1.3.1. Parasetamol.

a. Larutan sampel dalam air dltambahkan larutan besi

( I I I ) klorida akan terjadl warna biru ( 29 )

(memenuhi)

b. Sampel dldidihkan dengan 1 ml asam klorida selama 3

menit, kemudian ditambahkan 10 ml air, didlnginkan

tidak terbentuk endapan. Kemudian ditambahkan

larutan kalium bikromat 0,1 N, maka akan terjadl

warna violet yang tidak berubah menjadi merah (29)

(memenuhi) .

1.3.2. Kofeina.

Lebih kurang 5 mg sarnpel dilarutkan dalam 1 ml asam

klorida dalam cawan porselin, ditambahkan 50 mg kalium

klorat dan diuapkan di atas tangas air hingga kering.

Kemudian cawan diletakkan terbalik di atas bejana yang

berisi beberapa tetes amonia, rnaka slsa pengeringan

akan berwarna violet (29) (memenuhi).



42

• :;: '

... i ... _, ...

! " I ' ~ ,

','

, ,

Gambar 4 : Termogram OSC parasetamol •



43

. 100 150 200 25Q,

____ ~) .Oe

Gambar 5 : Termogram OSC kofeina •



o o

,

J I -'-. ~!

---c;ra

40

, . . . . j ~ --"">- ., ,

.~

-'--~ -' , o- , ..

f-

"

60

-!::--=-; ---'---,

-r r-, F

l::

~

C-, ! , L ! L

;

~

0 0

",,'

""I'

. , ,..1......-.....1----1_

J

.'-,

o·

80

", .. --.1

100 ____ +) tOe

Gambar 6 . . Termogram osc propifenazon

--F ....-o g

1-

L-J ~~_ _ .,J---=-_o_:"-'-""-

.-t

.\.

F-·~I-.j

, , ~~ , a

·0

-~.l-=-""-i 0,

_. :::

120

•

44



45

1.3.3. propifenazon.

Larutan sampel dalam air ditambahkan larutan DAB hldre

klorida akan terjadi warna violet (memenuhl).

2. Optimasi parameter.

2.1. Optlmasi fase mobil.

Dllakukan elusi larutan standar tunggal (3.2.1) dan

larutan campuran (3.2.2) dengan kondlsi kromatografl

sebagai berikut '- kolom ODS Zorbax

- suhu percobaan 40° C

- detektor u.v (254 nm)

- volume sampel yang diinjekkan 10,IUI

- kecepatan aliIan £ase mobil 1 ml/mnt

Kromatogram dengan fase mobil metanol-air dapat dilihat

pada gambar 7 dan dengan £ase mobil asetonitrl1-air

gambar 8.

2.1.1. penentuan harga Rs dan DC dengan lase mobil

asetonltril-air .

Berdasar kromatogram gambar 8 dapat dihitung harga Rs

dan 0( yang hasllnya dapat dillhat pada tabel 1.



46

Tabel 1 Retens! relatif (OC) dan resolusi (Rs) dari

parasetamol

propl£ena zon

asetonltrll-alr.

terhadap

dengan

ko£eina

fase

dan

mobIl

-----------------------------------------------------

PERSENTASE ASETONITRIL

Rs loe 30 40 50 60

-----------------------------------------------------oC_ 1 1,18 1,10 1,05 1,06

IX - 2 > 23,5 4,95 3,00 2,37

Rs - 1 1,01 0,28 0,32 0,53

Rs - 2 • 6,65 5,62 .3,75

Keterangan :

OC 1 : parasetamol-kofeina.

OC 2 parasetamol-propifenazon.

Rs-l : parasetamol-kofeina.

Rs-2 parasetamol-proplfenazon.

Dari data pada tabel 1 dapat dlbuat grafik hubungan

antara persentase asetonitrll dengan hargac(,terl1hat

pada gambar 9, dan hubungan persentase asetonltrl1

dengan harga Rs yang terlihat pada gambar 10.

Dari tabel 1 terllhat bahwa fase mobil campuran



L6L', J Of: : Ol. J q?''-'

• 0 < :'c'; . ~ 3

I

47

I _PH~l:::· • ... 0

L8v'3 "' .. ... O£ : .:19 0

"' 2fv'S 0>

C . -.. .., ... - . ~ m e I

0>

I l;jtllS C ... ~ • m e c

0 L6L'S 14 N ... m

0.: 09

m c I " .... ...

0 ... C 0-

SS.!.'£: I

.

809': ) . . .

T I l~~lS

... 2SS'Lt ~

m 0 .., 14 W 0-e • • 14 .... 0-... ...

.c 0 •• 0 '" e .. .. ... C

" 0 ... ~ "" " m ... ... C 0

" >l C ." II m '" 0> ~ C "'

,.

" '" ." .. .... ... 0 e "' e m 10 m 14

.., 0> • " 0 ... .. .., 0 m m <f 14 e .. " 0 ... 0-14 0 H

'" 10 0. .. 00 : 0':

1I LH'v il d ft:3':'

I l~tllS' -- - '-

IR - P

erpustakaan Universitas A

irlangga

TES

ISO

PTIM

ALIS

AS

I FAS

E M

OB

IL ...S

RI P

OE

DJIA

RTI

'" II>

'"

Q Q

'" II> Cl.

•• •• Q Q ~ '" '" '" '" oS' ,

"- "" .. ," .. Cl. Cl. , . ,

'" ;. '" , <V

'" , "-

,

- , -"'- 0-0 0 l- I-- ~

l- I-0: '" a: .0; l- I-

"' "' ---------

Gamber 8 : Kromatogram denQsn fase mobil asetonltrl1-air mssing -

mas1ng 40%:60%. 50%:50% dan 60%:40% •

P.parasetamol ; K.kofei~e ; Pr-proplfenazon •

.. Cl.

0>

'" '" In

0 .,. ••

0

'"

l> CD



2.

15

I.

r 5

~-- oC:2

··----~.----_.. ______ c 0(1

• 30 40 50 o. ----tl ')bASETONITRIL

Gambar 9 : Kurua hubungan harga 0( dengan fase mobil aseto

"itril - air pada berbagai macam perbandingan •

49



'0

R.

