identifikasi gen sitokrom p450 2a6 alel*4 pada ...enzim sitokrom p450 2a6 (cyp2a6) terdapat di hati...

i

IDENTIFIKASI GEN SITOKROM P450 2A6 ALEL*4 PADA SUBJEK UJI

NONPEROKOK SUKU TIONGHOA INDONESIA DENGAN METODE

POLYMERASE CHAIN REACTION

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Vink Dellin

NIM : 168114024

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2019

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii

IDENTIFIKASI GEN SITOKROM P450 2A6 ALEL*4 PADA SUBJEK UJI

NONPEROKOK SUKU TIONGHOA INDONESIA DENGAN METODE

POLYMERASE CHAIN REACTION

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Vink Dellin

NIM : 168114024

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2019


iii


iv


v

HALAMAN PERSEMBAHAN

Karya ini kupersembahkan kepada, Tuhan Yesus yang menjadi sumber kekuatan dan jawaban dalam setiap

tantangan yang saya hadapi, Bapa yang menyertai dalam setiap rancangan yang disediakannya kepada aku.

Mama, Papa, dan Vion yang terus-menerus mendukungku dan

menyemangatiku.

Sahabat-sahabat dan teman-teman yang selalu menyemangatiku dan mememaniku melalui setiap proses selama ini.


vi


vii


viii

PRAKATA

Puji dan syukur penulis haturkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas

berkat, tuntunan, serta rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi

dengan berjudu “Identifikasi Gen Sitokrom P450 2A6 Alel*4 pada Subjek Uji

Nonperokok Suku Tionghoa Indonesia dengan Metode Polymerase Chain

Reaction”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar

Sarjana Farmasi (S. Farm) Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

Penyelesaian skripsi ini tidak terlepas dari dukungan, bimbingan dan bantuan

berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan

terima kasih kepada:

1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartani, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt. Selaku Dosen Pembimbing Skripsi atas

bimbingan, dukungan, pelajaran, nasihat, serta setia mendampingi penulis

dengan sabar hingga penyusunan skripsi ini.

3. Bapak Maywan Hariono, Ph. D., Apt. selaku Dosen Penguji yang telah

memberikan kritik dan saran kepada penulis.

4. Ibu Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc., selaku Dosen Penguji yang telah

memberi kritik dan saran kepada penulis sekaligus sebagai Kepala Penanggung

Jawab Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah memberikan izin untuk

penggunaan semua fasilitas laboratorium selama penelitian.

5. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, Apt. selaku Dosen Pembimbing Akademik yang

atas bimbingannya selama perkuliahan dari awal hingga akhir.

6. Pak Kayatno selaku laboran biokimia yang sudah setia membantu penulis

dalam penelitian.

7. Pak Heru, Pak Wagiran, dan Mas Bimo yang telah membantu selama proses

penelitian di laboratorium.

8. Papa, Mama, dan Vion yang sudah memberikan doa, semangat, dan dukungan

kepada penulis hingga terselesaikannya skripsi ini.

9. Rekan seperjuangan penelitian ini yaitu Evelyn, Handani, Lodvi, Tasya dan


ix


x

DAFTAR ISI

COVER .............................................................................................................. i

HALAMAN JUDUL ......................................................................................... ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................. iii

HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................... iv

HALAMAN PERSEMBAHAN........................................................................ v

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................................ vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ......................................................... vii

PRAKATA ..................................................................................................... viii

DAFTAR ISI ..................................................................................................... x

DAFTAR TABEL ............................................................................................ xi

DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xii

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xiii

ABSTRAK ..................................................................................................... xiv

ABSTRACT ...................................................................................................... xv

PENDAHULUAN............................................................................................. 1

METODE PENELITIAN .................................................................................. 3

HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................................... 7

KESIMPULAN ............................................................................................... 16

SARAN ........................................................................................................... 16

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 17

LAMPIRAN .................................................................................................... 20

BIOGRAFI PENULIS .................................................................................... 41


xi

DAFTAR TABEL

Tabel I. Frekuensi Alel CYP2A6 *1 dan alel CYP2A6 *4 pada suku Tionghoa

………………………………………………………………………...15


xii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan Teknik

elektroforesis…………………………. …………………………10

Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen urutan basa potongan gen

CYP2A6 *1…………………………. …………………………..12

Gambar 3. Urutan nukleotida potongan urutan basa CYP2A6 *1 dan CYP2A6

*4 ………………………………………………………………...13

Gambar 4. Elektroforegram produk PCR dari berbagai hasil pita …………..14


xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Ethical Clearence Penelitian ........................................................... 21

Lampiran 2. Go TaqGreen Master Mix Certification of Analysis ........................ 22

Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix ........................... 23

Lampiran 4. Product Datasheet of Primer Forward and Reverse CYP2A6*4 .... 24

Lampiran 5. Product Datasheet of DNA Ladder and Markers ............................ 25

Lampiran 6. Product Datasheet of FluorovueTM Nucleid Acid Gel Stain ............ 26

Lampiran 7. Product Datasheet of FavorPrepTM Blood Genomic Mini DNA

Extraction Kit ......................................................................................................... 27

Lampiran 8. Elektroforegram Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA .................. 28

Lampiran 9. Elektroforegram Hasil PCR CYP2A6 *4 ....................................... 29

Lampiran 10. Data Subyek ................................................................................... 31

Lampiran 11. Frekuensi Alel ................................................................................ 32

Lampiran 12. Inform Consent .............................................................................. 33

Lampiran 13. Hasil kuisioner subyek uji dan inform consent .............................. 38


xiv

ABSTRAK

Asap rokok mengandung banyak senyawa prokarsinogen, salah satunya

adalah Tobacco-specific nitrosamines (TSNA). Enzim CYP2A6 dapat

mengaktifkan TSNA melalui reaksi α-hidroksilasi menjadi zat intermediet yang

dapat berikatan dengan DNA dan menyebabkan miscoding. Polimorfisme pada gen

dapat memberikan efek yang bervariasi, di antaranya dapat menurunkan,

menghilangkan atau meningkatkan aktivitas enzim. Alel CYP2A6*4 merupakan

salah satu bentuk polimorfi yang mengalami whole gene deletion yang

mengakibatkan penurunan aktivasi senyawa nitrosamin sehingga dapat mengurangi

risiko kanker yang disebabkan oleh senyawa TSNA dalam asap rokok. Alel ini

banyak ditemukan pada orang Asia, khususnya pada suku Tionghoa. Tujuan

penelitian ini, yaitu untuk mengetahui keberadaan alel CYP2A6 *4 serta

menentukan frekuensi alel CYP2A6 *4 yang terdapat pada isolat DNA non perokok

suku Tionghoa di Indonesia. Hasil produk PCR dianalisis menggunakan

elektroforesis. Hasil penelitian menunjukkan frekuensi alel CYP2A6 *4 pada suku

Tionghoa Indonesia sebesar 30%. Berdasarkan hasil penelitian ini, maka dapat

disimpulkan bahwa adanya bentuk polimorfi CYP2A6 *4 pada subjek uji suku

Tionghoa Indonesia yang diketahui merupakan slow metabolizer dan dapat

mengakibatkan penurunan aktivasi TSNA sehingga memiliki kecenderungan

menurunkan risiko kanker paru.

Kata kunci: Nitrosamin, CYP2A6*4, Polimorfisme, Polymerase Chain Reaction

(PCR)


xv

ABSTRACT

Cigarette smoke contains many procarcinogenic compounds and one of

them is Tobacco-specific nitrosamines (TSNA). Enzyme CYP2A6 could activate

TSNA by α-hydroxylation into intermediets which bind to DNA and cause

miscoding . Polymorphisms in genes could provide a varied effect, either decrease,

eliminate or increase the activity of enzymes. Allele CYP2A6 * 4 is an example of

the polymorphy that undergoes whole gene deletion thus resulting in a decreased

activation of nitrosamine compounds. Therefore, this can reduce the risk of cancer

caused by TSNA compounds in cigarette smoke. This allele is mostly found in

many Asians, especially Chinese ethnic. The purpose of this research is to identify

the presence of CYP2A6 * 4 and determine the frequency of the Allele CYP2A6 *

4 contained in the Chinese non-smokers’ DNA extract in Indonesia. The PCR

product is analyzed using PCR, which results an allele CYP2A6 * 4 in Indonesian

Chinese with a frequency of 30%. Based on the results collected, it could be

concluded that the presence of CYP2A6*4 polymorphic allele in among Chinese

Indonesian population sample study were slow metabolizer, which may decrease

the activation of TSNA thus having the tendency to lower the risk of lung cancer.

