optimasi dan validasi kondisi polymerase … · diajukan untuk memenuhi salah satu syarat ......

i

OPTIMASI DAN VALIDASI KONDISI POLYMERASE CHAIN REACTION

PADA IDENTIFIKASI CYP2A6*9

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Cindy

NIM : 138114127

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2017

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii



SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Cindy

NIM : 138114127

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2017


iii

Persetujuan Pembimbing



Skripsi yang diajukan oleh :

Cindy

NIM : 138114127

telah disetujui oleh

Pembimbing

( Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt.) tanggal 18 November 2016


iv

Pengesahan Skripsi Berjudul



Oleh :

Cindy

NIM : 138114127

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

pada tanggal 4 Januari 2017

Mengetahui

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Dekan

(Aris Widayati, Ph.D., Apt.)

Panitia Penguji : Tanda tangan

1. Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt. .......................

2. Damiana Sapta Candrasari, M.Sc. .......................

3. Maywan Hariono, Ph.D., Apt. .......................


v

HALAMAN PERSEMBAHAN

我的世界

For My Soul,

Papa, Mama, Hendrikus, Diana Fransiska,

Lidya Natalia, Steven and Kevin,

who let me write my own story.


vi

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :

Nama : Cindy

Nomor Mahasiswa : 138114127

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :



beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan

kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me-

ngalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data,

mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media

lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun

memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai

penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal : 18 November 2016

Yang menyatakan

( Cindy )


vii

PRAKATA

Penulis menghaturkan puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa,

karena atas berkat dan rahmat-Nya, penulis dapat menyelesaikan skripsi yang

berjudul "Optimasi dan Validasi Kondisi Polymerase Chain Reaction pada

Identifikasi CYP2A6*9" untuk memenuhi persyaratan memperoleh gelar Sarjana

Farmasi (S. Farm) Program Studi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma.

Penyusunan skripsi ini tidak terlepas dari dukungan berbagai pihak. Pada

kesempatan ini, penulis menyampaikan terima kasih kepada:

1. Ibu Aris Widayati, Ph. D., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma

2. Ibu Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing atas

segala bimbingan, saran, dan nasihat kepada penulis

3. Ibu Damiana Sapta Candrasari, M.Sc., selaku dosen penguji atas bantuan,

kritik dan saran kepada penulis

4. Bapak Maywan Hariono, Ph. D., Apt., selaku dosen penguji atas bantuan,

kritik dan saran kepada penulis

5. Bapak Jeffry Julianus, M. Si., atas segala ilmu, bimbingan, motivasi, dan

dukungan kepada penulis

6. Ibu Dita Maria Virginia, M. Sc., Apt., selaku Dosen Pembimbing

Akademik penulis

7. Ibu dr. Elsa Herdiana Murhandarwati, M. Kes., Ph. D., selaku supervisor

penulis selama penelitian di Laboratorium Parasitologi Fakultas

Kedokteran UGM

8. Ibu Rumbiwati, M.Sc., selaku teknisi Laboratorium Parasitologi Fakultas

Kedokteran UGM atas bantuan dan petunjuk selama penelitian

9. Sr. Yenny Baptista, KFS atas segala bantuan dan dukungan sejak penulis

berada di bangku SMP

10. Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan Republik Indonesia atas Program

Beasiswa yang diberikan kepada penulis


viii

11. Segenap civitas akademika Universitas Sanata Dharma yang telah

memberikan wawasan dan motivasi kepada penulis selama perkuliahan

12. Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma periode 2014, 2015, 2016

13. Keluarga tercinta yang telah memberikan segalanya kepada penulis

14. Sahabat sejak semester pertama: Jessy Florensia, Indriyani Permatasari,

Regina Hiacinta Eva Angelista, dan Putu Ririn Andreani

15. "Tim PICS Sadhar": Kenny Kowira, Bernadetta Inez Ludwinia, Yolanda

Tyas Prameswari, dan Donny Soeparto

16. MCL: Jonathan Ronny Kurniawan, dan Suryatmoko Agung

17. Partner lomba: Pricella, Erica Kusuma Rahayu Sudarsono

18. Kirana Andranilla, Ivana Tunggal, Monita Natalia Siregar, Ineke

Andrayani, Nadia Okky Luciana, Trensia Imel atas kebaikan dan ketulusannya

19. Teman-teman FSM C 2013 dan FST 2013, beserta seluruh teman-teman

angkatan 2013 Prodi S1 Farmasi Universitas Sanata Dharma atas segala

proses dan dinamika bersama selama masa perkuliahan

20. Seluruh pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu atas bantuan secara

langsung maupun tidak langsung selama penyusunan skripsi

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih memiliki banyak kekurangan

sehingga segala saran, kritik dan masukan sangat diharapkan. Penulis berharap

skripsi ini dapat bermanfaat dalam perkembangan ilmu pengetahuan, khususnya

di bidang kesehatan.

Yogyakarta, 18 November 2016

Penulis


ix

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini

tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan

dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah ini,

maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-

undangan yang berlaku.

Yogyakarta, 18 November 2016

Penulis

(Cindy)


x

DAFTAR ISI

HALAMAN SAMPUL....................................................................................... i

HALAMAN JUDUL........................................................................................... ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING................................................. iii

HALAMAN PENGESAHAN............................................................................ iv

HALAMAN PERSEMBAHAN......................................................................... v

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI............................................... vi

PRAKATA......................................................................................................... vii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA............................................................ ix

DAFTAR ISI...................................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR.......................................................................................... xi

DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... xii

ABSTRAK.......................................................................................................... xiii

ABSTRACT.......................................................................................................... xiv

PENDAHULUAN............................................................................................. 1

METODE PENELITIAN................................................................................. 3

HASIL DAN PEMBAHASAN......................................................................... 5

KESIMPULAN................................................................................................. 10

DAFTAR PUSTAKA........................................................................................ 11

LAMPIRAN...................................................................................................... 14

BIOGRAFI PENULIS....................................................................................... 32


xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik

elektroforesis..................................................................................................... 6

Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen CYP2A6*9...................... 7

Gambar 3. Produk PCR pada berbagai suhu annealing dan siklus

Amplifikasi........................................................................................................ 7

Gambar 4. Elektroforegram produk PCR pada kondisi optimum dari

berbagai isolat DNA......................................................................................... 9

Gambar 5. Urutan nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan

CYP2A6*9........................................................................................................ 9


xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Ethical clearance........................................................................... 15

Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis....................... 16

Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix....................... 17

Lampiran 4. Product Datasheet of DNA Ladder & Markers............................ 18

Lampiran 5. Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA menggunakan Teknik

Elektroforesis...................................................................................................... 19

Lampiran 6. Hasil PCR pada Optimasi Volume Primer.....................................20

Lampiran 7. Simulasi Penempelan Primer pada CYP2A6*1 dengan NCBI....... 21

Lampiran 8. Hasil Uji Reprodusibilitas PCR.................................................... 22

Lampiran 9. Hasil Sekuensing Produk PCR...................................................... 23

Lampiran 10. Tahapan manual editing pada BioEdit.......................................... 24

Lampiran 11. Hasil manual editing pada BioEdit.............................................. 27


xiii

ABSTRAK

CYP2A6 merupakan anggota famili CYP2 dari sitokrom P450 dan diketahui memiliki polimorfisme yang tinggi. CYP2A6*9 merupakan alel CYP2A6 yang mengalami mutasi titik pada TATA box (T-48G) pada ujung '5 sehingga menyebabkan penurunan aktivitas. Adanya polimorfisme pada CYP2A6 dapat dideteksi dengan menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Adapun parameter penting yang mempengaruhi spesifisitas reaksi dalam PCR antara lain suhu penempelan primer (annealing) dan jumlah siklus amplifikasi.

Primer forward, primer reverse dan reagen yang digunakan dalam penelitian ini berturut-turut adalah 5'-GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3', 5'-GGC TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3', dan Promega Go Taq Green Master Mix. Suhu annealing dioptimasi dengan pengaturan pada suhu 56oC, 60oC, dan 64oC, sedangkan siklus amplifikasi pada 25 siklus dan 30 siklus.

Adapun kondisi PCR optimum yang didapatkan: initial denaturation pada suhu 94oC selama 3 menit; diikuti dengan 30 siklus terdiri dari denaturation pada suhu 94oC selama 30 detik, annealing pada suhu 60oC selama 30 detik, dan extension pada suhu 70oC selama 25 detik; kemudian diakhiri dengan final extension pada suhu 72oC selama 5 menit. Kondisi ini memenuhi parameter spesifisitas dan reprodusibilitas pada validasi metode analisis.

Kata kunci: CYP2A6*9, CYP2A6*1, PCR, optimasi, validasi


xiv

ABSTRACT

CYP2A6 belongs to the CYP2 family of P450 cytochromes is known

having a high polymorphism. CYP2A6*9 is an allel of CYP2A6 having point of mutation in TATA box (T-48G) that reduced its activity. The polymorphism of CYP2A6 could be determined using polymerase chain reaction (PCR). There have been a few parameters important for reaction specificity in PCR including annealing temperatures and amplification cycles number.