, ~". __________ ----_"R"

• o 30 '0 '0 .0

----+) % ASETONITRIL

Gambar 10 : Kurva hubungan harga Rs dengan fase mobil 85etonitril - air pads berbagai macam perbandingan •

50



51

asetonitril-aiz: pada' semua perbandlngan hasil resolusi

parasetamol dan ko£eina kurang dari 1 ( < 1). dengan

mellhat kromatogram gambaI: 8 terlihat bahwa

parasetamol dan kofeina tldak terpisahkan, sehlngga

pada optimasi selanjutnya lase mobil campuran

asetonitril air tidak dipakai.

2.1.2. Penentuan harga Rs dan OC dengan fase mobil

metanol-air.

Berdasar kromatogram gambar 1 dapat dihltung barga Rs

dan oC dengan rumus pada (21,22,23) yang hasilnya

dapat dilihat pada tabel 2.

Tabe1 2 Retensi relatif (CIC) dan resolusi (Rs) dart

parasetamol terhadap kofeina dan

propifenazon dengan fase mobil

metanol-air.

PERSENTASE HETANOL

oC / Rs 30 40 50 60 65 70

-----------------------------------------------------oc_ 1 2,20 2,12 1,58 1,41 1,35 1,32

0<_ 2 > 22 15,20 6,24 3,31 2,52 1,94

0<_ 3 7,40 7,20 3,87 2,35 1,87 1,47

Rs - 1 1,16 5, 74 4,38 3,48 2,35 1,80

Rs - 2 > 46 22,57 21,07 13,05 8,64 5,16

.j;-

I '

,; V A. r.



Keterangan

oc- 1

'" - 2

'" - 3

Rs-l

parasetamol - kofeina.

parasetamol - proplfenazon.

ko£eina - propifenazon.

parasetamol - kofeina.

Rs-2 par-asetamol - propifenazon.

52

Dari data dalam tahel 2 da,pat dibuat kurva hubungan

konsentrasi metanal dengan harga oc yang terlihat pad a

gambar II, dan kurva hubungan antara konsentrasi

metano! dan harga Rs yang terllhat pada gambar 12.

Berdasar tabel 2 dan gambar 11, 12 terlihat bahwa £ase

mobil yang balk untuk pemlsahan parasetamol, kofeina

dan proplfenazon adalah fase mobil dengan kon'sentrasi

metana! 60 \ dan 70 t. Haka untuk mendapatkan fase

mobil yang optimal dibuat satu macam 1ag1 fase mobil

campuran metanol-air dengan konsentrasi metanal 65 t.

Dengan membuat kurva retensi relatif (OC) terhadap

konsentrasi metanol menurut cara" window diagram"

(15) yang hasilnya dapat dilihat pada gambar 13, dapat

disimpulkan bahwa fase mobil yang terbaik

pemisahan campuran

Propifenazon adalah

Parasetamol, Kofeina

campuran metanol-air

untuk

dan

dengan

perbandlngan 65 : 35. Resoluslnya dapat dilihat pada

kromatogram gambar 7 .



o

•

'0 ----~. % METANOL

40

53

oC. '------•• --~.~ .. , «,

50 10 .5 70

Callbar 11 : Kurua hubungan harga 0( dengan fase .obll ... tanol -

air pada berbagai maca. perbandlnoan •



00

"

Rs

10

•

•

30 40 eo 8Ii •

---..... , Ok METANOL

Ga.bar 12 : Kurva hubungan harga Rs dengan fase mobil metanol-air pada berbagai .acam perban -

dingan •



17

15

0(3 .. __ _ ...

5

0( ..... ---i

• 3. 4. 50 eo e5 70

----•• '16METANOL

Gambar 13 : "Window diagram n untuk memisahkan parasetamol, kofeina dan propifenazon •

55



"

•

55

2.2. Penentuan 5uhu keloID optimal dari fase mobil terpilih.

Dilakukan elusi sampel menggunakan £ase mobil metanol-

air perbandingan 65 : 35 dengan tiga macam suhu yaitu

30 ° C,400 C dan 50° C K t t . d' . rama ogram yang er)a 1

terlihat pada gambar 14 .

dapat

Dari kromatogram diatas dapat dihitung harga -= dan Rs

dari optimasi suhu ( tabel 3 ).

Tabel 3 Retensi relatif (OG) dan resolusi (Rs) dari

parasetamol terhadap kofeina dan proplfenazon

dengan £ase mobil metanol-air pada suhu yang

berbeda.

SURU (0 C )

'" / Rs

oc - 1

'" - 2

Rs - 1

Rs - 2

Keterangan . . oc- 1 parasetamol

cC - 2 parasetamol

Rs - 1 parasetamol

Rs - 2 parasetamol

,

30 40

1,41 1,35

2,77 2,52

2,74 2,35

9,33 8,64

- kofeina.

- propifenazon.

- kofeina.

- propifenazon.

50

1,29

2,29

2,27

7,87



." ." ." 0 0 OJ ". • 0 .. • " " ~

~ ~

., .:: :0:

"' 00 '" OJ

'" ". ... If) . " "' "- .,-, ... ". OJ "-

'0 "- '" "' '" ,,-, , .,. , .

- - ----

G.mbar 14 : Kromatogra. dengan fasa _Obi1 metanol-air (65:35) pada suhu 30De, 400 dan 50 De

It)

_ 57



58

Dengan membuat kurva suhu terhadap harga cC dan Rs yang

dapat dilihat pada gambar 15 dan 16 disimpulkan suhu

optimal adalah 500 c.

2.3. Penentuan pH optimal dari £ase mobil optimal dan Buhu

optimal.

Dilakukan elusi sampel menggunakan fase mobil metanol-

air 65 3S ) suhu 50 C dengan lima macam pH yaitu

pH = 3, pH = 4, pH = 5, pH = 6· dan pH = 7. Kromatogram

yang teijadl dapat terlihat pada gambar 17.

Dari kromatogram (gambar 17 ) dapat dlhitung harga OC

dan harga Rs, hasilnya dapat terlihat pada tabel 4

dari lima macam pH.