Keywords : Nitrosamine, CYP2A6*4, Polimorphism, Polymerase Chain Reaction

(PCR)


PENDAHULUAN

Merokok merupakan salah satu faktor pemicu terjadinya penyakit jantung,

osteoporosis, kanker paru, kelainan reproduktif, diabetes dan penyakit lambung

(Gupta, 2001). Bahaya asap rokok tidak hanya merugikan bagi perokok aktif,

namun juga akan berdampak buruk terhadap perokok pasif. Kemungkinan perokok

pasif mengalami gangguan kesehatan akibat asap rokok yang dihirup mencapai

sekitar 30% (Barber, 2008). Menurut hasil survei Global Adults Tobacco Survey

(GATS) tahun 2011, Indonesia menempati urutan pertama untuk persentase jumlah

perokok pasif yaitu sebesar 78,4% (Plianbangchang, 2011). Orang yang terpapar

asap rokok akan mengalami peningkatan risiko penyakit jantung sebesar 25-30%

dan kanker paru sebesar 20-30% (Surgeon General, 2006; WHO, 2004).

Asap rokok dari produk tembakau mengandung sejumlah senyawa

prokarsinogen. Salah satu senyawa prokarsinogen yang terdapat pada asap rokok

adalah Tobacco-specific nitrosamines (TSNA) (Hoffman dan Hoffman, 1997).

TSNA memainkan peran penting dalam induksi beberapa jenis kanker, dan salah

satunya adalah kanker paru. Beberapa jenis TSNA yang telah ditemukan adalah N’-

nitrosonornikotin (NNN), 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanon (NNK),

4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanol (NNAL), Nitrosoanatabin (NAT),

Nitrosoanasabin (NAB), 4-(metilnitrosamino)-4-(3-piridil)-1-butanol (iso-NNAL),

dan 4-(metilnitrosamino)-4-(3-piridil)-1-asam butirat (iso-NNAC). TSNA dan

nitrosamin lainnya diaktivasi oleh enzim CYP2A (Rossini et al., 2008).

Enzim sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) terdapat di hati dan merupakan

enzim monooksigenase yang dapat memetabolisme senyawa xenobiotik dan

mengaktivasi toksin seperti nitrosamin (Mcdonagh et al., 2012; Tanner dan Tyndale,

2017). NNK, NNN, dan NNAL merupakan senyawa nitrosamin dalam asap rokok

yang berpotensi menimbulkan kanker (Xue et al., 2014). NNAL, merupakan sebuah

produk genotoksik hasil reduksi karbonil NNK. NNK akan mengalami reaksi α-

hidroksilasi menghasilkan beberapa metabolit genotoksik tambahan (Brown et al.,

2003). NNN dapat dimetabolisme melalui α-hidroksilasi lewat dua jalur yaitu

karbon 2’ dan karbon 5’ sehingga menghasilkan DNA adduct (Rossini et al., 2008).


2

Gen yang mengkode enzim CYP2A6 memiliki polimorfisme yang tinggi (Tanner

dan Tyndale, 2017).

Polimorfisme gen sitokrom P450 (CYP2A6) bervariasi dan diantaranya

dapat menurunkan, menghilangkan atau bahkan meningkatkan aktivitas enzim

(https://www.pharmvar.org/gene/CYP2A6). Polimorfisme gen CYP2A6 dapat

mengubah kecepatan aktivasi NNN dan NNK, dan meningkatkan risiko kanker

berhubungan dengan konsumsi tembakau (Rossini et al., 2008). Mayoritas dari

polimorfisme CYP2A6 adalah polimorfisme non-synonymous single nucleotide

(SNPs) yang terdapat pada ekson. CYP2A6 alel *1 merupakan wild type atau alel

normal pada gen CYP2A6 (Yoshida et al., 2002). Sedangkan salah satu varian dari

polimorfisme gen CYP2A6 yang dapat menyebabkan metabolisme enzim CYP2A6

menjadi lebih lambat (slow metabolizer) yang mengarah pada penurunan aktivasi

TSNA dan penurunan risiko kanker paru dibandingkan dengan normal metabolizer

adalah alel CYP2A6*4 (Malaiyandi et al., 2006; McDonagh et al., 2012; Tanner

dan Tyndale, 2017).

Bentuk polimorfi gen CYP2A6 banyak ditemukan pada orang-orang Asia,

dengan frekuensi alel nonaktif yang tinggi. Bentuk alel non aktif CYP2A6 yang

dapat dijumpai pada populasi Asia adalah CYP2A6 *4 dengan presentase sebesar

11-20% (Nakajima dan Yokoi, 2005). Alel CYP2A6*4 merupakan whole gene

deletion yang dapat berdampak fungsional pada tidak diekspresikannya mRNA dan

protein. Berkurangnya kemampuan ekspresi mRNA dari gen CYP2A6 akan

berkaitan dengan penurunan aktivitas metabolik total dari TSNA (Tanner dan

Tyndale, 2017). Hal ini diperkuat dengan hasil penelitian Mcdonagh (2012) yang

menyatakan bahwa frekuensi alel CYP2A6*4 berkisar antara 5-15% pada orang

Cina.

Indonesia adalah negara yang terkenal dengan keberagaman suku, dan

tercatat sedikitnya ada 300 suku di Indonesia. Salah satu suku yang terdapat di

Indonesia adalah suku Tionghoa dengan jumlah penduduk sekitar 2.832.510 jiwa

(Badan Pusat Statistik, 2010). Suku Tionghoa di Indonesia berasal dari dataran

Tiongkok/Cina yang kemudian menetap di Indonesia dan menikah dengan sesama

suku Tionghoa (Christian, 2017). Penelitian ini menggunakan subyek uji berupa


3

suku Tionghoa nonperokok di Indonesia untuk mengidentifikasi adanya

polimorfisme gen CYP2A6 alel *4 pada populasi tersebut.

Penelitian ini difokuskan untuk mengidentifikasi adanya polimorfisme

terkait gen CYP2A6 khususnya alel *4 pada isolat DNA nonperokok suku

Tionghoa di Indonesia dan mengetahui frekuensinya. Metode Polymerase Chain

Reaction (PCR) adalah metode yang dapat digunakan untuk mendeteksi alel

CYP2A6 *1 (wild type) dan CYP2A6 *4 (CYP2A6 deletion) (Shimizu et al., 2015;

Patramurti, 2017). PCR merupakan metode pengujian enzimatis yang digunakan

untuk mengamplifikasi suatu primer yang merupakan fragmen DNA pendek

dengan sekuen yang melengkapi target DNA (Garibyan and Avashia, 2013). Hasil

produk PCR akan dibaca dengan menggunakan metode elektroforesis.

METODE PENELITIAN

Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan pada penelitian ini berupa sampel darah non

perokok suku Tionghua Indonesia. Primer forward :5’-CCT CAT CAC ACA CAA

CTT CCT C-3’ dan primer reverse : 5’- CGC AGG TAC TGG GTG CTT GGT

AG-3’ (Stella, 2017), blue tip, yellow tip, white tip, Promega Go Taq Green Master

Mix (berisi taq DNA polymerase, dNTP, MgC12, dan buffer), kit DNA isolasi

(FavorPrep Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell) yang terdiri-dari FABG

buffer; etanol; W1 buffer; wash buffer, dan elution buffer, Nuclease Free Water

(Promega), FluoroVueTM Nucleid Acid Gel Stain (Smobio), Tris-Borate-EDTA

Buffer (TBE) pH 8,3 (10x) (Vivantis), Agarose Molecular Biology Grade

(Genedirex), DM3100 ExcelBandTM 1 KB (0.25-10 kb) DNA Ladder (Smobio),

DNA loading dye (bromophenol blue 25 mg; gliserol 3,3 mL; aqua pro injection

6,7 mL), etanol absolut (Sigma Chemical Co, St. Louis), aqua pro injection

(Ikapharmindo) dan es batu.

