identifikasi tanaman potensial penghasil tanin-protein kompleks untuk penghambatan aktivitas amylase...

Identifikasi tanaman penghasil tanin-protein kompleks kaitannya sebagai pestisida nabati

31

PELITA PERKEBUNAN, Volume 29, Nomor 1, Edisi April 2013

Pelita Perkebunan 29(1) 2013, 31-43

Identifikasi Tanaman Potensial Penghasil Tanin-protein KompleksUntuk Penghambatan Aktivitas -amylase Kaitannya Sebagai

Pestisida Nabati

Identification of Potential Plants Producing Tannin-protein Complexfor -amylase as Botanical Pesticide

Asriyah Firdausi1), Tri Agus Siswoyo1*), dan Soekadar Wiryadiputra2*)

1)Pascasarjana Program Agronomi, Fakultas Pertanian, Universitas Jember2)Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia, Jl. PB. Sudirman No. 90, Jember, Indonesia

*)Alamat penulis (corresponding author): [email protected]; [email protected] diterima (received) 16 November 2012, disetujui (accepted) 11 Januari 2013

Abstrak

Penelitian tentang pestisida nabati perlu dikembangkan melalui metodebaru, di antaranya melalui penghambatan aktivitas enzim pencernaan oleh senyawametabolit sekunder. Penelitian bertujuan untuk mengidentifikasi tanaman potensialpenghasil bahan aktif tanin protein kompleks untuk penghambatan aktivitas-amylase sebagai langkah awal untuk merakit pestisida nabati. Penelitian dibagimenjadi tiga tahap: 1) identifikasi tanaman potensial penghasil bahan aktif tanin,2) isolasi tanin protein kompleks, dan 3) pengujian tanin protein kompleks padaaktivitas -amylase. Beberapa tanaman yang digunakan antara lain daun sidaguri(Sida rhombifolia), daun melinjo (Gnetum gnemon), daun gamal (Gliricidia sepium),daun lamtoro (Leucaena leucocephala), biji pinang (Areca catechu) dan simplisiagambir (Uncaria gambir) komersial. Biji melinjo digunakan sebagai sumber pro-tein. Berdasarkan penelitian ini diketahui bahwa dari berbagai jenis tanaman yangtelah diidentifikasi didapatkan bahan yang berpotensi sebagai sumber tanin-pro-tein kompleks, yakni biji pinang yang diinteraksikan dengan biji melinjo. Tanin-protein kompleks ini memiliki kandungan tanin sebesar 1,77 mg TAE/mL denganaktivitas antioksidan sebesar 90%, kemampuan untuk menghambat aktivitas-amylase sebesar 95% dengan nilai IC50 sebesar 10 mg/mL.

Kata kunci: Tanin, protein, -amylase, pestisida nabati, Areca catechu, Gnetum gnemon.

Abstract

Research on the development of botanical pesticides should bedeveloped through new methods, such as by inhibiting the activity of digestiveenzymes by secondary metabolites. The aim of this study was to identifysome of potential plants as a source of tannin-protein complexes to inhibitthe activity of -amylase. The study of identification of potential plantsproducing the active ingredient tannin-protein complex was divided into threestages, 1) identification of potential plants producing tannin, 2) isolation oftannin-protein complexes, and 3) in vitro test of tannin-protein complexeseffect of the -amylase activity. Some of the observed plants were sidaguri leaf(Sida rhombifolia), melinjo leaf (Gnetum gnemon), gamal leaf (Gliricidia sepium),lamtoro leaf (Leucaena leucocephala), betel nut (Areca catechu), and crudegambier (Uncaria gambir) as a source of tannins and melinjo seed was used asprotein source. Betel nut and melinjo seed were the best source of tannin-pro-

32


Firdausi et al.

tein complex, tannin content 1.77 mg TAE/mL with antioxidant activity of 90%,the ability to inhibit the activity of -amylase by 95% with IC50 values of10 mg/mL.

Key words: Tannin, protein, -amylase, botanical pesticides, Areca catechu, Gnetum gnemon.

PENDAHULUAN

Hama tanaman kakao yang palingberperan dalam menurunkan hasil hingga80% adalah hama penggerek buah kakao(PBK, Conopomorpha cramerella (Snell.))(Lepidoptera: Gracillariidae) (Wiryadiputra,2009; Wahyudi et al., 2008). Pengendalianhama ini yang umum dipraktekkan olehpetani adalah menggunakan pestisida, baikpestisida nabati, misalnya limbah tembakau(Wiryadiputra, 2003) maupun pestisida kimiayang telah diketahui menyebabkan dampakyang cukup serius terhadap keseimbanganekosistem (Ramasoota, 2001). Oleh karenaitu diperlukan terobosan baru sebagai upayaperakitan pestisida yang lebih berwawasanlingkungan yakni dengan mengembangkanpestisida nabati yang cara kerjanya melaluipenghambatan terhadap enzim pencernaanserangga.

Alfa amylase (-1, 4-glucan-4-glucano-hydrolases, EC 3.2.1.1) merupakan enzimyang menghidrolisis ikatan -D-(1,4)-glukanpada komponen pati, glikogen dan jenis yangberhubungan dengan karbohidrat untukdiubah menjadi energi yang dapat digunakanoleh serangga untuk pertumbuhannya,bertahan hidup dan beraktivitas (Xiao et al.,2009). Alfa amylase merupakan enzimpenting dalam pencernaan yang berdampakpada daya hidup serangga. Hama seranggaselalu hidup pada kondisi yang kayapolisakarida dan kelangsungan hidupnyasangat tergantung pada keefektifan enzim-amylase. Pencernaan pati oleh -amylaseserangga telah ditunjukkan dan dideskripsikanpada beberapa jenis serangga, termasuk ordo

Coleoptera, Hymenoptera, Diptera, Lepi-doptera, dan Hemiptera. (Mehrabadi &Bandani, 2009; Jimenez et al., 2008).

