identifikasi gen sitokrom p450 2a6 (cyp2a6) alel *9 … fileiii pengesahan skripsi berjudul uji...

IDENTIFIKASI GEN SITOKROM P450 2A6 (CYP2A6) ALEL *9 PADA

SUBYEK UJI PEROKOK RAS KULIT HITAM PAPUA INDONESIA

SKRIPSI

Dijalankan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Farmasi

Diajukan Oleh:

Dismas Adi Prabowo

NIM: 148114166

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2017

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

IDENTIFIKASI GEN SITOKROM P450 2A6 (CYP2A6) ALEL *9 PADA

SUBYEK UJI PEROKOK RAS KULIT HITAM PAPUA INDONESIA

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Farmasi

Diajukan Oleh:

Dismas Adi Prabowo

NIM: 148114166

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2017


ii

Persetujuan Pembimbing


iii

Pengesahan Skripsi Berjudul

UJI HEPATOPROTEKTIF JANGKA PANJANG EKSTRAK METANOL

80% DAGING Hylocereus polyrhizus TERHADAP KADAR ALT DAN AST

PADA TIKUS JANTAN GALUR WISTAR TERINDUKSI

KARBON TETRAKLORIDA

Oleh:

Monica Praditya Puji Astari

NIM : 148114047

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

pada tanggal: 05 Januari 2018

Mengetahui

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Dekan

(Aris Widayati, M.Si., Apt., Ph.D.)

Panitia Penguji: Tanda tangan

1.

drh. Sitarina Widyarini, M.P., Ph.D

……………...

2.

Phebe Hendra, M.Si., Ph.D., Apt.

……………...

3.

Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt.

……………...


iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini

tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan

dalam kutipan dan daftar pustaka, dengan mengikuti ketentuan sebagaimana

layaknya karya ilmiah.

Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah

ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-

undangan yang berlaku.

Yogyakarta, 23 November 2017

Penulis

Monica Pradiya Puji Astari


v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswi Universitas Sanata Dharma:

Nama : Monica Praditya Puji Astari

Nomor Mahasiswa : 148114047

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:

Uji Hepatoprotektif Jangka Panjang Ekstrak Metanol 80% Daging

Hylocereus polyrhizus Terhadap Kadar ALT dan AST

pada Tikus Jantan Galur Wistar Terinduksi Karbon Tetraklorida

beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan

kepada Perpustakan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,

mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam benruk pangkalan

data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau

media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya

maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencatumkan nama saya

sebagai penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal : 23 November 2017

Yang menyatakan

(Monica Praditya Puji Astari)


vi

PRAKATA

Puji dan syukur penulis haturkan ke hadirat Tuhan yang Maha Esa atas

berkat, rahmat, dan penyertaan-Nya hingga penelitian dan penyusunan skripsi

dengan judul “Identifikasi Gen Sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) Alel *9 pada

Subyek Uji Perokok Ras Kulit Hitam Papua Indonesia” dapat penulis selesaikan.

Skripsi ini merupakan bagian dari penelitian Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt.,

dengan judul “ Pengaruh Polimorfisme Enzim Sitokrom P450 alel *1 *4 dan *9

terhadap Kadar Gula Darah pada Subyek Uji Suku Thionghoa dan Papua

Indonesia “ berdasarkan SK: No.014b/LPPM USD/III/2017.

Skripsi ini penulis susun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh

gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) program studi Farmasi Universitas Sanata

Dharma. Selama proses penyusunan skripsi ini penulis sadar bahwa pembuatan

skripsi ini tidak lepas dari dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena

itu, pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan terima kasih kepada:

1. Ibu Aris Widayanti, M.Sc., Ph.D., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

2. Ibu Dr. Sri Hartati Yuliani, Apt., selaku Ketua Program Studi Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

3. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, Apt., selaku Kepala Laboratorium Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan izin untuk

penggunaan segala fasilitas laboratorium selama penelitian.

4. Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt., selaku Dosen Pembimbing atas

kesabaran, arahan, bimbingan, semangat, serta dukungannya selama proses

penelitian hingga penyusunan skripsi ini.

5. Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc., selaku Dosen Penguji yang telah

memberi kritik dan saran yang sangat membangun dalam penelitian ini.

6. Maywan Hariono Ph.D., Apt., selaku Dosen Penguji yang telah memberi

kritik dan saran yang sangat membangun dalam penelitian ini.

7. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, Apt., selaku Dosen Pembimbing Akademik atas

bimbingannya selama ini.


vii

8. Pak Bima, Pak Kayat, Pak Bimo, Pak Heru, Pak Parlan, selaku laboran yang

telah membantu selama penelitian.

9. Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta.

10. Keluarga tercinta Bapak Ignatius Riyanto dan Ibu Barbara Sriwahyuningsih

serta Kakak Yulius Wahyu Prabowo yang selalu memberikan semangat, doa,

dan dukungan pada penulis.

11. Rekan seperjuangan penelitian ini yakni Rabulas Tri Nugroho, Evan Julian,

Jasvidianto Chriza. Terima kasih atas semangat dan kerjasamanya selama ini.

12. Rekan satu bimbingan yakni Maria Clara, Yulius Denis, Maria Redita,

Chintya Halim, Petrus Febrian Widiantoro, dan Yohana Alpionita. Terima

kasih atas bantuan dan kerjasamanya selama ini.

13. Agustina Deka Chrissanti, atas dukungan, doa, dan semangat selama kuliah

dan penelitian ini terutama sudah menemani suka dan duka selama menyusun

naskah skripsi.

14. Teman-teman FSM D 2014 dan Keluarga Besar farmasi 2014, terima kasih

atas kebahagiaan dan kebersamaan selama ini.

15. David Ginola dan burjo PH yang memberikan tempat nongkrong yang

nyaman tiada duanya.

16. Serta semua pihak yang telah banyak membantu penulis yang tidak dapat

penulis tulis satu persatu.

Penulis menyadari dalam penulisan skripsi ini masih terdapat kelemahan

dan kekurangan. Oleh karena itu penulis mengharapkan adanya kritik dan saran

yang membangun dari semua pihak. Akhir kata, penulis berharap semoga skripsi

ini dapat bermanfaat bagi semua pihak terutama dalam bidang ilmu Farmasi.