Alat Penelitian

Alat yang digunakan pada penelitian ini berupa Thermal cycler (Perkin

Elemer 2400), satu set elektroforensis horizontal (Sigma Aldrich), UV

Transilluminator (Fisher Scientific), Centrifuge (Fisher Scientific), disposable


4

gloves, ice box, microtubes 1,5 mL (Fisher Scientific), spuit injeksi 3 mL (Terumo),

mikropipet ukuran 1-10 µl (Socorex Acura 825), mikropipet ukuran 100-1000 µl

(Socorex Acura 825), timbangan analitik (Mettler AE 260), FABG column,

collection tube 2 mL, elution tube, hot plate (CimarecTM Thermo Scientific),

waterbath, vortex, oven, vacutainer K2 yang mengandung EDTA (4,5 mg), PCR ®

Tubes (Axygen), kamera mirrorless Fujifilm XA3 dan alat-alat gelas.

Tata Cara Penelitian

Penentuan Kriteria Subyek Uji Penelitian

Subyek uji pada penelitian ini berjumlah 30 orang yang memenuhi kriteria

inklusi. Subyek uji berjenis kelamin perempuan/laki-laki dewasa yang tidak

merokok atau pernah terpapar asap rokok. Subyek uji merupakan suku Tionghoa

asli minimal third degree relatives (kakek dan nenek orang Tionghoa asli) yang

tinggal di Yogyakarta (diketahui dari hasil wawancara). Subyek uji tidak sedang

mengkonsumsi obat rutin; tidak menderita penyakit hepar seperti hepatitis, sirosis

hati, hepatoma, dan penyakit lain yang dapat disebabkan oleh virus dan bakteri.

Pemilihan subyek uji dilakukan melalui wawancara langsung serta

pengisian kuisioner. Subyek uji dengan sadar bersedia menandatangani inform

consent. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang memenuhi kode etik yang telah

disetujui oleh Komisi Etik Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Duta Wacana.

Pengambilan Sampel Darah pada Subyek Uji

Sampel darah dari 30 subyek uji diambil oleh petugas profesional perawat.

Sampel darah diambil dari pembuluh vena subyek uji dan ditampung dalam

vacutainer K2 yang mengandung EDTA (5,4 mg). Darah segar yang diperoleh dari

subyek uji disimpan pada suhu ±20°C sebelum dianalisis untuk identifikasi alel

CYP2A6*4.

Isolasi DNA

Isolasi DNA dari sampel darah 30 subyek uji yang berbeda dilakukan

dengan menggunakan reagen Favorprep ™ Blood Genomic DNA Extraction Mini

Kit. Sampel darah subyek uji sebanyak 200 µl disiapkan dan dipindahkan ke

microsentrifuge tube 1,5 ml lalu ditambahkan 20 µl Proteinase K dan 200 µl FABG


5

buffer ke dalam sampel. Proteinase K jangan dicampur ke dalam FABG buffer lalu

divortex sebentar. Sampel diinkubasi pada 60 °C selama 15 sambil divortex setiap

3 menit untuk dilisiskan. Sampel dilakukan 2 kali vortex selama 30 detik masing-

masing. Sampel dilanjutkan dengan disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm

selama 30 detik dan supernatan dihilangkan dari tube. Sebanyak 200 µl etanol

absolut ditambahkan ke dalam sampel dan divortex selama 30 detik lalu dilanjutkan

dengan disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 30 detik. Pada saat itu

juga, W1 Buffer dan wash buffer ditambahkan etanol pada saat pertama kali dibuka.

Selanjutnya, FABG column dipasangkan pada 2 mL collection tube. Sentrifugasi

selama 1 menit pada kecepatan maksimal (13000 rpm) lalu dibuang cairan dalam 2

ml collection tube tersebut dan dipindahkan ke dalam 2 mL collection tube baru.

Kemudian FABG column dicuci dengan 500 µl W1 buffer dan disentrifugasi pada

kecepatan maksimal (13000 rpm) selama 1,5 menit. Cairan yang ada pada 2 mL

collection tube dibuang. FABG column kemudian dicuci dengan 750 µl wash buffer

yang sudah ditambahkan etanol dan diulangi langkah seperti diatas. FABG column

diletakkan kembali pada collection tube dan disentrifugasi dengan kecepatan

maksimal (13000 rpm) selama 1,5 menit lalu dibuang sisa cairan dalam collection

tube. FABG column disentrifugasi pada kecepatan maksimal (13000 rpm) selama 4

menit untuk mengeringkan kolom. FABG column yang sudah kering dipasangkan

ke 1,5 ml elution tube lalu ditambahkan 200 µl elution buffer yang sudah

dipanaskan ke tengah membran FABG column lalu didiamkan dengan posisi tegak

selama 3 menit agar elution buffer dapat terserap pada membran FABG column lalu

disentrifugasi pada kecepatan maksimal (13000 rpm) selama 3 menit untuk

mengelusi DNA. Hasil isolasi DNA dari subyek uji disimpan pada suhu -70°C.

Penyiapan Gel Agarose

Elektroforesis menggunakan gel agarose 1% dibuat dengan menimbang

250 mg agarose untuk dilakukan dalam 25 mL larutan 1x TBE kemudian

dipanaskan di atas hot plate sampai mendidih sambil diaduk dengan menggunakan

magnetic stirrer hingga gel agarose larut, lalu ditambahkan 2,5 µl larutan nucleic

acid gel stain dan diaduk hingga homogen. Larutan dituang sebanyak 25 ml ke

dalam cetakan gel yang telah diberi sisiran pada tepi gel dan gel dibiarkan mengeras.


6

Sisir dicabut setelah gel mengeras sehingga terbentuk sumur-sumur. Untuk

mengidentifikasi kemurnian isolat DNA digunakan konsentrasi agarose 1%, dan

digunakan konsentrasi agarose 1,5% untuk mengidentifikasi hasil PCR.

Analisis Kualitatif Isolat DNA

Isolat DNA sebanyak 4 µl ditambahkan aquabidest sebanyak 1 µl, lalu

ditambahkan loading dye sebanyak 1,0 µl. Kemudian campuran tersebut diambil

sejumlah 6 µl dan dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel menggunakan mikropipet.

Satu sumur gel diisi dengan 100 bp DNA ladder sebanyak 4 µl sebagai marker. Gel

agarosa ditempatkan di dalam gel tray elektroforesis berisi larutan buffer 1x TBE

dengan tegangan 100 volt selama 30 menit. Molekul DNA pada gel tray pada pH

netral akan bergerak ke kutub positif dari kutub negatif. Hasil elektroforesis berupa

gel agarosa dideteksi di bawah lampu UV Transilluminator kemudian

didokumentasikan dengan kamera DSLR. Panjang pita DNA dapat diketahui

dengan cara menarik garis lurus masing-masing pita DNA sampel dengan pita DNA

ladder.

Amplifikasi Alel CYP2A6 *4

Dilakukan amplifikasi untuk mendapatkan fragmen DNA dari alel

CYP2A6*4 dengan menggunakan primer forward: :5’-CCT CAT CAC ACA CAA

CTT CCT C-3’ dan primer reverse : 5’- CGC AGG TAC TGG GTG CTT GGT

AG-3’ (Stella, 2017). Reaksi PCR dilakukan dengan menggunakan Promega Go

Taq Green Marker Mix (berisi taq DNA polymerase, dNTP, MgC12, dan buffer)

dengan volume akhir campuran 25 µl, reagen 12,5 µl, primer forward 1,25 µl,

primer reverse 1,25µl, isolat DNA 5 µl, dan Nuclease-free water 5 µl. Amplifikasi

dilakukan dengan mesin PCR Thermal cycler (Perkin Elmer 2400). Kondisi PCR

yang digunakan yaitu sebagai berikut: initial denaturasi pada suhu 95°C (5’);

dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 98°C (20’’); annealing pada suhu 64 °C

(15’’) dan ekstensi pada suhu 72°C (30’’). Siklus amplifikasi dilakukan sebanyak

35 siklus kemudian diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72°C (5’) (Patramurti

et al., 2015).


7

Analisis produk PCR Menggunakan Teknik Elektroforesis

Analisis hasil amplifikasi produk PCR dilakukan elektroforesis dengan

menggunakan gel agarose 1,5% yang telah ditambahkan nucleic acid gel stain.