Penghambatan pada enzim -amylaseakan menurunkan kemampuan untukmencerna pati yang merupakan saranapenyedia energi. Penelitian yang dilakukanoleh Mcdougall et al. (2003) menunjukkanbahwa senyawa fenolik dari beberapatanaman mampu menghambat aktivitasenzim -amylase. Secara alami, tanamanmenghasilkan senyawa-senyawa metabolitsekunder, antara lain terpentin, fenolik,glikosida, dan alkaloid (Hopkins & Huner,2004; Wang et al., 2009). Senyawa metabolitsekunder memiliki kemampuan proteksi yaknisebagai penghambat aktivitas makan(antifeedant), antioksidan serta antibakterisehingga berpotensi untuk dimanfaatkansebagai pestisida nabati (Turkmen et al.,2007; Misnawi & Wahyudi, 2008). Salahsatu senyawa metabolit sekunder darigolongan polifenol adalah tanin.

Tanin merupakan senyawa makromolekul yang dihasilkan oleh tanamandan berperan sebagai penolak nutrisi(antinutrient) dan penghambat enzim(enzyme inhibitor) sehingga mengakibatkanrendahnya hidrolisis pati dan menurunkanrespons terhadap gula darah pada hewan(Matsushita et al., 2002). Jenis tanaman yangmengandung tanin antara lain adalah daunsidaguri (Sida rhombifolia L.) yang diketahuimengandung tanin cukup tinggi dan telahdigunakan sebagai pestisida nabati pembunuhulat (larvasidal) (Kusuma et al., 2009;Islam et al., 2003). Daun melinjo (Gnetum


33


gnemon L.) juga mengandung tanin. Daungamal (Gliricidia sepium Jacq.) dan lamtoro(Leucaena leucocephala Lamk.) mempunyaikandungan tanin 8-10% (Suharti, 2005;Sulastri, 2009). Biji pinang (Arecacatechu L.) dan simplisia gambir (Uncariagambir Roxb.) telah dikenal luas sebagaipenghasil tanin dengan kandungan taninmasing-masing sebesar 26,6% dan 30-40%(Pambayun, 2007; Hadad et al., 2007).

Senyawa tanin yang terdapat dalamtanaman secara alami memiliki kemampuanuntuk berinteraksi dengan protein danmembentuk protein kompleks, demikian puladengan senyawa pati (Makkar et al., 2007).Senyawa kompleks tersebut bersifat racunyang dapat berperan dalam menghambatpertumbuhan dan mengurangi nafsu makanherbivora melalui penghambatan aktivitasenzim pencernaan yakni -amylase.Terhadap penghambatan aktivitas enzim-amylase belum banyak dilakukan peng-amatan. Tulisan ini menyajikan hasilidentifikasi tanaman potensial penghasil tanin-protein kompleks, penghambatan aktivitas-amylase sebagai langkah awal perakitanpestisida nabati untuk mengendalikan hamakakao yang ramah lingkungan.

BAHAN DAN METODE

Penelitian dilaksanakan di LaboratoriumAnalisis Tanaman Jurusan BudidayaPertanian Fakultas Pertanian UniversitasJember, sedangkan bahan lain yangdigunakan berstandar kualitas untukanalisis (analitical grade) . Penelitiandilakukan dengan menggunakan rancanganacak lengkap dengan enam perlakuandan tiga ulangan. Perlakuan berupa contohjaringan tanaman yaitu daun sidaguri (Sidarhombifolia L.), biji, dan daun melinjo(Gnetum gnemon L), daun gamal (Gliricidiasepium Jacq.), daun lamtoro (Leucaenaleucocephala Lamk.), biji pinang (Areca cate-

chu L.), dan simplisia gambir (Uncariagambir Roxb.). Bahan penelitian yangdigunakan antara lain adalah DiphenilPicrilhydrazil (DPPH), asam galat (Gallicacid), asam askorbat (Ascorbic acid),Bovine Serum Albumin (BSA), dan enzim-amylase porcine pancreatic (Sigma), sertabahan pendukung lain dengan kualitas untukanalisis (analitical grade).

Sepuluh gram contoh dilarutkan dengan50 mL 50% metanol, kemudian disentrifusidengan kecepataan 10.000 rpm (rotary perminute) untuk dipisahkan antara supernatandan pelet, supernatan akan digunakan padaproses berikutnya.

Total Protein Terlarut

Kandungan protein total diukur denganmetode Bradford (1976). Sepuluh (10) Lcontoh ditambah dengan 990 L larutanBradford, diinkubasi selama 15 menit padasuhu ruang, kemudian diukur nilai absor-bansinya pada panjang gelombang 595 nm.Hasil pengukuran dibandingkan dengan 1 mg/mL Bovine Serum Albumin (BSA) sebagaistandar untuk mengetahui kandungan totalprotein terlarut.