Yogyakarta, 9 Desember 2017

Penulis


viii

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ........................................................................................ i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................. ii

HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ...................................................................... iv

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................................ v

PRAKATA ....................................................................................................... vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .......................................................... viii

DAFTAR ISI .................................................................................................... ix

DAFTAR TABEL ............................................................................................ x

DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xi

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xii

ABSTRACT ..................................................................................................... xiii

ABSTRAK ....................................................................................................... xiv

PENDAHULUAN ........................................................................................... 1

METODE PENELITIAN ................................................................................. 3

HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................ 7

KESIMPULAN ................................................................................................ 14

SARAN ............................................................................................................ 14

DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 15

LAMPIRAN ..................................................................................................... 17

BIOGRAFI PENULIS ..................................................................................... 29


ix

DAFTAR TABEL

Tabel I. Karakteristik subjek uji yang terlibat dalam penelitian .................... 8


x

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik

elektroforesis .................................................................................... 10

Gambar 2. Situs penempelan primer pada urutan basa nukleotida CYP2A6*9.. 11

Gambar 3. Urutan nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*9

(mutasi Single nucleotide polymorphism (SNP) ditunjukkan oleh

warna hijau dan kuning, primer ditunjukkan oleh warna merah)..... 12

Gambar 4. Elektrogram produk PCR pada kondisi optimum dari berbagai isolat

DNA... .............................................................................................. 13


xi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat keterangan kelaiakan etik (ethical clearence) .................... 18

Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis ...................... 19

Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix ....................... 20

Lampiran 4. Product Datasheet of DNA Ladder& Markers ............................ 21

Lampiran 5. Product Datasheet of primer forward and reverse CYP2A6*9... 21

Lampiran 6. Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA menggunakan Elektroforesis

..................................................................................................... 22

Lampiran 7. Hasil PCR .................................................................................... 23

Lampiran 8. Usage Information of FavorPrepTM ............................................ 25

Lampiran 9. Data Subjek Uji hasil kuisioner ................................................... 26

Lampiran 10. Hasil Kuisioner ............................................................................ 27

Lampiran 11. Perhitungan jumlah sampel ......................................................... 30

Lampiran 12. Biografi Penulis ........................................................................... 31


xii

ABSTRAK

Adanya polimorfisme gen sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) akan

mempengaruhi aktivitas enzim terhadap metabolisme nikotin di dalam tubuh, baik

menurunkan, menghilangkan atau meningkatkan aktivitas enzim yang akan

mempengaruhi seseorang dalam melakukan aktivitas merokok. Salah satu

polimorfisme dari gen CYP2A6 tersebut adalah alel CYP2A6*9. Alel CYP2A6*9

mengalami polimorfisme satu nukleotida dalam kotak TATA di daerah promoter.

Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi ada tidaknya alel CYP2A6*9 pada

perokok pria ras kulit hitam Papua Indonesia.

Penelitian ini dilakukan secara deskriptif observasional. Sebanyak 30

subyek uji dengan kriteria inklusi dan eksklusi diminta mengisi kuisioner tentang

aktivitas merokok lalu diambil sampel darahnya. Pada sampel darah tersebut

dilakukan isolasi DNA dan isolatnya dianalisis secara kualitatif menggunakan

elektroforesis. Replikasi alel CYP2A6*9 dilakukan dengan amplifikasi

menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR).

Hasil penelitian menunjukkan tidak adanya alel CYP2A6*9 pada

perokok pria ras kulit hitam di Papua, Indonesia sehingga dapat dikatakan untuk

sementara bahwa jumlah batang rokok yang dikonsumsi perokok pria ras kulit

hitam Papua Indonesia tidak dipengaruhi oleh alel CYP2A6*9.

Kata kunci: CYP2A6*9, ras kulit hitam Papua, Polymerase Chain Reaction

(PCR)


xiii

ABSTRACT

The presence of cytochrome P450 2A6 gene (CYP2A6) polymorphism will

affect the activity of the enzyme towards nicotine metabolism in the body, either

decrease, eliminate or increase the activity of enzymes that will affect a person in

smoking. One of the polymorphisms of the CYP2A6 gene is the CYP2A6*9 allele.

The CYP2A6*9 allele undergoes one nucleotide polymorphism in the TATA box

located in the promoter region. This study aims to identify the presence of

CYP2A6*9 alleles in black male smokers in Papua, Indonesia.

This study was designed descriptively observational. A total of 30 subjects

with inclusion and exclusion criteria was instructed to fill out questionnaires

about smoking activity and then blood were collected for further. From those

samples, the DNA isolation was carried out and then followed by the qualitative

analyze using electrophoresis. The replication of the CYP2A6*9 allele was

amplified using the Polymerase Chain Reaction (PCR) method.

The results showed that there is no CYP2A6*9 allele in black male

smoker in Papua, Indonesia. In conclusion up to now, there is no influence of

CYP2A6*9 existence toward the number of cigarette being consumed by black

male of Papua Indonesia.

Keywords: CYP2A6*9, black race Papua, Polymerase Chain Reaction (PCR)


1

PENDAHULUAN

Merokok merupakan penyebab morbiditas dan mortalitas prematur paling

penting pada populasi dunia yang seharusnya bisa dicegah. Dalam asap rokok,

jumlah nikotin meningkat sampai 10%, diperkirakan hal ini terjadi oleh karena

proses pencampuran rasemik (racemization) selama pembakaran (Hukkanen et

al., 2005). Rata-rata dalam sebatang rokok mengandung 10-14 mg nikotin dan

sekitar 1 mg nikotin diabsorbsi ke dalam peredaran darah sistemik selama

merokok (Hukkanen et al., 2005). Nikotin terdistribusi secara luas dalam jaringan

tubuh dengan volume distribusi rata-rata 2,6 liter/kg berat badan (Hukkanen et al.,

2005).

Enzim sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) adalah enzim yang bertanggung

jawab terhadap 70-90% metabolisme nikotin dalam darah menjadi kotinin

(Gullstén 2000; Rao et al., 2000; Hukkanen et al., 2005). Enzim sitokrom P450

2A6 ini merupakan enzim utama yang berperan dalam proses metabolisme

xenobiotika fase 1. Di antara banyak gen kandidat yang berperan atau diduga

berperan dalam ketergantungan fisik terhadap nikotin terdapat gen CYP2A6, yaitu

gen yang mengkode enzim CYP2A6 (Gullstén 2000; Rao et al., 2000; Hukkanen

et al., 2005).