Hasil produk PCR sebanyak 5 µl ditambahkan loading dye sebesar 1 µl lalu dari

campuran diambil sebanyak 6 µl dengan mikropipet lalu dimasukkan ke sumur-

sumur gel agarose. Salah satu sumur diisi dengan DNA ladder sebanyak 3,0 µl

sebagai marker. Gel agarose ditempatkan dalam gel tray elektroforesis berisi buffer

TBE 1x hingga permukaan gel terendam dan dilakukan running elektroforesis

dengan tegangan sebesar 110 volt selama 30 menit. Gel agarosa kemudian dideteksi

di bawah lampu sinar UV Transilluminator kemudian DNA yang terekspresi

didokumentasikan dengan kamera mirrorless Fujifilm XA3. Produk PCR yang

terbentuk pada yaitu panjang pita 350 bp merupakan wild type (CYP2A6*1)

sedangkan apabila pada panjang 350 bp tidak terbentuk pita maka subyek uji

dikatakan memiliki bentuk polimorfi CYP2A6 alel *4.

Analisis Hasil

Hasil elektroforesis dengan panjang pita 350 bp dapat mendeteksi adanya

alel CYP2A6*1 dan CYP2A6*4 pada sampel. Terbentuknya hasil produk berupa

pita dengan panjang 350 bp menunjukkan bahwa isolat DNA yang dianalisis

memiliki alel CYP2A6*1. Jika tidak ditemukan hasil produk, dapat dinyatakan

bahwa isolat DNA yang dianalisis memiliki CYP2A6*4. Frekuensi alel CYP2A6*1

dan CYP2A6*4 dihitung dengan rumus berikut:

Frekuensi alel CYP2A6 ∗ 1 = Jumlah alel CYP2A6 ∗ 1 yang diperoleh

Jumlah seluruh subyek uji (30 orang)x 100 %



HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada penelitian polimorfisme gen CYP2A6 ini dilakukan lima tahapan

utama, yaitu pemilihan subyek uji, isolasi DNA, analisis kualitatif isolat DNA,

amplifikasi alel CYP2A6 *4, dan analisis produk PCR (Polymerase Chain Reaction)

dengan metode elektroforesis. Pada penelitian ini digunakan PCR sebagai suatu

teknik sintesis untuk amplifikasi DNA secara in vitro sehingga dapat mengetahui


8

ada tidaknya polimorfisme berupa CYP2A6 *4 pada isolat DNA nonperokok suku

Tionghoa di Indonesia. Bentuk alel CYP2A6 *4 merupakan bentuk alel yang tidak

aktif, sedangkan alel CYP2A6 *7 dan alel CYP2A6 *9 merupakan alel yang akan

menyebabkan penurunan aktivitas enzim sehingga dapat menurunkan risiko kanker

paru-paru (Patramurti, 2017). Pemilihan alel CYP2A6 *4 dikarenakan bentuk

polimorfi enzim CYP2A6 banyak ditemukan pada orang Asia dengan frekuensi alel

non aktif yang tinggi. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi terkait

variasi alel pada populasi nonperokok suku Tionghoa di Indonesia. Penelitian ini

juga dapat dijadikan dasar edukasi di bidang Farmasi sebagai usaha preventif

merokok dan ketergantungan terhadap rokok dengan informasi terkait CYP2A6 *4.

Pemilihan Subyek Uji

Penelitian ini menggunakan subyek uji berjumlah 30 orang yaitu 17 orang

berjenis kelamin perempuan dan 13 orang berjenis kelamin laki-laki dewasa (17-25

tahun), keturunan suku Tionghoa asli minimal third degree relatives (kakek dan

nenek orang Tionghoa asli) yang tinggal di Yogyakarta. Dewasa yang dimaksud

dalam kriteria merupakan individu yang memiliki pertanggung jawaban penuh

terhadap diri sendiri, memahami norma-norma susila dan nilai-nilai etis, serta dapat

mengerti isi dari inform consent. Subyek uji yang digunakan tidak sedang

mengkonsumsi obat rutin; menderita penyakit hepar seperti hepatitis, sirosis hati,

hepatoma. Metode PCR dapat mendeteksi DNA baik manusia maupun DNA virus

dan bakteri, sehingga subjek uji yang mengalami penyakit akibat virus dan bakteri

di eksklusi. Subyek uji dipilih sejumlah 30 orang karena jumlah tersebut sudah

dapat digunakan untuk mendeteksi dua alel pada penelitian ini yaitu CYP2A6 *1

(wild type)/ alel utama dan CYP2A6 *4 (alel minor) dengan probabilitas tinggi (B-

Rao, 2001). Jumlah sampel minimal yang dibutuhkan untuk melihat polimorfisme

pada alel yang langka dapat dihitung dengan persamaan dibawah ini:

Nmin ≥ log (1-π )/2 log (1-fmin)

Dengan keterangan Nmin menunjukkan jumlah sampel minimal, π (phi)

menunjukkan probabilitas alel utama (0,95) dan fmin menunjukkan Frekuensi Alel

Minor (0,05). Berdasarkan hasil yang didapatkan maka dapat disimpulkan jumlah

sampel minimal untuk penelitian ini adalah lebih dari 29 orang (B-rao, 2001).


9

Isolasi DNA

Isolasi DNA dari sampel darah dilakukan dengan menggunakan

Favorprep™ Blood Genomic DNA Extraction Mini Kit. Tujuan isolasi DNA adalah

untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat.

Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah berupa penghancuran (lisis) membran

dan dinding sel yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel dengan menambahkan

FABG buffer dan ditambahkan Proteinase K (Hidayati et al., 2016). Selain untuk

melisiskan sel, Proteinase K juga berfungsi untuk menghilangkan kontaminan

berupa protein dengan cara mendegradasi protein atau menghancurkan protein

sehingga membran sel rusak dan seluruh isi sel keluar (Fitriya et al., 2012;

Kameliah, 2017). Dalam proses ini digunakan vortex untuk membantu proses lisis

sel dengan prinsip menggunakan bantuan listrik (Utami, et al,, 2013). Sampel yang

sudah divortex akan diinkubasi pada 60 °C selama 15 menit dan perlu dibolak-balik

dengan tujuan agar larutan buffer dapat melisiskan sel dengan sempurna (Mulyani

et al., 2011). Sampel disentrifugasi agar terjadi pemisahan DNA dari bahan padat

seperti protein. Setelah tahapan pemisahan DNA, sampel ditambahkan dengan

etanol absolut dengan tujuan untuk mempresipitasi DNA agar DNA dapat

menggumpal dan membentuk struktur fiber dan pellet DNA yang berupa endapan

kering setelah disentrifugasi (Hidayati et al., 2016). Presipitasi juga berfungsi untuk

menghilangkan residu-residu yang berasal dari tahapan ekstraksi/pemisahan DNA.

Selanjutnya dilakukan tahapan pencucian DNA dengan ditambahkan W1 Buffer dan

wash buffer untuk memisahkan senyawa lain dan menghilangkan residu etanol dan

sisa garam yang ikut mengendap bersama endapan DNA untuk memurnikan DNA

dan berfungsi sebagai langkah awal protokol elusi (Mulyani et al., 2011; Utami et

al., 2013; Kamaliah, 2017). Setelah itu, FABG column diletakkan kembali pada

collection tube dan disentrifugasi dengan kecepatan maksimal (13000 rpm) selama

4 menit untuk mengeringkan kolom. FABG column yang sudah kering ditambahkan

elution buffer untuk mengelusi DNA sehingga dihasilkan DNA yang murni

sebelum sentrifugasi pada tahap terakhir (Utami et al., 2013). Tahap purifikasi

bertujuan untuk memurnikan DNA dari makromolekul sel lainnya setelah sel

dihancurkan. Terakhir, ekstrak DNA yang telah diperoleh dan terlarut dalam buffer


10

disimpan di dalam freezer yang bersuhu -20 °C agar DNA hasil isolasi tidak rusak

(Marwayana, 2019). Kemurnian dari isolat DNA yang diisolasi dapat ditentukan

dari ada tidaknya kontaminan seperti protein dan RNA dengan menggunakan

teknik elektroforesis (Hidayati et al., 2016).

Analisis Kualitatif Isolat DNA

Hasil isolasi DNA diuji secara kualitatif dengan teknik elektroforesis

menggunakan gel agarose 1% (Hidayati et al., 2016). Isolat DNA yang telah

dijalankan (running) dengan teknik elektroforesis kemudian diamati dan hasilnya

akan berupa pita-pita DNA yang tervisualisasi dibawah UV transilluminator.