Flavonoid

Penentuan kandungan flavonoid meng-gunakan metode AlCl3, yaitu 50 L padamasing-masing ekstrak contoh dilarutkanpada 500 L air deionisasi (deionizedwater), 30 L 5% NaNO2 ditambahkan,didiamkan selama lima menit, lalu ditambah-kan 30 L 10% AlCl3, didiamkan kembaliselama enam menit. Setelah enam menit,200 L 1N NaOH ditambahkan dengandiikuti penambahan 240 L air deionisasi.Besarnya konsentrasi flavonoid yangdihasilkan pada masing-masing ekstrakcontoh ditentukan dengan mengukur nilaiabsorbansinya pada panjang gelombang

34


Firdausi et al.

Sebanyak 2,5 g agarose ditambahkan dengan250 mL 0,05 M bufer asetat pH 5,0 yangmengandung 60 M asam askorbat, di-panaskan dengan microwave, kemudiandiinkubasi pada suhu 45oC selama 15 menit,selanjutnya ditambahkan BSA dan diletak-kan pada petridis. Pada gel di dalam petridisdibuat beberapa lubang sebagai tempatuntuk menguji contoh, dan contoh yangdimasukkan sebanyak 7g GAE (gallic acidequivalent).

Tanin-protein kompleks didapat melaluimetode presipitasi protein berdasarkan pH.Sumber protein yang digunakan padapenelitian ini adalah biji melinjo yangdilaporkan mempunyai kandungan proteincukup tinggi yakni sekitar 10% (Siswoyo,2011). Untuk mendapatkan sumber proteindari biji melinjo, 4 g biji melinjo dihaluskandengan menggunakan 20 mL air, larutandisentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm,dan supernatan akan digunakan sebagaisumber protein dalam membentuk tanin-pro-tein kompleks. Sepuluh (10) mL contoh yangmenjadi sumber tanin diinteraksikandengan protein biji melinjo pada perbandingan1:2, kemudian diukur pH-nya. Untukmendapatkan pH rendah (2,4), contoh diberilarutan 1 N HCl dengan cara diteteskan,sampai sesuai dengan pH yang diinginkansedangkan untuk pH tinggi (8) diberi larutan1 N NaOH. Contoh disentrifugasi dengankecepatan 10.000 rpm selama 15 menit untukdiambil peletnya dan digunakan pada prosesselanjutnya [Hoon et al. (1980) dalam Neveset al. (1997)].

Penghambatan Aktivitas -amylase

Pengujian aktivitas -amylase secara invitro dilakukan berdasarkan hambatanaktivitas enzim -amylase yang berasal dariporcine pancreatic -amylase, sedangkangula reduksi yang dihasilkan dianalisis

415 nm dengan menggunakan 1 mg/mLQuercetin sebagai standar.

Polifenol

Kandungan senyawa polyphenol diukurmenggunakan Folin-Cicalteau Reagentdengan menggunakan 1 mg/mL asam galatsebagai standar. Seratus (100) L ekstrakcontoh dilarutkan dalam 2 mL 2% Na2CO3,yang kemudian diikuti dengan penambahanpereaksi 100 L 50% Folin-CicalteauReagent. Larutan dicampur sampai homogen,lalu didiamkan selama 30 menit pada suhukamar. Absorbansi dari larutan tersebutdiukur dengan menggunakan spektrofoto-meter U-2001 dengan panjang gelombang750 nm.

Interaksi Tanin Protein

Pengujian kandungan tanin dilakukandengan metode yang dikemukakan olehHagerman (2002) dengan menggunakantannic acid sebagai standar. Pengujiankandungan protein dilakukan dengan metodeBradford menggunakan BSA (Bovine SerumAlbumin) sebagai standar dan untuk pengujianaktivitas antioksidan menggunakan DPPH(1,1-diphenil-2-picrylhydrazil).

Aktivitas antioksidan dihitung denganrumus :

Nilai RF (rate of flow) dihitung denganrumus:

Keterangan (Note):abs (DPPH) = absorbansi (nm) pada DPPH, dan RF = lajualir (rate of flow) senyawa antioksidan.

Metode Radial Difusion Assay inidikemukakan oleh Hagerman (2002).

Aktivitas Antioksidan =abs (DPPH)abs (DPPH+contoh) x 100%

abs (DPPH)

Jarak yang ditempuh oleh senyawaRF = Jarak yang ditempuh pelarut


35


menggunakan metode DNS (dinitrosalisilycacid, asam dinotrosalisilat) dengan 1 mg/mLmaltose sebagai standar. Dua puluh (20) L-amylase, 100 L 1% pati terlarut (solublestarch), dan 400 L bufer diinkubasikan padasuhu 37oC selama 30 menit. Lima ratus(500) L DNS ditambahkan untuk meng-akhiri reaksi. Larutan diinkubasikan pada airyang mendidih selama lima menit, absorbandiukur dengan spektrofotometer denganpanjang gelombang 540 nm.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Identifikasi tanaman potensial penghasilbahan akif tanin-protein kompleks dilakukanpada beberapa tanaman yang berada didaerah dekat dengan kebun kakao, denganharapan mudah diperoleh petani kakaosebagai langkah awal untuk membuatpestisida nabati. Hasil uji kandungan protein,fenolik dan tanin dari sampel yang digunakan,dapat dilihat pada Tabel 1. Fenolik merupakansenyawa metabolit sekunder yang dihasilkantanaman. Secara umum, senyawa inimerupakan senyawa yang disintesis dari gulasederhana dan memiliki cincin benzenhidrogen dan oksigen, sedangkan taninmerupakan bagian dari fenolik yang berfungsisebagai pengikat protein, enzim, penghambat

proses pencernaan serta bersifat sebagaiantioksidan.

