identifikasi gen sitokrom cyp2a6 alel *4 pada isolat …

i

IDENTIFIKASI GEN SITOKROM CYP2A6 ALEL *4 PADA ISOLAT DNA PEROKOK SUKU TIONGHOA DI INDONESIA

DENGAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh: Stella Felina Kiatarto

NIM : 158114172

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2018

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii

IDENTIFIKASI GEN SITOKROM CYP2A6 ALEL *4 PADA ISOLAT DNA PEROKOK SUKU TIONGHOA DI INDONESIA


SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh: Stella Felina Kiatarto

NIM : 158114172

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2018


iii

Scanned by CamScanner


iv


v

HALAMAN PERSEMBAHAN

FormyJesus,myparents,mybeloved,

Andmyfriends.


vi

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa universitas Sanata Dharma :

Nama : Stella Felina Kiatarto

NIM : 158114172

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :

IDENTIFIKASI GEN SITOKROM CYP2A6 ALEL *4 PADA ISOLAT DNA

PEROKOK SUKU TIONGHOA DI INDONESIA


Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan

kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,

mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pengkalan data,

mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media

lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun

memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai

penulis.

Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal :

12 Desember 2018

Yang menyatakan

(Stella Felina Kiatarto)


vii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak

memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam

kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah ini, maka

saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-undangan

yang berlaku.

Yogyakarta, 22 Januari 2019

Penulis

(Stella Felina Kiatarto)


viii

PRAKATA

Penulis menghaturkan puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa atas berkat

dan rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Identifikasi

Gen Sitokrom Cyp2A6 Alel *4 pada Isolat Dna Perokok Suku Tionghoa Di

Indonesia Dengan Metode Polymerase Chain Reaction” untuk memenuhi

persyaratan memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) Program Studi Farmasi

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

Penyusunan skripsi ini tidak lepas dari dukungan berbagai pihak. Penulis

mengucapkan terima kasih kepada: �

1. Ibu Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing atas

segala bimbingan, saran, dan nasihat kepada penulis.�

2. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini. Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma.

3. Ibu Damiana Sapta Candrasari, M.Sc., selaku dosen penguji atas bantuan,

kritik dan saran kepada penulis. �

4. Bapak Maywan Hariono, Ph. D., Apt., selaku dosen penguji atas bantuan,

kritik dan saran kepada penulis.�

5. Seluruh Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah

memberikan pengetahuan dan bimbingan kepada penulis selama proses

perkuliahan.

6. Bapak Kayat selaku Laboran Laboratorium Biokimia Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta yang selalu membantu dan berkontribusi dalam hal

sarana dan prasarana.

7. Ibu Rumbiwati, M.Sc., selaku teknisi Laboratorium Parasitologi Fakultas

Kedokteran UGM atas bantuan dan petunjuk selama penelitian. ��

8. Afra Alvianus yang selalu mendukung, memotivasi dan menyemangati

penulis.

9. Keluarga tercinta ibu, ayah, dan kakak yang selalu memberikan dukungan

kepada penulis.

10. Sahabat WW yang telah mendampingi dan menyemangati penulis.


ix

11. Teman seperjuangan dalam melakukan penelitian dan penyusunan skripsi,

Elisa, Ayu, dan Netti yang telah berjuang bersama dan memperlancar proses

pengerjaan skripsi.

12. Teman-teman FSMD 2015 beserta seluruh teman-teman angkatan 2015

prodi S1 Farmasi Universitas Sanata Dharma atas segala proses dan

dinamika bersama selama perkuliahan.

13. Seluruh pihak yang telah membantu dan memberi dukungan yang tidak

dapat disebutkan satu per satu.

Akhir kata penulis menyadari dalam penulisan skripsi ini masih banyak

kekurangan dan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang dapat

membantu menyempurnakan karya tulis ini. Penulis berharap semoga karya tulis

ini dapat bermanfaat dalam perkembangan ilmu dan pengetahuan. Sekian dan

terima kasih, Tuhan Yesus memberkati.

Yogyakarta, 22 Januari 2018

Penulis


x

ABSTRAK

Nikotin merupakan salah satu zat kimia pada rokok yang menimbulkan efek ketergantungan. Nikotin dalam tubuh dimetabolisme oleh enzim sitokrom 2A6 (CYP2A6) menjadi metabolit tidak aktif. Enzim CYP2A6 memiliki tingkat polimorfisme yang tinggi, salah satunya yaitu delesi gen pada alel CYP2A6*4. Individu dengan alel CYP2A6*4 akan mengalami penurunan metabolisme nikotin, sehingga akumulasi nikotin dalam darah lebih banyak. Akumulasi nikotin yang tinggi dapat meningkatkan risiko penyakit kardiovaskular (stroke, jantung koroner,dan gagal jantung dan diabetes). Variasi alel CYP2A6*4 banyak ditemukan pada populasi suku Tionghoa. Suku Tionghoa adalah salah satu suku yang menduduki peringkat 18 terbesar di Indonesia, dengan jumlah laki-laki dan perempuan sebesar 2.832.510 orang. Tujuan penelitian ini adalah mengidentifikasi dan mengetahui frekuensi alel CYP2A6*4 yang terdapat pada suku Tionghoa di Indonesia menggunakan metode PCR. Analisis hasil dari produk PCR dilakukan dengan elektroforesis.