Tabel 4: Retensi relatif (cC) dan resolusi (Rs) dari

parasetamol terhadap kofeina dan propifenazon

dengan fase mobil metanol-air ( 65: 35 )

pacta pH berbeda.

pH

CC / Rs

3 4 5 6 7

oc- 1 1,30 1,30 1,30 1,29 1,29

OC - 2 2,48 2,42 2,42 2,35 2,29

Rs 1 2,40 2,34 2,34 2,28 1,83

Rs - 2 8,82 8,42 8,42 8,47 8,10

-------------------------------------------------------



53

3

2

0( II.. --1

• 3. 4. 5. ---ot) .oe

Gambar 15 : Kurva hubungan suhu dengan harga oC t dengan fase

mobil metanol-air (65 : 35) •



60

,. Rs.

R.

---,,--_ ... R. I

• 3 • 4. 5.

, .OC

-16

~ Rs dengan Gambar • Kurva hubungan suhu dengan harga • fase mobil metanol-air (65 • • 35) •



SL'£

L • Hd 2tZ'8

2 '" -

806'~

'9 • Hd

292 '8 8 I '" -

l I I '9

S • Hd

882 '8 . -t.. ";_ '" --

I '9

" D Hd 82'8

C '"

~d 882'9

£ • Hd

)I Sle'e

d ' "

-

.. '-_ 0_0

I l~t'lS

) HH1~

J l~~lS

Jl H~lS

I HH1S

-

~

'" .., •• • '" Ie ... ~ .

:I: .. 0-... " C I " .... "0 o C Ie " . ... " m 0-" . '" .... . ... :z: .D 0-o • e <t • m :z: " 0-~ .. . .., C • " :z: '" a. C

OJ " " "0

" e a.

" .. u '" 0 o 0 ... '" " e " o .<: .. " '" ., .. .. " .D

!I

61



62

Keterangan

oc- 1 parasetamol - kofeina.

0<: - 2 parasetamol - propifenazon.

Rs - 1 parasetamol - kofeina.

Rs - 2 parasetamol - propifenazon.

Dengan membuat kUIva pH terhadap harga« dan Rs yang

hasilnya dapat dilihat pada gambar 18 dan 19, dapat

dlsimpulkan pH optimal adalah pH = 7.

3. Penentuan kadar parasetamol, kofeina dan propifenazon

dalam sampel.

3.1. Penetuan kurva linier campuran parasetamol, kofeina dan

propifenazon.

Kurva linier hubungan luas area dan konsentrasi dari

parasetamol, kofeina dan propifenazon yang terlihat pada

gambar 20, 21 dan 22 dapat disimpulkan bahwa campuran

parasetamol, kofeina dan propifenazon dengan konsentrasi

campuran 50 ppm sampai 200 ppm masih menunjukkan

hubungan yang linier, dengan koefien korelasi untuk

parasetamol 0,9870, kofeina 0,9934 dan propifenazon

0,9998 (perhitungan dapat dilihat pada lampiran 7).

3.2. Penentuan kadar parasetamol, kofeina dan propifenazon

dalam campuran dengan metoda standar eksternal.

Dilakukan elusi terhadap larutan standar eksternal dan

larutan sampel dengan kondisi kromatografi

berikut :

sebagai



63

•

..._--.,---.,------.,------ -a 0(.

2

•• ----.----.----... ---..... 0( 1

o , 2 3 • • • 7

___ -+. pH

Gamber 18 : Kurva hubungan pH dengan harga oC dang an fase mobIl

.etanol~air (65 : 35), suhu 500 e



64.

1.

• ............._-_.-.----..

1t Rs 8

•

It_

• "

2 ~R.I

• 1 2 3 • 5 • 7 ____ • pH

Gambar 19 : Kurva hubungan pH dengan harga Rs dengan fase mobil metanol-air (65:35). suhu 50°C



3500

3000

2000

1500

AREA

11000

aoo

•

•

00 .. 100

----.... XONSENTRASI (ppm)

Gamba_~: Kurva kallbrasi parasetamol •

65

•

100



66

20.

2 ••

AREA

•••

• o •• .0 20

----~I KONSENTRASI ( ppm)

Gamber 21 : Kurva kalibrasi kofeina •



67

AREA

[

o 25 75

----.... KONSENTRASI (ppm)

Gambar 22 : Kurva kalibrasi propifenazon •



- kolom ODS zorbax

fase mobil metanal - air 65 35

- suhu percobaan 50° C

- kecepatan fase mobil 1 ml/menit

- detektor u.v ( 254 nm )

- volume sampel yang diinjekkan lOJUl

- pH = 7

68

Pad a penelitian in1 dilakukan repllkasi sebanyak lima

kali. Kromatogram yang terjadl dapat dilihat pada

gambar 23.

3.3. Perhitungan kadar.

Perhitungan

terlihat pada

4. Analisa data.

kadar dl1akukan

tabel 5.

oleh komputer, hasilnya

Dar! hasil perhitungan kadar yang diperoleh (tabel 5 )

dllakukan perhltungan "recovery" yang dapat dilihat pad a

tabel 6, 7 dan 8, dapat disimpulkan ketelitian parasetamol

dan propifenazon adalah baik. Sedangkan dari uji t yang

hasilnya dapat dilihat pada lampiran 1, 2 dan 3 dapat

dlsimpulkan kofeina dan propifenazon menunjukkan ketepatan

yang baik pada derajat kemaknaan CC= 0,05 (33).

Hasil penetapan kadar campuran parasetamol, kofeina dan

propifenazon dapat dilihat pada lampiran 4.



ryLIBPATION MADE IN IDE~TIFICRTION FILE 7 MnDE! 121 WINDOW 5

NAME TIME

2 PAPASETAMOL 2.59 (OrEIN 3.34 PROP! FENAZOti 6.-16

':;41'lPEL ,~

,~;TAP.T 1

( C-R2AX CHANNEL .SAf'lF'LE NO REPORT NO

1 o 777

6.147

FACTOR

€to ('11)299584 O.OP)15.'56 0.00557634

FILE METHOD SAMPLE ~T

COtlC

11 1. 8 22 66.1

7 44

100

PK/-lO TIME AREA MK I DNO CONC NAME

69

2.59 -. :3.35 c .-. 6.147 ,

36325 2233

1170?