5'-GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3', 5'-GGC TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3', and Promega Go Taq Green Master Mix were used as the forward primer, the reverse primer, and the reagent in these study, respectively. The annealing temperature were optimized by adjusting the temperature at 56oC, 60oC, and 64oC, while the amplification cycles were at 25 cycles and 30 cycles.

The PCR was carried out under the following conditions: initial denaturation at 94oC for 3 minutes; 30 cycles of denaturation at 94oC for 30 seconds, annealing at 60oC for 30 seconds, and extension at 70oC for 25 seconds; and subsequently a final extension at 72oC for 5 minutes. These conditions met parameters of specificity and reproducibility on analytical method validation.

Keywords: CYP2A6*9, CYP2A6*1, PCR, optimize, validation


1

PENDAHULUAN

Sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) merupakan gen yang mengekspresikan enzim

CYP2A6 dan diketahui memiliki polimorfisme yang tinggi. Polimorfisme didefinisikan

sebagai variasi bentuk dari gen yang menghasilkan dua atau lebih varian dan masing-masing

varian memiliki frekuensi yang cukup tinggi (Maggert, 2012). Saat ini terdapat 80 jenis

bentuk polimorfi CYP2A6 yang sudah berhasil diidentifikasi (Sim, 2014). Adanya

polimorfisme CYP2A6 akan mempengaruhi aktivitas enzim pada metabolisme senyawa

xenobiotik dalam tubuh, baik dengan menurunkan, menghilangkan atau meningkatkan

aktivitas enzim (Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012).

Enzim CYP2A6 bertanggungjawab utama dalam metabolisme nikotin, suatu

senyawa yang terkandung dalam rokok (Bloom et al., 2011) dan berperan utama terhadap

timbulnya efek ketergantungan fisik terhadap rokok (Baurley et al., 2016). Seorang perokok

akan mengalami ketergantungan fisik terhadap rokok karena mempertahankan kadar nikotin

dalam plasma sehingga dapat memberi efek psikoaktif yang berkelanjutan (Bloom et al.,

2011). Enzim CYP2A6 memetabolisme nikotin menjadi kontinin, yang selanjutnya akan

diubah menjadi 3-hidroksikotinin sebagai metabolit tidak aktif (Park et al., 2016). Enzim

CYP2A6 turut berpartisipasi dalam metabolisme beberapa senyawa kimia, baik senyawa

obat maupun senyawa toksik. Pada umumnya, substrat CYP2A6 relatif polar, dengan berat

molekul rendah hingga sedang. Contoh substrat CYP antara lain kumarin, nikotin,

metoksifluran, pilokarpin dan efavirenz. Beberapa senyawa prokarsinogen golongan

N-nitrosamin dimetabolisme oleh CYP2A6, terutama senyawa spesifik pada tembakau,

yaitu 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanon (NNK) yang dapat diaktivasi menjadi

senyawa intermediet melalui reaksi hidroksilasi alfa, yang dapat menyebabkan timbulnya

kanker pada jaringan yang terpapar pada asap rokok, yaitu paru-paru dan laring (Raunio and

Rahnasto-Rilla, 2012).

Polimorfisme CYP2A6 banyak ditemukan pada orang-orang Asia dengan frekuensi

alel non aktif yang tinggi (Peamkrasatam et al., 2006; Yusof and Gan, 2009). Pada

penelitian genotip enzim CYP2A6 terhadap subyek uji perokok dan bukan perokok suku

Jawa Indonesia, diperoleh data bahwa pada populasi yang diteliti ditemukan bentuk alel

nonaktif CYP2A6*4 dengan frekuensi yang tinggi. Sebanyak 95% dari subyek uji yang

diteliti mempunyai bentuk genotip lain dikategorikan sebagai slow metabolizer (Patramurti

et al., 2014). Hasil penelitian menunjukkan bahwa adanya alel non aktif CYP2A6*9 pada


2

suatu individu akan menurunkan aktivitas CYP2A6 pada metabolisme nikotin dibandingkan

CYP2A6 normal (Yoshida et al., 2003). Seorang perokok yang memiliki alel CYP2A6*9

akan mengalami penurunan ketergantungan fisik terhadap rokok untuk mempertahankan

kadar nikotin dalam plasma sehingga tidak memerlukan peningkatan dosis untuk mendapat

efek yang sama (Minematsu et al., 2006) yang dapat menurunkan risiko terjadinya berbagai

jenis penyakit kanker yang disebabkan oleh asap rokok (Kadlubar et al., 2009; Liu et al.,

2013; Wang et al., 2013), sehingga penelitian mengenai identifikasi CYP2A6*9 perlu

dilakukan.

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan metode yang dapat digunakan untuk

mendeteksi adanya polimorfisme pada suatu gen. PCR merupakan metode molekuler untuk

menggandakan potongan DNA hingga berjuta kali lipat dalam waktu yang relatif singkat.

Penggandaan tersebut tidak terlepas dari penggunaan enzim dan sepasang primer bersifat

spesifik terhadap DNA target yang akan dilipatgandakan (Joko et al., 2011). PCR mampu

mengamplifikasi suatu fragmen gen pada templat DNA berdasarkan primer tertentu

sehingga dapat diidentifikasi suatu alel dalam sampel DNA (Rahman et al., 2013). Secara

garis besar, PCR terdiri dari tiga tahapan utama, yaitu tahap denaturasi templat DNA

(denaturation), tahap penempelan primer (annealing) dan tahap pemanjangan DNA

(extension). Produk PCR yang dihasilkan dipengaruhi oleh parameter-parameter yang

berkontribusi dalam proses PCR, antara lain sepasang primer, dNTPs, buffer PCR, MgCl2,

dan enzim polimerase DNA. Ketepatan primer, suhu annealing, dan jumlah siklus

amplifikasi merupakan faktor-faktor kritis pada kondisi PCR yang dapat mempengaruhi

produk PCR (Ishmael and Stellato, 2008). Adanya penggunaan PCR dengan kondisi yang

tidak optimum akan menghasilkan produk yang tidak sesuai dengan produk target, atau

bahkan tidak menghasilkan produk (Roux, 2009). Oleh karena itu, optimasi kondisi PCR

menjadi penting untuk dilakukan.

Pengembangan metode dilakukan melalui tahapan optimasi dan validasi metode.

Optimasi metode dilakukan untuk memastikan parameter-parameter penting dalam metode

dapat memberikan hasil optimum. Optimasi metode PCR perlu dilakukan untuk

mengefisienkan waktu dan bahan sehingga proses deteksi dapat dilakukan dengan cepat dan

tepat (Joko et al., 2011). Dalam penelitian ini dilakukan optimasi suhu annealing dan jumlah

siklus amplifikasi PCR dengan cara memvariasikan suhu annealing dan jumlah siklus

amplifikasi PCR sehingga didapatkan kondisi yang paling sesuai untuk mendapatkan

fragmen gen CYP2A6*1. Adanya gen CYP2A6*1 pada subyek uji menunjukkan subyek uji


3

memiliki gen CYP2A6 normal yang tidak mengalami polimorfisme berupa Single

Nucleotide Polymorphism (SNP) pada TATA box menjadi CYP2A6*9 (Pitarque et al., 2001).

Validasi metode dilakukan untuk memastikan bahwa hasil yang didapatkan dari metode

optimum telah sesuai dengan tujuan penggunaannya (World Organization of Animal Health,

2013). Validasi metode dalam penelitian ini dilakukan dengan cara sekuensing produk PCR

(parameter spesifisitas) dan memastikan kondisi PCR yang digunakan mampu memberikan

hasil yang reprodusibel (parameter reprodusibilitas). Visualisasi produk PCR dilakukan

dengan teknik elektroforesis. Penelitian ini bertujuan untuk menetapkan kondisi optimum

PCR pada identifikasi alel CYP2A6*9 melalui ketiadaan alel CYP2A6*1 serta menetapkan

validitas dari metode tersebut. Penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai acuan pada

identifikasi alel CYP2A6*9 melalui ketiadaan alel CYP2A6*1 menggunakan metode PCR

dan memberikan kontribusi dalam perkembangan ilmu kesehatan.

METODE PENELITIAN

Jenis dan Rancangan Penelitian. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental

analitik murni dengan rancangan acak lengkap pola searah. Pada penelitian ini terdapat

variabel bebas, variabel tergantung dan variabel pengacau terkendali. Variabel bebas dalam

penelitian ini adalah suhu annealing dan jumlah siklus amplifikasi. Variabel tergantung

dalam penelitian ini adalah produk PCR yang dideteksi dengan elektroforesis. Variabel

pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kemurnian isolat DNA total dan jenis

reagen yang digunakan. Dalam penelitian ini dilakukan perlakuan pada subyek uji isolat

DNA dan dipaparkan peristiwa yang terjadi akibat perlakuan sehingga terdapat hubungan

sebab akibat antara variabel bebas dan variabel tergantung.