Kata Kunci : Nikotin, CYP2A6*4, elektroforesis, Polymerase Chain Reaction.


xi

ABSTRACT

Nicotine is one of the chemicals in cigarettes which causes dependency effects. Nicotine in the body is metabolized by the enzyme cytochrome 2A6 (CYP2A6) into an inactive metabolite. CYP2A6 enzymes have a high level of polymorphism, one of which is gene deletion in CYP2A6 * 4 alleles. Individuals with CYP2A6*4 alleles will undergo a decrease in nicotine metabolism, resulting in more accumulation of nicotine in the blood. High accumulation of nicotine can increase the risk of cardiovascular disease (stroke, coronary heart disease, and heart failure and diabetes). CYP2A6 * 4 allele variation is found in many ethnic Chinese populations. The Chinese are one of the tribes which ranks the 18th largest in Indonesia, with a total of 2,832,510 men and women. The purpose of this study was to identify and determine the frequency of CYP2A6 * 4 alleles found in Chinese tribes in Indonesia using the PCR method. Analysis of the results of PCR products is caried out by electrophoresis. Keywords : Nicotine, CYP2A6*4, electrophoresis, Polymerase Chain Reaction.


xii

DAFTAR ISI

COVER.............................................................................................................. i HALAMAN SAMPUL...................................................................................... ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING................................................ iii HALAMAN PENGESAHAN............................................................................ iv HALAMAN PERSEMBAHAN......................................................................... .v PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI.............................................. vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA............................................................ vii PRAKATA........................................................................................................ viii ABSTRAK........................................................................................................ x ABSTRACT...................................................................................................... xi DAFTAR ISI..................................................................................................... xii DAFTAR TABEL............................................................................................. xiii DAFTAR GAMBAR........................................................................................ xiv DAFTAR LAMPIRAN..................................................................................... xv PENDAHULUAN............................................................................................. 1 METODE PENELITIAN.................................................................................. 2 HASIL DAN PEMBAHASAN......................................................................... 4 KESIMPULAN................................................................................................. 12 SARAN............................................................................................................. 12 DAFTAR PUSTAKA........................................................................................ 13 LAMPIRAN...................................................................................................... 15 BIOGRAFI PENULIS....................................................................................... 26


xiii

DAFTAR TABEL Tabel I. Frekuensi alel CYP2A6 pada suku Tionghoa..................................9 Tabel II. Skor FTND.....................................................................................10 Tabel III. Pengaruh Alel CYP2A6*4 dan Alel CYP2A6*9 terhadap

Ketergantungan Rokok...................................................................10


xiv

DAFTAR GAMBAR Gambar I. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik

elektroforesis....................................................................................6 Gambar II. Situs penempelan primer pada urutan basa nukleotida

CYP2A6*1.......................................................................................7 Gambar III. Urutan nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan

CYP2A6*4.......................................................................................7 Gambar IV. Elektrogram produk PCR pada kondisi optimum dari berbagai isolat

DNA.................................................................................................8


xv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Ethical Clearance Penelitian..........................................................16 Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis.........................17 Lampiran 3. Usage Information of Go Tag Green Master

Mix..................................................................................................18 Lampiran 4. Product Datasheet of Primer Forward and Reverse

CYP2A6*7......................................................................................19 Lampiran 5. Product Datasheet of DNA Ladder and Markers..........................20 Lampiran 6. Karakteristik Sampel.......................................................................21 Lampiran 7. Elektroforegram Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA Suku

Tionghoa.........................................................................................22 Lampiran 8. Elektroforegram Produk PCR CYP2A6*4 pada Kondisi

Optimum.........................................................................................23 Lampiran 9. Elektroforegram Produk PCR CYP2A6*9 pada Kondisi

Optimum.........................................................................................24 Lampiran 10. Frekuensi gen CYP2A6 alel *4,*9, dan *1 pada suku

Tionghoa.........................................................................................25


1

PENDAHULUAN

Merokok menimbulkan permasalahan kesehatan, sosial, ekonomi, dan

lingkungan tidak hanya pada perokok tersebut namun juga bagi orang lain.

Lingkungan asap rokok adalah penyebab terjadinya berbagai penyakit mematikan.

Menurut data WHO (2018), merokok dapat membunuh lebih dari tujuh juta orang

setiap tahunnya. Tahun 2030 diperkirakan angka kematian perokok di dunia akan

mencapai 10 juta jiwa, dan 70% berasal dari negara berkembang (Kemenkes RI,

2015).

Nikotin bertanggung jawab terhadap ketergantungan merokok karena dapat

menimbulkan rasa kecanduan yang sangat tinggi, seimbang dengan heroin dan

kokain. Nikotin diklasifikasikan sebagai obat stimulan yang berperan dalam

meredakan kelelahan, depresi, dan rasa sakit. Oleh karena itu, perokok merasa

bahwa merokok dapat meredakan stres dan ingin merokok lebih lagi terutama

dalam kondisi tertekan (WHO, 2010). Kadar nikotin dalam darah yang tinggi dapat

meningkatkan risiko penyakit kardiovaskular stroke, jantung koroner, dan gagal

jantung serta diabetes (Minematsu et al., 2006). Sebanyak 80-90% nikotin yang

diabsorbsi akan dimetabolisme di liver. Nikotin merupakan substrat spesifik enzim

CYP2A6 yang dioksidasi menjadi kotinin, dan kotinin dimetabolisme lebih lanjut

menjadi trans-3'-hidroksikotinin sebagai metabolit tidak aktif oleh CYP2A6

(Sellers et al., 2003).

Enzim CYP2A6 disandi oleh gen CYP2A6. Gen ini memiliki tingkat

polimorfisme alel yang tinggi sehingga dapat mempengaruhi metabolisme nikotin,

yaitu menurunkan, menghilangkan, atau meningkatkan aktivitas enzim yang

diekspresikan dan pada akhirnya akan mempengaruhi kadar nikotin dalam darah

(Jaja et al., 2008). Bentuk aktif dari gen CYP2A6 adalah alel CYP2A6*1 (wild

type), sedangkan salah satu bentuk tidak aktifnya adalah CYP2A6*4. Bentuk alel

tidak aktif tersebut dapat mempengaruhi aktivitas enzim menjadi lebih lambat

daripada bentuk aktifnya (Minematsu et al., 2006).