V 1 2 3

110.3227 PARASETAMOl 22.7266 KOFEItI 65.2797 PROPIFENAZON

---------TaTel 50770 198.3291

~amba~ : Kromatogra. analisis kuantitatif ca.puran

parasetamol,kofeina dan proplfenazon .



T: .. ocl 5 ! :.i:a3il pcr,,-:;::..nutan p~nctapun k:.tdar Par<!zct9..flJ.ol,

dan :-'ropif'enazon dalam sampel dengan HPLG.

70

... " . LO.l. elr . .:::..

==================~=====================~===~~===~~============

No. sampel

1

2

3

4

5

Kadar yang diperoleh dari kromatogram (ppm)

Parasetamol

107.7C. 106.31

107.16

116.05 114.58 115.00

113.16 114.00 113.03

118.14 117.13 115.23

110.32. 111.22 114.25

I .

!~ofe ina

30.26 28.96 23.19

20.16 21.62 17.82

21.44 22.30 20.05

23.85 23.96 24.07

22.72 23.06 28.91

I I I

Propifenazon

56,20 53.06 53.06

65.59 67.17 68.62

67.20. 66.81 64.60

68.09 62.81 65.72

65.28 66.26

70.25

==============================================================



71

metode stando.r eksternal.

=========T=================T=~=~============T=~===============~

. Kadar dalam : Kadar Y3.~ dipe-; Persentase "reco-No. sampel' roleh darl kroma; ver)"

sampel () togram (,' ppm (ppm) "

1 105,96

2. 111 ,00

3 111,16

4 . 111 ,72

5 110,31

107,0622

115,2161

113,4011

116,838

111,9347

Rata-rata (%)

SD K. V.

101,0402

103,7982

102,0161

104,5811

101,4728

102,5817

1,5331

1,4946 ===============================================================



72

Taber 7 : Hasil p~net<.ipan kad~ kofeina dalam sampel dengan me

tode standar eksternal.

=============================================================== ! Kadar yang d' I Kadar dalam ~pe-. Persentase ureco-No. sampel ! roleh dar! kroma! ve%1'11

sampel (ppm) togram (% (ppm)

1 30,88 29,1402 94,3659 !

2 ! 22,25 19,8712 ! 83,3088

3 22,28 21,2683 95,4591

4 22,28 23,966 107,5673

5 24,01 24,9027 103,718 ! ! ! --------------------------------------------------------------

Rata-rata (%)

3D

K. V.

96,8838 9,4007 9,7031

==============================================================



73

Tabel 8 : Hasil penetapan kG.dar propifenazon do.lam sampel de

ngan metode standar' eksternal.

=====================~========================================

No. sampel

1

2

3

4

Kadar dalam sampel

(ppm)

57,92

66,61

66,65

66,58

5 66,46

! Kadar yang ! roleh dari

togram (ppm)

54,5637 . , 67,1287

dipe-' kr

; Persentase 11 reco-oma. very-II

! (%)

94,2053

100,7787

66,2078. 99,3365

65,545 98,4455

67,2673 101,2147 , , ---------~---------------------------------~------------------

Rata-rata (%) SD K.V.

98,7961 2,7960 2,8301

==============================================================



BAB V

PEHBAHASAN

Pada awal dari penelitian in1 dilakukan optimasi fase

mobil berdasar cara segi tiga dari Snyder (16). Untuk

mendapatkan fase mobil awal dari seg1 tiga Snyder (17)

dilakukan elusi isokratis menggunakan fase mobil campuran

metanal dan 'air dengan komposis! awal metana! 20\ berdasar

hasil penelitian yang telah dilakukan peneliti lain (5).

Karena fase mobil campuran metanol-air dengan persentase

metanal 20\ menghasilkan waktu retensi propifenazon yang

relatif lama (lebih dari 90 menit), meka untuk selanjutnya

dilakukan elu51 isokratis dengan persentase metanol yang

lebih besar, yaitu masing-masing 30\, 40\, 50\, 60\ dan 70\ •

Dari 5 macarn komposisi fase mobil dlatas, fase mobIl

dengan persentase metanol 60% menunjukkan pemisahan yang

cukup baik dan waktu retensi relatif singkat (lebih kuran,g 10

menit) . Kemudian dilakukan satu seri elusi isokratis

menggunakan

persentase

menyesuaikan

fase mobil campuran asetonitril-air

asetonitril 30\, 40\, 50\, dan 60\

kondisi isoeluotropik terhadap fase

dengan

untuk

mobil

metanol-air diatas (60\ metanol) berdasar segi tiga Snyder.

Menurut nomograf dari Schoenmaker (17,25), kondisi

isoeluotropik terhadap campuran metanol-air dengan

74



75

perbandingan masing-masing 60\ dan 40% adalah campuran

asetonitril-air dengan perbandingan masing-masing 50\ dan 50\

Tetapi berdasarkan kromatogram yang didapat, fase mobil

campuran asetonitri!-air ( 50 : 50 ) tidak dapat memisahkan

parasetamol dan kofeina ( gambar 8 ), karena terlihat puncak

kromatogram parasetamol dengan

melihat kurva gambar" 9 dan 10

kofeina

terlihat

berimpit. Dengan

bahwa harga Rsl

(reselusi parasetamol dan kofeina") pada semua persentase

asetonitril kurang dari satu dan harga~ kurang lebih satu.

Harga Rs untuk suatu pemisahan yang baik adalah )1,5 (20,22)

dan hargaCC)l (24). Kenyataan ini menunjukkan bahwa nomograp

dari schoenmaker menunjukkan perbedaan antara ramalan secara

teoritis dengan empiris (25). Berdasar hasil elusi pemisahan

parasetamol, kofeina dan proplfenazon dengan fase mobil

metanol-air telah didapatkan pemisahan yang cukup baik; maka

optimasi selanjutnya tidak dilakukan dengan cara Snyder

tetapi dilakukan menurut cara "window diagram" dengan fase

mobil campuran metanol-air.