Pada dasarnya setiap tanaman meng-hasilkan tanin sebagai metabolit sekunder,hanya jumlahnya berbeda pada setiaptanaman, begitu pula pada setiap bagiantanaman (Frutos et al., 2004; Taiz & Zieger,2002). Kandungan tanin dan protein berbedauntuk setiap contoh, hal ini disebabkan karenametabolit sekunder yang disintesis oleh setiaptanaman mempunyai distribusi yang terbataspada famili tertentu, genera, dan bahkanspesies. Hal ini disebabkan oleh lingkungantempat tanaman itu tumbuh (Hopkins &Huner, 2004; Kayani et al., 2007). Tidakhanya itu, bahkan penelitian yang telahdilakukan oleh Morris et al. (1993), denganmenggunakan tanaman Lotus corniculatusvar. japonicas menunjukkan bahwa distribusitanin pada bagian dari tiap tanaman tersebutjuga berbeda.

Aktivitas Antioksidan

Pengujian aktivitas antioksidan secarakualitatif dilakukan dengan metode dot blotDPPH. Metode ini relatif mudah, sederhanadan sensitif untuk seleksi antioksidan padatanaman, kemudian dilanjutkan denganmetode TLC-DPPH untuk menentukan

Tabel 1. Kandungan protein, fenolik, dan tanin pada beberapa jenis tanaman

Table 1. Protein, phenol, and tannin content in several species of plants

Daun sidaguri (S. rhombifolia leaves) 02.41 0.02 d 4.18 0.02 a 5.91 0.02 a

Daun melinjo (G. gnemon leaves) 03.18 0.05 c 12.11 0.07 d 14.50 0.19 c

Daun gamal (G. sepium leaves) 00.97 0.05 e 7.37 0.03 c 7.21 0.09 ab

Daun lamtoro (L. leucocephala leaves) 00.13 0.03 f 4.69 0.06 b 14.90 0.06 c

Simplisia gambir (Crude gambier) 12.13 0.02 b 74.77 0.10 e 26.90 0.06 e

Biji pinang (Arecanut fruit) 14.87 0.06 a 74.38 0.04 e 20.74 0.09 d

Sampel Tanaman (Plant species)Protein (Protein)

mg/g

Fenolik (Phenolic)

mg GAE/g

Tanin (Tannin)

mg TAE/g

Catatan (Notes): BSA = (Bovine serum albumin); GAE = Ekuivalen asam galat (Gallic acid equivalent); QE = Ekuivalenkuersetin (Quercetin equivalent); TAE = Ekuivalen asam tanat (Tannin acid equivalent).

Angka-angka di dalam kolom yang sama dan diikuti dengan huruf yang sama menunjukkan tidak berbedanyata dengan uji jarak Duncan 5% (Numbers within the column followed with the same letters are notsignificantly different according to DMRT test at 5% level).

36


Firdausi et al.

secara spesifik senyawa-senyawa yang ber-potensi sebagai antioksidan. Pengujian inidilakukan menggunakan GA (gallic acid) danBHT (butylated hydroxytoluene) sebagaikontrol.

Dari Gambar 1 (A) dapat diketahuibahwa semua contoh yang digunakan padapenelitian ini mempunyai kemampuansebagai antioksidan. Hal ini tampak padareduksi warna ungu yang berubah menjadiputih atau coklat. Warna ungu merupakansenyawa DPPH yang merupakan senyawaradikal bebas dan akan berubah menjadiputih atau coklat apabila senyawa DPPHberikatan dengan senyawa yang merupakanantioksidan. Pada Gambar 1 (B) yakni hasildari metode TLC-DPPH menunjukkan bahwaterdapat banyak senyawa yang berfungsisebagai antioksidan pada masing-masingcontoh, namun terdapat pita (band) yangmenunjukkan bahwa senyawa tersebutmerupakan antioksidan utama. Senyawa inimempunyai nilai laju alir (rate of flow = RF)

yang berbeda untuk setiap tanaman. Hal inimenunjukkan bahwa terdapat beberapasenyawa berbeda yang terkandung padacontoh yang bersifat sebagai antioksidan.

Metode berikutnya yaitu denganperendaman dalam DPPH yang digunakanuntuk mengetahui aktivitas antioksidansecara kuantitatif pada setiap tanaman danhasilnya tampak pada Gambar 2.

Pada penelitian ini diketahui bahwacontoh memiliki aktivitas antioksidan yangberbeda. Pada konsentrasi 10 mg GAE/mL,contoh sudah menunjukkan aktivitasantioksidan yang tinggi, yaitu pada bijipinang, simplisia gambir, daun melinjo, daunlamtoro, dan daun gamal, namun pada daunsidaguri baru menunjukkan aktivitasantioksidan dalam konsentrasi yang tinggiyakni 40 mg GAE/mL. Hal ini menunjukkanbahwa semua bahan tanaman yang diujimempunyai potensi untuk dijadikan sebagaisumber antioksidan, namun biji pinang dansimplisia gambir memiliki potensi yang lebih

Gambar 1. (A) Pengujian aktivitas antioksidan dengan metode dot blot, (B) penentuan aktivitas penangkalradikal dengan TLC-DPPH. GA = gallic acid; ME = metanol; BHT = butil hidroksitoluen;S = daun sidaguri; M = daun melinjo; G = daun gamal; L = daun lamtoro; P = biji pinang;GB = simplisia gambir.