Kemurnian isolat DNA dapat diketahui dengan adanya pita tunggal DNA jika

diamati dibawah UV transilluminator. Bila sampel DNA menunjukkan hasil berupa

pita tunggal yang terang dan tebal maka disimpulkan sampel DNA memiliki

konsentrasi dan tingkat kemurnian yang tinggi. Namun apabila pita yang

didapatkan menunjukkan hasil yang tipis, maka hal tersebut mengindikasikan

bahwa konsentrasi DNA yang dihasilkan kecil (Mulyani et al., 2011; Hidayati et

al., 2016). Hasil elektroforesis menunjukkan terbentuknya pita tunggal yang terang

dan tebal dengan ukuran lebih dari 10000 bp (Gambar 1).

Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA

menggunakan teknik elektroforesis

Keterangan:

M : 1KB (0,25-10 kb) DNA ladder sebagai marker

1-5 : Isolat DNA dengan pita tunggal dan tebal

Kondisi elektroforesis : Fase diam agarose 1,0%; fase gerak larutan TBE 1X, volume injeksi 6 µl;

kecepatan 100 V/cm selama 30 menit

M 1 2 3 4 5

10000 bp Isolat

DNA


11

Bila terdapat smear berarti sampel isolat DNA yang diteliti tidak murni,

tercemar atau terdapat kontaminan bahkan terdegradasi. Smear merupakan sisa dari

larutan-larutan yang masih terbawa selama proses isolasi atau DNA yang

terdegradasi pada proses isolasi (Mulyani et al., 2011). Hasil uji kualitas isolat DNA

yang dilakukan menunjukkan sampel isolat DNA bersifat murni dan dapat

digunakan sebagai template untuk identifikasi polimorfisme CYP2A6 *4

(Patramurti et al., 2017).

Amplifikasi Alel CYP2A6 *4

Polimorfisme gen CYP2A6 dapat mengubah kecepatan aktivasi NNN dan

NNK sehingga dapat menurunkan risiko terjadinya kanker paru yang berhubungan

dengan produk tembakau (Rossini et al., 2008). Alel CYP2A6 *1 merupakan

bentuk aktif CYP2A6, dan merupakan alel normal (wild type) sedangkan CYP2A6

*4 merupakan bentuk tidak aktif. Subyek dengan alel CYP2A6 *1/*4 termasuk

dalam golongan slow metabolizer dan dapat mengalami penurunan aktivitas enzim

sebesar 50%. Aktivasi senyawa prokarsinogen dapat meningkatkan resiko

terjadinya kanker paru yang disebabkan oleh asap rokok (Akrodou, 2015; Tanner

dan Tyndale, 2017). Alel CYP2A6*4 terdiri dari crossover homolog yang tidak

sama dengan CYP2A7 pada beberapa posisi (CYP2A6 *4A-F) yang mengarah

terjadinya delesi pada keseluruhan gen secara homogen sehingga berdampak

fungsional pada tidak diekspresikannya mRNA dan protein atau hilangnya aktivitas

enzimatik (Ito et al., 2015; Lopez-Flores et al., 2016).

Amplifikasi alel CYP2A6*4 pada penelitian ini dilakukan dengan

menggunakan metode PCR. Komponen-komponen yang diperlukan dalam proses

amplifikasi dengan metode PCR adalah berupa template DNA; sepasang primer,

yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang

komplementer dengan urutan nukleotida DNA template; dNTPs (Deoxynucleotide

triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan enzim DNA

polimerase (Handoyo dan Rudiretna, 2001). Pada penelitian ini, kondisi PCR

optimum yang digunakan yaitu initial denaturasi pada suhu 95°C (5’); dilanjutkan

dengan denaturasi pada suhu 98 °C (20’’); annealing pada suhu 64°C (15’’) dan

ekstensi pada suhu 72°C (30’’). Siklus amplifikasi dilakukan sebanyak 35 siklus


12

kemudian diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72°C (5’) (Patramurti et al.,

2015). Proses pemilihan primer juga sangat penting dilakukan karena pemilihan

primer berkaitan dengan keberhasilan proses amplifikasi DNA target (Surahman et

al., 2007). Jika primer yang digunakan tidak spesifik dan tidak sesuai dengan

sekuens nukleotida target maka proses penggandaan oleh enzim taq-polymerase

tidak akan terjadi sehingga amplifikasi tidak dapat berlangsung. Optimasi suhu

annealing juga penting untuk dilakukan karena berkaitan dengan spesifisitas

produk PCR dan keberhasilan amplifikasi produk PCR. Jika suhu annealing terlalu

rendah, maka penempelan primer pada DNA template tidak spesifik dan akan

menyebabkan multiple band pada hasil elektroforesis sehingga menghasilkan

produk PCR yang tidak spesifik (unspecific band), bila suhu annealing yang terlalu

tinggi maka penempelan primer pada DNA template akan lepas sehingga hasilnya

dapat menjadi kurang jelas (Hidayati et al., 2016; Yuenleni et al., 2019). Untuk

mengamplifikasi fragmen DNA dari alel CYP2A6 *4, digunakan primer spesifik

yang akan menempel pada CYP2A6 *1. Primer yang digunakan berupa primer

forward: 5’-CCT CAT CAC ACA CAA CTT CCT C-3’ dan primer reverse: 5’-

CGC AGG TAC TGG GTG CTT GGT AG-3’. Situs penempelan primer pada

sekuen urutan basa potongan gen CYP2A6 *1 diilustrasikan pada Gambar 2.

Alel CYP2A6 *1

Primer forward

5’ 3’

CCT CATCACACACAACTTCCT C CTACCAAGCACCCAGTACCTGCG

GGAGTAGTGTGTGTTGAAGGAG GATGGTTCGTGGGTCATGGACGC

5’ 3’

Primer reverse

Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen urutan basa potongan gen

CYP2A6*1

Keterangan:

: arah penempelan primer reverse

: arah penempelan primer forward

Identifikasi ada tidaknya CYP2A6*4 menggunakan primer forward dan

reverse spesifik untuk mengamplifikasi CYP2A6*1. Amplifikasi dengan

menggunakan primer spesifik tersebut dapat menghasilkan produk PCR berukuran

350-bp yang merupakan alel normal (CYP2A6 *1). Isolat DNA dari subyek uji

yang memiliki alel CYP2A6 *4 tidak akan membentuk pita pada saat diamati


13

dibawah UV Transilluminator karena alel *4 memiliki perbedaan basa G (guanin)

menjadi A (adenin) pada sisi penempelan primer reverse dengan alel *1 pada basa

ke -10993.

Adanya perbedaan basa antara CYP2A6 *1 dan CYP2A6 *4 dapat dilihat

dari gambar 3 sebagai berikut:

A : CCTCATCACACACAACTTCCTCCTCCCTACCAGGGCACCGAAGTGTTCCC

B : CCTCATCACACACAACTTCCTCCTCCCTACCAGGGCACCGAAGTGTTCCC

A : TATGCTGGGCTCTGTGCTGAGAGACCCCAGTTTCTTCTCCAACCCCCAGG

B : TATGCTGGGCTCCGTGCTGAGAGACCCCAGCTTCTTCTCCAACCCTCAGG

A : ACTTCAATCCCCAGCACTTCCTGAATGAGAAGGGGCAGTTTAAGAAGAGT

B : ACTTCAATCCCCAGCATTTCCTGAATGAGAAGGGGCAGTTTAAGAAGAGT

A : GATGCTTTTGTGCCCTTTTCCATCGGTAAGAGACCACTGTTTGCTGCCAG

B : GATGCTTTTGTGCCCTTTTCCATCGGTAAGAGACCACTGTTTGCTGCCAG

A : GCCACGGCTCACACCAGCAGGGGCCTCCCTCACCCTCCTCCCCTCTCTGC

B : GCCACGGCTCACACCAGCAGGCGCCTCCCTCACCCTCCTCCCCTCTCTGC

A : GGTGTAGCCTGGTATTTCTCCAGCTTGGAAGTTCCTGTTAGAATCTACCC

B : GGTGTAGCCTGGTATTTCTCCAGCTTGGAAGTTCCTGTTAGAATCTACCC

A : TTGAGCCAGCAGCTGATACTTCCTTAACTACCAAGCACCCAGTACCTGCG

B : TTGAGCCAGCAGCTGATACTTCCTTAACTACCAAGCACCCAGTACCTGCA

Gambar 3. Urutan nukleotida potongan urutan basa CYP2A6 *1 dan *4

Keterangan :