Bahan. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat DNA dari

populasi suku Jawa Indonesia yang pernah diteliti oleh Patramurti et al. (2014), primer

forward: 5'-GATTCCTCTCCCCTGGAAC-3', primer reverse: 5'-GGCTGGGGTGGTTTG

CCTTTA-3', Promega Go Taq Green Master Mix (berisi Taq DNA Polymerase, dNTPs,

MgCl2, dan buffer), Nuclease-Free Water (Promega), Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer pH

7 (Geneaid), 1% dan 1,5% gel agarose (Geneaid), larutan ethidium bromide (Geneaid) 0,44

mg/mL, 100 bp DNA Ladder (Geneaid), blue orange DNA loading dye (Geneaid), etanol

96% (Sigma Chemical Co., St. Louis), aqua bidestilata steril (Ikapharmindo).

Alat. Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Thermal cycler (Perkin


4

Elmer 2400), satu set Elektroforesis (Biorad), UV Transilluminator (Fisher Scientific),

microwave (National), mikrosentrifuge (Fisher Scientific), kamera Polaroid.

Analisis Kualitatif Isolat DNA. Elektroforesis menggunakan agarose 1,0 %

dilakukan dengan cara 1,5 g agarose dilarutkan dalam larutan 0,5 x TBE sebanyak 100 mL

lalu dipanaskan dalam microwave selama dua menit sampai semua agarose larut kemudian

ditambahkan 5 µL larutan EtBr dan dicampur hingga homogen. Larutan dituang ke dalam

cetakan gel, diberi sisiran pada tepi gel dan gel dibiarkan mengeras. Sisir dicabut setelah

gel mengeras sehingga terbentuk sumur-sumur. Isolat DNA sebanyak 5,0 µL (kadar 50 ng)

ditambahkan dengan aquabidest sebanyak 2,0 µL, kemudian dicampur dengan loading dye

sebanyak 1,0 µL. Campuran tersebut diambil sejumlah 7,0 µL dan dimasukkan ke dalam

sumur-sumur gel menggunakan mikropipet. Satu sumur gel diisi dengan 100 bp DNA

ladder sebanyak 2 µL sebagai marker. Gel agarose ini kemudian ditempatkan ke dalam gel

tray elektroforesis yang sudah berisi larutan bufer 0,5 x TBE dan diberi tegangan 100 volt

selama 30 menit, molekul DNA yang bermuatan negatif pada pH netral akan bergerak ke

arah positif. Gel agarose kemudian dideteksi di bawah lampu UV dan didokumentasikan

menggunakan kamera Polaroid. Panjang pita DNA dapat diketahui dengan cara menarik

garis lurus masing-masing pita sampel DNA dengan posisi pita DNA ladder.

Optimasi kondisi PCR pada amplifikasi CYP2A6. Untuk mendapatkan

fragmen DNA dari alel CYP2A6*9 dilakukan amplifikasi dengan menggunakan primer

yang diadopsi Yoshida et al. (2003), yaitu primer forward: 5'-GAT TCC TCT CCC CTG

GAA C-3', primer reverse: 5'-GGC TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3'. Optimasi reaksi

PCR dilakukan menggunakan Promega Go Taq Green Master Mix. Kadar genomik DNA

yang digunakan kira-kira 50 ng dengan volume akhir campuran 25 μL (reagent 12,5 μL,

primer forward 1,25 μL, primer reverse 1,25 μL, isolat DNA 5,0 μL, Nuclease-Free Water 5

μL). Penentuan rentang suhu annealing dan jumlah siklus amplifikasi yang dioptimasi

dilakukan berdasarkan penelitian Patramurti et al. (2014). Amplifikasi dilakukan dengan

mesin PCR (Thermal cycler Perkin Elmer 2400). Kondisi PCR digunakan adalah sebagai

berikut: initial denaturasi pada suhu 94˚C (3’); dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu

94˚C (30”); annealing pada suhu 56˚C, 60oC, dan 64˚C (30”) dan ekstensi pada suhu 70˚C

(25”). Siklus amplifikasi tersebut dilakukan sebanyak 25 dan 30 kali dan selanjutnya

diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72˚C (5’). Kondisi optimum PCR ditentukan

dengan cara melihat suhu annealing dan jumlah siklus yang dapat mengamplifikasi alel

CYP2A6*1 berdasarkan hasil produk PCR yang terdeteksi pada elektrofotogram dengan


5

ukuran 368-bp. Adanya gen CYP2A6*1 pada subyek uji menunjukkan subyek uji memiliki

gen CYP2A6 normal yang tidak mengalami polimorfisme menjadi CYP2A6*9.

Analisis Produk PCR menggunakan Teknik Elektroforesis. Untuk melihat

keberhasilan amplifikasi dilakukan elektroforesis dengan fase diam agarosa 1,5% yang telah

diwarnai dengan ethidium bromide dan dievaluasi menggunakan lampu UV. DNA yang

terekspresi didokumentasi dengan kamera Polaroid. Produk PCR alel normal, yaitu alel

CYP2A6*1 berada pada pita 368-bp (Yoshida et al, 2003).

Validasi Metode PCR. Validitas metode PCR dilakukan dengan menguji

parameter reprodusibilitas dan spesifisitas produk PCR. Metode PCR memenuhi parameter

reprodusibilitas bila dihasilkan elektroforegram yang sama pada 368-bp dari produk PCR

sampel isolat DNA yang berbeda. Metode PCR memenuhi parameter spesifisitas bila urutan

nukleotida produk PCR pada 368-bp sesuai dengan urutan nukleotida CYP2A6*1 pada

GenBank. Spesifisitas ditetapkan dengan melakukan sekuensing produk PCR di Macrogen,

Singapore. Hasil sekuensing dilakukan manual editing menggunakan program BioEdit.

Runutan nukleotida yang dihasilkan disejajarkan dengan runutan nukleotida CYPA6 dari

Genbank menggunakan Clustal W yang terdapat pada program BioEdit.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Studi polimorfisme pada CYP2A6 pada penelitian ini dilakukan dalam empat

tahapan, yaitu analisis kualitatif isolat DNA, optimasi PCR pada amplifikasi CYP2A6*1,

analisis produk PCR menggunakan teknik elektroforesis, dan validasi metode PCR. PCR

merupakan salah satu metode yang dapat digunakan untuk mendeteksi adanya variasi

genetik di dalam suatu populasi. Alel CYP2A6*9 merupakan jenis alel yang diidentifikasi

pada penelitian ini. Pemilihan alel CYP2A6*9 didasarkan pada adanya frekuensi alel slow

metabolizer seperti CYP2A6*9 yang sangat tinggi pada populasi Asia, terutama pada

populasi oriental (Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012).

Analisis kualitatif isolat DNA. Isolat DNA yang digunakan pada penelitian ini

merupakan isolat DNA yang pernah diteliti oleh Patramurti et al. (2014). Isolat DNA

dianalisis secara kualitatif menggunakan teknik elektroforesis (Broeders et al., 2014). Hasil

elektroforesis menunjukkan adanya variasi bentuk pita, baik pita tunggal dan tebal, maupun

pita ganda dan tipis dengan ukuran lebih dari 3000 bp (Gambar 1). Adanya variasi bentuk

pita dapat disebabkan karena adanya isolat DNA yang tidak murni, tercemar (Patramurti et


6

al., 2014) atau terdegradasi (ECJRC, 2012). Adapun isolat DNA yang dipilih untuk

digunakan dalam penelitian adalah isolat DNA yang menghasilkan pita tunggal dan tebal

dengan ukuran lebih dari 3000 bp, yang menunjukkan bahwa isolat DNA yang digunakan

masih dalam keadaan murni, tidak tercemar oleh protein lain serta tidak terdegradasi

(Patramurti et al., 2014).

M 1 2 3 4 5 6 7 8

3000

1500

1000

500

200

100

Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik elektroforesis

Keterangan:

M : 100 bp DNA Ladder (Geneaid) sebagai marker

1-3, 8 : Isolat DNA dengan pita tipis dan tunggal

4 : Isolat DNA dengan pita tipis dan ganda

5 : Isolat DNA dengan pita tebal dan ganda

6-7 : Isolat DNA dengan pita tebal dan tunggal

Kondisi Elektroforesis : Fase diam agarose 1%; Fase Gerak Larutan TBE 0,5%; Kecepatan 100 V/cm;

Vol. Injeksi 6 μL

Optimasi Kondisi PCR pada Amplifikasi CYP2A6. Identifikasi alel dari

CYP2A6*9 pada penelitian ini mengadopsi dari penelitian yang pernah dilakukan oleh

Yoshida et al. (2003). Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi alel CYP2A6*1

adalah primer forward: 5'-GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3' dan primer reverse:

5'-GGC TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3'. Spesifisitas primer akan menentukan

keberhasilan proses PCR, karena spesifisitas menentukan kemampuan primer untuk

menempel pada sekuen target pada isolat DNA (McPherson and Moller, 2006). Amplifikasi

alel CYP2A6*1 menggunakan primer forward 5'-GATTCCTCT CCC CTG GAA C-3' akan

mengamplifikasi ekson 395 sampai 376, sedangkan primer reverse 5'-GGC TGG GGT

GGT TTG CCT TTA-3' akan mengamplifikasi ekson 48 sampai 28 dari gen CYP2A6*1

Isolat DNA


7

(Yoshida et al., 2003). Amplifikasi gen CYP2A6 menggunakan primer tersebut

menghasilkan produk PCR yang berukuran 368-bp yang merupakan produk dari alel

CYP2A6*1. Situs penempelan primer pada sekuen urutan basa potongan gen CYP2A6*1

pada daerah yang diamplifikasi disimulasikan dengan http://ncbi.nlm.nih.gov/ dan

diilustrasikan seperti pada Gambar 2.