Alel CYP2A6*4 adalah alel tidak aktif yang paling sering ditemukan di

benua Asia. Frekuensi alel CYP2A6*4 pada penduduk Asia adalah 20%, sehingga

alel ini berperan penting bagi penduduk Asia (Muroi et al., 2012). Penelitian ini


2

juga diperkuat dengan hasil penelitian Nakajima (2006) yang menyatakan bahwa

terdapat bentuk alel tidak aktif CYP2A6 yaitu CYP2A6*4 sebesar 11-20% dari

populasi penduduk Asia (N=1328).

Indonesia merupakan negara dengan tingkat keanekaragaman yang tinggi,

variasi suku di Indonesia amat bervariasi. Metabolisme nikotin oleh CYP2A6

bervariasi di seluruh suku, salah satunya pada suku Tionghoa. Suku Tionghoa

adalah salah satu suku yang menduduki peringkat 18 terbesar di Indonesia, dengan

jumlah laki-laki dan perempuan sebesar 2.832.510 orang (Badan Pusat Statistik,

2010). Berdasarkan Penelitian Oscarson (1999), diketahui bahwa pada populasi

Tionghoa di China terdapat frekuensi alel CYP2A6*4 sebesar 15%. Tujuan

penelitian ini adalah mengidentifikasi adanya alel CYP2A6*4 pada isolat DNA

suku Tionghoa yang tinggal di Indonesia dan mengetahui frekuensinya. Hasil

penelitian ini dapat digunakan sebagai acuan pengendalian penyakit kardiovaskular

dan diabetes pada suku Tionghoa yang tinggal di Indonesia.

METODE

Alat dan Bahan Penelitian

Alat yang digunakan berupa Thermal cycler (Perkin Elemer 2400), satu set

elektroforesis horizontal (Sigma Aldrich), UV Transilluminator (Fisher Scientific),

ice box, dispossable gloves, hot plate (CimarecTM Thermo Scientific), microtubes

0,5 mL, alat gelas, mikropipet (Acura 825), dan kamera DSLR.

Bahan yang digunakan yaitu isolat DNA dari populasi suku Tionghoa yang

pernah digunakan dalam penelitian oleh Julian (2017). Primer forward: 5'-CCT

CAT CAC ACA CAA CTT CCT C-3', primer reverse: 5'-CGC AGG TAC TGG

GTG CTT GGT AG-3', blue tip, yellow tip, white tip, Promega Go Taq Green

Master Mix (berisi Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl2, dan buffer), Tris-Borate-

EDTA Buffer (TBE) 10x, 1% gel agarose, GelRedTM Nucleic Acid Gel Stain

(Biotium), VC 100bp Plus DNA marker (Vivantis), DNA loading dye, etanol 96%,

Nuclease free water.


3

Penyiapan Gel Agarose

Elektroforesis menggunakan gel agarose 1,5 % dibuat dengan melarutkan

1g agarose dalam 100mL larutan 1x TBE lalu dipanaskan di atas hot plate hingga

mendidih sambil diaduk menggunakan magnetic stirrer hingga larut, kemudian

ditambahkan 1 µL larutan gel red dan diaduk hingga homogen. Larutan dituang ke

dalam cetakan gel sebanyak 25 ml yang telah diberi sisiran pada tepi gel dan gel

dibiarkan mengeras. Sisir dicabut setelah gel mengeras sehingga terbentuk sumur-

sumur.

Analisis Kualitatif Isolat DNA

Isolat DNA sebanyak 2 µL ditambahkan aquabidest sebanyak 3 µL,

dicampur dengan loading dye sebanyak 1 µL, kemudian campuran tersebut diambil

sejumlah 5,0 µL dan dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel menggunakan

mikropipet. Satu sumur gel diisi dengan 100 bp DNA ladder sebanyak 4 µL sebagai

marker. Gel agarose ditempatkan di dalam gel tray elektroforesis berisi larutan

buffer 1x TBE dan diberi tegangan 110 volt selama 45 menit. Molekul DNA yang

bermuatan negatif pada pH netral akan bergerak ke arah positif. Gel agarose

kemudian dideteksi di bawah lampu UV Transilluminator kemudian

didokumentasikan dengan kamera DSLR. Panjang pita DNA dapat diketahui

dengan cara menarik garis lurus masing-masing pita DNA sampel dengan pita DNA

ladder.

Amplifikasi Alel CYP2A6*4

Amplifikasi fragmen DNA alel CYP2A6*4 dilakukan menggunakan primer

forward: 5'-CCT CAT CAC ACA CAA CTT CCT C-3', primer reverse: 5'-CGC

AGG TAC TGG GTG CTT GGT AG-3'. Reaksi PCR dilakukan dengan

menggunakan Promega Go Taq Green Master Mix (berisi Taq DNA polymerase,

dNTPs, MgCl2, dan buffer) dengan volume akhir campuran 25 uL, reagen 12,5 µL,

primer forward 1,25 µL, primer reverse 1,25 µL, isolat DNA 5,0 µL, ditambahkan

dengan Nuclease-free water 5 µL. Amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR

Thermal cycler Perkin Elmer 2400. Kondisi PCR yang digunakan yaitu initial

denaturasi pada suhu 95˚C (5’); dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 98˚C

(20”); annealing pada suhu 64˚C (15”) dan ekstensi pada suhu 72˚C (30”).