A : potongan urutan basa CYP2A6 *1

B : potongan urutan basa CYP2A6 *4

Analisis Produk PCR dengan Teknik elektroforesis

Pada penelitian yang dilakukan oleh Antona et al (2009) dijelaskan proses

polimorfisme genetik yang terjadi dan gen dapat mempengaruhi peningkatan risiko

kanker yang disebabkan oleh paparan asap rokok. Berdasarkan pengelompokkan

genotip dari CYP2A6, maka aktivitas enzim CYP2A6 dapat dibagi menjadi tiga

kelompok, yaitu normal metabolizers (genotipe CYP2A6*1/*1), slow metabolizers

(genotipe CYP2A6*1/*4; CYP2A6*1/*9, CYP2A6*1/*9/*4, CYP2A6*9/*9)

aktivitas metabolismenya 50% lebih lambat dibandingkan dengan normal

metabolizers) dan poor metabolizers (genotipe CYP2A6*4/*4, CYP2A6*4/*9);

aktivitas metabolismenya 25% lebih lambat dibandingkan dengan normal

metabolizers) (Mwenifumbo et al., 2010).


14

Hasil produk PCR dapat diidentifikasi dengan menggunakan teknik

elektroforesis. Urutan basa potongan alel CYP2A6 *1 dan CYP2A6 *4 memiliki

perbedaan pada basa -10993 sehingga menyebabkan tidak terjadinya amplifikasi

dan tidak terbentuknya pita gel agarosa. Gambar 4 Menunjukkan hasil

elektroforesis produk PCR yang diamati dengan UV transilluminator dan

didokumentasikan dengan kamera DSLR mirrorless Fujifilm XA3. Dari gambar

tersebut dapat dilihat bahwa lima dari tujuh isolat DNA yang diamplifikasi

menghasilkan produk PCR dengan panjang pita 350-bp. Terbentuknya hasil produk

berupa pita dengan panjang 350-bp menunjukkan bahwa isolat DNA yang

dianalisis memiliki alel normal CYP2A6*1 (wild type). Apabila hasil menunjukan

bahwa tidak terbentuk pita pada panjang 350-bp maka dapat dinyatakan bahwa

isolat DNA yang dianalisis memiliki CYP2A6*4 karena tidak terjadi amplifikasi.

Hasil produk PCR yang tidak dapat diamplifikasi dan tidak membentuk pita

menunjukkan bahwa subyek uji mengalami polimorfisme sehingga tidak dapat

diamplifikasi menggunakan primer yang digunakan.

Gambar 4. Elektroforegram produk PCR dari berbagai hasil pita

Keterangan:

M : 1KB (0,25-10 Kb) DNA ladder sebagai marker

2&6 : tidak terbentuk pita pada produk PCR

1,3-5,7 : produk PCR dengan pita tebal dan tunggal

Kondisi elektroforesis : Fase diam agarose 1,5%; fase gerak larutan TBE 1X, volume injeksi

6 µl; kecepatan 110 V/cm selama 30 menit

Dari 30 sampel yang diamplifikasi dan dianalisa dengan menggunakan

teknik elektroforesis, didapatkan bahwa 9 sampel tidak menghasilkan pita dan 21

sampel menghasilkan pita. Sehingga dengan demikian, pada penelitian ini

M 1 2 3 4 5 6 7

Produk PCR

350-bp

10000 bp

500 bp

200 bp Produk PCR

350-bp

dengan pita

tunggal dan

terang

Produk PCR

tidak

terbentuk

ekspresi pita


15

teridentifikasi sebanyak 21 orang (70%) dari subyek yang diuji memiliki alel aktif

(CYP2A6*1) dan 9 orang (30%) memiliki bentuk alel tidak aktif (CYP2A6*4) dan

data tersebut disajikan dalam tabel 1. Subjek yang memiliki alel CYP2A6*4 tidak

dapat mengaktivasi nitrosamin seperti NNK dan NNN yang terkandung dalam asap

tembakau sebagai karsinogen hasil nikotin, sehingga hal ini akan berakibat pada

berkurangnya risiko kanker yang diinduksi oleh asap rokok dari tembakau (Liu et

al., 2013).

Tabel I. Frekuensi Alel CYP2A6 *1 dan alel CYP2A6 *4 pada suku Tionghoa

Alel Jumlah Subyek Frekuensi Alel

CYP2A6 *1 21 70%

CYP2A6 *4 9 30%

Hasil penelitian menunjukkan bahwa 9 dari subyek uji nonperokok

termasuk dalam kategori slow metabolizer. Keberadaan alel CYP2A6 *4

menandakan subyek uji dapat mengalami penurunan aktivasi prokarsinogen

sehingga hal tersebut dapat berdampak pada penurunan risiko kanker paru yang

disebabkan oleh asap rokok (Tanner dan Tyndale, 2017). Namun, hal tersebut tidak

menutup kemungkinan bahwa individu dengan polimorfisme alel CYP2A6 *4 tidak

akan mengalami kanker paru karena faktor penyebab kanker paru juga mencakupi

antara lain: makanan, hormon, alcohol, paparan sinar matahari (Blackadar, 2016).

Polimorfisme gen CYP2A6 *4 juga dapat mempengaruhi metabolisme

beberapa obat, seperti: obat prodrug Tegafur yang dimetabolisme menjadi

5’hydroxytegafur dan dapat dipecah menjadi 5-fluorouracil (5 FU) yang kemudian

menjadi metabolit aktif untuk terapi antikanker. Gen delesi alel CYP2A6*4 dapat

menurunkan kadar mRNA dan protein pada sampel hati manusia secara signifikan

sehingga berkorelasi dengan penurunan metabolisme Tegafur secara in vitro dan in

vivo. Dengan adanya genotipe CYP2A6 poor-metabolizer menyebabkan penurunan

metabolisme Tegafur menjadi 5-FU sehingga menurunkan efikasi anti-tumor.

Selain itu, individu yang memiliki gen delesi alel *4 juga dapat meningkatkan kadar

plasma obat asam valproat yang digunakan sebagai terapi anti-epilepsi sehingga

menurunkan aktivitas metabolit enzim CYP2A6 yang kemudian menginduksi


16

peningkatan paparan terhadap obat yang berakibat hepatotoksisitas pada manusia

(Mcdonagh et al., 2012). Sehingga penelitian terkait polimorfisme enzim ini

penting untuk dilakukan lebih lanjut agar dapat mendeteksi tingkat risiko suatu

penyakit dalam suatu populasi dan dapat meningkatkan pemahaman suatu

mekanisme penyebab/etiologi penyakit (Kelada et al., 2003).

KESIMPULAN

Hasil amplifikasi isolat DNA pada subyek uji suku Tionghoa di Indonesia

yang dianalisis dengan teknik elektroforesis menunjukan bahwa terdapat 9 individu

yang teridentifikasi mengalami polimorfisme dan memiliki alel CYP2A6 *4

sehingga didapatkan frekuensi alel tersebut yaitu sebesar 30%.

SARAN

Peneliti menyarakan perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai

identifikasi gen sitokrom CYP2A6 di Indonesia dengan jumlah subyek uji lebih

besar dan terdistribusi merata di Indonesia.


17

DAFTAR PUSTAKA

Antona, C. R., Gomez, A., Karlgren, M., Sim, S. C., dan Ingelman-Sundberg, M.,

2009. Molecular Genetics and Epigenetics of the Cytochrome P450 Gene

Family and Its Relevance for Cancer Risk and Treatment. Human

Genetics, 127, 1-17.

Barber, S., Adioetomo, S. M., Ahsan, A., dan Setyonaluri, D., 2008. Tembakau di

Indonesia. Jakarta: Lembaga Demografi Fakultas Ekonomi Universitas

Indonesia.

Blackadar, C. B., 2016. Historical review of the causes of cancer. World Journal of

Clinical Oncology, 7(1), 54.

B-rao, C., 2001. Sample size considerations in genetic polymorphism studies.