Proses metabolisme nikotin dilakukan oleh CYP2A6 melalui proses C-

oksidasi menjadi kotinin (COT), yang selanjutnya dimetabolisme lagi oleh

CYP2A6 menjadi trans-3'-hidroksikotinin (3HC) (Benowitz et al., 2006). Nikotin

diubah menjadi kotinin rata-rata sekitar 70% sampai 80%, dimana kotinin

merupakan metabolit proksimat utama (Jarvis et al., 1984). Penelitian Haiman et

al., (2006) menyimpulkan bahwa metabolisme kotinin lebih lambat pada orang

kulit hitam dibandingkan dengan orang kulit putih karena lambatnya proses

metabolisme oksidatif dari nikotin menjadi kotinin. Orang kulit hitam memiliki

risiko lebih tinggi untuk kanker paru-paru dibandingkan dengan kulit putih

(Haiman et al., 2006). Adanya polimorfisme gen sitokrom P450 2A6 (CYP2A6)

akan mempengaruhi aktivitas enzim terhadap metabolisme nikotin di dalam


2

tubuh, baik menurunkan, menghilangkan atau meningkatkan aktivitas enzim

(Raunio dan Rahnasto-Rilla, 2012).

Polimorfisme pada gen CYP2A6 terdapat sekitar 37 alel varian (Hukkanen

et al., 2005). Adanya polimorfisme gen CYP2A6 akan mempengaruhi aktivitas

enzim terhadap metabolisme nikotin di dalam tubuh, baik menurunkan,

menghilangkan atau meningkatkan aktivitas enzim (Raunio dan Rahnasto-Rilla,

2012). Salah satu polimorfisme dari gen CYP2A6 tersebut adalah alel

CYP2A6*9. Alel CYP2A6*9 mengalami polimorfisme satu nukleotida dalam

kotak TATA di daerah promoter sehingga menurunkan proses transkripsi dan

aktivitas metabolik in vivo dari CYP2A6, yang terdeteksi 16-22% dari populasi

orang Asia (Minematsu et al., 2006). Polimorfisme gen CYP2A6 dengan alel non

aktif yang tinggi banyak ditemukan pada orang-orang Asia (Peamkrasatam et al.,

2006; Yusof dan Gan, 2009). Sebagaimana diuji oleh Pitarque et al.,(2005)

menjelaskan bahwa mutasi yang terjadi pada alel CYP2A6*9 menurunkan proses

transkripsi hingga 50% sehingga membuat CYP2A6*9 menjadi salah satu alel

CYP2A6 yang bertanggung jawab terjadinya status metabolisme yang rendah

(Pitarque et al., 2005).

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknik yang dapat

mendeteksi adanya polimorfisme pada CYP2A6. PCR adalah suatu teknik yang

melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi

duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Untai ganda DNA templat (unamplified

DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga

mencapai suatu suhu tertentu untuk memberi waktu pada primer menempel

(anneal primers) pada daerah tertentu dari target DNA. Polimerase DNA

digunakan untuk memperpanjang primer (extend primers) dengan adanya

deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) dan buffer yang sesuai (Newton and

Graham, 1994). PCR mampu mengamplifikasi suatu fragmen gen pada templat

DNA berdasarkan primer tertentu sehingga dapat diidentifikasi suatu alel dalam

sampel DNA (Rahman et al., 2013). Penelitian identifikasi gen sitokrom P450

2A6 alel *9 ini perlu dilakukan pada perokok pria ras kulit hitam Papua di

Indonesia karena pada perokok yang memiliki kulit gelap memiliki kemampuan


3

metabolisme nikotin yang lebih rendah sehingga ketergantungan terhadap rokok

juga lebih rendah.

METODOLOGI PENELITIAN

Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif observasional. Pada

penelitian ini dilakukan penggambaran hasil polimorfisme gen CYP2A6 pada

satu populasi. Pada penelitian ini terdapat variabel tercoba, variabel teramati, dan

variabel pengacau terkendali. Variabel tercoba dalam penelitian ini adalah sampel

DNA dari berbagai individu. Variabel teramati dalam penelitian ini adalah produk

PCR yang dideteksi dengan elektroforesis. Variabel pengacau terkendali dalam

penelitian ini adalah kemurnian isolat DNA total. Hal tersebut diatasi dengan

melakukan penyimpanan pada suhu -20ºC sebelum melakukan analisis dengan

PCR.

Bahan penelitian

Sampel darah perokok pria ras kulit hitam Papua, Primer forward: (5’-

GATTCCTCTCCCCTGGAAC-3’) dan primer reverse: (5’-

GGCTGGGGTGGTTTGCCTTTA-3’), Promega Go Taq Green Master Mix

(berisi taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl2, dan buffer), FavorPrep TM

Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell), 10X Tris-Borate-EDTA (TBE)

Buffer pH 8,3 Ultra Pure Grade (Vivantis), agarose (Vivantis), GelRed TM

Nucleic Acid Gel Stain (Biotium), VC 100bp Plus DNA marker (Vivantis),, DNA

loading dye (Vivantis), etanol 96% (Sigma Chemical Co., St. Louis), aqua

bidestilata steril (Ikapharmindo).

Alat penelitian

Alat-alat gelas, DNA isolasi kit (Favorgen), Thermal cycler Perkin Elmer

2400, satu set Elektroforesis horizontal (Sigma Aldrich), UV Transilluminator

(fisher scientific), dispossable gloves, receivertubes (1,5 mL), hot plate (thermo

scientific), mikropipet, waterbath, blue tip, yellow tip, white tip, sentrifuge (fisher

scientific), kamera DSLR, spuit injeksi 3 mL (Terumo), timbangan analitik

dengan ketelitian 0,0001 g (Metler Toledo), vacutainer K2 yang mengandung

EDTA 5,4 mg, PCR ® Tubes (Axygen).