4

Amplifikasi dilakukan sebanyak 30 siklus kemudian diakhiri dengan final ekstensi

pada suhu 72˚C (5’).

Analisis Produk PCR Menggunakan Teknik Elektroforesis

Untuk melihat keberhasilan amplifikasi dilakukan elektroforesis

menggunakan gel agarose 1,5% yang telah ditambahkan gel red. Gel agarose

diitempatkan dalam gel tray elektroforesis berisi buffer TBE 1x hingga permukaan

gel terendam. Produk PCR sebanyak 5 µL dicampurkan dengan loading dye sebesar

1 µL kemudian campuran tersebut diambil sebanyak 6 µL dengan mikropipet lalu

dimasukkan ke sumur gel agarose. Salah satu lubang sumur diisi dengan DNA

ladder sebanyak 4 µL sebagai marker. Kemudian dilakukan running elektroforesis

dengan tegangan sebesar 110 volt selama 45 menit. Gel agarose kemudian dideteksi

di bawah lampu UV Transilluminator kemudian didokumentasikan dengan kamera

DSLR.

Analisis Hasil

Alel CYP2A6*1 dan CYP2A6*4 pada sampel dapat dideteksi dengan

menggunakan elektroforesis. Terbentuknya hasil produk berupa pita dengan

panjang 350 bp menunjukkan bahwa isolat DNA yang dianalisis memiliki alel

CYP2A6*1. Jika tidak ditemukan hasil produk, dapat dinyatakan bahwa isolat

DNA yang dianalisis memiliki alel CYP2A6*4. Frekuensi alel CYP2A6*1 dan

CYP2A6*4 diketahui dengan rumus berikut:

Frekuensi alel CYP2A6 *1:

Jumlah isolat dengan alel CYP2A6*1

Jumlah seluruh isolat (30)

Frekuensi alel CYP2A6*4:

Jumlah isolat dengan alel CYP2A6*4

Jumlah seluruh isolat (30)

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada penelitian polimorfisme CYP2A6 dilakukan tiga tahapan utama, yaitu

analisis kualitatif isolat DNA, amplifikasi alel CYP2A6, dan analisis produk PCR

dengan teknik elektroforesis. Penelitian ini menggunakan PCR sebagai metode

x100%

x100%


5

untuk mengidentifikasi adanya polimorfisme pada suatu genetik dalam suatu

populasi. Alel CYP2A6*4 merupakan alel yang akan diidentifikasi pada penelitian

ini dengan metode PCR. Terjadinya polimorfisme CYP2A6*4 dapat menyebabkan

inaktivasi enzim CYP2A6 sehingga metabolisme nikotin akan menurun dan

meningkatkan kadar nikotin dalam darah.

Analisis Kualitatif Isolat DNA

Isolat DNA yang digunakan pada penelitian ini merupakan isolat DNA

perokok suku Tionghoa yang diisolasi oleh Julian (2017). Kriteria subjek uji yang

digunakan berjumlah 30 orang dengan jenis kelamin laki-laki, merupakan suku

Tionghoa yang tinggal di Indonesia, berusia antara 20-30 tahun, dan menghisap

rokok kretek/filter minimal 5 batang/hari selama minimal 5 tahun. Rata-rata

keseluruhan subjek uji dalam penelitian ini berusia 22 tahun, telah merokok selama

6 tahun dan menghisap 13 batang rokok dalam sehari (Julian, 2017).

Isolat DNA dianalisis secara kualitatif dengan teknik elektroforesis (Lee et

al., 2012). Isolat DNA yang baik adalah isolat DNA yang menghasilkan pita

tunggal menunjukkan bahwa isolat DNA yang digunakan masih dalam keadaan

murni, tidak tercemar oleh protein lain serta tidak terdegradasi (Patramurti et al.,

2014). Menurut Lee et al (2012), semakin tinggi intensitas pita isolat DNA

menunjukkan kadar DNA yang lebih besar sehingga apabila terdapat variasi dalam

terbentuknya pita yang tipis dapat menunjukkan kadar isolat DNA kurang besar.

Hasil elektroforesis menunjukkan adanya variasi bentuk pita, baik pita tunggal dan

tipis maupun pita tunggal dan tebal dengan ukuran lebih dari 3000 bp (Gambar 1).

Dari hasil yang didapat, dapat diketahui bahwa isolat DNA yang digunakan murni

namun memiliki kadar yang kurang tinggi sehingga diatasi dengan memaksimalkan

volume DNA yang digunakan untuk PCR dan memperbanyak siklusnya menjadi

30 kali pada saat amplifikasi.


6

Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik

elektroforesis Keterangan: L : DNA Ladder sebagai marker 1 : Isolat DNA dengan pita tebal dan tunggal 2-7 : Isolat DNA dengan pita tipis dan tunggal

Amplifikasi Alel CYP2A6*4

Identifikasi alel CYP2A6*4 pada penelitian ini dilakukan menggunakan

teknik PCR. Kondisi PCR yang digunakan yaitu initial dengan suhu 94oC selama 3

menit, denaturasi 94oC selama 30 detik, ekstensi 70oC selama 25 detik, final

ekstensi 72oC selama 5 menit, dan jumlah siklus sebanyak 30 siklus yang telah

dioptimasi untuk mendapatkan kondisi PCR yang optimal agar dapat menghasilkan

produk PCR yang baik. Untuk mengetahui adanya alel CYP2A6*4, digunakan

primer yang spesifik menempel pada alel CYP2A6*1 yaitu primer forward: 5'-CCT

CAT CAC ACA CAA CTT CCT C-3', dan primer reverse: 5'-CGC AGG TAC

TGG GTG CTT GGT AG-3'. Desain primer yang spesifik dan sekuens yang

optimal akan menentukan keberhasilan proses PCR, karena spesifitas menentukan

kemampuan primer untuk menempel pada isolat DNA target (Elsalam, 2003). Situs

penempelan primer pada sekuen urutan basa nukleotida potongan gen CYP2A6*1

pada daerah yang diamplifikasi dapat diilustrasikan seperti pada Gambar 2.