Alel CYP2A6*1

Primer forward

5' 3' GATTCCTCTCCCCTGGAAC TAAAGGCAAACCACCCCAGCC

CTAAGGAGAGGGGACCTTG ATTTCCGTTTGGTGGGGTCGG

5' 3'

Primer reverse

Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen CYP2A6*1

Keterangan:

: arah penempelan primer forward

: arah penempelan primer reverse

Penggunaan suhu annealing dengan jumlah siklus amplifikasi berturut-turut 56oC, 25

siklus; 56oC, 30 siklus; 64

oC, 30 siklus belum dapat mengamplifikasi CYP2A6 seperti yang

dikehendaki. Hal ini dapat dilihat pada hasil elektroforegram yang ditunjukkan pada Gambar

3, yaitu adanya produk PCR yang tipis, tidak terlihat jelas, dan adanya pita DNA berukuran

selain 368-bp pada elektroforesis. Penggunaan suhu annealing 60oC dan jumlah siklus

amplifikasi 30 siklus telah mampu mengamplifikasi CYP2A6 seperti yang dikehendaki,

karena menghasilkan satu produk PCR spesifik, dengan pita DNA tebal dan berukuran

368-bp pada elektroforesis (Stephenson and Abilock, 2012).

Penggunaan suhu annealing 56oC dan 64

oC menyebabkan terbentuknya pita DNA

berukuran selain 368-bp. Hal ini dapat disebabkan karena suhu annealing tidak sesuai untuk

menempelkan primer pada DNA target, sehingga primer tidak menempel pada DNA target

(Rahman et al., 2013) atau terjadi mispriming (McPherson and Moller, 2006), yang

menghasilkan pita DNA selain pita berukuran 368-bp. Jumlah siklus amplifikasi sebanyak

25 siklus telah mampu menghasilkan produk PCR, namun pita yang dihasilkan belum

berupa pita tebal. Hal ini disebabkan karena pada amplifikasi 25 siklus, reaksi belum terjadi

secara optimal (Innis, M.A., and Gelfand, D.H., 1990) sehingga masih terdapat primer yang

tersisa. Adanya primer yang tersisa terlihat pada elektroforegram (Gambar 3). Pada jumlah

siklus amplifikasi 30, primer digunakan untuk menggandakan DNA secara optimal sehingga

tidak terlihat sisa primer pada elektroforegram. Oleh karena itu, suhu annealing dan jumlah

sikus amplifikasi yang optimum untuk amplifikasi CYP2A6 menggunakan primer forward:


http://ncbi.nlm.nih.gov/

8

5'-GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3' dan primer reverse: 5'-GGC TGG GGT GGT TTG

CCT TTA-3'berturut-turut adalah 60oC dan 30 siklus.

1 1 2 2 B M 3 3 4 4

3000

1500

1000

500

300

200

100

Gambar 3. Produk PCR pada berbagai suhu annealing dan siklus amplifikasi

Keterangan:

1 : 64O

C, 30 siklus

2 : 60O

C, 30 siklus

3 : 56O

C, 30 siklus

4 : 56O

C, 25 siklus

B : Kontrol Negatif


Kondisi Elektroforesis : Fase diam Agarose 1,5%; Fase Gerak Larutan TBE 0,5%; Kecepatan 100

V/cm; Vol. Injeksi 6 μL

Validasi Metode PCR. Validitas metode PCR ditentukan dengan menguji

reprodusibilitas dan spesifisitas produk PCR. Reprodusibilitas dari reaksi kondisi

amplifikasi alel CYP2A6*1 menggunakan primer forward: 5'-GAT TCC TCT CCC CTG

GAA C-3' dan primer reverse: 5'-GGC TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3' pada kondisi

optimum ini dapat dilihat dari hasil reaksi PCR sepuluh sampel isolat DNA yang berbeda,

di mana pada semua sampel menghasilkan satu produk PCR yang sama dengan panjang

pita 368 bp (Gambar 4). Kontrol negatif yang berisi campuran yang digunakan pada PCR

tanpa isolat DNA (reagent 12,5 μL, primer forward 1,25 μL, primer reverse 1,25 μL,

Nuclease-Free Water 10 μL) tidak menghasilkan pita DNA pada 368-bp yang

menunjukkan bahwa campuran tersebut tidak mempengaruhi produk PCR. Dari hasil

pengujian, dapat ditetapkan bahwa kondisi optimum PCR tersebut telah memenuhi

parameter reprodusibilitas.

produk PCR 368 bp

primer tersisa

produk PCR mispriming


9

B 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10

3000

1500

1000

500

300

200

100

Gambar 4. Elektroforegram produk PCR pada kondisi optimum dari berbagai isolat DN

Keterangan:


B : kontrol negatif

1-10 : Produk PCR dari berbagai isolat DNA yang berbeda



Spesifisitas PCR ditetapkan melalui sekuensing produk PCR (Broeders et al., 2014).

Pembacaan sekuen merupakan hal penting dan utama dalam biologi molekuler karena

dapat mengetahui komposisi nukleotida suatu gen. Hasil sekuensing urutan basa potongan

alel gen menunjukkan bahwa produk PCR memiliki urutan basa yang sama dengan urutan

basa alel CYP2A6*1 menurut GenBank. Hal ini menunjukkan bahwa kondisi optimum

PCR telah memenuhi parameter spesifisitas. Pada hasil sekuensing produk PCR terlihat

bahwa urutan basa alel CYP2A6*1 mempunyai perbedaan sebanyak 1-bp terhadap alel

CYP2A6*9, yang disebabkan oleh adanya single nucleotide polymorphism (SNP) T-48G

pada CYP2A6 (Gambar 5). Adanya perbedaan urutan basa antara alel CYP2A6*9 dan

CYP2A6*1 menyebabkan primer forward: 5'-GATTCCTCTCCCCTGGAAC-3' dan primer

reverse: 5'-GGCTGGGGTGGTTTGCCTTTA-3' mengamplifikasi alel CYP2A6*1 secara

spesifik. Adanya perbedaan urutan basa tersebut mengakibatkan terjadinya perbedaan

urutan asam amino yang dikode oleh kedua alel, yang menyebabkan alel CYP2A6*9

mengalami penurunan aktivitas dalam mengekspresikan enzim CYP2A6 (Pitarque et al.,

2001).

A. CYP2A6*1 GGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGC

B. CYP2A6*1 TGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGC

C. CYP2A6*9 GGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGC

produk PCR 368 bp


10

A. CYP2A6*1 ATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTA

B. CYP2A6*1 ATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTA

C. CYP2A6*9 ATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTA

A. CYP2A6*1 TGCAAATATTCCAAACTCCTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCC

B. CYP2A6*1 TGCAAATATTCCAAACTCCTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCC

C. CYP2A6*9 TGCAAATATTCCAAACTCCTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCC

A. CYP2A6*1 CCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAAGTACCACA

B. CYP2A6*1 CCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAAGTACCACA

C. CYP2A6*9 CCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAAGTACCACA

A. CYP2A6*1 GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCC

B. CYP2A6*1 GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCC

C. CYP2A6*9 GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCC

A. CYP2A6*1 CCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCA

B. CYP2A6*1 CCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCA

C. CYP2A6*9 CCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCA

A. CYP2A6*1 TGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAAT

B. CYP2A6*1 TGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAAT

C. CYP2A6*9 TGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAAGGAGGTAATTATGTAAT

A. CYP2A6*1 CAGCCAAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTATAAAGGCAAACC

B. CYP2A6*1 CAGCCAAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTATAAAGGCAAACC

C. CYP2A6*9 CAGCCAAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTAGAAAGGCAAACC

A. CYP2A6*1 ACCCCAGCCG

B. CYP2A6*1 ACCCCAGCCA

C. CYP2A6*9 ACCCCAGCC Gambar 5. Urutan nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*9 (perbedaan 1-bp

ditunjukkan oleh warna hijau dan kuning, primer ditunjukkan oleh warna merah)

Keterangan :

A : potongan urutan basa CYP2A6*1 menurut Gen Bank

B : urutan basa konsensus CYP2A6*1 hasil sekuens

C : urutan basa CYP2A6*9 menurut teori Yoshida et al (2003)

KESIMPULAN

Kondisi optimum PCR pada identifikasi CYP2A6*9 menggunakan primer forward

5'-GATTCCTCTCCCCTGGAAC-3' dan primer reverse 5'-GGCTGGGGTGGTTTG

CCTTTA-3' dengan Promega Go Taq Green Master Mix adalah sebagai berikut: initial

denaturation 94oC

(3 menit); 30 siklus terdiri dari denaturation 94

oC (30 detik), annealing

60oC (30 detik), extension 70

oC (25 detik); diakhiri final extension 72

oC (5 menit). Kondisi

ini memenuhi parameter spesifisitas dan reprodusibilitas pada validasi metode analisis.