4

Kriteria Subyek Uji

Pada penelitian ini menggunakan subjek uji yang yang diwawancara lalu

diminta mengisi kuisioner dengan kriteria yaitu perokok berjenis kelamin laki-laki

berjumlah 30, keturunan ras kulit hitam Papua asli minimal sampai third degree

relativies (Kakek dan nenek orang Papua asli) dan berumur 20-40 tahun yang

tinggal di Yogyakarta. Perokok aktif minimal 5 tahun yang mengkonsumsi baik

rokok kretek dan rokok putih. Mengeliminasi pasien yang sedang mengonsumsi

obat rutin atau sedang menjalani pengobatan untuk berhenti merokok dalam

sebulan terakhir, pasien dengan penyakit yang mengharuskan beristirahat total

selama ≥ 10 hari dalam sebulan terakhir, seperti heart diseases, renal failure,

pulmonary diseases, pasien dengan penyakit hepar seperti hepatitis, sirosis hati,

dan hepatoma. Subjek uji dengan sadar bersedia menandatangani inform consent.

Penelitian yang dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Biokimia

Universitas Sanata Dharma ini telah memenuhi Kode Etik yang disetujui oleh

Komisi Etik Fakultas Kedokteran Kristen Duta Wacana.

Pengambilan Sampel Darah Pada Subyek Uji

Sampel darah diambil oleh petugas profesional perawat. Sampel darah

diambil dari pembuluh vena subjek uji dan ditampung dalam dan ditampung

dalam vacutainer K2 yang mengandung EDTA 5,4 mg. Darah segar yang

diperoleh disimpan pada suhu ± 4°C, sebelum dianalisis. Darah ini kemudian

digunakan untuk identifikasi alel CYP2A6*9.

Isolasi DNA

Isolasi DNA dari sampel darah dilakukan dengan menggunakan reagen

FavorPrepTM Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell). Sampel darah yang

digunakan sebanyak 300 μL. Disiapkan sampel darah subjek uji dan dipindahkan

300 μL sampel darah tersebut ke tabung mikrosentrifuge 1,5mL. Ditambahkan

900 μL RBC lisis buffer, dilakukan pencampuran dengan digojog dan diinkubasi

pada suhu ruangan selama 10 menit. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan

3000 x g selama 5 menit. Supernatan dihilangkan dari tube, ditambahkan 100 μL

RBS lisis buffer pada pellet yang ada pada tube. Selanjutnya ditambahkan 200 μL

FABG buffer dan dihomogenkan dengan vorteks. Diinkubasi selama 10 menit


5

pada suhu ruangan dan dibolak-balikan setiap 3 menit. Elution buffer dipanaskan

dengan waterbath dengan suhu 70 ºC. Selanjutnya ditambahkan 200 μL etanol

96% ke dalam tube dan divorteks selama 10 detik. Kolom FABG dipasangkan

dengan 2 ml collection tube dan sampel dipindahkan ke dalam kolom FABG

tesebut. Sentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan maksimal (14.000 rpm atau

10.000 x g) dan dipindahkan kolom FABG pada collection tube baru. Kemudian,

kolom FABG dicuci dengan 400 μL W1 buffer dan dan disentrifuge pada

kecepatan maksimal. Cairan yang ada pada collection tube dibuang. Kolom

FABG dipindahkan pada 2 ml collection tube dan ditambahkan 600 μL wash

buffer yang sudah ditambahkan etanol. Kemudian disentrifugasi selama 30 detik

pada kecepatan maksimal dan cairan yang ada pada collection tube dibuang.

Kolom FABG diletakkan kembali pada collection tube dan disentifugasi dengan

kecepatan maksimal untuk mengeringkan kolom. Kolom FABG yang sudah

kering dipasangkan ke 1,5 ml mikrosentrifuge tube, dan ditambahkan 100 μL

elution buffer yang telah dipanaskan ke tengah membran kolom FABG. Kolom

FABG didiamkan dengan posisi tegak selama 3-5 menit sehingga elusi buffer

dapat terserap membran kolom FABG. Kemudian disentifugasi pada kecepatan

maksimal selama 30 detik untuk mengelusi DNA. DNA hasil isolasi disimpan

pada suhu -20ºC.

Analisis kemurnian isolat DNA

Elektroforesis menggunakan gel agarosa 1,0 % dilakukan dengan cara 1,0

g agarosa dilarutkan dalam larutan 1x TBE sebanyak 100 mL lalu dipanaskan

pada hot plate hingga mendidih sambil diaduk menggunakan magnetic stirrer

hingga larut, kemudian ditambahkan 1 μL larutan gel red dan diaduk hingga

homogen. Larutan dituang ke dalam cetakan gel sebanyak 25 ml yang telah diberi

sisiran pada tepi gel dan gel dibiarkan mengeras. Sisir dicabut setelah gel

mengeras sehingga terbentuk sumur-sumur dan ditempatkan ke dalam gel tray

elektroforesis yang sudah berisi larutan bufer 1x TBE. Isolat DNA sebanyak 4,0

μL ditambahkan aquabidest sebanyak 1,0 μL, kemudian dicampur dengan loading

dye sebanyak 1,0 μL, kemudian campuran tersebut diambil sejumlah 6,0 μL dan

dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel menggunakan mikropipet. Satu sumur gel


6

diisi dengan 100 bp DNA ladder sebanyak 4,0 μL sebagai marker dan dilakukan

elektroforesis dengan tegangan 125 volt selama 30 menit. Molekul DNA pada gel

tray akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif pada pH netral. Hasil

elektroforesis berupa gel agarosa dideteksi di bawah UV transilluminator dan

didokumentasikan menggunakan kamera DSLR 7D. Panjang pita DNA dapat

diketahui dengan cara menarik garis lurus masing-masing pita sampel DNA

dengan posisi pita DNA ladder.