Human heredity, 52, 191-200.

Brown, B. G., Borschke, A. J., & Doolittle, D. J., 2003. An Analysis of the Role of

Tobacco-Specific Nitrosamines in the Carcinogenicity of Tobacco

Smoke. Nonlinearity in Biology, Toxicology, Medicine, 1(2),

154014203914343.

Christian, S. A., 2017. Identitas Budaya Orang Tionghoa Indonesia. Jurnal

Cakrawala Mandarin, 1(1), 11-22.

Fitriya, R. T., Ibrahim, M., dan Lisdiana, L., 2015. Keefektifan Metode Isolasi DNA

Kit dan CTAB/NaCl yang Dimodifikasi pada Staphylococcus aureus dan

Shigella dysentriae, LenteraBio, 4(1), 87-92.

Flores, L., Rubio, P., dan Valencia, F., 2017. Distribution of Polymorphic Variants

of CYP2A6 And Their Involvement in Nicotine Addiction. Experimental

and Clinical Science Journal, 16, 174-196.

Garibyan, L., dan Avashia, N., 2013. Polymerase Chain Reaction. Journal of

Investigative Dermatology, 133(3), 1–4.

Gupta, C., 2001. The Public Health Impact Tobacco. Current Sciences, 81(5).

Handoyo, D., dan Rudiretna, A., 2001. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase

Chain Reaction (PCR). Unitas, 9(1), 17-29.

Hidayati, Saleh. E., dan Aulawi, T., 2016. Identifikasi Keragaman Gen Bmpr-1b

(Bone Morphogenetic Protein Receptor Ib) Pada Ayam Arab,Ayam

Kampung Dan Ayam Ras Petelur Menggunakan PCR-RFLP. Jurnal

Peternakan, 13(1), 1-12.

Hoffman, D., dan Hoffman, I., 1997. The Changing Cigarette, 1950-1995. Journal

of Toxicology and Enviromental Health, 50(4), 307-364.

Ito, T., Tsuji, M., Mori, Y., Kanda, H., Hidaka, T., Kakamu, T., Fukushima, And

T., 2015. Effect Of Cyp2a6*4 Genetic Polymorphisms On Smoking

Behaviors And Nicotine Dependence In A General Population Of

Japanese Men. Fukushima Journal Of Medical Science, 61(2), 125–130.

Kamaliah, 2017. Perbandingan Metode Ekstraksi DNA Phenol-Chloroform dan Kit

Extraction Pada Sapi Aceh Dan Sapi Madura, Jurnal Biotik, 5(1), 60-65.

Kelada, S. N., Eaton, D. L., Wang, S. S., Rothman, N. R., & Khoury, M. J., 2003.

The Role of Genetic Polymorphisms in Environmental Health.

Environmental Health Perspectives, 111(8), 1055–1064.


18

Liu, Y., Xu, Y., Li, F., Chen, H., & Guo, S., 2013. CYP2A6 deletion polymorphism

is associated with decreased susceptibility of lung cancer in Asian

smokers: a meta-analysis. Tumor Biology, 34(5), 2651–2657.

Malaiyandi, V., Lerman, C., Benowitz, NL., Jepson, C., Patterson, F., dan Tyndale,

R. F., 2006. Impact of CYP2A6 Genotype On Pretreatment Smoking

Behaviour and Nicotine Levels from and Usage of Nicotine Replacement

Therapy. Molecular Psychiatry, 11, 400-409.

Marwayana, O., 2015. Ekstraksi Asam Deoksiribonukleat (DNA) Dari Sampel

Jaringan Otot. Oseana, 9(2), 1-9.

McDonagh, E. M., Wassenaar, C., David, S. P., Tyndale, R. F., Altman, R. B.,

Carrillo-Whirl, M., dan Klein, T. E., 2012. PharmGKB Summary: Very

Important Pharmacogene Information For Cytochrome P-450, family 2,

subfamily A, polypeptide 6. Pharmacogenetics and Genomics, 22, 695-

708.

Mulyani, Y., Purwanto, A., dan Nurruhwati, I., 2011. Perbandingan Beberapa

Metode Isolasi DNA untuk Deteksi Dini KOI Herpes Virus (KHV) pada

Ikan Mas (Cyripnus caprio L.). Jurnal Akuatika, 2(1), 2-15.

Mwenifumbo, J. C., Zhou, Q., Benowitz, N. L., Sellers, E. M., & Tyndale, R. F.,

2010. New CYP2A6gene deletion and conversion variants in a population

of Black African descent. Pharmacogenomics, 11(2), 189–198.

Nakajima, M., & Yokoi, T., 2005. Interindividual Variability in Nicotine

Metabolism: C-Oxidation and Glucuronidation. Drug Metabolism and

Pharmacokinetics, 20(4), 227–235.

Patramurti, C., dan Fenty, 2017. Studi Genotipe Sitokrom P450 2A6 Alel

CYP2A6*4 dan CYP2A6*9 pada Subyek Uji Perokok Suku Jawa

Indonesia. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 15(1), 50-56.

Plianbangchang, S., 2011. Global Adult Tobacco Survey: Indonesia.

Raunio, H., Rautio, A., Gullsten, H., dan Pelkonen, O., 2001. Polymorphisms of

CYP2A6 and Its Practical Consequences. Journal of Clinical

Pharmacology, 52, 357-363.

Rossini, A., Simao, T. A., Albano, R. M., Pinto, L. F. R., 2008. CYP2A6

Polymorphisms and Risk for Tobacco-Related Cancers.

Pharmacogenomics, 9 (11), 1737-1752.

Shimizu, M., Koyama, T., dan Kishimoto, I., 2015. Dataset for Genotyping

Validation of Cytochrome P450 2A6 Whole-gene Deletion (CYP2A6 *4)

By Real-Time Polymerase Chain Reaction Platforms, Elsevier, 642-645.

Tanner, J. A., dan Tyndale, R. F., 2017. Variation in CYP2A6 Activity and

Personalized Medicine. Journal of Personalized Medicine, 7(18), 1-29.

Utami, S. T., Kusharyati, D. F., dan Pramono, H., 2013. Pemeriksaan Bakteri

Leptospirapada Sampel Darah Manusia Suspect Leptospirosis

Menggunakan Metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Balaba, 9(2),

74-81.

WHO, 2019. Second Hand Tobacco Smoke (Online).

https://www.who.int/tobacco/research/secondhand_smoke/en/ diakses

pada tanggal 20 April 2019, pukul 19.20


https://www.who.int/tobacco/research/secondhand_smoke/en/

19

Xue, J., Yang, S., dan Seng, S., 2014. Mechanisms of Cancer Induction by Tobacco-

Specific NNK and NNN. Cancers (Basel), 6(2), 1138-1156.

Yoshida, R., Nakajima, M., Watanabe, Y., Kwon, J.-T., & Yokoi, T., 2002. Genetic

polymorphisms in human CYP2A6 gene causing impaired nicotine

metabolism. British Journal of Clinical Pharmacology, 54(5), 511–517.

Yuenleni, 2019. Langkah-Langkah Optimasi PCR. Indonesian Journal of

Laboratory, 1(3), 51-56.


20

LAMPIRAN


21

Lampiran 1. Ethical Clearance Penelitian


22

Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis


23

Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix


24

Lampiran 4. Product Datasheet of Primer Forward and Reverse CYP2A6 *4


25

Lampiran 5. Product Datasheet of DNA ladder and marker


26

Lampiran 6. Product Datasheet of FluorovueTM Nucleid Acid Gel Stain


27

Lampiran 7. Product Datasheet of FavorPrepTM Blood Genomic Mini DNA

Extraction Kit


28

Lampiran 8. Elektrofogram Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA Suku Tionghoa

M 1 2 3 4 5


29

Lampiran 9. Elektroforegram Hasil PCR CYP2A6 *4

M 1 2 3 4 5 6 7

M 8 9 10 11 12 13 14


30

M 15 16 17 18 19 20 21

M 22 23 24 25 27 28 26

M 29 30


31

Lampiran 10. Data Subyek

Kode Polimorfisme

CYP2A6 *4

Risiko terkena

kanker paru akibat

asap rokok

1T Tidak ada Normal

2T Ada Rendah

3T Tidak ada Normal

4T Tidak ada Normal

5T Tidak ada Normal

6T Ada Rendah

7T Tidak ada Normal

8T Tidak ada Normal

9T Tidak ada Normal

10T Tidak ada Normal




14T Ada Rendah


16T Ada Rendah







23T Ada Rendah




27T Ada Rendah

28T Ada Rendah

29T Ada Rendah

30T Ada Rendah


32

Lampiran 11. Frekuensi Alel

Alel Jumlah Subyek Frekuensi Alel

CYP2A6 *1 21 70%

CYP2A6 *4 9 30%



=21

30x 100% = 70%



=9

30x 100% = 30%


33

Lampiran 12. Inform Consent

FORMULIR KUISIONER SUBJEK UJI

Nama : ..........................................................