Figure 1. (A) Antioxidant activity test using dot blot method , (B) TLC-DPPH. GA = gallic acid;ME = metanol; BHT = butil hidrositoluen; S = Sida rhombifolia L.; M = Gnetum gnemon L.;G = Gliricidia sepium; L = Leucaena leucocephala; P = Areca catechu; GB = Uncaria gambir.

RF : 0,86

RF : 0,85

RF : 0,79

RF : 0,76

A B

S M G L P GB


37


besar untuk dijadikan sebagai sumber tanin.Hasil penghitungan nilai IC50 (inhibitory con-centration) dari biji pinang 4,1; simplisiagambir 6,4; daun melinjo 20,0; daun gamal41,0; dan daun lamtoro 72,4 mg/mL GAE(Gambar 2). Untuk daun sidaguri tidak dapatditentukan nilai IC50-nya, hal ini karenaaktivitas penghambatannya terhadap DPPHtidak mencapai 50%. Hasil tersebutmenunjukkan bahwa dengan meningkatnyaaktivitas antioksidan, maka nilai IC50 akansemakin rendah dan contoh tersebut sangatberpotensi untuk dijadikan sebagai sumberpestisida nabati.

Interaksi Tanin Protein

Tanin secara alami memiliki kemampuanuntuk berikatan dengan protein yangkemudian membentuk tanin proteinkompleks. Secara umum, interaksi taninprotein-kompleks yang dapat diendapkan

dapat terjadi jika perbandingan jumlahprotein dan tanin lebih dari satu. Apabilakandungan tanin lebih besar daripadakandungan protein maka tanin-proteinkompleks yang terbentuk lebih mengarahpada tanin-protein kompleks yang tidakdiendapkan. Tanin protein kompleks dapatdisintesa secara turbidimetrik berdasarkangradien pH. Tidak semua tanaman mem-punyai nilai pH yang sama dalam pem-bentukan tanin protein kompleks.

Pada Tabel 2, dapat dilihat bahwamasing-masing contoh memiliki pH yangberbeda dalam pembentukan tanin-proteinkompleks. Ada yang terbentuk pada pHasam yakni melinjo pada pH 4, pH netralyakni gambir pada pH 6, dan yang terbanyakadalah pH basa, yaitu daun sidaguri padapH 8; daun gamal pada pH 10; daun lamtoropada pH 10 dan biji pinang pada pH 8. Halini dipengaruhi oleh jenis protein yangterdapat pada setiap tanaman. Kelarutan tanin

Gambar 2. Pengaruh pemberian contoh ekstrak tanaman dengan berbagai konsentrasi pada DPPH.Figure 2. Effect of plant samples with different concentrations on DPPH.

100

80

60

40

20

0 0 10 20 30 40 50 60

Konsentrasi contoh GAE (GAE concentration), mg/mL

Ham

bata

n D

PPH

(DPP

H in

hibi

tion)

, %

Pinang (Areca catechu)

Gambir (Uncaria gambier)

Gamal (Gliricidia sepium)Lamtoro (Leucaena leucocephala)

Melinjo (Gnetum gnemon L.)

Sidaguri (Sida rhombifolia L.)

38


Firdausi et al.

protein yang paling rendah terjadi pada nilaiisoelektrik dari protein (Shahidi & Marian,2004).

Kemampuan tanin untuk mengendapkanprotein dapat terjadi pada pH di bawah 8,kemudian akan menurun tajam pada pH diatasnya disebabkan tanin tidak dapatberikatan dengan protein pada pH tinggi. Padakondisi tersebut, tanin akan terionisasi dantidak tersedia untuk ikatan hidrogen.Meskipun demikian, hal ini tidak berlakuuntuk daun gamal dan daun lamtorodisebabkan protein yang terdapat di dalam-nya tidak seluruhnya tergantung padapembentukan ikatan hidrogen dengankelompok fenolik yang tidak terionisasi(Hagerman & Butler, 1978).

Pengujian afinitas contoh untuk ber-interaksi dengan protein dilakukan melalui ujiradial difusi tanin. Tanin yang berasal darimasing-masing contoh diletakkan pada aga-rose yang mengandung BSA (Bovine SerumAlbumin), hasilnya tampak pada Gambar 3.

Gambar 3. Difusi radial tanin dari tiap contoh padaprotein BSA: P = biji pinang; S = daunsidaguri; M = daun melinjo; G = daungamal; L = daun lamtoro; GB = simplisiagambir; GA = asam galat.

Figure 3. Radial diffusion of sample in BSAprotein: P = Arecanut fruit; S = Sidarhombifola leaves; M = Gnetum gnemonleaves; G = Gliricidia sepium leaves;L = Leucaena leucocephala leaves;GB = Crude gambier; GA = Gallic acid.

Kemampuan contoh sebagai sumbertanin berinteraksi dengan protein tampakpada hasil uji difusi radial (radial diffusion

GB

S

GA

M

GL

P

Tabel 2. Kandungan protein, fenolik, dan tanin protein kompleks pada beberapa tanaman contoh

Table 2. Protein, phenolic, and tannin-protein complex contents in several of plant species

Catatan (Notes): TPT = Total protein terlarut (Total of soluble protein); P/T = Rasio antara protein dan tanin (protein-tannin ratio).