Amplifikasi Isolat DNA Dengan Metode PCR

Untuk mendapatkan fragmen DNA dari alel CYP2A6*9 dilakukan

amplifikasi dengan menggunakan primer yang diadopsi Yoshida et al. (2003),

yaitu primer forward: 5'-GATTCCTC TCCCCTGGAAC-3', primer reverse: 5'-

GGCTGGGGTGGTTTGCCTTTA-3'. Amplifikasi DNA dengan PCR dilakukan

menggunakan Promega Go Taq Green Master Mix. Volume akhir campuran 25

μL, yang terdiri dari Promega Go Taq Green Master Mix 12,5 μL, primer forward

1,25 μL, primer reverse 1,25 μL, isolat DNA 5,0 μL, Aquabides 5 μL. Penentuan

rentang suhu annealing dan jumlah siklus amplifikasi berdasarkan pada hasil

optimasi yang dilakukan oleh Cindy (2017). Amplifikasi dilakukan dengan mesin

PCR (Thermal cycler Perkin Elmer 2400). Kondisi PCR digunakan adalah sebagai

berikut: initial denaturasi pada suhu 94ºC (3’); dilanjutkan dengan denaturasi pada

suhu 94ºC (30”); annealing pada suhu 60ºC (30”) dan ekstensi pada suhu 70ºC

(25”). Siklus amplifikasi tersebut dilakukan sebanyak 30 kali dan selanjutnya

diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72ºC (5’)

Analisis Produk PCR dengan Elektroforesis

Untuk melihat hasil produk PCR dilakukan elektroforesis dengan fase

diam agarosa 1,5% yang telah ditambahkan dengan gel red dan dilihat hasilnya

dengan menggunakan lampu UV Transilluminator. Produk PCR yang ditunjukkan

dengan adanya pita didokumentasi dengan kamera DSLR Canon 7D. Produk PCR

yang terbentuk pada penelitian ini berada pada pita 368-bp (Yoshida et al., 2003).


7

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada penelitian polimorfisme CYP2A6 dilakukan empat tahapan utama,

yaitu pemilihan subjek uji, isolasi DNA dari sampel darah, analisis kualitatif isolat

DNA, dan analisis produk PCR dengan teknik elektroforesis. Penelitian ini

menggunakan PCR sebagai metode untuk mengidentifikasi adanya polimorfisme

pada suatu genetik dalam suatu populasi. Alel CYP2A6*9 merupakan alel yang

akan diidentifikasi pada penelitian ini dengan metode PCR. Pemilihan alel

CYP2A6*9 dikarenakan tingginya frekuensi alel non aktif seperti CYP2A6*9

pada populasi di Asia serta dapat memberikan manfaat edukasi dalam

menurunkan ketergantungan mengkonsumsi rokok karena proses metabolisme

yang lambat.

Pemilihan subjek uji

Pada penelitian ini menggunakan subjek uji sebanyak 30 subjek yang

berasal dari perokok berjenis kelamin laki-laki keturuan ras kulit hitam Papua

minimal tiga generasi yang berumur 20-28 tahun dengan rata-rata umur yaitu 23

tahun. Menurut B-Rao (2001), ukuran sampel minimum dalam studi polimorfisme

genetik dengan dua alel yang terdeteksi adalah 30 sampel yang dapat dilihat di

lampiran. Dalam ukuran sampel ini, kedua alel akan terdeteksi dalam probabilitas

tinggi (B-Rao, 2001). Salah satu kelemahan dari penelitian ini adalah sulitnya

mencari subjek uji perokok pria ras kulit hitam yang berdomisili di Yogyakarta.

Hal ini menyebabkan jumlah subjek uji yang didapatkannya memiliki rentang usia

subjek uji yang tidak diinginkan yaitu 20-40 tahun. Hal ini berdampak pada

kurangnya sampel uji yang mencerminkan aktivitas merokok pada populasi

perokok pria ras kulit hitam Papua.

Keseluruhan subjek uji rata-rata menghisap 10 batang rokok per hari

dengan rentang 3-24 batang perhari dan subjek uji rata-rata melakukan aktivitas

merokok selama 8 tahun dengan rentang 5-18 tahun. Hasil karakteristik subjek uji

yang terlibat dapat dilihat di tabel I.


8

Tabel I. Karakteristik subjek uji yang terlibat dalam penelitian

Karakteristik Nilai

Jumlah subjek uji 30 perokok

Umur (Tahun) Range 20-28

Mean ± SD 23,33 ± 2,53

Jumlah batang rokok

yang dihisap perhari

Range 3-24

Mean ± SD 10,30 ± 6,22

Lama merokok

(Tahun)

Range 5-18

Mean ± SD 8,03 ± 3,2

Keterangan :

SD = Standar deviasi

Hal ini menunjukkan aktivitas merokok seseorang dipengaruhi oleh

polimorfisme pada gen CYP2A6 akan mempengaruhi aktivitas enzim CYP2A6

yang pada akhirnya turut berpengaruh terhadap kadar nikotin dalam darah. Bentuk

aktif enzim CYP2A6 adalah alel CYP2A6*1 yang berpengaruh terhadap aktivitas

enzim CYP2A6 dengan metabolisme yang normal. Apabila seseorang mengalami

polimorfisme gen menjadi alel CYP2A6*9 hal tersebut akan menurunkan proses

transkripsi hingga 50% sehingga membuat CYP2A6*9 menjadi salah satu alel

CYP2A6 yang bertanggung jawab terjadinya status metabolisme yang rendah

(Pitarque et al., 2005). Faktor ketergantungan aktivitas merokok seseorang

dipengaruhi oleh kadar nikotin dalam tubuh yang ditentukan oleh jumlah

konsumsi nikotin karena merokok dan kecepatan metabolisme oleh hati, dimana

kadar nikotin akan lebih rendah pada perokok dengan alel CYP2A6*9 oleh karena

rendahnya metabolisme nikotin dibandingkan dengan alel CYP2A6*1 (Raunio

dan Rahnasto-Rilla, 2012).

Isolasi DNA dari sampel darah

Isolasi DNA menggunakan Genomic DNA Mini Kit (FavorPrepTM).

Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain

seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA dengan

favoergen yaitu penghancuran (lisis) sel darah merah dengan cara menambahkan

RBC lysis, penghancuran sel karena DNA terdapat pada nukleus (Elrod, 2007)


9

dengan menambahkan FABG buffer. Penambahan buffer lisis berguna untuk

mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008). Lalu penambahan etanol 96-100%

dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi. Setelah itu

dilakukan proses pencucian dengan W1 buffer dan wash buffer untuk

menghilangkan residu etanol dari DNA lalu dilakukan pengeringan pellet DNA.

Tahapan terakhir yaitu penambahan TE atau elution buffer untuk melarutkan

DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak rusak (Asris, 2010) kemudian

disimpan di dalam freezer dengan suhu sekitar -20oC agar tidak rusak dan

terkontaminasi. Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang perlu

diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA

tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA (Surzycki, 2000). Hasil

kemurnian isolasi DNA dapat dilihat secara kualitatif dengan menggunakan

teknik elektroforesis.