11

DAFTAR PUSTAKA

Baurley, J.W., Edlund, C.K., Pardamean, C.I., Conti, D.V., and Bergen, A.W., 2016,

Smokescreen: A Targeted Genotyping Array for Addiction Research, BMC Genomics,

17, 1-12.

Bloom, A.J., Hinrichs, A.L., Wang, J.C., Von-Weymarn, L.B., Kharasch, E.D.,Bierut, L.J., et

al, 2011, The Contribution of Common CYP2A6 Alleles to Variation in Nicotine

Metabolism Among European Americans, Pharmacogenetic Genomics, 21(7),

403-416.

Broeders, S., Huber, I., Grohmann, L., Berben, G., Taverniers, I., Mazzara, M., Roosens, N.,

and Morisset, D., 2014, Guidelines for Validation of Qualitative Real-Time PCR

Mehods, Trends in Food Science & Technology, 37, 115-126.

European Commission Joint Research Centre, 2012, Report on the Single-Laboratory

Validation of A PCR-Based Detection Method for Identification of FlorigeneTM

IFD-25958-3 GM Carnation, EU-RL GMFF, 1-15.

Ishmael, F.T., and Stellato, C., 2008, Principles and Applications of Polymerase Chain

Reaction: Basic Science for The Practicing Physician, Annals of Allergy, Asthma, and

Immunology, 101, 437-443.

Joko, T., Kusumandari, N., and Hartono, S., 2011, Optimasi Metode PCR untuk Deteksi

Pectobacterium carotovorum, Penyebab Penyakit Busuk Lunak Anggrek, Jurnal

Perlindungan Tanaman Indonesia, 17(2), 54-59.

Kadlubar, S., Anderson, J.P., Sweeney, C., Gross, M.D, Lang, N.P., Kadlubar, F.F. et al, 2009,

Phenotypic CYP2A6 Variation and the Risk of Pancreatic Cancer, Journal of the

Pancreas, 10(3), 263–270.

Liu, Y., Xu, Y., Li, F., Chen, H., and Guo, S., 2013, CYP2A6 Deletion Polymorphism is

Associated with Decreased Susceptibility of Lung Cancer in Asian Smokers: a

Meta-Analysis, Tumour Biology: the Journal of International Society for

Oncodevelopmental Biology and Medicine, 34(5), 2651–2567.

Maggert, K.A., 2012, Genetics: Polymorphisms, Epigenetics, and Something In Between,

Genetic Research International, 1-9.

McPherson, M.J., and Moller, S.G., 2006, PCR, 2 edition, New York: Taylor & Francis,

292.

Minematsu, N., Nakamura, H., Furuuchi, M., Nakajima, T., Takahashi, S., Tateno, H., et al.,

2006, Limitation of Cigarette Consumption by CYP2A6*4, *7 and *9 Polymorphisms,

European Respiratory Journal, 27(2), 289–292.

Park, L.S., Tiirikainen, M.I., Patel, Y.M., Wilkens, L.R., Stram, D.O., Marchand, L.L., et al.,

2016, Genetic Determinants of CYP2A6 Activity Across Racial/Ethnic Groups with

Different Risks of Lung Cancer and Effect on Their Smoking Intensity, Carcinogenesis,

37(3), 269-279.

Patramurti, C., Sugiyanto, Nurrochmad, A., and Martono, S., 2014, Polymorphism of

Cytochrome P450 2A6 (CYP2A6*1 and CYP2A6*4) Among Javanese Indonesian

Smoker and Non Smoker, Indonesian Journal of Pharmacy, 26(1), 11-19.

Peamkrasatam, S., Sriwatanakul, K., Kiyotani, K., Fujieda, M., Yamazaki, H., Kamataki, T.,

et al., 2006, In Vivo Evaluation of Coumarin and Nicotine as Probe Drugs to Predict the

Metabolic Capacity of CYP2A6 Due To Genetic Polymorphism in Thais, Drug

Metabolism and Pharmacokinetics, 21(6), 475-484.

Pitarque, M., Richter, O., Oke, B., Berkkan, H., Oscarson, M., and Ingelman-Sundberg, M.,

2001, Identification of a Single Nucleotide Polymorphism in the TATA Box of the

CYP2A6 Gene: Impairment of Its Promoter Activity, Biochemical and Biophysical


12

Research Communications, 284, 455-460.

Rahman, M.T., Uddin, M.S., Sultana, R., Mone, A., and Setu, M., 2013, Polymerase Chain

Reaction (PCR): A Short Review, Anwer Khan Modern Medical College Journal, 4(1),

30-36.

Raunio, H. and Rahnasto-Rilla, M., 2012, CYP2A6: Genetics, Structure, Regulation, and

Function, Drug Metabolism and Drug Interactions, 27(2), 73-88.

Roux, K.H., 2009, Optimization and Troubleshooting in PCR, Cold Spring Harbor

Protocols, 4(4), 1-6.

Stephenson, F.H. and Abilock, M.C., 2014,PCR Optimization.

Sim, S.C., 2014, CYP2A6 Allele Nomenclature (Online),

http://www.cypalleles.ki.se/cyp2a6.htm., accessed 10 Maret 2014.

Wang, L., Zang, W., Liu, J., Xie, D., Ji, W., Pan, Y., et al, 2013, Association of CYP2A6*4

with Susceptibility of Lung Cancer: A Meta-Analysis, PLoS ONE, 8(4),1-5.

World Organization of Animal Health, 2013, Principles and Methods of Validation of

Diagnostic Assays for Infectious Dieseases, OIE Terrestrial Manual, 1-17.

Yoshida, R., Nakajima, M., Nishimura, K., Tokudome, S., Kwon, J-T., and Yokoi, T., 2003,

Effects of Polymorphism in Promoter Region of Human CYP2A6 gene (CYP2A6*9)

on Expression Level of Messenger Ribonucleic Acid and Enzymatic Activity In Vivo

and In Vitro, Clinical Pharmacology and Therapeutics, 74(1), 69-76.

Yoshida, R., Nakajima, M., Watanabe, Y., Kwon, J-T., and Yokoi, T., 2002, Genetic

Polymorphisms in Human CYP2A6 Gene Causing Impaired Nicotine Metabolism, Br.

J. Clin. Pharmacol., 54(5), 511-517.

Yusof, W. and Gan, S.H., 2009, High Prevalence of CYP2A6*4 and CYP2A6*9 Alleles

Detected Among a Malaysian Population, Clinica Chimica Acta: International Journal

of Clinical Chemistry, 403(1-2),105–9.

Zhu, A.Z.X., Renner, C.C., Hatsukami, D.K., Swan, G.E., Lerman,C., Benowitz, N.L., dkk.,

2013, The Ability of Plasma Cotinine to Predict Nicotine and Carcinogen Exposure is

Altered by Differences in CYP2A6: the Influence of Genetics, Race, and Sex, Cancer

Epidemiology Biomarkers and Prevention, 22(4), 708-718.


http://www.cypalleles.ki.se/cyp2a6.htm.,

13

LAMPIRAN


14

Lampiran 1. Ethical clearance


15

Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis


16

Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix


17

Lampiran 4. Product Datasheet of DNA Ladder & Markers


18

Lampiran 5. Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA menggunakan Teknik Elektroforesis

9 10 11 12 13 14 15 16 M 17

3000

1500

1000

500

200

100

18 19 20 21 22 23 24 25 M 26

3000

1500

1000

500

200

100

Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik elektroforesis

Keterangan:

M : Marker (100 bp DNA Ladder Geneaid)

9-25 : Isolat DNA

Kondisi Elektroforesis : Fase diam agarose 1%; Fase Gerak Larutan TBE 0,5%; Kecepatan 100 V/cm;

Vol. Injeksi 6 μL

Isolat DNA

Isolat DNA


19

Lampiran 6. Hasil PCR pada Optimasi Volume Primer

A A M B B C C

3000

1500

1000

500

200

100

Produk PCR pada berbagai volume primer

Keterangan:

A : 1 μL

B : 1,25 μL

C : 1,5μL




Produk PCR 368-bp


20

Lampiran 7. Simulasi penempelan primer pada CYP2A6*1 dengan NCBI


21

Lampiran 8. Hasil Uji Reprodusibilitas PCR

a b c d e f g h M i j k l m n o p

3000

1500

1000 500

200

100

q r s t u v w x M y z 1 2 3 4 5 6

3000

1500

1000

500

200

100

Elektroforegram produk PCR pada kondisi optimum dari berbagai isolat DN

Keterangan:


a-ff : Produk PCR dari berbagai isolat DNA yang berbeda



Isolat DNA

Isolat DNA


22

Lampiran 9. Hasil Sekuensing Produk PCR


23

Lampiran 10. Tahapan manual editing pada BioEdit


24


25


26


27

Lampiran 11. Hasil manual editing pada BioEdit

>ConsensusA (primer forward)

TGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACMACTTTGGGGTGCATTCTCACT

CTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTATGCAAATATTCCAAACTC

CTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCCCCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACC

CCTCCTGAAGTACCACAGATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCC

TGGGGTCCCCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCATG

GTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAATCAGCCAAAGTC

CATCCCTCTTTYTCAGGCAGTATAAAGGCAAACCACCCCAGCCA

>ConsensusB (primer reverse)

TGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGCATTCTCACTC

TCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTATGCAAATATTCCAAACTCC

TCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCCCCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCC

CTCCTGAAGTACCACAGATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCT

GGGGTCCCCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCATGG

TGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAATCAGCCAAAGTCC

ATCCCTCTTTTTCAGGCAGTATAAAGGCAAACCACCCCAGCCA

Dibandingkan dengan sekuens CYP2A6*1 pada GenBank : CCCTTACGCCCTCCTGAAGCAGGACACTCTTATGCCCTCAATGACACCTGAGACAACACACA

GAGCCCTC

TTGGCACCAAACATGACTTCAATATTCTCCTGGTGTCAAGTTCAGTGCCAACTTGTTTCCCAT

CCTCGCA

TACACCTGGGGGCAGTCCCAAAGCCAACACGATGCCTTTCCCTCCCTGGCCATACCTGATGC

TGATATCA

GAACCCACCAATGTCATCAGTGTGTCCACTGCTGATGCCAGTCCCAGCACTCACCTCCTGCT

AAGGCTGG

CCTGCACTTGACTCCCAGGGTGATCTAGGCCAGTCAATGAAGGGGGGTGAGGAGAAAGTTC

ACATCCCAG

CTCCCTCACTTACTCCCTGTGTGACCTCACTCAAGAGGATTTATGGAGTCTAGATCTGCTCAT

CTTCAAA

ATGAGGATGATCATGATGAACCAACCTCATTGTTACAAAGATTCAACCAGATCATACACACCT

AGACTTA

ATCTTCCCGTATACGACCATGCTCACCAAAGGGTAACTGTCCTGTTTACTAAGGAAGAATTTC

CCTGAGG

GAAGGACAGGAGGGCTACTCATCCCTTCTCCACTCACACCCACCCCAGGATCTGCCTCTGTG

CCTAATAC

TGGAGTTTACCCCAATCTCTTCTGCCACTGTTCCCTCTGCCTGCTAATAGTAGTAGCCCCTGA

CAAAGCA

GGAATCATTCTTAAAGGAGACTTAACTCACCCTCGAATGTGATCTTCTCTTCCCAAACACTCC

CTTTCCA

CTGGCAGGAAAACCAAATCCAGAAAGGGGAACTAAGTACACAGAGCAGGAGAGATGGGAG

TTCAGGGCCA

CTCACACATGTCCCCTGCCCACTGTCTGTTTTCTGTCCTCTGTAGATCTTTATATAAAATGAGA

AACATA

AACAACAATCATAATATTAATAGGGATGATACAATCAATCTAGTGGGTTTCCCTGAGGATCTG

GGTTGGA

AACCAGCGGACAACCCTTGGGACACTTGAGATTTTTCCACCATTTGGGGGTTGTTATTACTAT

TTCTCCA

GACCTAGCCAATCCCTCTGCCAACCGCTAACTCCAGGTACTCTTCTCCAGGTGTGGGGAAAG


28

TTCCCCTG

AAATATGGCTCTGGTCTTCCTCCCCTTCCCAATCAGAGATGGGCAGTGGAGGTTCTATGGCA

CCCATCCT

GGCCTCACTCTGAGGTTCCAATGAGGATTCTGGGCATCAAGAGACAGCTCTGGGCAAAAGC

AAAATCAAG

TCAGCCCCTGGACCCAGTGCTGGGCTGCTGGGCTTTCTGGGAGAACCCGCTGGGCTTGCTA

CACACTCCT

CCTCCCAGAAACTCCACACCCACAGCCCTGGGTCTTCCTAGCCCCGAGACTTTCAAGTCCAT

ATGCCTGG

AATCCCCCTTCCTGAGACCCTTAACCCTGCATCCTCCACAACAGAAGACCCCTAAATGCACA

GCCACACT

TTGTCTTACCCTAATAAAACCCAGACCTTTGGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACA

ACTTTGG

GGTGCATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTATGCAAATATTCC

AAACTCCT

CAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCCCCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAA

GTACCACA

GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCCCCTTATCCTCCCTTGCTG

GCTGTGT

CCCAAGCTAGGCAGGATTCATGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGT

AATCAGCC

AAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTATAAAGGCAAACCACCCCAGCCGTCACCATCTATC

ATCCCACT

ACCACCATGCTGGCCTCAGGGATGCTTCTGGTGGCCTTGCTGGTCTGCCTGACTGTGATGGT

CTTGATGT

CTGTTTGGCAGCAGAGGAAGAGCAAGGGGAAGCTGCCTCCGGGACCCACCCCATTGCCCTT

CATTGGAAA

CTACCTGCAGCTGAACACAGAGCAGATGTACAACTCCCTCATGAAGGTGTCCCAAGGCAGG

GAGATGGGT

GGCACGGGGTGGGGGCTGCCTAGTTGGCTGGGGCTTTGTGGCAGGGGGTTGACCAGTGTG

GACCAGAGTC

TTAGGAAATGGAGTTTTGGAGTTTCAGCATCAGAAAGACAGGATCTTGGGATGTCCAGCTCC

CTGACTGT

GAGAACCTGGGTGCGAAGCATCCCAGCACATGACATCTCGGTGCTGGGCCCCATTCAGAGT

GGAGGCTTC

TCCCTCTAACCACTCCCACCCACCTCCATCAGATCAGTGAGCGCTATGGCCCCGTGTTCACC

ATTCACTT

GGGGCCCCGGCGGGTCGTGGTGCTGTGTGGACATGATGCCGTCAGGGAGGCTCTGGTGGAC

CAGGCTGAG

GAGTTCAGCGGGCGAGGCGAGCAAGCCACCTTCGACTGGGTCTTCAAAGGCTATGGTGAG

GGGGTGCCCA

AGAGGGGGAAGGTGGCCAGGTGGACACGAAGGTCTCAGTGTTCCCAGCCTTCTCCCTGACT

CTCCTGCCA

ACTGGAGGCTAAGGCAGAGTCCCCAGTCTGGTCTTCCCTCCCCATCTCCCTTCATTGTGGCC

TCTCCATG

TGTATCCCTCACCTGTCTCCAGCGTCCCTGTCCTGATTCCTCCCTGCCTCTCTCTGCCCCACC

TCCTTAT

TCTCTCTCACTGGAGTCTCCTCTTTCCCCTCTCTCTCCATCTCTAAGGACATCCTGGGTTTCT

GTTTTCC

AGCCCTGGTTCTCTGTCTTCATTTGTCTTTTTGTCCCTCTTAGCTTCTGGGCTTCTCTGTGTTT

CTCATC

TCTCCGCATCCCTTTCTCACTTCTTCCTCTGTCTTAGGATTTCAGGGTATTCCTACTTCCACAT

CTTCAG

CCTCCATCTCCTGGTAACAGTCTCTCTTCCTTCCAGACCCTCTCTGTTTCTATCTCAATATTTT

TCTCTC

TTCTCCAGCTCAGCTTAAGAATGTTTCACCATTTTTATTTCCTCCTCCCAGATCTCCCCATATC


29

TCACTT

CCCCTCCCTCCATCCTCTTCCTCCATCACTCTCTTTCTCTCCCCACTTCCTTCCCTTCCTCCAT

GGAGTG

TCCCCTTATCCCTCTGTTTCTATGTGCATCTCTCTGTCTGGCCTTTCTGTTTCTTTTCTGATTGT

CTTAT

TCTTTAAACCTGGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCTCTCTCT

CTTCT

CTCTCTCTCTCCTCTCTCTCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCTCTCTCTCTTCTCTCTCTC

TCTCT

CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACCTCGACATCGTGTTTCTCTGACTGAGTTTGCAGCTCTGC

TGGGCAA

TGGCGCTGAATCCATCTCTCTCCCACCCTACTCCCTCTCTCCTCCACCCTTGGGGAGCCCCTT

GGAGCTG

CTCCGCTCCTGCCCCCGCCGCCCCCTGGCCTGTCTCCATTCCCGCGTTCACCTCCCCAGGCG

TGGTATTC

AGCAACGGGGAGCGCGCCAAGCAGCTCCGGCGCTTCTCCATCGCCACCCTGCGGGACTTCG

GGGTGGGCA

AGCGAGGCATCGAGGAGCGCATCCAGGAGGAGGCGGGCTTCCTCATCGACGCCCTCCGGG

GCACTGGCGG

TGAGCAGGGGACCCCGAGTGCGGGGGCAGGAGAAGGAAAACACCCAGGACGAGGAACCC

GCGCGCGTTCT

GCCTGGGGATGGGGACTAGGTGGGGAAAGGCGCCCGCACTTCCAGCCCTGGAGTCTGGCG

CTGGGAATTT

GGCTCAACAAGGCCCTGCCTCCTGGAATTCTGACTCTCCTCAGACCTCTGAGTTGACTCTCT

CCCCAACC

CCCTTCTCCCGCCATACCCGCAGGCGCCAATATCGATCCCACCTTCTTCCTGAGCCGCACAGT

CTCCAAT

GTCATCAGCTCCATTGTCTTTGGGGACCGCTTTGACTATAAGGACAAAGAGTTCCTGTCACT

GTTGCGCA

TGATGCTAGGAATCTTCCAGTTCACGTCAACCTCCACGGGGCAGGTAACTGGCTGCAGCCC

GGCCCGTGA

CGCCCCTACCACAACCTGCCAACTGCTCCCCTACCTGGAGACAGGTGCCCCAAACTCCCAC

CGCCCTCCA

GACAGTGTCCCCTCAAAATCAGTCCCCGATATTGGACAACTGGACAGTTGCACCAGAACCC

AGGATGGAT

GTCCAATACCCTGTCTCCAAGGACACCTGGATAGCTCAACAGATGCTCCCCAAAACAGAGC

CTGCTGGCA

GGATGCATACCCTCAGCTCAGCTCTCTCACCTGGGCACATGTTCCCATCCCCAACTTACCGTA

ATTTCTA

ACAGATGCTCCCTACCCAGTTCTTCTGAATATTTTAACACCTGGACAAGTGACTGCGTCAAC

CGGCCTCC

TGCATACCTGAACACCTGGTGCTGCAAAATCCAGCCCATCATAATCATTTCACATCTACACAA

ATGTCCC

AGATTAGCCCACTGGAATATCTGGCCAAGCGCCCTCTACTTCACCCACTTAAATACCTGAAA

ACATGGAC

AGCTGCCCTAACCAACACCTTAAACACATAAATATCTAGACAGATTGTTCCCTGACACACAA

ATAAGTGT

TCCCCAACCCTTTCCAATCACACACCTTACAGAGGTGCTCCCAGTGCATCCCACTTGGATAG

GTAAACAC

CTCAACAGGTATCCCCTCCACTTCAACATCTTCACCAGCCCCACTTTAATACCTGAGCACCTG

AACAAAA

GCCCCCAATCCAGACCCAGTAAGTATCTGGACAGCTGTCTCCAACCAAGCCTACTTGAATGC

CTAAATAC

CTAGACAGGTGACACTCACCTCATACCAGCCCCACCTGAAGAGCTAAACACCTGGACAGGT

GTCTTCCAA

CTCAACTTCACTTGAATATCTGAACACCTAGATGTGTGCTCCAATCCAGCCTCGTTTAAATAC


30

CTGAAAC

CTGGATATATGTCTCAGTTCTTCTCACCTAAATTACTAGACCGTGGCCCTGGTACCTAACCTTC

CTGAAA

ACTTAGATATAAGTTCCTATCCGGCCCCACTGAAATACCTAAACAACGAGACAGATGCCTTTA

ACTCAGT

TCCTTCCTTGCTATGAAACAAATCCCATTCCCATCAGCTCCTGCCCCGTGACAGCTGTCCTTC

CCTTCCC

ATCCTCTCTCTGCAACCCCAGCTCTATGAGATGTTCTCTTCGGTGATGAAACACCTGCCAGG

ACCACAGC

AACAGGCCTTTCAGTTGCTGCAAGGGCTGGAGGACTTCATAGCCAAGAAGGTGGAGCACA

ACCAGCGCAC

GCTGGATCCCAATTCCCCACGGGACTTCATTGACTCCTTTCTCATCCGCATGCAGGAGGTAC

ACCCCAGC

AGCCACTGCGGGGAGATGCAAAGCCAGGCAGAGGGAAATCAGTCTGGGAGTGGGGCAGGC

AGATGACACA

GGCCCATTCAAATTAACCCTCATCATAATAATCCTCACAATTGGCTGGGTGCCGTGGCTAACA

GCCTGTA

ATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCAGGTGGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCA

GCCTGGCCAA

CATGGTCAAACCCCGTCTCTACTAAAAATCCAAAAATTAGTTGGGCATGGTGGCGCGAAGG

GGGGCAGAG

GTTGCAATGAGCCAAGATCACGGCATTGCACTCCAGTCTGGGTGACAGAATGAGGCCCTGT

GTCAAAAAA

AATTAATTAATTGTTTAAAAAGTAAGTGAGCCTGCATGGTCATGCGCATGTGCAGTTCCAGCT

ACTCAGG

AGGCTGAGGCTGGAGGATTGCTTGAGCTCAGGAGTTGGAGTCCGGCCTGTGCAACTTAGCA

AGACCAAGT

CAGTATAAGAAAAAAAAAAACAAAAAAAAACTGACAGCTAAGTTGATAATTGAAGGACAG

ATGGTCAGCA

AGGTAAAGAAGGTGAGAAGGAAGAGCATTTTGGGCAAAGCCAGCAGCCAGGGCAAGGGC

TGGAACCTAGA

GCGAGTCTGGTAGATCTAGGGTCCCTCTTTCCACCTTTGGTCTGAACCAAAGAGAGGTAGAT

CCAAAGGA

AAAGCCCTAGAAGGGCCCTGAGGGCAAGAGGAGTGAGGTTGGCCTAAAGCCCCCTCTCCC

TGCAGGAGGA

GAAGAACCCCAACACGGAGTTCTACTTGAAAAACCTGGTGATGACCACGTTGAACCTCTTC

ATTGGGGGC

ACCGAGACCGTCAGCACCACCCTGCGCTATGGCTTCTTGCTGCTCATGAAGCACCCAGAGG

TGGAGGGTA

AGGCTGGAGGGGGACGGAAGTGGAGGGCCCCAGACCCTCAAAATTCCCCTTCGACTGGTG

CAATGTCCCC

ACCTGTCCCAGATCCCGGGACCCTGAGACGTGACTTGCTGTCCAGAGACAGGGCAACATTC

AGCTGGTAG

GCATCAGCTGAGTCTCATTAGATATTAAAATATTGAAAATGTCTGCACTGATTGGTCAGTCAC

TTCTGTC

CCAAGCCCACTGAGTGCCCACTGCCCGTTCCACCGGGTCATCCCCTAAGTTCCTCCCTGTGC

CTCCCCTG

TGATTCTGGCACAACCTGGTTAACAGGATCCTACTCCAACAATGCGAATGGCTGATGTCTGT

TCTGTTAT

GAATGCTCTACTTCCGTCTCATAGGCGGAGCCATATCATCCACCCCATTTTGCCTATTCGGACT

ATCATT

TCCTGCTCTGAGACCCCTAGATACCTAAACACATTCCCCCTCCTCCCCCAGCCAAGGTCCAT

GAGGAGAT

TGACAGAGTGATCGGCAAGAACCGGCAGCCCAAGTTTGAGGACCGGGCCAAGATGCCCTA

CATGGAGGCA

GTGATCCACGAGATCCAAAGATTTGGAGACGTGATCCCCATGAGTTTGGCCCGCAGAGTCA


31

AAAAGGACA

CCAAGTTTCGGGATTTCTTCCTCCCTAAGGTGCTATCCGCCCCCACCCCCCAGACTACGGGG

ACTTCCAG

CCCCTCTCTGTGTCCCCAGCATCCCACCCACATTAGAAGCTTTCTAGACCCTGTCCCACTCCC

TCAATCA

GTCAAAAAAGACTTCCCCAACCACCACATCCGTTCCACCTTTCCACTTAGACACTCCTGAGT

CCTGCATC

TCTCCAGACTCTTTGTGTCAGGAGAATCAAACACATGTTCCCAAACTTCCTATCTTAAGAAA

CAGAAGCC

CCCTTTCCATTCGGCCTTTTGTCATAGGGACAGAAATCTCAGGTCCCCCAAACTCCTGCCTA

GAAGGACA

TGGACCCCATGTCTCCCAAACTTCCTGTTTCAGAGATGTGAACCTTCTATCCCCCAAAGCTC

CTCCATCA

GAGGACCCCAACTCCTCCATGCCTGCCACTTCCCCTTACCTGGGGCACACTAGTTCCCCCTC

CAGCCCCT

GTGTACTTTCACCAATCCCCCGACCCTCCTCATCACACACAACTTCCTCCTCCCTACCAGGG

CACCGAAG

TGTACCCTATGCTGGGCTCTGTGCTGAGAGACCCCAGTTTCTTCTCCAACCCCCAGGACTTC

AATCCCCA

GCACTTCCTGAATGAGAAGGGGCAGTTTAAGAAGAGTGATGCTTTTGTGCCCTTTTCCATCG

GTAAGAGA

CCACTGTTTGCTGCCAGGCCACGGCTCACACCAGCAGGGGCCTCCCTCACCCTCCTCCCCTC

TCTGCGGT

GTAGCCTGGTATTTCTCCAGCTTGGAAGTTCCTGTTAGAATCTACCCTTGAGCCAGCAGCTGA

TACTTCC

TTAACTACCAAGCACCCAGTACCTGCGCCCAGGTAAAATGAAAGGAAACATCTTTCCCCGTA

GATGTATT

TCTCTAGGGTCACACAGCAGATTCCTCAGATCCCTAAAAAGGAGATGACGGCACAGCAGTC

ATATTTGCA

AGTGTACCTGGCAGGAAAGGACATCTAAACCTCCCATTGCTACACCTGGCATGGATCACCCC

ATCTATGA

TGGATGTGTGACATTATGCCTTTTTCAAAACCCATAGAACTGTATAACACAGAGTAAACCCTA

ATGTAAA

CTATGGACTTTGTTAGTAATAATATATCAATATTGGTTCACCATTGTTACATCTCTTATAGAAAG

AAATT

GAGGCTCAGGGAGGATCAGAGCCTCCTCTGAAACTCTCTCAGGCCATAATATTCCACCCTTC

CTCCCTGG

GAGAGCCGCAGCTGGAGGTCGGTACTGGGGCGAGGCTGCACTGAGAGTGGGCTTCACCTC

CACCCCTCCC

GCCTCTCCTCCTCAGGAAAGCGGAACTGTTTCGGAGAAGGCCTGGCCAGAATGGAGCTCTT

TCTCTTCTT

CACCACCGTCATGCAGAACTTCCGCCTCAAGTCCTCCCAGTCACCTAAGGACATTGACGTGT

CCCCCAAA

CACGTGGGCTTTGCCACGATCCCACGAAACTACACCATGAGCTTCCTGCCCCGCTGAGCGA

GGGCTGTGC

CGGTGCAGGTCTGGTGGGCGGGGCCAGGGAAAGGGCAGGGCCAAGACCGGGCTTGGGAG

AGGGGCGCAGC

TAAGACTGGGGGCAGGATGGCGGAAAGGAAGGGGCGTGGTGGCTAGAGGGAAGAGAAGA

AACAGAAGCGG

CTCAGTTCACCTTGATAAGGTGCTTCCGAGCTGGGATGAGAGGAAGGAAACCCTTACATTAT

GCTATGAA

GAGTAGTAATAATAGCAGCTCTTATTTCCTGAGCACGTACCCCCGTGTCACCTTTGTTCAAAA

ACCATTG

CACGCTCACCTAATTGCCACAAACCTCTGCGAAGGGCGTTCATGCCCATTTTACACGTGACA

AAACTGAG

GCTTAGAAAGTTGTCTCTGATGTCTCACAAAACATAAGTGCCCAGAAAATCTTTGAACACAG


32

ATCTGTGC

CCATAGCCTTCTAGACAGATTCTTAAAAAGCACCTATTCCTCACGTAAAACAGCTTAGTATAG

CATCACA

TGGCCTGAACATCCCTGTCCTGGGGAGTTTTCCAGAGACCTGGCGGGTGGCTGTCCTGCCTT

CACTGCAC

ACATGCCCACACTCTCACCTACTCAACATGCTTTGAATACCCGGGTGTAATCTGTGCTTGCTA

CCAGATA

AGGCCACTGTAGCCCATTCAGAGTCAGTCCAGGGACACAACGAGACATGAATGGACATACA

GAGTCAGTC

CATTAACAATTTTTTGCAGAGCAGAAGTTTTTAATTTTAATGACATTCTGTCAATATATCCCTT

AATGAA

GAAGTTGAAGGAAAGAATCACTTACAGAGAATGAGAGAACTCTGGATCAGGACATAGCCAT

ATTCATGTG

TGTGATCATGTTCAGACATGCATGTGAGCATATGACTGCATATTCTCCTCCGTGTATGCATGAA

ACATAT

TCCACTATGGGTTCTGAAGGCTGGGCTCTCCTGATGGATCTGGGGTCTGTTGTAAGACCCAG

CTGAGAGT

TTCACAATCACTGCCCACTCTCAAAGAAGTTAGTGTGTGTCCCCCTTAGAAGCTCCCTTACG

GCTTTCAC

GAAAATTAACTCCAAGTTTATTGTAGACCTAAATGAATAGTGAGTACAAAACTTCTAGAAGA

TAATGTAG

GAGAAAATCTAGATGACCTTAAGTTTGGTGATGGCTTATTAGATACAACACCAAAAGCACAA

TCCTTGAA

AGAAGCAATTGATAAGTTCTGTGTCATTAAAATTAGAAGCTTCTGCTCTGCAAAAGAATTGT

CAAGAGAA

TGACAATACAAGCTACAGACTAGGAGAACATATTTGCAGGGGACATACCTGATAAGGGACTT

ACATTCAA

AATACACAAAGAACTGTTAAAACTCAATAGAAAACAACCCAATTAAAGAATGGGCAAACGA

TCTGAGCAG

ACACCTCACCAAAGAAAATATACACATAGCAAATAAGCATAAGGAAAGATGCTCCATATCATA

TGTCAGT

AGCCATTTCAAATTGAAACAATAATGATGTACCACTACTCACCTATTAGAATGGCTAAAATCC

AAAGCTG

ACAACATCAAATGCTGACAAGGAGGTGGCTCAACAGGAACTGTCATTCATTGATGGTGGGA

ATGCAAAAT

GACACAGCTACTTTGAAAGACAATTTGGCGGTTTCTTGCAAAGCTAAACATATTCTTACCAT

GTGCTACA

GCAATCATGTTCTTCGGTATTAACCCAAATGAGTTGAAAACATATAGCAACACAAAAACCTC

TGCACAGA

TGTTTATAGCAGCTTTATTCATAATTGCCAAATCTTGTAAGCAACCAAGATGTTCTTCAACAA

GTGAATG

GATAAATGAACTGTAATATGTTCATACAATGAAATACGGCAGGGCTTGATGGCTCATACTGTT

AATTATA

GCACTATGGGAGGCCGAGGTGGGCAGATCACTTGAGGTCAGGAATTCGAGACCAGCCTGGC

CAACATGGT

GAAACCCCATCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGCACGGTGGCATGCGCCTGCAGTT

GCAGCCAC

TTGGGAGGCTGAGGTGGGAGAATTGCCTGAACCCATAAGGCAGAGGTTGCAGCGAGCTGA

GATGGAGCCA

CTGCACTCCAGCCTGGGCGACACAGTGAGATTAGAAGAAGCAATATTGTTAAAATGTTCATA

CTACTCAA

AGCAATCTACAGATTCAATGCAATTCCTATCAAAATACCAATGACATTCTTCACAGAAACAG

AAAAAA


33

BIOGRAFI PENULIS

Penulis mempunyai nama lengkap Cindy, dilahirkan di Surabaya,

pada tanggal 13 April 1995, serta merupakan anak ketiga dari enam

bersaudara dari pasangan Tjua Nyit Fui dan Henny Susana. Penulis

menempuh pendidikan TK hingga SMA di Kota Sambas, Kalimantan

Barat, yaitu TK Amkur (1999-2001), SDS Amkur (2001-2007), SMP

Amkur (2007-2010) dan SMA Santo Bonaventura (2010-2013).

Penulis melanjutkan studi di Program Studi S1 Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2013. Selama masa kuliah, penulis aktif dalam

kegiatan akademik dan non akademik di dalam maupun di luar kampus, yaitu Dewan

Perwakilan Mahasiswa Fakultas (DPMF) Farmasi sebagai anggota Divisi Advokasi (2014),

Bendahara (2015), dan Ketua (2016); Kepanitiaan Inisiasi Fakultas Tiga Hari Temu Akrab

Farmasi (Titrasi) sebagai anggota Kesekretariatan (2014) dan Koordinator Kesekretariatan

(2015); anggota Patient Counseling Club; anggota Herbal Garden Team; asisten Praktikum

Kimia Dasar (2014), Kimia Organik (2015-2016), Kimia Analisis (2015), Biologi Sel dan

Molekuler (2015-2016); Tim Farmasi Bakti Sosial Pengobatan Gratis Yayasan

Persaudaraan Masyarakat Yogyakarta; peserta Kalbe Pharmaceutical Professional

Program (2016), peserta Good Manufacturing Practice education (GMPed) dan Patient

Counseling Event (PCE) dalam Pekan Ilmiah Mahasiswa Farmasi Indonesia (PIMFI) di

Universitas Padjadjaran Bandung (2015), Juara 3 Pharmaceutical Industry Case Study di

Institut Teknologi Bandung (2016), Semifinalis Nutrifood Leadership Award (2016), 15

Besar Olimpiade Sains Mahasiswa Tingkat Nasional Bidang Kimia (2016), Juara 1 Aksi

Penulisan Ilmiah Nasional (2016), 10 Naskah Terbaik Lomba Karya Tulis Ilmiah Tingkat

Nasional (2016), Peserta Phase Paper of Innovation Challenge, Peringkat II Olimpiade

Nasional MIPA bagi Mahasiswa Perguruan Tinggi (ONMIPA-PT) Swasta Tingkat Wilayah

2016 Bidang Kimia, 50 besar Lomba Essay Nasional (2016), Peserta Olimpiade Farmasi

Indonesia 8 di Universitas Andalas Padang (2016), Peserta Pharmacy Competition (2016);

Peserta Clinical Pharmacy Skill Event dalam kegiatan Kompetisi Farmasi Seluruh

Indonesia di Universitas Airlangga (2016); Peserta Kompetisi Kefarmasian Mahasiswa

Tingkat Nasional Pharmadays di Universitas Gadjah Mada (2015); Peserta Lomba Cerdas

Cermat Farmasi dalam Pharmacy Festival di Universitas Indonesia (2015); dan peserta

Student Exchange Program di Mahasarakham University, Thailand (2017).


optimasi dan validasi kondisi polymerase … · diajukan untuk memenuhi salah satu syarat ......

Documents