identifikasi gnrh di dalam otak dan kelenjar pituitary

5/16/2018 Identifikasi GnRH Di Dalam Otak Dan Kelenjar Pituitary - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/identifikasi-gnrh-di-dalam-otak-dan-kelenjar-pituitary 1/21

IDENTIFIKASI LOKASI GONADOTROPIN REALISINGHORMON (GnRH) DI DALAM OTAK DAN KELENJAR

PITUITARY PADA IKAN NILA PERCH (Lates niloticus ) (TELEOSTEI, CENTROPOMIDAE

Mustafa A. Mousa & Shaaban A. Mousa

OLEH :

FARIDA

MAYOR ILMU AKUAKULTUR

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2011



GnRH Neuroendocrine deka-pe ptida

Fungsi

Neurohormone

Neurotransmitter/ Neuromodulatory

Bentuk

Reproduksi

mGnRH

cGnRH-II

cfGnRH

sGnRH



TUJUAN

PENELITIAN

Mengkarakterisasi dan

mengetahui distribusi

dari bentuk-bentuk GnRH

dalam otak dan kelenjar pituitary

Apakah terdapat asosiasi antara

GnRH dengan tipe-tipe sel

endokrin lainnya pada pituitary

pada ikan nila perch menggunakan

Immunohistochemical



BAHAN DANMETODE

IKAN

PENYIAPANJARINGAN

PROSEDUR IMMUNOHISTOCHEMICAL



IKAN

Dua puluh ekor ikan nila perch (L. niloticus )

terdiri dari jantan dan betina yang sebagian

sudah matang kelamin dan sebagian belum,dengan panjang standar lebih dari 20 cm.

Sampel dikoleksi secara hidup dari Danau

Nasser selama musim praspawning danspawning (memijah) yaitu sekitar Bulan Juli

September.



Penyiapan Jaringan

Ikan Dibius dengan cara direndam padalarutanTricaine methanosulfonate (MS222) (100 ml/L)

Kelenjar pituitary

yang menempeldi otak segera

diambil

Otak & kelenjarpituitary

Didehidrasikanmenggunakan

larutan ethanolbertingkat,dibersihkan &

diletakkanpada paraplast(M.P. : 56-58 C)

Sayatan tipis padabagian tengah otak &

kelenjar pituitarydengan ketebalan 4 m

Di perfuse melalui aorta

menggunakan 20 mlpada salinitas normal

50 ml larutanBoin’s padasuhu 4 C



PROSEDUR IMMUNOHISTOCHEMICAL

1. ANTIBODI Antiserum kelinci penghambat ACTH diperoleh dari National Institute of Health . Antiserum -MSH didapatkan dari Dr. R.M. Dores, University of Denver, USA. Antiserum untuk hormon chum salmon (Oncorhynchus keta ): subunit GTH IIchum salmon (Lot No. 8506), GH chum salmon (Lot No.8208), PRL chum salmon (Lot No. 8502) dan SL chum salmon (Lot No.

8906) diperoleh dari Dr. H. Kawauchi (School of Fisheries Science, Kitasato University, Iwate, Japan ). Antiserum GnRH : mGnRH (83LRF) dari G.Tramu, Avenue des Facultes, Talence, France ), GnRH salmon (Lot No.1668) dari J.A. King, University of Cap Town, South Africa , cGnRH-II dariRudiger W. Schulz, University of Utrecht, Faculty of Biology, the Netherlands , cGnRH-II (aC116) dari Koichi Okuzawa, National research

Institute of Aquaculture, Mie, Japan , I GnRH Lamprey (Lot 21-134) dan IIIGnRH Lamprey (Lot 3952) dari Stacia Sower, University of New Hampshire, USA .



lanjutan

2. Immunohistochemistry

Immunohistochemistry KIT pewarna ABC (avidin-biotin

peroxidase complex )