7

Gambar 2. Situs penempelan primer pada urutan basa nukleotida CYP2A6*1

Keterangan : : Arah penempelan primer forward : Arah penempelan primer reverse

Amplifikasi gen CYP2A6 menggunakan primer tersebut menghasilkan

produk PCR yang berukuran 350-bp yang merupakan produk dari alel CYP2A6*1.

Pada identifikasi alel CYP2A6*4, digunakan primer yang mengamplifikasi

CYP2A6*1 karena kedua alel ini memiliki perbedaan basa pada sisi penempelan

primer reverse sehingga isolat DNA dengan alel CYP2A6*4 tidak akan menempel

dan tidak membentuk pita pada saat diamati dengan UV Transilluminator.

Perbedaan basa ini dapat dilihat dengan mencocokkan urutan basa nukleotida

CYP2A6*1 dengan urutan basa CYP2A6*4 yang didapat dari Gen Bank (Gambar

3).

A :CCTCATCACACACAACTTCCTCCTCCCTACCAGGGCACCGAAGTGTTCCC B :CCTCATCACACACAACTTCCTCCTCCCTACCAGGGCACCGAAGTGTTCCC

A :TATGCTGGGCTCTGTGCTGAGAGACCCCAGTTTCTTCTCCAACCCCCAGG B :TATGCTGGGCTCCGTGCTGAGAGACCCCAGCTTCTTCTCCAACCCTCAGG

A :ACTTCAATCCCCAGCACTTCCTGAATGAGAAGGGGCAGTTTAAGAAGAGT B :ACTTCAATCCCCAGCATTTCCTGGATGACAAGGGGCAGTTTAAGAAGAGT

A :GATGCTTTTGTGCCCTTTTCCATCGGTAAGAGACCACTGTTTGCTGCCAG B :GATGCTTTTGTGCCCTTTTCCATCGGTAAGAGACCACTGTTTGCTGCCAG

A :GCCACGGCTCACACCAGCAGGGGCCTCCCTCACCCTCCTCCCCTCTCTGC B :GCCACTGCTCACACCAGCAGGCGCCTCCCTCACCCACCTCCCCTCTCTGC

A :GGTGTAGCCTGGTATTTCTCCAGCTTGGAAGTTCCTGTTAGAATCTACCC B :GGTGTAGCCTGGTATTTCTCCAGCTTGGAAGTTCCTGTTAGAATCTACCC

A :TTGAGCCAGCAGCTGATACTTCCTTAACTACCAAGCACCCAGTACCTGCG B :TTGAGCCAGCAGCTGATACTTCCTTAACTACCAAGCACCCAGTACCTGCA

Gambar 3. Urutan nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*4

Keterangan: A : Potongan urutan basa CYP2A6*1 B : Potongan urutan basa CYP2A6*4


8

Analisis Produk PCR

Hasil produk PCR dapat diidentifikasi dengan teknik elektroforesis. Situs

penempelan primer pada urutan basa potongan gen CYP2A6*4 tidak sesuai dengan

pasangan basa primer yang digunakan dalam penelitian ini sehingga pada produk

PCR dengan gen CYP2A6*4 tidak terjadi amplifikasi dan tidak terbentuk pita gel

agarose. Hasil elektroforesis menunjukkan panjang pita produk PCR berupa

amplifikasi DNA yang diamati dengan UV transilluminator kemudian

didokumentasikan dengan menggunakan kamera DSLR (Gambar 4).

Gambar 4. Elektrogram produk PCR pada kondisi optimum dari berbagai isolat

DNA Keterangan: L : DNA Ladder sebagai marker 1 : Isolat DNA dengan pita tebal dan tunggal 2-7 : Isolat DNA dengan pita tipis dan tunggal

Hasil analisis produk PCR yang dilakukan dengan elektroforesis

ditunjukkan pada gambar 4, memperilhatkan bahwa ada yang menghasilkan produk

PCR dengan ukuran 350-bp dan ada juga yang tidak menghasilkan produk PCR.

Produk PCR yang membentuk pita dengan panjang 350-bp menunjukkan bahwa

sampel DNA tersebut merupakan wild type (CYP2A6*1) dan sebaliknya, pita yang

kosong menunjukkan bahwa sampel DNA memiliki alel CYP2A6*4.

Pada penelitian ini dilakukan amplifikasi pada 30 sampel, 18 sampel

menghasilkan pita pada 350-bp dan 12 sampel tidak menghasilkan pita. Dapat

dinyatakan bahwa dari 30 isolat DNA perokok suku Tionghoa yang tinggal di


9

Indonesia, teridentifikasi 18 orang (60%) yang memiliki alel aktif (CYP2A6*1)

dan 12 orang (40%) yang memiliki alel tidak aktif (CYP2A6*4). Sampel yang

digunakan dalam penelitian ini telah digunakan pada penelitian sebelumnya oleh

Kotta (2018) untuk mengidentifikasi adanya alel CYP2A6*9. Dari hasil penelitian

Kotta (2018) teridentifikasi sebanyak 7 isolat merupakan alel CYP2A6*9. Apabila

hasil dari penelitian ini digabungkan dengan penelitian Kotta (2018) maka didapati

frekuensi alel CYP2A6*1/*1 sebesar 50%, alel CYP2A6*1/*4 sebesar 26.67%, alel

CYP2A6*1/*9 sebesar 10%, dan *4/*9 sebesar 13.33%.