Analisis kualitatif isolat DNA

Isolat DNA yang digunakan pada penelitian ini berasal dari proses isolasi

yang sudah dilakukan sebelumnya menggunakan sampel darah dari populasi ras

kulit hitam Papua. Analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik

elektroforesis (Yusof and Gan., 2009). Isolat DNA yang digunakan dalam

penelitian adalah pita dengan ukuran lebih dari 3000 bp dan seharusnya

menghasilkan pita yang tunggal dan tebal dimana hal ini menunjukkan bahwa

isolat DNA yang diggunakan tidak tercemar protein dan tidak terdegradasi.

Namun apabila terjadi variasi dalam terbentuknya pita ganda dan tipis hal ini

dapat menunjukkan bahwa isolat yang digunakan sudah tercemar ataupun

terdegradasi (Patramurti et al., 2014). Hasil elektroforesis isolat DNA dapat

dilihat dari terbentuknya pita yang dilihat dengan menggunakan lampu UV

transilluminator. Hasil elektroforesis menunjukkan terbentuknya variasi pita baik

pita tunggal dan tipis atau pita tunggal dan tipis dengan ukuran lebih dari 3000 bp

(Gambar 1). Hal ini menunjukkan bahwa isolat DNA yang dihasilkan murni dan

terbebas dari kontaminan.


10

M 1 2 3 4 5 6 7

Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik

elektroforesis

Keterangan :

M : 100 bp DNA ladder sebagai marker

1-5 : Isolat DNA dengan pita tunggal dan tebal

6-7 : Isolat DNA dengan pita tunggal dan tipis

Kondisi elektroforesis : Fase diam agarose 1%; fase gerak larutan TBE 0,5%;

kecepatan 100 V/cm; volume injeksi 6µL

Analisis produk PCR dengan teknik elektroforesis

Identifikasi alel CYP2A6*9 pada penelitian ini menggunakan teknik PCR

(Yoshida et al., 2003). Kondisi tiap-tiap tahap PCR yaitu initial 94oC selama 3

menit, denaturasi 94oC selama 30 detik, annealing 60oC selama 30 detik, ekstensi

70oC selama 25 detik, final ekstensi 72oC selama 5 menit, dan jumlah siklus

sebanyak 30 siklus yang telah dioptimasi Cindy (2017) dengan tujuan agar pada

optimasi suhu dan jumlah siklus tersebut telah mampu mengamplifikasi CYP2A6

yang diinginkan, menghasilkan satu produk PCR yang spesifik dengan pita DNA

tunggal dan tebal, serta mencegah terjadinya mispriming karena primer yang tidak

menempel yang disebabkan oleh faktor suhu (Stephenson and Abilock, 2012).

Kondisi PCR yang diggunakan tersebut sangat penting untuk proses

annealing yang merupakan proses penempelan primer. Tahap annealing primer

Isolat DNA

3000 bp


11

(Gambar 2) merupakan tahap yang penting dalam PCR karena jika terdapat

sedikit saja kesalahan pada tahap ini maka akan menyebabkan primer tidak

menempel dan hasil akhir produk DNA yang diinginkan (Ahluwalia, 2009).

Elongasi terjadi setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA

polimerase akan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari

gabungan antara primer, DNA cetakan, dan nukleotida. Jika dilakukan

pengulangan terhadap ketiga tahapan tersebut, maka untai DNA yang baru

dibentuk akan kembali mengalami proses denaturasi, penempelan, dan

pemanjangan untai DNA menjadi untai DNA yang baru (Handoyo dan Ari, 2001).

Alel CYP2A6*9

Primer forward

5' 3'

GATTCCTCTCCCCTGGAAC TAAAGGCAAACCACCCCAGCC

CTAAGGAGAGGGGACCTTG ATTTCCGTTTGGTGGGGTCGG

3’ 5’

Primer reverse

Gambar 2. Situs penempelan primer pada urutan basa nukleotida CYP2A6*9

Keterangan:

: arah penempelan primer forward

: arah penempelan primer reverse

Keberhasilan PCR juga ditentukan oleh spesifisitas primer dalam

menempel pada isolat DNA (McPherson and Moller, 2006). Pada identifikasi alel

CYP2A6*9 ini digunakan primer yang untuk mengamplifikasi CYP2A6*1 yang

diambil dari penelitian Yoshida et al., (2003) yaitu primer forward: (5’-

GATTCCTCTCCCCTGGAAC-3’) dan primer reverse: (5’-

GGCTGGGGTGGTTTGCCTTTA-3’). Primer foward akan mengamplifikasi

ekson 395 sampai 376 dan primer reverse mengamplifikasi ekson 48 sampai 28

(Yoshida et al., 2003). Amplifikasi alel CYP2A6*9 ini menggunakan primer yang

digunakan untuk mengamplifikasi alel CYP2A6*1 karena kedua alel ini hanya

memiliki perbedaan 1 basa (Gambar 3). Perbedaan 1 basa ini dapat dilihat dengan

mencocokkan potongan urutan basa CYP2A6*1 menurut Gen Bank dengan

urutan basa CYP2A6*9 menurut teori Yoshida et al., (2003) (Cindy, 2017). Pada


12

alel CYP2A6*9 dapat dilihat terjadi polimorfisme satu nukleotida (SNP) dalam

kotak TATA di daerah promoter sehingga amplifikasi alel CYP2A6*9 dapat

menggunakan primer dari alel CYP2A6*1.