Sayatan

diinkubasi bersama dengan biotynilated secondary antibody (Vektor Laboratories) selama 1 jam dan dengan avidin-biotin yang dikonjugasikan dengan peroxidase selama 45 menit

diinkubasi bersama dengan antiserum yang terdiri dari berbagai macamGnRH selama 1 malam pada suhu 4 C (1:1000 untuk masing-masing1GnRH-I, 1GnRH-III, sGnRH (1668), cGnRH-II dan mGnRH (83LRF)

dicuci dan diwarnai dengan 3 ’,3 ’ -diaminobenzidin tetrahydrochloride (DAB) (Sigma) yang mengandung 0,01% H2O2 dalam 0,05 M Triss-buffered saline (pH 7,6) selama 3-5 menit

dicuci dalam phosphate-buffered saline (PBS; pH 7,4) sebanyak 2kali masing-masing selama 10

menit

dilekatkan pada Xilene, rehedritasimenggunakanethanol bertingkat

Setelah terjadi reaksi sayatan dicuci menggunakan air ledeng,

didehidrasi menggunakan alkohol, dibersihkan dalam xylene danletakkan pada DPX



3. Pewarnaan Immunohistochemical ganda

Sayatan

diinkubasi dengan antibody utama kedua yang menghambat hormon pituitary yaitu PRL, ACTH, GTHII, SL atau -MSH secara berurutan selama semalampada suhu 4 C, cuci menggunakan PBS, munculkan dengan biotinylated secondary antibody (Vector Laboratories) selama 1 jam dan dengan avidi-biodin yang dikonjugasikan dengan peroksida selam 45 menit

dicuci dan diwarnai dengan 3 ’, 3 ’ – diaminobenzidintetrahydrochloride (DAB) yangmengandung 0,01 % H2O2 dalam 0,05 M Triss-buffered saline (pH 7,6) selama 3-5

menit. Selama pewarnaan menggunakan DAB, larutan nickel digunakan untuk mendeferensiasi proses immunostaining ganda. Chromogen DAB/Ni digunakan untuk antiserum utama pertama yang dimunculkan dengan warna abu-abu/hitam sedangkanantiserum kedua ditandai dengan warna coklat

dicuci dengan menggunakan PBSsecara bergantian

Yang sudahdiwarnai denganantibody anti-GnRH

Setelah terjadi reaksi, sayatan dicuci dengan air ledeng, didehidrasi

dalam alkohol, dibersihkan dalam xylene dan letakkan pada DPX

lanjutan



Lanjutan

Untuk menunjukkan spesifikasi pewarnaan,

dilakukan kontrol yaitu (1) preabsorpsi larutanantibody dengan 50 M peptida-peptida GnRHsintetik (Peninsula Laboratories, CA, USA) selama24 jam pada suhu 4 C. (2) Menghilangkan

antiserum utama lainnya, antibody kedua atauavidin-biotin complex . Uji kontrol ini tidak akanmenunjukkan reaksi pewarnaan positif terhadapsembarang antibody yang diuji.



HASIL & PEMBAHASAN

Gambar 1. Ilustrasi skematik mengenai distribusi bodi sel GnRH (titik) dan serat (garis) pada sayatansagittal yang menunjukkan (A) antiserum mGnRH; (B) antiserum cGnRH. Dua antibodi menunjukkanpola distribusi yang berbeda. C:cerebellum; MO:modulla oblongata; MT:midbrain tegmentum;NLTP:nucleus lateralis tuberis pars posterior; OB:olfactory bulb; ON:optic nerve; O tec:optic tectum;OVLT:organum vasculosum laminae terminalis; pit:pituitary gland; Tel:telencephalon.



Gambar 2. Sayatan sagittal melaluiNLTP, nucleus lateralis tuberis parsposterior dan kelenjar pituitarymenunjukkan GnRH immunoreactivity.(A) Pengelompokan bodi sel mGnRH-irdalam NLTP dan serat-serat mGnRH-irmemasuki kelenjar pituitary. (B –E) Porsipembesaran (A). (B) Dua type neuronmGnRH; neuron besar (arrowheads )dan neuron kecil (arrows ), disebelahserat-serat mGnRH-ir yang masuk keRPD. (C) Neuron mGnRH-ir besar

menunjukkan bentuk yang berbeda-beda dan dilengkapi dengan axon tipisdan tebal. (D) Neuron mGnRH-ir kecilmempunyai immunoreaktifitas kuat dandilengkapi dengan axon yang tipis. (E) Axon dari sel mGnRH-ir kecilmembentuk kelompok/ikatan

(arrowhead). (F) Sayatan sagittal padabagian tengah hypothalamusmemperlihatkan kerapatan serat-seratmGnRH-ir. Bar ¼ 100lm (A); 80lm (B);and 40lm (C) –(F).