Angka-angka di dalam kolom yang sama dan diikuti dengan huruf yang sama menunjukkan tidak berbedanyata dengan uji jarak Duncan 5 % (Numbers in the same column followed with the same letters are notsignificantly different according to DMRT test at 5 % level).

Daun sidaguri 8 2.30 0.08 ab 01.63 0.02 b 0.91 0.13 ab 13.62 0.27 ab 2.52S. rhombifolia leavesDaun melinjo 4 2.05 0.15 ab 1.39 0.03 b 0.37 0.00 a 18.44 0.23 cd 5.54G. gnemon leaves

Daun gamal 10 5.66 0.66 c 0.83 0.00 ab 0.65 0.13 ab 11.76 0.50 a 8.71G. sepium leaves

Daun lamtoro 10 1.49 0.02 ab 12.76 5.74 c 0.96 0.02 ab 16.13 0.59 bc 1.55L. leucocephala leaves

Simplisia gambir 8 1.01 0.01 a 0.33 0.01 a 0.55 0.09 ab 32.07 0.23 e 1.84Crude gambier

Biji pinang 6 4.96 0.68 c 43.55 7.78 d 2.79 0.06 c 86.70 0.05 f 1.78Arecanut fruit

Jeneis tanamanPlant species

pH TP TTotal soluble protein

mg/ml

FenolikPhenolic

mg GAE/ml

TaninTannin

mg TAE/ml

Hambatan DPPHDPPH inhibition

%

P/T


39


kuat dibandingkan dengan ikatan ion (Shahidi& Marian, 2004) dan setiap tanaman memilikikarakteristik tanin yang berbeda.

Dari Tabel 3 dapat diketahui bahwa taninprotein kompleks yang berasal dari simplisiagambir dan biji melinjo memiliki kandungantanin yang lebih rendah dibandingkan dengantanin protein komplek yang berasal dari bijipinang dan biji melinjo. Demikian puladengan kemampuan anti-oksidannya. Olehkarena itu, contoh yang akan dipilih sebagaibahan pestisida tanin protein komplek adalahyang berasal dari biji pinang dan biji melinjo.

Aktivitas Penghambatan -amylase

Telah banyak penelitian yang me-nyatakan bahwa aktivitas pencernaan akanterganggu dengan adanya -amylaseinhibitor (Narayanan, 2004; Obame et al.,2007; Vinayaka et al., 2009). Sebagai contoh,aktifitas -amylase larva Tecia solanivoramenurun sebesar 80% dengan adanya bijiAmaranthus hypocondriacus. Mekanismepenghambatan tanin terhadap bakteri danbeberapa enzim belum diketahui secara pasti.Ada pendapat yang menyatakan bahwastrategi penghambatan -amylase seranggaantara lain melalui penghambatan interaksiantara sisi substrat yang seharusnya ber-ikatan dengan enzim, menjadi berikatandengan tanin. Akibatnya terbentuk subsiteyang menciptakan molekul-molekul lainsehingga struktur yang seharusnya terlibat

assay), sebagai tampak pada Gambar 3.Interaksi tanin dengan protein terlihat darilingkaran cincin (visible ring) yangterbentuk. Semakin lebar visible ring yangterbentuk, maka kemampuan tanin untukberinteraksi dengan protein juga semakinbesar (Makkar et al., 2007). Hasil radialdifusi menunjukkan bahwa sampel yangberasal dari biji pinang dan gambir mempunyaiafinitas yang tinggi untuk berikatan denganprotein dibandingkan dengan sampel yanglain. Hal ini menunjukkan bahwa biji pinangdan gambir berpotensi untuk dijadikansebagai sumber tanin.

Pada penelitian ini, biji melinjo dipilihuntuk digunakan sebagai sumber protein,karena biji melinjo mempunyai kandunganprotein yang cukup tinggi yakni mencapai10% untuk tiap butir bijinya (Siswoyo,2011). Selain itu biji melinjo dikenal memilikikemampuan sebagai antioksidan dankarakteristik protein pada biji melinjotelah diketahui. Penginteraksian antarasumber tanin dengan protein yang berasaldari biji melinjo diharapkan dapatmeningkatkan penghambatan aktivitas-amylase. Kandungan protein, fenolik, dantanin pada tanin protein kompleks disajikandalam Tabel 3.

Interaksi antara tanin dan protein untukmembentuk tanin protein komplek di-pengaruhi oleh ikatan antara keduanya. Taninprotein kompleks yang terjadi karena ikatanhidrofobik memiliki kemampuan yang lebih

Tabel 3. Kandungan protein, fenolik, dan tanin dalam tanin protein kompleks

Table 3. Protein, phenolic, and tannin content in tanin protein complex

P-M 5.30 0.02 b 1.77 0.01 b 0.31 0.001 a 90.05 0.37 b

Gb-M 1.43 0.01 a 0.52 0.00 a 0.27 0.001 a 46.74 0.89 a

ContohSample

Fenolik Phenolic

mg GAE/mL

TaninTannin

mg TAE/mL

TP TTotal soluble protein

mg/mL

Hambatan DPPH/Aktivitas antioksidanDPPH Inhibition/antioxidant activity

%

Catatan (Notes): BSA = Bovine Serum Albumin; GAE = Gallic acid equivalent; QE = Quercetin equivalent; TAE = Tannicacid equivalent.

P = Biji pinang (Arecanut fruit); Gb = Simplisia gambir (Crude gambier); M = Biji melinjo (Gnetumgnemon bean).