A. CYP2A6*1 GGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGC

C. CYP2A6*9 GGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGC

A. CYP2A6*1 ATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTA

C. CYP2A6*9 ATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTA

A. CYP2A6*1 TGCAAATATTCCAAACTCCTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCC

C. CYP2A6*9 TGCAAATATTCCAAACTCCTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCC

A. CYP2A6*1 CCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAAGTACCACA

C. CYP2A6*9 CCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAAGTACCACA

A. CYP2A6*1 GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCC

C. CYP2A6*9 GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCC

A. CYP2A6*1 CCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCA

C. CYP2A6*9 CCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCA

A. CYP2A6*1 TGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAAT

C. CYP2A6*9 TGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAAGGAGGTAATTATGTAAT

A. CYP2A6*1 CAGCCAAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTATAAAGGCAAACC

C. CYP2A6*9 CAGCCAAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTAGAAAGGCAAACC

A. CYP2A6*1 ACCCCAGCCG

C. CYP2A6*9 ACCCCAGCC

Gambar 3. Urutan nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*9

(mutasi Single nucleotide polymorphism (SNP) ditunjukkan oleh warna hijau dan

kuning)

Keterangan :

A : Potongan urutan basa CYP2A6*1 menurut Gen Bank

C : Urutan basa CYP2A6*9 menurut teori Yoshida et al., (2003)

Amplifikasi gen CYP2A6 menggunakan primer tersebut menghasilkan

produk PCR yang berukuran 368-bp yang merupakan produk dari alel

CYP2A6*1. Hasil analisis produk PCR dari 30 sampel yang dilakukan dengan

teknik elektroforesis menghasilkan produk PCR dengan ukuran 368 bp (Gambar

4) dengan pita tunggal dan tebal. Hal ini menunjukkan produk PCR yang

dihasilkan merupakan produk dari alel aktif CYP2A6*1 dan dari 30 sampel yang

diidentifikasi, tidak ada subjek uji yang memiliki alel CYP2A6*9. Hasil tersebut


13

dapat diartikan bahwa sebanyak 30 sampel yang tidak memiliki alel CYP2A6*9

akan memiliki metabolisme yang lebih cepat dibandingkan dengan orang yang

memiliki alel CYP2A6*9 sehingga memiliki kemungkinan akan merokok lebih

banyak.

M 7 6 5 4 3 2 1

Gambar 4. Elektrogram produk PCR pada kondisi optimum dari berbagai isolat

DNA

Keterangan :

M : 100 bp DNA ladder sebagai marker

1-7 : Produk PCR dari berbagai isolat DNA yang berbeda

Kondisi elektroforesis : Fase diam agarose 1,5%; fase gerak larutan TBE 0,5%;

kecepatan 100 V/cm; volume injeksi 6µL

Produk PCR

368 bp

3000 bp


14

KESIMPULAN

Hasil identifikasi gen sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) alel *9 pada perokok

pria ras kulit hitam Papua yaitu tidak adanya alel CYP2A6*9 dengan frekuensi

0% sehingga dapat dikatakan untuk sementara bahwa jumlah batang rokok yang

dikonsumsi perokok pria ras kulit hitam Papua tidak dipengaruhi oleh alel

CYP2A6*9.

SARAN

Untuk penelitian selanjutnya, peneliti menyarankan melakukan identifikasi

polimorfisme gen CYP2A6 pada alel non aktif yang berbeda seperti alel

CYP2A6*4, CYP2A6*7, CYP2A6*11, dll yang diduga memiliki peran terhadap

proses metabolisme nikotin di dalam tubuh pada populasi perokok pria ras kulit

hitam Papua.


15

DAFTAR PUSTAKA

Ahluwalia, K. B. 2009. Genetics. Ed ke-2. New Age International Publisher, New

Delhi: p.451.

Asris., 2010. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi

DNA.http://asris07. Student.ipb.ac.id. Diakses pada tanggal 5 Desember

2017, pada pukul 23.00 WIB.

Benowitz NL, Lessov-Schlaggar CN, Swan GE, Jacob P III. Female sex and oral

contraceptive use accelerate nicotine metabolism. Clin Pharmacol Ther

2006;79:480–8

B-Rao C., 2001. Sample size considerations in genetic polymorphism studies.

Human Heredity, 52, 191–200.

Cindy., 2017, Optimasi dan Validasi Kondisi Polymerase Chain Reaction pada

identifikasi CYP2A6*9, Skripsi, Fakultas farmasi Universitas Sanata

Dharma, Yogyakarta.

Elrod, S., 2007. Genetika Edisi Keempat. Erlangga. Jakarta.

Gullstén, H. 2000. Significance of Polymorphism in CYP2A6 Gene. Disertation.

Oulu: Department of Pharmacology and Toxicology University of Oulu.

Haiman, C. A., Stram, D. O., Wilkens, L. R., Pike, M. C., Kolonel, L. N.,

Henderson, B. E., et al,. (2006). Ethnic and racial differences in the

smoking-related risk of lung cancer. New England Journal of Medicine,

354, 333–342.

Hukkanen, J., Jacob III, P. & Benowitz, N.L. 2005. Metabolism and Disposition

Kinetics of Nicotine. The American Society for Pharmacology and

Experimental Therapeutics. Vol. 57, No. 1.

Jarvis M, Tunstall-Pedoe H, Feyerabend C, et al. Biochemical markers of smoke

absorption and self-reported exposure to passive smoking. J Epidemiol

Community Health 1984;38: 335-9.

Kruman, I. I., 2011, Cell Cycle and DNA Damage Response in Postmitotic

Neurons, DNA Repair, InTech, Texas.

Minematsu, N., Nakamura, H., Furuuchi, M., Nakajima, T., Takahashi, S., Tateo,

H., et al., 2006, Limitation of Cigarette Consumption by CYP2A6*4, *7

and *9 Polymorphisms, European Respiratory Journal, 27(2), 289-292.

McPherson, M.J., and Moller, S.G., 2006, PCR, 2 edition, New York: Taylor &

Francis, 305.

Newton, C.R. and A. Graham, 1994. PCR. BIOS Scientific Publishers

Limited,Oxford.

Patramurti, C., Sugiyanto, Nurrochmad, A., and Martono, S., 2014, Polymorphism

of Cytochrome P450 2A6 (CYP2A6*1 and CYP2A6*4) Among Javanese

Indonesian Smoker and Non Smoker, Indonesian Journal of Pharmacy,

26(1), 11-19.

Peamkrasatam. S., Sriwatanakul, K., Kiyotani, K., Fujieda, M., Yamazaki, H.,

Kamataki, T., et al., 2006, In Vivo Evaluation of Coumarin and Nicotine

as Probe Drugs to Predict the Metabolic Capacity of CYP2A6 Due To

Genetic Polymorphism in Thains, Drugs Metabolism and

Pharmacokinetics, 21(6), 475-484.


http://asris07/

16

Pitarque, M., Richter, O., Oke, B., Berkkan, H., Oscarson, M., and Ingelman-

Sundberg, M., 2001, Identification of a Single Nucleotide Polymorphism

in the TATA Box of the CYP2A6 Gene: Impairment of Its Promoter

Activity, Biochemical astepnd Biophysical Research Communications,

284, 455-460.