Gambar 3. Sayatan sagittalpada NLTP, nucleus lateralis tuberispars posterior dan kelenjar pituitary(A, B), kelenjar pituitary (C –E),

OVLT (F) menunjukkanimmunoreaktifitas mGnRH. (A)Ikatan serat-serat mGnRH-irmemasuki neurohypophysis dariventral hypothalamus (arrowhead)dan mencapai tiga area kelenjar

pituitary : RPD, PPD, and PI. (B –E)Porsi perbesaran dari (A). (B) Axondari neuron mGnRH-ir memadatdan menembus tangkai kelenjarpituitary (arrowhead). (C) Serat-serat yang memadat di dialam PPD.(D) Sedikit serat yang terlihat

(arrowheads) ditandai di dalamRPD (E). In-nervasi yang cukupektensif pada PI oleh serat-seratmGnRH-ir. (F) Neuron bipolar yangdilengkapi dengan axon tipis danaxon kasar di dalam OVLT. Bar ¼

100lm (A); 80lm (B); and 40lm(C) –(F).



Gambar 4. Sayatan sagittalpada ON, optic nerve (A –D), OB(E), dan NLTP, nucleus lateralistuberis pars posterior and

pituitary (F) Memperlihatkanimmunoreaktifitas cGnRH-II. (A,B) Terdapat banyak sel cGnRH-II-ir terdistribusi di dalam ON.(C –D) Porsi perbesaran dari (A).(C) Sel-sel cGnRH-II-ir secara

intens terwarnai di dalam ON.(D) Kelompok sel cGnRH-II-iryang beraggregat membentuk suatu lapisan yangbersambung. (E) Serat-seratcGnRH-II-ir terdistribusi didalam OB. (F) Serat-seratcGnRH-II-ir menembus NLTPdan masuk ke kelenjar pituitary.Bar ¼ 100lm (A, B); 80lm (E);and 40lm (C, D, F).



Gambar 5. Sayatan sagittalpada kelenjar pituitary yangdiwarnai dengan

immunostaining ganda dengananti serum GTHIIβ dan mGnRH.(A, B) Immunostaining gandamenunjukkan bahwa serat-seratmGnRH-ir mencapai tiga areaadenohypophysis; RPD, PPD,

and PI. (C, D) Porsi perbesarandari (A, B) menunjukkan sel-selGTH-ir yang bergabung denganserat-serat mGnRH-ir (arrows)di dalam PI (C) dan di dalamPPD (D). (E –H) Detail dari

hubungan kedekatan antaraserat-serat mGnRH-ir (arrows)dengan sel-sel GTH-ir cells. Bar¼ 100lm (A, B); 80lm (C, D);and 40lm (E –G).



Gambar 6. Bagian darisayatan kelenjar pituitary yangdiwarnai dengan immunostainingganda dengan antiserum mGnRH

dan GH (A –E) atau PRL (F –H). (A)Sel-sel GH-ir bergabung denganserat-serat mGnRH-ir di dalam PPD.(B) Porsi perbesaran dari (A) yangmenunjukkan serat-serat mGnRH-irmelingkupi sekelompok sel-sel GH-ir cells. (C –E) Detail dari kedekatanhubungan antara serat-seratmGnRH-ir (arrows) dengan sel-selGH-ir. (F) Immunostaining gandamenunjukkan serat-serat mGnRH-ir(arrows) di dalam area sel-sel PRL-ir di dalam RPD. (G, H) Detail dari

kedekatan hubungan antara serat-serat mGnRH-ir (arrows) dengansel-sel PRL-ir. Bar ¼ 80lm (A, F);40lm (B, C, D, E, G, H).