Dengan mengamati "window diagram" yang terjadi,

disimpulkan bahwa pemisahan campuran parasetamol, kofeina dan

propifenazon adalah fase mobil dengan persentase 40\ metanol

karena terjadi puncak yang tertinggi pada "window diagram ll,

tetapi resolusinya terlalu besar. Dari lima macam elusi

isokratis campuran metanol - air yang telah dilakukan diatas,

dan berdasarkan kriteria harga aC (QC)l ) dan Rs (Rs )1,5),

juga hasil kromatogramnya ( gambar 7), dapat disimpulkan



76

bahwa pemisahan yang balk terjadl pada fase mobil dengan

persentase 60' metanal dan 70% metanal. Haka untuk optimasi

dilakukan satu lagi elusi isokratis menggunakan £ase mobil

dengan persentase diantara persentase terse but yaltu 65\

metanal, ternyata resolusinya paling baik dan waktu

analisisnya relatif singkat (7 menit).

Pengaruh polaritas bermacam-macam fase mobil terhadap

waktu retensi salut p~da kromatografi cair fase balik (RPC)

dapat dilihat pada tabel berikut:

Tabel 9 Waktu retensl (dalam menit) dar! parasetamol,

kofeina dan propifenazon dengan fase mobil

metanol-air dalam berbagai perbandingan.

-------------------------------------------------------------PERSENTASE HETANOL

30 40 50 60 65 70 -------------------- ._---------------------------------------

------------------ -----------------------------------------Parasetamol

Kofeina

Propifenazon

3,17

6,98

> 70

3,14 2,80 2,61 2,55 2,47

6,66 4,52 3,73 3,41 3,27

47,8 17,54 8,80 6,35 4,80

-------------------------------------------------------------

Terlihat bahwa makin tinggi konsentrasi metanol dalam £ase

mobil makin keeil waktu retensinya. Hal in1 dapat

dlterangKan bahwa mekanisme pemlsahan pada kromatografi fase



77

balik berdasarkan teori solvofobik terutama disebabkan karena

efek fase mobil (12,17). Dalam hal in1 molekul-~olekul salut

yang lebih polar akan dielusi lebih dahulu karena molekul

polar berantaraksi lebih kuat dengan fase mobil yang relatif

polar, sedangkan molekul-molekul yang kurang polar mempunyai

gaya tolak terhadap fase mobil yang relatif polar dan akan

ditarik oleh fase diam yang non polar, sehingga akan dielusi

kemudian.

Urutan elusi untuk senyawa-senyawa yang digambarkan pada

kromatogram gambar 7 dan tabel 9 (parasetamol diikuti

kofeina kemudian propifenazon), dapat dijelaskan berkaitan

dengan strukturnya, dimana polaritas parasetamol (mempunyai

gugus para hidroksi dengan amina sekunder) > kofeina

(mempunyai 2 gugus karbonil dan gugus amina tersier dengan

pasisi orto) > propifenazon (mempunyai 1 gugus karbonil dan

gugus amina tersier dengan posisi orto). Demikian pula halnya

dengan harga ex; (gambar 11), dimana makin besar persentase

metanal harga 0(. mak1n keell, hal In1 sesuai dengan teor1

solvofobik yang telah dijelaskan. Makin besar konsentrasi

metanol dalam fase mobil, makin lemah ikatan solut dengan

"ligand" non polar fase diam (12).

Dari hasil optimasi suhu dengan rentang 300

terlihat bahwa baik harga·~ maupun Rs akan menurun dengan

kenaikan suhu. Hal ini dapat dijelaskan bahwa kelarutan

kornponen-komponen sampel (parasetamol, kofeina dan

propifenazon) dalam fase mobil semakin besar dengan kenaikan

suhu , sehingga menurunkan waktu retensi dan memperkeeil harga

OC dan Rs.



78

HasiI optimasi pH dengan r~ntang 3 - 7 ternyata bahwa harga

OC ralatif tidak dipengaruhi oleh perubahan pH. Demikian pula

halnya dengan harga Rs , telatif tidak dipengaruhi cleh

perubahan pH. Hal in1 dapat dijelaskan bahwa pada rentang pH

3 7 parasetamol (asam lemah), kofeina (basa lemah) dan

propifenazon (basa lemah) relatif tidak mengalami ionisasi,

sehingga kepolaran ketiganya pada rentang pH tersebut diatas

telatif tetap dan relatif tidak merubah harga CC dan Rs.

Berdasarkan hal itu maka pH yang dipi1ih adalah pH = 7,

karena ketiga komponen diatas pad a pH tersebut tidak

bermuatan; sehingga urutan pemisahannya didasarkan pada si£at

hidrofobiknya. Sifat hidrofobik parasetamol (mempunyai gugus

para hidroksi) < kofeina (mempunyai 2 gugus karboni!) <

propifenazon (mempunyai 1 gugus karbonil).

Hasil optimasi parameter fase mobil, suhu kolom dan pH

diaplikasikan dalam anal isis kuantitatif campuran

parasetamol, kofeina dan propifenazon dengan perbandlngan

sesual formula sediaan yaitu 5 : 1 : 3 (1) menggunakan metode

standar eksternal. Kriteria hasil anal isis kuantitatif ini

adalah ketepatan (akurasi) dan ketelitian (presisl). Sebagai

ukuran dari ketepatan adalah' "recovery" (' hasil yang

diperoleh kembali) ,. Hasi! analisls kuantitatif disebut

mempunyai ketepatan yang baik jika tidak ada perbedaan yang

bermakna (pada derajat kemaknaan tertentu) antara harga

sesungguhnya dengan "recovery". Adapun sebagai ukuran dari

ketelitlan dapat digunakan koefisien variasi (KV). Analisis

" . " _.· .. i""" "



79

dianggap teliti jika harga ~V sekecil mungkin.