Tabel I. Frekuensi alel CYP2A6 pada suku Tionghoa

Alel Jumlah isolat Frekuensi Alel

CYP2A6*1/*1 15 50 %

CYP2A6*1/*4 8 26,67 %

CYP2A6*1/*9 3 10 %

CYP2A6*4/*9 4 13,33 %

Faktor genetik berkontribusi sebesar 50-70% terhadap ketergantungan

merokok. Adanya alel tidak aktif seperti CYP2A6*4 dan CYP2A6*9 dapat

menurunkan metabolisme nikotin sehingga menurunkan tingkat ketergantungan

terhadap rokok (Ito et al., 2015). Penelitian ini mengacu dari penelitian Kotta

(2018) yang menggunakan indikator Fagerström Test for Nicotine Dependence

(FTND) untuk mengukur tingkat ketergantungan terhadap rokok. FTND

merupakan instrumen standar berupa kuisioner yang digunakan untuk menilai

intensitas ketergantungan fisik terhadap nikotin melalui hasil skor penilaian yang

menentukan tingkat ketergantungannya. Menurut hasil kuisioner yang diperoleh

dari Kotta (2018), didapatkan data yang dirangkum dalam Tabel II.


10

Tabel II. Skor FTND

Total Skor Keterangan Jumlah Subjek Uji

0-2 Ketergantungan sangat rendah 8

3-4 Ketergantungan rendah 15

5 Ketergantungan sedang 5

6-7 Ketergantungan tinggi 2

8-10 Ketergantungan sangat tinggi -

Berdasarkan total skor FTND, 23 orang subjek uji memiliki total skor di

bawah 5 yang menggambarkan tingkat ketergantungan terhadap nikotin tergolong

rendah. Terdapat 5 orang subjek uji dengan total skor 5 sebanyak 2 orang yang

menggambarkan tingkat ketergantungan terhadap nikotin sedang. Jumlah subjek uji

dengan total skor di atas 5 sebanyak 2 orang uang menggambarkan tingkat

ketergantungan terhadap nikotin tinggi. Pengaruh polimorfisme alel CYP2A6

terhadap rokok dapat dihubungkan dengan hasil skor FTND yang menggambarkan

tingkat ketergantungan merokok dari subjek uji yang digunakan. Hasil analisis

pengaruh polimorfisme alel CYP2A6*4 dan CYP2A6*9 dapat dilihat pada tabel

III.

Tabel III. Pengaruh Alel CYP2A6*4 dan Alel CYP2A6*9 terhadap Ketergantungan Rokok

Tingkat

Ketergantungan

Rokok

Jumlah Subjek Uji

Alel

CYP2A6

*1/*1

Alel

CYP2A6

*1/*4

Alel

CYP2A6

*1/*9

Alel

CYP2A6

*4/*9

Sangat Rendah 2 3 2 1

Rendah 8 4 - 3

Sedang 4 1 - -

Tinggi 1 - 1 -

Sangat Tinggi - - - -

Total 15 8 3 4


11

Jika dilihat pengaruh ketergantungan rokok dari faktor genetik, seharusnya

individu dengan alel CYP2A6*1 akan memiliki tingkat ketergantungan paling

tinggi karena memiliki enzim CYP2A6 yang aktif. Individu dengan alel heterozigot

inaktif (CYP2A6*4 atau CYP2A6*9) akan memiliki tingkat ketergantungan yang

lebih rendah. Sedangkan individu dengan alel homozigot inaktif (CYP2A6*4 dan

CYP2A6*9) akan memiliki tingkat ketergantungan yang paling rendah.

Dari hasil yang didapat (tabel III), tidak semua sesuai dengan teori. Pada

individu dengan alel CYP2A6*1 terdapat tingkat ketergantungan yang sangat

rendah, rendah, sedang, dan juga tinggi. Pada individu dengan alel CYP2A6*4

terdapat tingkat ketergantungan yang sangat rendah, rendah dan sedang. Sedangkan

pada individu dengan alel CYP2A6*9 memiliki tingkat ketergantungan yang sangat

rendah dan tinggi. Sedangkan pada individu dengan alel CYP2A6*9 dan

CYP2A6*4 memiliki tingkat ketergantungan yang sangat rendah dan rendah.

Terdapat individu dengan alel inaktif yang memiliki tingkat ketergantungan lebih

rendah dibandingkan dengan individu dengan alel aktif, namun terdapat juga hasil

yang tidak sesuai dengan teori. Terdapat individu dengan alel aktif yang memiliki

tingkat ketergantungan sangat rendah dan rendah, sedangkan individu dengan

heterozigot inaktif ada yang memiliki tingkat ketergantungan yang tinggi.

Adanya hasil yang tidak sesuai dengan teori dapat dikarenakan terdapat alel

tidak aktif lain pada subjek uji yang belum diketahui. Terdapat variasi alel tidak

aktif selain CYP2A6*4 dan CYP2A6*9, yaitu CYP2A6*2, CYP2A6*7, dan

CYP2A6*12. Adanya alel CYP2A6*2 dan CYP2A6*4 dapat menurunkan aktivitas

enzimatik CYP2A6 sebesar ≥50%, sedangkan alel CYP2A6*7, CYP2A6*9, dan

CYP2A6*12 dapat menurunkan aktivitas CYP2A6 hingga 20% (Chenoweth et al.,

2013). Faktor utama yang mempengaruhi tingkat ketergantungan terhadap rokok

adalah faktor genetik dan lingkungan (Tyndale and Seller, 2005). Hasil penelitian

yang tidak sesuai kemungkinan dapat dipengaruhi dari faktor lingkungan seperti

lama merokok, ekonomi, budaya, umur, tingkat pendidikan, dan pergaulan

(Georgiadou, 2015).