40


Firdausi et al.

dalam proses, menjadi berikatan denganstruktur molekul yang bebas yang merupakanmolekul inhibitor, hasilnya proses terhambat(Payan, 2004). Selain itu ada yang ber-pendapat bahwa kemampuan tanin untukberikatan dengan protein mampu meng-hambat -amylase, glucosyl transferase, danhal ini menyebabkan enzim tersebutkehilangan fungsi dan terdistorsi menjadistruktur tersier (Miller, 2001).

Penghambatan aktivitas -amylase daritanin-protein kompleks yang berasal dari bijipinang-melinjo sebagaimana terlihat padaGambar 4. Pemberian tanin-protein kompleksternyata berpengaruh positif terhadappenghambatan aktivitas -amylase. Pemberi-an tanin yang berasal dari ekstrak buahpinang dan protein yang berasal dari biji

melinjo ternyata mampu menghambataktivitas -amylase dengan nilai IC50 masing-masing sebesar 11 mg/mL dan 51 mg/mL.Namun dengan membentuk tanin proteinkompleks yang berasal dari kedua bahan initernyata mampu meningkatkan penghambatanterhadap aktivitas -amylase, yakni sebesar95% dengan nilai IC50 sebesar 10 mg/mL.

Korelasi antara aktivitas penghambatan-amylase dan aktivitas antioksidan bijipinang-melinjo tampak pada Gambar 5. Darihasil penelitian ini tampak bahwa terdapatkorelasi positif antara antioksidan danaktivitas penghambatan -amylase. Padatanin-protein kompleks yang berasal dari bijipinang-melinjo, peningkatan aktivitasantioksidan ternyata sejalan dengan mening-katnya penghambatan aktivitas -amylase.

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Peng

ham

bata

n (In

hibi

tion)

, %

Protein (Protein), mg

0 20 40 60 80 100 120

Pinang-melinjo (Areca catechu-Gnetum gnemon L.)

Gambar 4. Aktivitas penghambatan -amylase oleh tanin-protein kompleks dari biji pinang dan biji melinjo.

Figure 4. -amylase inhibition activity by tannin protein complex from Arecanut fruit and Gnetum gnemonseed.

Pinang (Areca catechu)

Melinjo (Gnetum gnemon L.)


41


KESIMPULAN

Bahan yang berpotensi sebagai sumbertanin-protein kompleks, yakni biji pinangyang diinteraksikan dengan biji melinjo.Tanin-protein kompleks ini memilikikandungan tanin sebesar 1,77 mg TAE/mLdengan aktivitas antioksidan sebesar 90%,kemampuan untuk menghambat aktivitas-amylase sebesar 95% dengan nilai IC50sebesar 10 mg/ml.

DAFTAR PUSTAKA

Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitivemethod for quantitation of microgramquantities of protein utilizing the prin-

ciple of dye binding. Analytical Bio-chemistry, 72, 248254.

Frutos, P.; G. Hervas; F.J. Giraldez &A.R. Mantecon (2004). Review. Taninsand ruminant nutr ition. SpanishJournal of Agricultural Research, 2,191202.

Hadad, M.; N.R. Ahmadi; M. Herman;H. Supriadi & A.M. Hasibuan (2007).Teknologi Budidaya dan PengolahanHasil Gambir. Balai PenelitianTanaman Rempah dan Aneka TanamanIndustri.

Hagerman, A.E. (2002). Tanin Chemistry.Miami University, Oxford, USA.

Hagerman, A.E. & L.G. Butler (1978). Proteinprecipitation method for the quantita-

Gambar 5. Korelasi antara aktivitas penghambatan -amylase dan aktivitas antioksidan dari tanin proteinkompleks asal biji Pinang-biji Melinjo.

Figure 5. Correlation between -amylase inhibition activity and antioxidant activity from tannin proteincomplex derived from Areca catechu-Gnetum gnemon seeds.

120

100

80

60

40

20

0

-20

Ham

bata

n D

PPH

(DPP

H In

hibi

tion)

, %

Hambatan -amylase (-amylase inhibition), %

y = -0.008x2 + 1.941x - 1.334R2 = 0.980

0 20 40 60 80 100

42


Firdausi et al.

tive determination of tannins. Journalof Agricultural and Food Chemistry,26, 809812.

Hopkins, W.G. & N.P.A Huner (2004). Intro-duction to Plant Physiology. JohnWiley and Sons, Inc. Third Edition.London.

Islam, M.D.; N.A. Khatune; M.I.I. Waheed& M.D. Haque (2003). Larvacidalactivity of a new glucocide, phenylethyl D-glucopiranoside from the stemof plant Sida rhumbifolia Linn.Pakistan Journal of BiologicalScience, 6, 7375.

Jimenez., A.V.; J.W. Arboleda; A. Lopez Avila & M.F. Rossi-de-Sa (2008). Diges-tive -amylases from Tecia solanivoralarvae (Lepidoptera: Gelechiidae):response to pH, temperature and plantamylase inhibitors. Bulletin of Ento-mological Research, 98, 575579.

Kayani, S.A.; M. Ayeesha; K.H. Abdul;Achakzai & A. Shahla (2007). Distri-bution of secondary metabolites inplants of Quetta-Balochistan. PakistanJournal Botany, 39, 11731179.

Kusuma, F.; K. Dewi & F. Enny (2009). Isolasi,Identifikasi, dan Uji Toksisitas MinyakAtsiri Daun Sidaguri (Sida rhombifoliaLinn). Jurusan Kimia FMIPA UNDIP.Semarang.