Berdasarkan hasi! perhitungan uji t pada

(perhitungan dapat dilihat lampiran 1,2 dan 3)

OC =0,05

dapat

dinyatakan ada perbedaan yang bermakna dari persentase

"recovery" parasetamol dan tidak ada perbedaan yang bermakna

dari persentase kofeina dan propifenazon. Sedang dari

perhitungan KV didapatkan harga KV untuk parasetamol adalah

1,49, kofeina adalah 9,70 dan propifenazon adalah 2,83

(lampiran 4). Besarnya harga KV kofeina disebabkan karena

kecl1nya kadar ko£eina dalam campuran sampel.

Hasil anal isis kuantitatif campuran parasetamol, kofeina

dan propifenazon dapat disimpulkan bahwa dengan menggunakan

metode standar· eksternal , parasetamol menunjukkan

yang kurang baik (ada perbedaan yang bermakna

ketepatan

dari \

"recovery") dan ketelitian yang baik. Propi£enazon

menunjukkan ketepatan dan ketelit1an yang balk sedangkan

ko£elna menunjukkan ketepatan yang balk (tldak ada perbedaan

yang bermakna dari persentase "recovery") dan ketelitian yang

kurang balk (harga KV besar).

Besarnya kesalahan yang ditlmbulkan dengan cara metode

standar eksternal in1 dlsebabkan antara lain karena kesalahan

-kesalahan pada waktu ekstraksl dan perbedaan volume

penglnjekslan antara replikasi (9,22) karena pada penelltian

In1 penginjeks1an sampel d1lakukan secara manual.



'BAB VI

KESIMPULAN

Da~i hasil pe~cobaan dan pembahasan diatas

disimpulkan hal-hal sebagai berikut :

dapat

1. Be~dasa~kan hasil optimasi "window diag~am", fase mobil

yang terbaik untuk pemisahan campuran parasetamol,

kofeina dq,n p~opifeilazon dengan kolom "ODS Zo~bax" adalah

campuran metano1 dan air (65: 35) pada suhu kolom

50 0 C dan pH = 7.

2. Analisls kuantitatlf campuran parasetamol, kofeina dan

propifenazon dengan formulasi 5 : l: 3 dengan metode

standar eksternal, pada kondisi optimal menunjukkan

ketepatan yang baik untuk kofeina dan propifenazon serta

ketepatan yang kurang balk untuk parasetamol. Dari

perhitungan harga KV menunjukkan ketelitian yang baik

untuk parasetamol dan propifenazon serta ketelitian yang

relatif kurang baik untuk kofeina.

80



agar

BAB VII

SARAN-SARAN

Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan disarankan

1. Dilakukan penelitian optimasi fase mobil dengan cara lain,

misalnya : diagram tiga titik kapasitas faktor atau cara

seg1 tiga Snyder te·rhadap campuran parasetamol, kofeina

dan propifenazon dengan metode analisis HPLC.

2. Dilakukan penelitlan dengan metode anal isis HPLC terhadap

campuran parasetamol, kofeina dan propifenazon rnenggunakan

metode standar internal.

81



BAB nIl

DAFTAR PUSTAKA

1. Martone Winotoprajoko, dkk . 1985. lnformasi SDesialite

Obat Indonesia. Vol 5 . 19FI Jakarta. p. 129 - 142.

2. Goodman, L.S and Gilman, A

Basis of Therapeutic • 7th

Inc. New York .

1985 • The Pharmacological

ed, Mac. Hillan Publishing Co

3. Lily Julinda . 1985. Penerapan metode spektrofotometrik

pada penetapan Kadar asam askorbat dan asetaminofen dalarn

campuran ", Skr ips i . Fakul tas Farmasi Unalr.

4. Hulja, H dan Syahrani, A. 1987 Aplikasi analisis

spektrofotometri uv-vis • Hecphiso Grafika • p. 31.

5. Noardin, M.A ,dkk . 1983 . Penetapan Kadar parasetamol

secara spektrofotometri dengan pereaksi asam nitrit

Proceeding Konggres Ilmiah L[!L ~ • p. 342 - 345.

6. Haddad, P. Hutchins, Sand Tuffy, M

Performance Liquid Chromatography of some

1983. High

Analgesic

compounds. ~ QL chemical Education, 60 . 2 . p. 166

168.

7. Cas Gupta.v 1980. Simultaneous quantitation of

Acetaminophen, Aspirin, Coffein, Codein phosphat,

Phenacetin and Salicylamide by HPLC. ~ QL Pharm. ~ .

69 . 1 . p. 110 - 112.

82

-



83

8. Mtinson, J,W (1984) HPLe, Theory, Instrumentation, and

Pharmaceutical applications. Pharmaceutical Analysis ~

R. Edited by Munson, J.W., Marcel Dekker Inc. p. 15-

154

9. Indrayanto ,G 1987. Aplikasi HPLC untuk kontrol

kualitas obat-obatan . Simposium HPte . Surabaya

10. Logawa, B 1983 Faktor-faktor yang mempengaruhi

pengembanqan metode ana!isis dengan HPLe Proceeding

Konggres Ilmiah ~ lY . p. 346 - 350.

11. Glajach, J.L and Kirkland, J.J. 1983 Optimization

of selectivity in Liquid Chromatography Analitical

Chemistry . 55 2. p. 319 A - 336 A.

12. Horvath, C and Helander, W.J . 1977 ~ Chromatogr. Sci.

15 . p. 393.

13. Costanzo, S.J 1986 . Selection of a mobile phase

optimization technique in HPLe . ~ ~ ChromatQgr. ~ •

24 • p. 89 -94.

14. Sabate,

1983

L.G, Diaz, A.H, Tomas, X.H, and Gassiot,

Computer Assisted optimization in HPLC .

Chromatogr. ~ . 21 . p. 439 - 43.

M.M

,L" IlL.

15. Issaq H.J., Huschick G.M., and Janini G.M. 1983 A

Graphic representation of binairy mobile phase

optimization in RP - HPLC . ~ ~ ChroroatQgr . 6 p.

259 - 69.



84

16. Deming S.N,. and Michael,L.H.T . 1978 . Optimization of

reverse phase Liquid Chromatographic separation of weak

organic acids . Analitical Chemistry. 50 • 4 • p. 546 ~

48.

17. J.T Baker Chemical Co . 1985 . "PLC Solvent Reference

Manual . p. 4 - 3.