12

KESIMPULAN

Alel CYP2A6*4 pada subjek uji suku Tionghoa yang tinggal di Indonesia

teridentifikasi dengan frekuensi sebesar 40% dari 30 subjek uji.

SARAN

Perlu dilakukan penelitian tentang polimorfisme CYP2A6*4 pada suku lain

dan dengan jumlah sampel yang lebih besar.


13

DAFTAR PUSTAKA

Badan Pusat Statistik, 2010. Sensus Penduduk 2010 - Indonesia. BPS (Online), http://sp2010.bps.go.id/ diakses tanggal 23 April 2018 pukul 21:39 WIB.

Chenoweth, M.J., O'Loughlin, J., Sylvestre, M., Tyndale, R.F., 2013. CYP2A6 slow nicotine metabolism is associated with increased quitting by adolescent smokers. Pharmacogenet Genomics, 23(4), 232-235.

Elsalam, K.A., 2003. Bioinformatic tools and guideline for PCR primer design. African Journal of Biotechnology, 2(5), 91-95.

Julian, E., 2018. Identifikasi Gen Cyp2a6 Alel *9 Pada Perokok Suku Tionghoa Indonesia Dengan Metode Polymerase Chain Reaction�(PCR). Skripsi. Yogyakarta: Universitas Sanata Dharma. 3.

Georgiadou, C., Lavdaniti, M., Psychogiou, M., Tzenalis, A., Sgantzos, M., Sapountzi-Krepia, D., 2015. Factors Affecting the Decision to Quit Smoking of the Participants of a Hospital-Based Smoking Cessation Program in Greece. Journal of Caring Sciences, 4(1), 1-11.

Ito, T., Tsuji, M., Mori, Y., Kanda, H., Hidaka, T., Kakamu, T., Kumagai, T., Hayakawa, T., Osaki, Y., Fukushima, T., 2015. Effect Of CYP2A6*4 Genetic Polymorphisms on Smoking Behaviors and Nicotine Dependence in a General Population of Japanese Men. Fukushima J. Med, Sci., 61(2), 125-130.

Jaja, C., Burke, W., Thummel, K., Edwards, K., Veenstrea, D.L., 2008. Cytochrome P45O Enzyme Polymorphism Frequency in Indigenous and Native American Population : A Systematic Review. Community Genetics, 11, 141-149.

Kemenkes RI, 2015. InfoDatin Pusat Data dan Informasi Kementerian Kesehatan RI (Online), didownload dari http://www.depkes.go.id/download.php?file=download/pusdatin/infodatin/infodatin-hari-tanpa-tembakau-sedunia.pdf pada tanggal 1 September 2018 pukul 19.57.

Lee, P.Y., Costumbrado, J., Hsu, C.Y., Kim, Y.H., 2012. Agarose Gel Electrophpresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments, 62, 3.

Minematsu, N., Nakamura, H., Furuuchi, M., Nakajima, T., Takahasi, S., Tateno, H., Ishizaka, A., 2006. Limitation of Cigarette Consumption by CYP2A6*4, *7 and *9 Polymorphisms. Eur. Respir. J., 27, 289–292.

Muroi, A., Kiyotani, K., Fujieda, M., Ishikawa, H., Takeshita, T., Iwano, S., Yamazaki, H., Kamataki, T., 2012. Effect of Genetic Polymorphism of CYP2A6 on Individual Susceptibility to Colorectal Tumors in Japanese Smokers. Journal of Cancer Therapy, 3 , 207-208.

Nakajima, Miki., Fukami, T., Yamanaka, H., Higashi, E., Sakai, H., Yoshida, R.,Kwon, J. T., McLeod, H. L., Yokoi, T., 2006. Comprehensive Evaluation of Variability in Nicotine Metabolism and CYP2A6 Polymorphic Alleles in Four Ethnic Populations. Clinical Pharmacology and Therapeutics, 80(3): 282-29.


14

Oscarson, M., Mclellan, R.A., Gullsten, H., Yue, Q., Lang, M.A., Bernal, M.L., Sinues, B., Hirvonen, A., Raunio, H., Pelkonen, O., Sundberg, M.I., 1999. Characterisation and PCR-based Detection of a CYP2A6 Gene Deletion Found at a High Frequency in a Chinese Population. FEBS Lett, 448, 105-110.

Patramurti, C., Sugiyanto, Nurrochmad, A., and Martono, S., 2014. Polymorphism of Cytochrome P450 2A6 (CYP2A6*1 and CYP2A6*4) Among Javanese Indonesian Smoker and Non Smoker. Indonesian Journal of Pharmacy, 26(1), 11-19.

Sellers, E.M., Tyndale, R.F., Fernandes, L.C., 2003. Decreasing Smoking Behaviour and Risk Through CYP2A6 Inhibition. DDT, 8 (11), 487-488.

Sellers, E.M., Tyndale, R.F., 2005. Variable CYP2A6-Mediated Nicotine Metabolism Alters Smoking Behavior and Risk. The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics, 29 (4). 548-552.

Kotta, J.C., 2018. Pengaruh Polimorfisme Gen Sitokrom P450 2a6 Alel *9 Terhadap Ketergantungan Rokok Pada Subjek Uji Suku Tionghoa Indonesia. Skripsi. Yogyakarta: Universitas Sanata Dharma. 4, 31-33.