Gambar 7. Bagian darisayatan sagittal kelenjar pituitaryyang diwarnai denganimmunostaining ganda denganantiserum mGnRH dan ACTH (A –C),

a-MSH (D –F), atau SL (G –I). (A)Immunostaining gandamenunjukkan serat-serat mGnRH-ir(arrows) dari ventral hypothalamusyang mencapai sel-sel ACTH-ir. (B –C) Detail dari serat-serat mGnRH-ir(arrows) yang berhubungan dekatdengan sel-sel ACTH-ir. (D) Sel-selMSH-ir bergabung dengan serat-serat mGnRH-ir (arrows). (E, F)Detail dari kedekatan/kesamaanantara serat-serat mGnRH-ir(arrows) dengan sel-sel MSH-ir. (G)

Immunostaining gandamenunjukkan sel-sel SL-irbergabung dengan serat-seratmGnRH-ir. (H, I) Detail darikedekatan hubungan antara serat-serat mGnRH-ir (arrows) dengansel-sel SL-ir. Bar ¼ 80lm (A, D, G);40lm (B, C, E, F, H, I).



Immunohistochemical mengandung 2 bentuk GnRH

(mGnRH, cGnRH) m en g

g un ak an

Antibodi yangmenghambat beberapabentuk GnRH saja

mGnRH di dalam otak lebih dominandibandingkan dengan cGnRH-II,

terutama di dalam anterior brain danpituitary . mGnRH dan cGnRH yangberada pada neuron-neuron yangberbeda dan terletak pada lokasi otak yang berbeda pada ikan nila perch mengindikasikan bahwa mGnRH dan

cGnRH tidak dalam kondisi kolokalisasi.

Pada ikan nila perch , mGnRH dancGnRH-II terlihat sebagai bentuk tersintesis dengan neuron yang berbedayang akan dikirimkan untuk pengaturanyang berbeda dan selanjutnya akanmemainkan pada aspek-aspek fisiologi

yang berbeda.

menunjukkan bahwa immunorekatifitas

cGnRH lebih lemah dibandingkan denganimmunoreaktifitas mGnRH. Sel-selchicken GnRH-ir terdeteksi pada optic tract .



• Yang menarik, pada studi ini juga ditemukan in-nervasi mGnRH yang cukupkuat dalam neurohypophysis pada semua level area adenohypophysis dalam kelenjar pituitary ikan nila perch . In-nervasi langsung serat-seratneuron GnRH dari hypothalamus pada kelenjar pituitary merupakan

karakteristik atau ciri khas pada kelas Osteichtyes (Muske, 1993).• Pada ikan nila perch , proyeksi mGnRH mencapai GTH-expressing cells didalam PPD dan pada batas luar PI. Proyeksi mGnRH juga mencapai sel-selGH-ir yang berada dekat dengan neurohypophysis dalam PPD.

• Asosiasi secara morfologi antara serat-serat mGnRH dengan GTH dan GH- expressing cells menunjukkan kemungkinan adanya peranan mGnRH

terhadap sekresi GTH dan GH pada ikan nila perch .• Hasil penelitian ini menunjukkan adanya asosiasi yang cukup dekat antara

serat-serat mGnRH-ir dengan sel-sel SL-ir. Pada pengaturan sekresi SL,secara farmakologi dan morfologi menunjukkan fakta bahwa GnRH terlibatdalam pelepasan SL.

• α-MSH berhubungan dengan adaptasi terhadap perbedaan warna latarbelakang (Zhu dan Thomas, 1996) dan respon terhadap stress (Wandelaarbonga, 1997). Hasil studi ini berhasil mengidentifikasi asosiasi yang cukupdekat antara serat-serat mGnRH-ir dengan α-MSH-expressing cells padaikan nila perch .

• Secara keseluruhan, data-data di atas menunjukkan bahwa GnRH

kemungkinan besar terlibat dalam proses sekresi α-MSH ikan-ikan teleostei.



KESIMPULAN

• studi ini menunjukkan bahwa cGnRH-II dan mGnRHyang terdapat pada sebagian besar ikan teleostei adalahkomponen utama pada system GnRH-ir di dalam otak ikan nila perch.

•Hasil studi ini mengindikasikan bahwa mGnRH dancGnRH-II terletak pada neuron-neuron yang berbedadan serat-serat mGnRH-ir mempunyai asosiasi yangcukup dekat dengan berbagai sel-sel pituitary .

• Studi ini menunjukkan fakta-fakta secaraimmunocytochemical bahwa GnRH bisa jadi mempunyaiberbagai macam fungsi dalam pengaturan sekresihormon-hormon pituitary termasuk didalamnya GTHspada ikan nila perch.



TERIMA KASIH

identifikasi gnrh di dalam otak dan kelenjar pituitary

Documents