18. Henschen A" Peter Hupe K,. Lottspeich F,. Voelter W

1985 Intrumentratlon H.lgh Perfornance Liguid

Chromatograp9Y in Biochemistry. VHC Publishers p.

79 - 137.

19. Dr. Ami Soewandi J.S., Dr. Indrayanto. G. , Dr.

Zainuddin. H" 1986 . Kursus Instrumen Fakultas Farmasi

UNAIR • Paket E

20. Hamilton R.J.,Sewelt P.A . 1977 . Introduction ~ High

Performance Liguid Chromatograohy . Chapman and Hall

London.

21. Michaelis A.F., Cornish D.W., Vlvilecchia R • 1973 . HIgh

Pressure Liquid Chromatography . ~ ~ Pharmaceutical

W. . 62 • 9 . p. 1399 - 1416.

22. Skoog D.A,. 1985 High Performance Liquld

Chromatography Princiles 2L Instrumental Analysis

3 Ed. Saunders College Publishing .

23. Pecsok R.L,. Shields D.L,. Cairns T,. McWilliam I.G

1976 Chromatography Modern Methods 2L Chemical

Analysis 2nd Ed . John Wiley & Sons . p. 41 - 53.



85

24. Julia Kantasubrata • 1~87 • Kalom HPLC . Simposium HPLC .

Surabaya.

25. Schoenmakers P.J,. DraueD A.C,. Billiet H.A.H,. and de

Galan L 1982 . A Simple procedure for the rapid

optimization of reverse phase separations with ternary

mobil phase mixtures. ChrQrnatographia • 15 • 688 - 96.

26. Snyder R.L. 1983 . Solvent degassing for HPLC . ~ ~

Chrornatogr. Sci • ·21

27. McNair H.M 1982

Chrornatogr. ~ . 20

p.65-69.

Equipment for HPLC - V

p. 537 - 50.

28. Shlmadzu HPLC. Column Temperatur control

of Shimadzu HPLC LC - SA System

Application

29. Farmakope Indonesia 1979. Ed.III. Departemen Kesehatan

Republik Indonesia p. 37, 175

30. Clark E.C.C . 1971 IsolatioD and Identification 2L ~

in Pharmaceutical Body FluId and Post material The

Pharmaceutical Press . p.

31. The Merck Index . 1976 . An Encyclopedia of Chemical

Drugs. 9 th Ed. Merck & Co, Inc. Rahway - New York.

5,188,887.

and

p.

32. Martindale, ~ Extra Pharmacopoeia 1977, Wade, A.

(Ed)The Pharmaceutical Press, London. p. 268, 276, 340.

33. Daniel,W.W. 1978. Biostatistics. A Foundation for

Analysis in The Health Sciences. 2nd Ed. John Wiley &

Sons. New York.



86

liji t kadar r:..ta-r:tta "recovery" Parasetarr:ol de

ngan kadar·sesu~guhnya.

==================================================

Sampel Parasetamol dalam %

1 101,0402

2 103,7982

3 102,0161

4 ,104,5811

·5 101,4728 ! ==================================================

x = 102,5817

SD = 1,5332

t hitung = 3,7653

t tabel 0,05(4) = 2,1318

t hi tung > t tabel.

Jadi ada perbedaan yang bermakna antara kadar rat~

rata yang diperoleh dengan kadar sesungguhnya.



S7

LUf'l-:-::iran 2 : :Jji t k::l.dt:.::> r;Ltd.-rata II rec ovcry" kofeina c.engan k'l

dar sesunGEuhnya.·

==========================~======~================

o"lampel Kofeina dalam %

1 94.3659

2 83.3088

3 95.4591

4 107.5673

"5 103.718 I

================================================== x = 96.8838

SD = 9.4007

t = 'U- X)Vn-SD - = 0.74

t tabel 0.05(4) = 2.1318

t hitung < t tabel.

Jadi tidak ada perbedaan yang bermakna antara ka

dar rata-rata yang diperoleh dengan kadar sesung-

guhnya.

-

! .'

.



Larrniran 3

88

~ji t ~8.dar rQ.tG.-r'~ta "recovery!! propifenazon de

ngan kadar sesun2guhnya.

==================================================

Sampel Propifenazon dalam %

1 94,2053

2 100,7787

3 99,3365

4 '98,4455

5 101,2147 ! ==================================================

x = 98,7961

SD = 2,7960

t l U - x) Vn' 0,9628 = = SD

t tabel 0,05(4) = 2,1318

t hitung < t tabel.

Jadi tidak ada perbedaan yang bermakna antara ka

dar rata-rata yang diperoleh dengan kadar sesung-

guhnya.

Sci . _Uh 'i',

IR -

Per

pust

akaa

n U

nive

rsita

s A

irlan

gga

TES

ISO

PTI

MA

LIS

AS

I FA

SE

MO

BIL

...

SR

I PO

ED

JIA

RTI

01

'" L:q;;pir:Jn 1 : IIasil penctapan kadar cnmpuran Parasetamol, Kofeina dan Propifenazon dengan

HilLC mcnggunoJ{an standar eksternal.

=============t========';=======l:=:!::==============::!:=======:!:========================-========= . ! Kadar yans diperoleh da-!

i :::::_:~~~;;!~~~~:::_i:=_~:~::~~r~~~l _________ l _____ ~~~~~:~::~_~_:_~ ___ _ 1\"0. ~ ~\l:lpe 1

P K Pr P K Pr P !K!Pr

1 105,96 30,88 57,92 !107,0622!29,1402!54,5637!101,0402!94,3659!94,2053 ! ! ! ! ! !

2 111,00 22,25 66,61 !114,2161!19,8712!67,1287!103,7982!83,3088!100,7787 ! ! ! ! ! !

:; 111,16 22,28 66,65 !113,4011!21,2683!66,2078!102,0161!95,4591! ! ! ! ! ! !

99,3365

4 111,72 22,28 66,58 !116,838 !23,966 !65,545 !104,5811!107,567! 98,',455 ! ! ! ! ! !