WHO, 2010. Gender, Women, and the Tobacco Epidemic. WHO (Online), didownload dari http://www.who.int/tobacco/publications/gender/en_tfi_gender_women_addiction_nicotine.pdf?ua=1 pada tanggal 14 September 2018 pukul 17.15 WIB.

WHO, 2018. Tobacco. WHO (Online), http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/tobacco/ diakses pada 2 September 2018 pukul 17.59 WIB.


15

LAMPIRAN


16

Lampiran 1. Ethical Clearance Penelitian


17

Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis


18

Lampiran 3. Usage Information of Go Tag Green Master Mix


19

Lampiran 4. Product Datasheet of Primer Forward and Reverse CYP2A6*4


20

Lampiran 5. Product Datasheet of DNA Ladder and Markers


21

Lampiran 6. Karakteristik Sampel

Nomor sampel Alel Skor FNTD Ketergantungan merokok 1 CYP2A6*1/*9 2 Ketergantungan sangat rendah 2 CYP2A6*4/*9 1 Ketergantungan sangat rendah 3 CYP2A6*1/*1 5 Ketergantungan medium 4 CYP2A6*1/*9 2 Ketergantungan sangat rendah 5 CYP2A6*1/*1 4 Ketergantungan rendah 6 CYP2A6*1/*1 6 Ketergantungan tinggi 7 CYP2A6*1/*4 1 Ketergantungan sangat rendah 8 CYP2A6*1/*4 1 Ketergantungan sangat rendah 9 CYP2A6*1/*1 4 Ketergantungan rendah 10 CYP2A6*1/*1 4 Ketergantungan rendah 11 CYP2A6*1/*1 4 Ketergantungan rendah 12 CYP2A6*1/*1 2 Ketergantungan sangat rendah 13 CYP2A6*4/*9 4 Ketergantungan rendah 14 CYP2A6*1/*1 3 Ketergantungan rendah 15 CYP2A6*4/*9 4 Ketergantungan rendah 16 CYP2A6*1/*9 6 Ketergantungan tinggi 17 CYP2A6*1/*4 5 Ketergantungan medium 18 CYP2A6*1/*1 5 Ketergantungan medium 19 CYP2A6*1/*4 4 Ketergantungan rendah 20 CYP2A6*1/*1 5 Ketergantungan medium 21 CYP2A6*1/*4 4 Ketergantungan rendah 22 CYP2A6*1/*1 2 Ketergantungan sangat rendah 23 CYP2A6*1/*1 3 Ketergantungan rendah 24 CYP2A6*1/*1 4 Ketergantungan rendah 25 CYP2A6*4/*9 3 Ketergantungan rendah 26 CYP2A6*1/*4 1 Ketergantungan sangat rendah 27 CYP2A6*1/*1 4 Ketergantungan rendah 28 CYP2A6*1/*4 5 Ketergantungan medium 29 CYP2A6*1/*1 3 Ketergantungan rendah 30 CYP2A6*1/*4 4 Ketergantungan rendah


22

Lampiran 7. Elektroforegram Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA Suku Tionghoa

M 7 56 4 3 2 1 M 14 13 12 11 10 9 8

M 21 20 19 18 17 16 15 M28272625242322

M2930


23

Lampiran 8. Elektroforegram Produk PCR CYP2A6*4 pada Kondisi Optimum

7654321L 141312111098L


24

Lampiran 9. Elektroforegram Produk PCR CYP2A6*9 pada Kondisi Optimum (Vidi, 2017)


25

Lampiran 10. Frekuensi gen CYP2A6 alel *4,*9, dan *1 pada suku Tionghoa

Alel Jumlah isolat Frekuensi Alel

CYP2A6*1/*1 15 50 %

CYP2A6*1/*4 8 26,67 %

CYP2A6*1/*9 3 10 %

CYP2A6*4/*9 4 13,33 %

- Frekuensi alel *1/*1 = "#$%&'&%)%*+,-./∗12&34567)$#8&3"#$%&'9&$:)%(<=) x 100%

= 1?<= x 100%

= 50 %

- Frekuensi alel *1/*4 = "#$%&'&%)%*+,-./∗@2&34567)$#8&3"#$%&'9&$:)%(<=) x 100%

= A<= x 100%

= 26,67 %

- Frekuensi alel *1/*9 = "#$%&'&%)%*+,-./∗B2&34567)$#8&3"#$%&'9&$:)%(<=) x 100%

= <<= x 100%

= 10 %

- Frekuensi alel *4/*9 = "#$%&'&%)%*+,-./∗@/∗B2&34567)$#8&3"#$%&'9&$:)%(<=) x 100%

= D<= x 100%

= 13,33 %


26

BIOGRAFI PENULIS

Nama lengkap penulis adalah Stella Felina Kiatarto,

dilahirkan di Yogyakarta pada tanggal 12 Febuari 1997.

Merupakan anak ketiga dari tiga bersaudara dari pasangan Lie

Ariana Kiatarto dan Lin Handy Kiatarto. Penulis menempuh

pendidikan TK hingga SMA di kota Yogyakarta, Daerah

Istimewa Yogyakarta, yaitu TK Tarakanita (2001-2003), SD

Tarakanita (2003-2009), SMP Stella Duce (2009-2012), dan

SMA BOPKRI 1 (2012-2015). Penulis melanjutkan studi di

Program Studi S1 Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2015.

Selama masa kuliah penulis aktif dalam kepanitiaan Seminar Nasional tahun 2016

sebagai divisi sponsorship. Selain itu penulis juga berpartisipasi sebagai asisten dosen

praktikum Anatomi Fisiologi Manusia (2018) dan praktikum Biokmia (2018).


identifikasi gen sitokrom cyp2a6 alel *4 pada isolat …

Documents