Tempat/tgl.lahir : ..........................................................

Umur : .............tahun

Jenis kelamin : laki-laki/perempuan

No. Tlp. (WhatsApp) : .........................................................

Alamat : .....................................................................................

...............................

Jawablah pertanyaan berikut!

1. Apakah Anda merupakan keturunan asli Papua?*

Jawab : Ya/Tidak

*Asli Papua : Kakek dan nenek, Ibu dan Bapak keturunan asli Papua

2. Apakah Anda seorang perokok?

Jawab : Ya/Tidak

3. Apakah Anda pernah merokok?

Jawab : Ya/Tidak

4. Jika Anda pernah merokok, kapan terakhir kali Anda merokok? (jika

tidak pernah merokok, tidak perlu menjawab pertanyaan ini)

A. < 5 tahun

B. > 5 tahun

5. Apakah Anda tinggal di lingkungan perokok?

Jawab : Ya/Tidak

6. Seberapa sering orang lain merokok di dalam tempat tinggal Anda?

A. Setiap hari

B. Setiap minggu

C. Setiap bulan

D. Tidak pernah


34

7. Seberapa sering anda terpapar asap rokok orang lain?

A. Tidak pernah

B. Jarang/kadang-kadang

C. Sering

D. Sangat sering

8. Apakah saat ini anda sedang sakit?

A. Tidak

B. Ya

9. Jika anda sedang sakit, sakit apa yang anda alami? Dan sudah berapa

lama?

Jawab: ............................................................./.....................................


35

LEMBAR INFORMASI UNTUK RESPONDEN

Saya Dr. Christine Patramurti, Apt. dari Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma akan melakukan penelitian yang berjudul “Identifikasi Alel Gen

Sitokrom P450 2A6 *4, *7, dan *9 pada Subjek Uji Nonperokok Suku Tionghoa

dan Ras Kulit Hitam Papua Indonesia dengan Metode Polymerase Chain Reaction

(PCR)”. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan dan frekuensi alel

gen Sitokrom P450 2A6 *4, *7, dan *9 pada subjek uji nonperokok suku Tionghoa

dan ras kulit hitam Papua Indonesia. Peneliti mengajak saudara/i, untuk ikut serta

dalam penelitian ini. Penelitian ini membutuhkan sekitar 30 subjek uji, dengan

jangka waktu keikutsertaan masing-masing subjek sekitar 2 hari.

A. Kesukarelaan untuk ikut penelitian

Keikutsertaan saudara/i bersifat sukarela, saudara/i dapat mengundurkan

diri dari penelitian setiap saat tanpa dikenakan denda.

B. Prosedur Penelitian

Penelitian ini akan dilakukan pada penduduk Indonesia dari suku

Tionghoa dan ras kulit hitam Papua. Semua subjek uji berjenis kelamin laki-laki atau

perempuan dan merupakan penduduk asli Indonesia ras Tionghoa dan ras kulit hitam

Papua asli, yang ditunjukkan dari Kartu Identitas Penduduk yang dimiliki dan telah

mengisi kuisioner serta inform consent.

Subjek uji kelompok nonperokok yang terpapar asap rokok orang lain

(perokok pasif), dalam keadaan sehat yaitu tidak sedang sakit akibat virus atau

bakteri. Jumlah subjek uji masing-masing 30 orang untuk tiap kelompok suku

Tionghoa dan ras kulit hitam Papua.

Sampel biologis yang akan digunakan pada penelitian ini berupa sampel

darah. Jumlah sampel biologis yang diambil adalah sebanyak 3 mL. Sampel darah

yang diambil dibagian pembuluh darah vena.

Pengambilan sampel darah akan dilakukan di Laboratorium Biokimia

Universitas Sanata Dharma oleh tim medis (perawat) yang terlatih,

berpengalaman, dan professional.


36

C. Risiko dan Efek Samping dan Penanganannya

Pada penelitian ini tidak dilakukan pemberian intervensi kepada subjek

uji. Risiko yang mungkin terjadi pada saat pengambilan darah diatasi dengan

mengeliminasi subjek yang mungkin tidak punya keberanian untuk diambil

darahnya. Ruangan yang memadai saat pengambilan darah juga mendukung

situasi yang aman bagi subjek uji. Selain itu setelah pengambilan darah, subjek uji

diberikan waktu untuk istirahat.

Untuk memperkecil risiko yang mungkin terjadi, pengambilan darah

dilakukan oleh tenaga medis perawat yang terlatih, berpengalaman, dan

professional. Alat-alat yang dipakai juga telah memenuhi standar untuk proses

pengambilan darah.

D. Manfaat

Penelitian ini mempunyai manfaat bagi subjek uji, yaitu memberikan

informasi bahwa risiko kanker akibat paparan asap rokok orang lain dapat

dipengaruhi gen individu tersebut.

E. Kerahasiaan

Informasi yang didapat dari penelitian ini bersifat rahasia, hanya akan

digunakan untuk tujuan penelitian.

F. Pembiayaan

Jika pada saat pengambilan sampel darah terjadi kesalahan yang

mengakibatkan subjek mengalami pendarahan, maka semua beban biaya yang

dikeluarkan untuk mengatasi kesalahan ini ditanggung sepenuhnya oleh peneliti.

G. Kompensasi

Peneliti mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada saudara/i

yang telah berkenan ikut serta dalam penelitian ini. Serta sebagai ungkapan terima

kasih peneliti memberikan uang kompensasi sebesar Rp.50.000,00.

H. Informasi Tambahan

Saudara/i diberi kesempatan untuk menanyakan semua hal yang belum

jelas sehubungan dengan penelitian ini. Bila sewaktu-waktu terdapat pertanyaan

atau membutuhkan penjelasan lebih lanjut, saudara/bapak dapat menghubungi Dr.


37

Christine Patramurti, Apt. pada no. Hp 085729800913.

Saudara/i juga dapat menanyakan tentang penelitian kepada Komite Etik

Penelitian Kedokteran dan Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah

Mada Yogyakarta.


38

Lampiran 13. Formulir Kuisioner Subyek Uji dan Inform Consent


39


40


41

BIOGRAFI PENULIS

Penulis bernama Vink Dellin, lahir di Tanjung Balai

Karimun tanggal 19 Febuari 1999, yang merupakan anak

pertama dari pasangan suami istri Hamzani Kho dan Siti

Ng. Penulis telah menempuh Pendidikan TK hingga

SMA di Tanjung Balai Karimun, yaitu TK Maha Bodhi

(2003-2004), SD Maha Bodhi (2004-2010), SMP Santo

Yusup (2010-2013), dan SMA Santo Yusup (2013-

2016). Penulis melanjutkan studi Pendidikan S1 di

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Selama

masa perkuliahan, penulis aktif dalam berbagai jenis kepanitiaan yakni Desa Mitra

1 tahun 2017 sebagai divisi acara, panitia TITRASI tahun 2017 sebagai divisi teater,

panitia PROTON LCC, LKTI, dan PI sebagai divisi pendaftaran, panitia FACTION

#2 sebagai divisi dekorasi tahun 2017 dan panitia FACTION #3 sebagai divisi

pendaftaran tahun 2018. Penulis juga mengikuti perlombaan PHARMALYMPIC

tahun 2017 dan PORSFI tahun 2018, serta mengikuti organisasi Badan Eksekutif

Mahasiswa Farmasi (BEMF) tahun 2016/2017 sebagai anggota divisi Hubungan

Internasional project officer IPSF.


identifikasi gen sitokrom p450 2a6 alel*4 pada ...enzim sitokrom p450 2a6 (cyp2a6) terdapat di hati...

Documents