5 ! 110,31 ! 24,01 ! 66,46 !111,9347!24,9027!66,2673!101,4728!103,718!101,2147 I 1 I f I I , t I . . . . . . . . . ----------------------------------------------------------------------------------------

Rata-rata (%l SD K. V.

!102,5817!96,8838! 98,7961 1,5332! 9,4007! 2,7960 1,4946! 9,7031! 2,8301

========================================================================================

I\ctcrangan : P = Paru3ctumol.

K = I\ofe ina.

Pr = Fropifenazon.



90

Lampiran-2 : Tabel uji t.

rerccnlilc$ or rhe I [)islrihUlioll

, :1.1201 ' .. d. r. /." I" ( ,;~ t." ,~

. l,078 6.JI)8 12.706 )1.821 63.657 2 1.886 2.9200 4.J027 6.965 9.920'8 3 1.638 2.35J·' 3.ISB • ..,.11 5.8409 4 un :U:1I8 2.7764 ~.747 4.6041 , 1.476 2.0150 2 . .5706 . J.J6S 4.0321

• 104·10 1.9-1)2 2.'1·169 ].I11J 3.7074 7 1.415 1.894(, 2.]f\II(, 2.998 J.4995 , LJ97 1.8595 2.]060 2.896 JJSS4

• IJlIJ 1.8)]1 2.2622 2.821 3.2"98 10 1.372 1.8115 2.2281 2.'164 3.169) II 1.363 1.1959 2.2010 2.718 3.10.58

" . I.J~6 1.71123 2.1188 2.681 l,OMS IJ I.JSO 1.7109 2.1601 2.650 3.012) 14 1.J4S 1.7613 2.1448 2.624 2.97(i8

" 1.)41 I.7SJO 2.131.5 2.602 2.9467

" 1.131 1.7459 2.1199 2J8J 2.9208 17 I.))) 1.7396 2.1098 2 . .567 2.8982 18 1,]30 1.7341 2.1009 2.552 2.8784

I. 1.328 1.7291 2.0930 2.539 2.8609 20 1.325 1.7247 2.0860 2J28 2.845) 21 1.32] 1.7207 2.0796 2 . .518 2.8314 22 1.]21 1.1171 2.0739 2.508 2.8188 23· 1.319 1.7139 2.0G87 2.500 2.8073

24 I.3IB 1.1109 2.0639 2.492 2.7969

" 1.316 1.7081 2.0':9': 2.48': 2.7874 26 1.315 1.70.56 2.05!'i!'i 2.479 2.7787 27 1.]14 1.7033 2.0518 2.473 2.7707 28 1.J13 1.7011 2.0484 2.467 2.7633

2' 1.311 1.6991 2.0452 2.462 2.7564-

JO 1.310 1.697] 2.0421 2.4H 2.7500

3' 1.3062 1.6896 2.0)01 lA38 2.7239 40 1.3011 1.6839 1.0111 2.42) 2.704.5

" 1.)007 1.67'14 2.0141 2.412 2.68'6 50 1.2987 I J,75') 2.008(, 2.403 H,]71l

60 1.29S9 1.6707 2.0003 2.390 2.(,(.03

70 1.2938 1.6M,,) 1.9945 1.381 2.60180

'0 1.2n2 1.(,(,4 I 1.9901 2.314 1.6)88

90 1.1910 1.(,620 1.9867 2.)(,8 2.6316 I~) 1.2901 1.(,(,()2 1.91140 2.3601 2.6U,o 120 1.2887 1.6577 1.9799 2.35K 1.6115 1<. 1.2876 I.(,SSH 1.9771 2.351 2.6114 160 1.2869 /.(,S4S I. 974'J 2.)SO 2.W70

180 1.286] J.(,H<I 1.9733 2.)017 2.6035

200 1.2858 l.bS.!S 1.'1719 2.345 2.(,IJO(, w 1.282 1.645 1.96 2.326 l.HG



91

LBmpiran . 6 . , • ! Koefisien korelesi rxy ,

1!eiiurut derajat kemeknean 5% dan 1 %

CO .. funOsCOUJlc ..... ".., nil ,,"-,,'1) I~~ LhWOf s.. ... lfK ... ~· ..

Oqnnol . ",,,,,,01 F"""'m 'l1 1% r-.. ~ I~ -_ . ...

• .• " .- ~.: . '" .'" , ."'" .... .. -", ." -J .Ill .", ,. .p. ..:" • OIl .14. :~ ... -: ." . , .;~ J>o '" .lO. .oJ 6 .!O1 JS4 ,. -'" .'" 7 ... JOt . lC .... .'" • .631 ]0, " .JU ..IiI 9 .., no .. -"" '" 10 J76 Jill ., -'" ··m II SS) . .... 50 Xl J~ .. " .. $)1 .16 • to ~ '" •

" 514 .• " •• 1£ .... " .'" .m .. ~17 .W

" . .:U: .... to ~ ,q 16 ~ .... .00 .... "." 17 • .a!06 SIS I:!S .. ,. -'" II '" ... , .50 .. " -"Ii

" .... H .'" ,.. .'" .11'

• '" ."::3 ~J1 1OO .'U .. " " :0 "" ... "" .. " .. ."" ~" ,.. ."" '" -

" ". "0' , ... .,~ .• 11 -DikuUp daric-: Sn.edecor, G.W. end I'I.G. Cochran.

J.974, Statistical Methods.. Sixth Edition. The Iowa State University

i Press, Ames loWe, U.S.A •• p.557 :.



Hasil perhitungan adanya korelasi linier an tara

konsentrasi dan area •

parasetamol

x

25

50

100

150

r xy

A

B

y

5017

11946

27178

34270

= 0,9870

,. 12,3621.

= 23,9743

x

5

10

15

25

kofelna

r xy

A

B

y

564

1136

1368

2356

= 0,9934

~ 160,4571

= 86,9486

r xy tab (0,05) = 0,950

x = konsentrasi

y • area

propifenazon

X Y

10 1770

25 4428

50 8824

75 12957

txy

,. 0,£998

A

8

= 103,1786

~ 172,4143

92

ifcl;' /dcjrepository.unair.ac.id/82643/2/kk tf 04 88 poe o.pdf · 2019. 5. 23. · titrasi...

Documents