Rahman, M.T., Uddin, M.S., Sultana, R., Moue, A., & Setu, M. 2013. Polymerase

Chain Reaction (PCR): A Short Review. Anwer Khan Modern Medical

College Journal. 4 (1): 30-36.

Rao, Y., Hoffmann, E., Zia, M., Bodin, L., Zeman, M., Sellers, E.M. & Tyndale,

R.F. 2000. Duplications and Defects in The CYP2A6 Gene:

Identification, Genotyping, and In Vivo Effects on Smoking. The

American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics. Vol.

58, No. 4.

Raunion, H. and Rahnasto-Rilla, M., 2012, CYP2A6: Genetics, Structure,

Regulation, and Function, Drug Metabolism and Drug Interaction, 27(2),

73-88.

Stephenson, F.H. and Abilock, M.C., 2014, PCR Optimization.

Surzycki, S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag,

Berlin, Heidelberg, New York.

Yoshida, R., Nakajima, M., Nishimura, K., Tokudome, S., Kwon, J-T., and

Yokoi, T., 2003, Effects of Polymorphism in Promoter Region of Human

CYP2A6 gene (CYP2A6*9) on Expression Level of Messenger

Ribonucleic Acid and Enzymatic Activity In Vivo and In Vitro, Clinical

Pharmacology and Therapeutics, 74(1), 69-76.

Yusof, W. and Gan, S.H., 2009, High Prevalence og CYP2A6*4 and CYP2A6*9

Alleles Detected Among a Malaysian Population, Clinical Chemical

Acta: International Jornal of Clinical Chemistry, 403(1-2), 105-9.

Yuwono, T., 2008. Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta.


17

LAMPIRAN


18

Lampiran 1. Surat keterangan kelaiakan etik (ethical clearence)


19

Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis


20

Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix


21

Lampiran 4. Product Datasheet of DNA Ladder& Markers

Lampiran 5. Product Datasheet of primer forward and reverse CYP2A6*9


22

Lampiran 6. Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA menggunakan Elektroforesis

16p 15p 14p 13p 12p 11p 1p

24p 25p 26p 27p 28p 29p 30p

17p 18p 19p 20p 21p 22p 23p


23

Lampiran 7. Hasil PCR

18p 19p 20p 13p 12p 17p 8p 1p 2p 3p 4p 5p 6p 7p

8p 9p 10p 11p 12p 13p 14p

14

15p 16p 17p 18p 19p 20p 21p


24

22p 23p 24p 25p 26p 27p 28

p

29p 30p 31p 32p 33p 1p 2p


25

Lampiran 8. Usage Information of FavorPrepTM


26

Lampiran 9. Data Subjek Uji hasil kuisioner

Subjek Umur Skor Jumlah batang

rokok

Lama

merokok

1p 22 3 15 8

2p 25 3 8 10

3p 24 3 21 5

4p 23 1 3 11

5p 28 6 20 11

6p 26 3 10 12

8p 25 3 8 5

9p 20 1 9 5

10p 27 4 11 9

11p 22 2 7 5

12p 21 3 5 9

13p 28 3 12 8

14p 20 3 3 6

15p 20 1 5 6

16p 20 2 3 5

17p 25 6 23 18

18p 22 4 10 6

19p 23 5 13 9

20p 21 3 10 5

21p 20 3 5 5

23p 22 4 16 6

24p 22 3 3 8

26p 21 2 4 5

27p 27 5 10 15

28p 22 1 7 7

29p 24 5 5 7

30p 25 5 18 5

31p 24 4 6 10

32p 24 3 15 8

33p 27 6 24 12


27

Lampiran 10. Hasil Kuisioner


28


29


30

Lampiran 11. Perhitungan jumlah sampel

Persamaan yang digunakan untuk menentukan jumlah sampel minimal pada

penelitian genetik polimorfisme menurut B-Rao (2001) adalah:

Nmin ≥ log (1 – π )/2log (1 – fmin)

Dimana:

Nmin : jumlah sampel minimal

π : probabilitas alel utama

fmin : frekuensi alel minor

Pada penelitian ini jenis alel yang akan diteliti adalah dua macam, yaitu:

CYP2A6*1 (alel utama) dan CYP2A6*9 (alel minor). Maka menurut B-Rao

(2001), nilai π dan fmin untuk kedua alel minor tersebut berturut-turut adalah: π =

0,95 dan fmin = 0,05.

Jadi jumlah sampel minimal yang diperlukan untuk penelitian adalah:

Nmin = log (1 – π )/2log (1 – fmin)

= log (1-0,95/2log (1-0,05)

= 28,89

= 29 orang

Jumlah sampel yang digunakan pada penelitan ini adalah 30 orang, oleh karena itu

jumlah ini sudah memenuhi persyaratan sampel untuk penelitian genetik

polimorfisme.


31

BIOGRAFI PENULIS

Penulis bernama lengkap Dismas Adi Prabowo, lahir di

Palembang pada tanggal 19 Desember 1996 dan

merupakan anak kedua dari pasangan Bapak Ignatius

Riyanto dan Ibu Barbara Sriwahyunigsih. Pendidikan

formal yang telah ditempuh penulis yaitu TK Xaverius

5 Palembang (2000 - 2001), tingkat Sekolah Dasar di

SD Xaverius 5 Palembang (2002 - 2008), tingkat

Sekolah Menengah Pertama di SMP Xaverius Maria

Palembang (2009 – 2011), dan tingkat Sekolah

Menengah Atas di SMA Xaverius 2 Palembang (2012 – 2014). Pada tahun 2014,

penulis melanjutkan pendidikan ke jenjang Perguruan Tinggi di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama perkuliahan, penulis aktif dalam

beberapa kepanitiaan seperti Desa Mitra tahun 2015 sebagai perlengkapan, titrasi

2015 sebagai anggota divisi Dana dan Usaha, titrasi 2016 sebagai perlengkapan,

PPRtos 2016 sebagai divisi keamanan, dan 2017 sebagai ketua panitia Kunjungan

Industri dan Rumah Sakit. Penulis juga berpartisipasi sebagai asisten dosen kimia

dasar tahun 2017.


identifikasi gen sitokrom p450 2a6 (cyp2a6) alel *9 … fileiii pengesahan skripsi berjudul uji...

Documents