Makkar, H.P.S.; P. Shiddurajju & K. Becker(2007). Plant Secondary Metabolites.Humana Press. New Jersey.

Matsushita, H.; T. Mio & O. Haruko (2002).Porcine pancreatic -amylase showsbinding activity toward N-linkedoligosaccharides of glycoproteins.The Journal of Biological Chemistry,277, 46804686.

Mcdougall, G.; S. Faina; D. Patricia; S. Pauline;B. Alison & S. Derek (2003). DifferPolyphenolic Components of SoftFruit Inhibit -Amylase and -Glu-cosidase. Scottish Crop ResearchInstitute. United Kingdom.

Mehrabadi, M. & A.R. Bandani (2009). Assess-ing of -amylase activity of midgut inwheat bug Eurygaster Maura. Ameri-can Journal of Applied Sciences, 6,478483.

Miller, J.M.T. (2001). Anti-cariogenic proper-ties of tea (Camellia sinensis). Jour-nal of Medical Microbiology, 50,299302.

Misnawi & T.Wahyudi (2008). Potential usesof cocoa bean infested by Cono-pomorpha cramerella for polyphenolextraction. ASEAN Food Journal, 15,2734.

Morris; T.R. Carron; M.P Robbin; & K.J. Webb(1993). Distributions of condensedtannins in flowering plants of Lotuscorniculatus var japonicas andtannin accumulations by transformedroot cultures. Journal of Experimen-tal Botany, 43, 221231.

Narayanan, K. (2004). Insect defense: itsimpact on microbial control of insectpest. Current Science, 86, 6-12.

Neves, V.A.; E.J. Lourenco & M.A.M. Silva(1997). Effect of tannins on albuminhydrolysis by tripsin. Cincia e Tecno-logia de Alimentos, 17, 208212.

Obame, L.C.; J. Koudou; B.S. Kumulungui;I.H.N. Bassol; P. Edou; A.S. Ouattara& A.S. Traor (2007). Antioxidant andantimicrobial activities of Canariumschweinfurthii Engl. Essential oil fromCentrafrican Republic. African JournalBiotechnology, 6, 23192323.

Pambayun, R.; G. Murdijadi; S. Slamet &R.K. Kapti (2007). Kandungan fenol dansifat antibakteri dari berbagai ekstrakproduk gambir (Uncaria gambir Roxb.).Majalah Farmasi Indonesia , 18,141146.

Payan, F. (2004). Structural basis for theinhibition of mammalian and insect-amylase by plant protein inhibitors.Biochimica et Biophysica Acta, 1696,171180.


43


Ramasoota, J. (2001). Chemical and botanicalpesticide in Vorthern Thailand.Journal of Health Science, 10, 17.

Shahidi, F. & N. Marian (2004). Phenolics inFood and Neutraceuticals . CRCPress. Washington D.C.

Siswoyo, T.A. (2011). Biji melinjo tingkatkandaya tahan. Harian Kompas, 27 Januari2011.

Suharti, F.M. (2005). Proteksi Protein DaunLamtoro (Leucaena leucocephala)Menggunakan Tanin, Saponin,Minyak dan Pengaruhnya TerhadapRUDP dan Sintesis Protein MikrobaRumen. Fakultas Peternakan, Univer-sitas Jendral Soedirman. Purwokerto.

Sulastri, T. (2009). Analisis kadar tanin ekstrakair dan ekstrak ethanol pada biji pinangsirih. Jurnal Chemical, 10, 5963.

Taiz, L. & E. Zieger (2002). Plant Physiology.Sinauer Associates. 3 th edition.Sunderland.

Turkmen, N.; Y.S. Velioglu; F. Sari & G. Polat(2007). Effect of extraction condition onmeasured total polyphenol content andantioxidant and antibacterial activitiesof black tea. Molecules, 12, 484496.

Vinayaka, S.; S.P. Swarnalatha; H.R. Preethi;K.S. Surabhi; R. Prashith & S.J. Sudhar-shan (2009). Studies on in vitro anti-oxidant, antibacterial, and insecticidalactivity of methanolic extract of Abruspulchellus wall (Fabaceae). AfricanJournal of Basic & Applied Sciences,1, 110116.

Wahyudi, T.; T.R. Panggabean & Pujiyanto(2008). Panduan Lengkap KakaoManajemen Agribisnis dari Huluhingga Hilir. Penebar Swadaya.Jakarta.

Wang, J; H. Liu; J. Zhao; H. Gao; L. Zhou;Z. Liu; Y. Chen & P. Sui (2009). Anti-microbial and antioxidant activities ofthe root bark essential oil of Periplocasepium and its main component 2-Hy-droxy-4-Methoxy-benzaldehyde.Molecules, 15, 58075817.

Wiryadiputra, S. (2003). Keefektifan limbahtembakau sebagai insektisida nabatiuntuk mengendalikan hama Helo-pheltis sp. pada kakao. Jurnal Per-lindungan Tanaman Indonesia, 9,3545.

Wiryadiputra, S. (2009). Diagnosis HamaUtama Tanaman Kakao. Bahan AjarProgram Pascasarjana UniversitasJember. Jember.

Xiao, Z.; R. Storms & A. Tsang (2009). A Quan-titative Starch-iodine Method forMeasuring -amylase and Gluco-amylase Activities. BiotechnologyResearch Institute. Canada.

*********.

identifikasi tanaman potensial penghasil tanin-protein kompleks untuk penghambatan aktivitas amylase...

Documents